專利名稱：人類角膜內(nèi)皮細(xì)胞的擴(kuò)增方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明大體而言涉及一種擴(kuò)增角膜內(nèi)皮細(xì)胞之方法，更具體言之，本發(fā)明
涉及一種例如角膜內(nèi)皮重建時(shí)治療疑難的角膜內(nèi)皮細(xì)胞失償(decompensation)的 方法及移植物。
背景技術(shù)：
角膜內(nèi)皮細(xì)胞位于角膜后方的基底膜(即后彈力膜(Descemet's membrane)) 上的單層扁平六角形細(xì)胞，其形成不含任何其它細(xì)胞類型的純細(xì)胞薄片。角膜 內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)維持角膜的透明度十分重要。該功能是基于內(nèi)皮對(duì)基質(zhì)水合(stromal hydration)的調(diào)節(jié)，包括眼球水狀液的屏障及泵功能。眼內(nèi)手術(shù)、青光眼、外傷 或者先天性角膜疾病對(duì)人類角膜內(nèi)皮造成的傷害可導(dǎo)致不可逆的角膜水腫，此 至少部分是因?yàn)槿祟惤悄?nèi)皮細(xì)胞在出生之后不具有絲分裂活性或具有極低的 有絲分裂活性，以致細(xì)胞群體隨年齡增長(zhǎng)而逐漸減少。
當(dāng)對(duì)人類角膜內(nèi)皮細(xì)胞之傷害引起角膜水腫時(shí)，通常建議使用同種異體移 植物之后板層角膜移植術(shù)或穿透性角膜移植術(shù)治療。后板層角膜移植術(shù)或穿透 性角膜移植術(shù)的一個(gè)主要顧慮是一個(gè)捐贈(zèng)者角膜只能提供一個(gè)病患的角膜內(nèi)皮 層移植。穿透性角膜移植術(shù)的另一顧慮是同種異體移植排斥反應(yīng)。此外，在許 多國(guó)家，捐贈(zèng)者角膜的供應(yīng)不足。
近來(lái)，有研究報(bào)導(dǎo)在兔子模型上，將裸露的羊膜用作培養(yǎng)人類角膜內(nèi)皮細(xì) 胞移植的載體(Ishino Y等人的Invest Ophthalmol Vis Sci. 2004; 45:800—806)。
然而，根據(jù)上述結(jié)果，該羊膜并未用作活體外(exvivo)細(xì)胞擴(kuò)增的基材
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)態(tài)樣是提供一種用于擴(kuò)增人類角膜內(nèi)皮細(xì)胞的方法，該方法 包括
a) 提供含或不含羊膜細(xì)胞的羊膜，其中該羊膜含細(xì)胞外間質(zhì)；
b) 將內(nèi)皮層片或包括人類角膜內(nèi)皮干細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液置于該羊膜上；及
c) 于該羊膜上培養(yǎng)角膜內(nèi)皮細(xì)胞一段足使上述角膜內(nèi)皮干細(xì)胞擴(kuò)增至一適 當(dāng)面積的時(shí)間。
本發(fā)明的另一態(tài)樣提供一種產(chǎn)生用于病患植入部位的外科移植物的方法， 該方法包括
a) 提供含或不含羊膜細(xì)胞的羊膜，其中該羊膜含細(xì)胞外間質(zhì)；
b) 將內(nèi)皮層片或含人類角膜內(nèi)皮干細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液置于該羊膜上；
c) 于該羊膜上培養(yǎng)角膜內(nèi)皮細(xì)胞一段足使上述角膜內(nèi)皮干細(xì)胞擴(kuò)增至一適 當(dāng)面積的時(shí)間；
d) 自該羊膜分離上述經(jīng)培養(yǎng)的角膜內(nèi)皮細(xì)胞；及
e) 將步驟d)中得到的該細(xì)胞移植至一載體上，以制得外科移植物。 本發(fā)明的另一態(tài)樣是關(guān)于一種外科移植物，其可通過(guò)本發(fā)明的上述方法制備。
本發(fā)明的再一態(tài)樣是關(guān)于一種治療病患缺乏角膜內(nèi)皮細(xì)胞的損傷部位的方 法，該方法包括
a) 提供含或不含羊膜細(xì)胞的羊膜，其中該羊膜含細(xì)胞外間質(zhì)；
b) 將內(nèi)皮層片或含人類角膜內(nèi)皮干細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液置于該羊膜上；
c) 于該羊膜上培養(yǎng)角膜內(nèi)皮細(xì)胞一段足使上述角膜內(nèi)皮干細(xì)胞擴(kuò)增至一適 當(dāng)面積的時(shí)間；
d) 自該羊膜分離上述經(jīng)培養(yǎng)的角膜內(nèi)皮細(xì)胞；
e) 將步驟d)中得到的細(xì)胞移植至一載體上，以制得外科移植物；及
f) 將步驟e)中得到的該外科移植物移植于該損傷部位。


結(jié)合附圖將更容易理解本發(fā)明的上述發(fā)明內(nèi)容及實(shí)施方式。為達(dá)成說(shuō)明本 發(fā)明的目的，圖中展示目前較佳的實(shí)施例。然而，應(yīng)了解本發(fā)明并不限于附圖 中展示的實(shí)施例。
附圖中
圖1是掃描電子顯微鏡(SEM)影像，其顯示根據(jù)本發(fā)明一實(shí)施例，在活體外
擴(kuò)增并移植至人類角膜圓片上的人類角膜內(nèi)皮干細(xì)胞。
具體實(shí)施例方式
根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施例，提供一種用于擴(kuò)增人類角膜內(nèi)皮細(xì)胞的方法，該
方法包括
a) 提供含或不含羊膜細(xì)胞的羊膜，其中該羊膜含細(xì)胞外間質(zhì)；
b) 將內(nèi)皮層片或含人類角膜內(nèi)皮干細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液置于該羊膜上；以及
c) 于該羊膜上培養(yǎng)角膜內(nèi)皮細(xì)胞一段足使上述角膜內(nèi)皮干細(xì)胞擴(kuò)增至一適 當(dāng)面積的時(shí)間。
根據(jù)本發(fā)明，羊膜用于擴(kuò)增人類角膜內(nèi)皮細(xì)胞。該羊膜可含或不含羊膜細(xì) 胞，其中該羊膜含細(xì)胞外間質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明之一實(shí)施例，在該羊膜的基底膜側(cè) 進(jìn)行活體外培養(yǎng)來(lái)擴(kuò)增該角膜內(nèi)皮干細(xì)胞。將角膜內(nèi)皮干細(xì)胞置于該羊膜的基 底膜側(cè)，使角膜內(nèi)皮細(xì)胞相對(duì)于基底膜的位置為面向上方。于該羊膜上培養(yǎng)角 膜內(nèi)皮細(xì)胞一段足使上述角膜內(nèi)皮干細(xì)胞擴(kuò)增至一適當(dāng)面積或大小之時(shí)間，例 如直徑約2至約3 cm的面積。
羊膜提供一種促進(jìn)角膜內(nèi)皮干細(xì)胞群擴(kuò)增的特殊合適的基材(niche substmte)。在本發(fā)明的實(shí)例中，于羊膜上擴(kuò)增角膜內(nèi)皮細(xì)胞后，自該羊膜分離該 等角膜內(nèi)皮細(xì)胞并將其移植至一載體，以制得外科移植物。接著，將置于裸露 的角膜后層表面上的所培養(yǎng)的角膜內(nèi)皮細(xì)胞移植入病患眼睛。
本發(fā)明的另一態(tài)樣提供一種產(chǎn)生施用于病患移入部位(recipient site)的外科 移植物的方法，其包含下述步驟-a) 提供含或不含羊膜細(xì)胞的羊膜，其中該羊膜含細(xì)胞外間質(zhì)；
b) 將內(nèi)皮層片或含人類角膜內(nèi)皮干細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液置于該羊膜上；以及
c) 于該羊膜上培養(yǎng)角膜內(nèi)皮細(xì)胞一段足使上述角膜內(nèi)皮干細(xì)胞擴(kuò)增至一適 當(dāng)面積的時(shí)間；
d) 自該羊膜分離上述經(jīng)培養(yǎng)的角膜內(nèi)皮細(xì)胞；以及
e) 將步驟d)中得到的細(xì)胞移植至一載體上，以制得外科移植物。
根據(jù)本發(fā)明一實(shí)施例，步驟d)中使用的載體可為角膜圓片、經(jīng)處理或改質(zhì) 的羊膜薄片或任一能承載細(xì)胞的適當(dāng)基材。在本發(fā)明一實(shí)施例中，載體可為大 小介于約8.5 mm與約9.0 mm之間的角膜圓片。該角膜圓片的厚度約小于 10(Him。該角膜圓片可為取自捐贈(zèng)者或眼庫(kù)(eye bank)的裸露角膜后層。在本 發(fā)明一實(shí)例中，該角膜盤為含有后彈力膜的角膜后層。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，上述角膜內(nèi)皮干細(xì)胞得自在對(duì)病患健康眼睛進(jìn)行角 膜后輪部組織切片(posterior limbal biopsy)內(nèi)皮層，或取自捐贈(zèng)者的內(nèi)皮層的人 類角膜內(nèi)皮細(xì)胞，較佳為角膜內(nèi)皮層周邊所取得的人類角膜內(nèi)皮細(xì)胞。
本發(fā)明亦關(guān)于一種用于病患缺乏角膜內(nèi)皮細(xì)胞的損傷部位的外科移植物， 其可通過(guò)上述方法制備。
本發(fā)明也關(guān)于一種治療病患缺乏角膜內(nèi)皮細(xì)胞的損傷部位的方法，其中該 方法包括
a) 提供含或不含羊膜細(xì)胞的羊膜，其中該羊膜含細(xì)胞外間質(zhì)；
b) 將內(nèi)皮層片或含人類角膜內(nèi)皮干細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液置于該羊膜上；以及
c) 于該羊膜上培養(yǎng)角膜內(nèi)皮細(xì)胞一段足使上述角膜內(nèi)皮干細(xì)胞擴(kuò)增至一適 當(dāng)面積的時(shí)間；
d) 自該羊膜分離上述經(jīng)培養(yǎng)的角膜內(nèi)皮細(xì)胞；
e) 將步驟d)中取得的上述細(xì)胞移植至一載體上，以制得外科移植物；及
f) 將步驟e)中取得的該外科移植物移植于該損傷部位。 參考以下特定、非限制性實(shí)例，進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明。實(shí)例1:自角膜后輪部組織切片(limbalbiopsy)制備人類角膜內(nèi)皮干細(xì)胞的培
養(yǎng)
在進(jìn)行小梁切除術(shù)(Trabeculectomy)期間，通過(guò)活組織切片方式自病患或另
一活體的相同眼或不同眼取得周邊的內(nèi)皮層的一小片。使用優(yōu)碘 (Betadine.RTM.)(聚維酮碘(Prvidone-iodine))消毒眼瞼。在無(wú)菌條件下，距離輪部 組織約5至6 mm之處，產(chǎn)生長(zhǎng)度約8 mm以輪部組織為底之結(jié)膜瓣(conjunctival flap)。在距離輪部組織約3 mm處產(chǎn)生長(zhǎng)度約5 mm、深度約400 (im以輪部組織 為底之鞏膜瓣(scleral flap),且該瓣延伸至角膜，并距離輪部組織約2 mm。當(dāng)掀 起鞏角膜瓣時(shí)，前房(anteriorchamber)由輪部組織區(qū)進(jìn)入，且在該輪部組織區(qū)周 圍平行延伸約3 mm的長(zhǎng)度。進(jìn)行小梁切除術(shù)，并自移除的組織分離角膜內(nèi)皮層。 接著使用分離的角膜內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，以10-0縫線間斷縫合鞏角膜瓣及結(jié)膜 創(chuàng)口。
實(shí)例2:自捐贈(zèng)者角膜制備人類角膜內(nèi)皮干細(xì)胞
自捐贈(zèng)者角膜取得周邊角膜內(nèi)皮層的小片。在進(jìn)行穿透性角膜移植術(shù) (penetrating keratoplasty)時(shí)，環(huán)鋸中央角膜以取得捐贈(zèng)者角膜的鞏角膜周緣 (sclerocomeal rim)。使用第15號(hào)外科手術(shù)刀將具有后彈力層的角膜內(nèi)皮層與小 梁組織網(wǎng)(Trabecular meshwork)仔細(xì)地分離。從一個(gè)捐贈(zèng)者角膜取得六小片周邊 角膜內(nèi)皮層。
將含有角膜內(nèi)皮干細(xì)胞的周邊的角膜內(nèi)皮層的小片置于含有1.5毫升(ml) 培養(yǎng)基的35 mm培養(yǎng)皿中。該培養(yǎng)基含有OPTIMEM-1作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基(basal medium),補(bǔ)充5至8%病患血清、10納克/毫升(ng/ml)的纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (Fibroblast Growth Factor, FGF)、 5 ng/ml的表皮生長(zhǎng)因子(Epidermal Growth Factor, EGF)、 10微克/毫升(iag/ml)的抗壞血酸、50 jig/ml的青霉素(penicilline)、 50 pg/ml的鏈霉素(streptomycin)及2.5 mg/ml的防治霉(fungizone)。將培養(yǎng)皿中 的小片立即送至實(shí)驗(yàn)室的無(wú)菌層流凈化罩中培養(yǎng)。
實(shí)例3:制備人類羊膜及在該人類羊膜上擴(kuò)增人類角膜內(nèi)皮干細(xì)胞
根據(jù)赫爾辛基宣言(Declaration of Helsinki)的宗旨并取得同意后，可在剖腹 產(chǎn)時(shí)取得人類羊膜。使用含有抗生素的PBS (5 ml，含0.3X氧氟沙星(ofloxacin))清洗羊膜，然后存放于-8(TC的DMEM及甘油中。
將羊膜基底膜側(cè)朝上，平滑地移于培養(yǎng)盤上，并在使用前置于37X:，含5% 二氧化碳(C02)及95%空氣的潮濕恒溫箱內(nèi)培育過(guò)夜。于羊膜上進(jìn)行角膜內(nèi)皮 外植體的培養(yǎng)。在含有約l至1.5ml培養(yǎng)基的35mm培養(yǎng)皿中，將含有角膜內(nèi) 皮干細(xì)胞的周邊角膜內(nèi)皮層植入/轉(zhuǎn)移至羊膜基底膜側(cè)。每隔兩天更換一次培養(yǎng) 基，并培養(yǎng)2至4周，此時(shí)角膜內(nèi)皮干細(xì)胞已生長(zhǎng)并擴(kuò)散至直徑約2至3cm的 面積。通過(guò)在37 。C使用1.2國(guó)際單位(IU)裂解酶II(dispaseII)處理約1至2小時(shí)， 接著再使用胰蛋白酶(trypsin)/乙二胺四乙酸(EDTA)處理數(shù)小時(shí)，將經(jīng)培養(yǎng)的人 類角膜內(nèi)皮干細(xì)胞自培養(yǎng)皿剝離，以取得供繼代培養(yǎng)用的細(xì)胞懸浮液。
實(shí)例4:制備人類角膜盤及將經(jīng)擴(kuò)增的人類角膜內(nèi)皮干細(xì)胞移植至人類角膜
圓片
在對(duì)患有大泡性角膜病變(bullous keratopathy)病患進(jìn)行穿透性角膜移植術(shù) 時(shí)，取得新鮮制備包括患病內(nèi)皮細(xì)胞的全厚度的角膜中央圓片。如實(shí)例2所述， 將全厚度的角膜中央圓片置于上述含有1.5 ml培養(yǎng)基的35 mm培養(yǎng)皿中。立即 將培養(yǎng)皿中的角膜圓片送至實(shí)驗(yàn)室的無(wú)菌層流凈化罩中培養(yǎng)。在漢克斯平衡鹽 溶液(Hank，s Balanced Salt Solution (HBSS))中，與0.02 mg/ml胰蛋白酶/EDTA于 37 "C培育1小時(shí)以除去病患內(nèi)皮細(xì)胞。通過(guò)使用火焰拋光吸量管(flame-polished pipette)劇烈攪散可使細(xì)胞分開(kāi)。以后彈力膜側(cè)朝上的方式將裸露的角膜圓片置 于24孔的培養(yǎng)皿中，接著將實(shí)例3所取得的小體積(0.3至0.5 ml)的上述繼代 培養(yǎng)用的細(xì)胞懸浮液，包含大約2x 105個(gè)細(xì)胞，吸注至裸露角膜圓片的后彈力 膜上，使用實(shí)例2所述的培養(yǎng)基培養(yǎng)約10至14天。細(xì)胞移植后，以逐漸減低 的血清濃度(10%， 5°/。， 2%)，在37 。C的培養(yǎng)基F99 (哈姆氏F12/培養(yǎng)基199 (Ham's /Medium 199》中培育角膜約1星期。使用顯微鏡及掃描電子顯微鏡從形 態(tài)學(xué)評(píng)估移植成功率。
參照?qǐng)D1，放大倍率為1000倍的掃描電子顯微鏡影像顯示根據(jù)本發(fā)明所述 方法的一實(shí)施例，將經(jīng)活體外擴(kuò)增的人類角膜內(nèi)皮干細(xì)胞移植至人類角膜圓片。 人類角膜內(nèi)皮的周邊區(qū)域就增殖及繼代培養(yǎng)而言，具有高度增殖能力。經(jīng)活體 外擴(kuò)增的人類角膜內(nèi)皮細(xì)胞的自體移植物(auto-graft)或同種異體移植物(alk)-gmft)及內(nèi)皮角膜移植術(shù)為未來(lái)的角膜重建提供了最佳的解決辦法。
在預(yù)先處理過(guò)的羊膜基材上進(jìn)行活體外擴(kuò)增的獨(dú)特技術(shù)能確保健康及年輕 的角膜內(nèi)皮干細(xì)胞的繼代培養(yǎng)并移植至接受者角膜。使用自體性角膜內(nèi)皮干細(xì) 胞進(jìn)行移植時(shí)，經(jīng)擴(kuò)增的人類角膜內(nèi)皮干細(xì)胞具有于移植后不需要施行免疫抑 制處理(immunosuppression)的優(yōu)點(diǎn)。針對(duì)以此方式移植的同種異體角膜內(nèi)皮干細(xì) 胞而言，因僅移植角膜內(nèi)皮干細(xì)胞而未移植其它類型細(xì)胞，減少排斥反應(yīng)的發(fā) 生率。
相信對(duì)于所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，本文已充分揭示其獨(dú)特及具發(fā)明 性的外科移植物及產(chǎn)生方法，且所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員不需進(jìn)行繁復(fù)的試驗(yàn) 即可實(shí)施本發(fā)明，且可在不脫離本發(fā)明的權(quán)利要求所定義的精神及范圍下，對(duì) 其作變更。
權(quán)利要求
1. 一種擴(kuò)增人類角膜內(nèi)皮細(xì)胞的方法，該方法包括a)提供含或不含羊膜細(xì)胞的羊膜，其中該羊膜含細(xì)胞外間質(zhì)；b)將內(nèi)皮層片或含人類角膜內(nèi)皮干細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液置于該羊膜上；及c)于該羊膜上培養(yǎng)角膜內(nèi)皮細(xì)胞一段足使上述角膜內(nèi)皮干細(xì)胞擴(kuò)增至一適當(dāng)面積的時(shí)間。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于于該羊膜的基底膜側(cè)上擴(kuò)增上述角膜內(nèi)皮干細(xì)胞。
3. —種產(chǎn)生用于病患植入部位的外科移植物的方法，該方法包括a) 提供含或不含羊膜細(xì)胞的羊膜，其中該羊膜含細(xì)胞外間質(zhì)；b) 將內(nèi)皮層片或含人類角膜內(nèi)皮干細(xì)胞之細(xì)胞懸浮液置于該羊膜上；及c) 于該羊膜上培養(yǎng)角膜內(nèi)皮細(xì)胞一段足使上述角膜內(nèi)皮干細(xì)胞擴(kuò)增至一適 當(dāng)面積的時(shí)間；d) 自該羊膜分離該等經(jīng)培養(yǎng)的角膜內(nèi)皮細(xì)胞；及e) 將步驟d)中得到之該等細(xì)胞移植至一載體上，以制得外科移植物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于于該羊膜的基底膜側(cè)上進(jìn)行上 述角膜內(nèi)皮干細(xì)胞之的活體外培養(yǎng)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于上述角膜內(nèi)皮干細(xì)胞取自 于在該病患的健康眼睛進(jìn)行后輪部組織切片的角膜內(nèi)皮層。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于上述角膜內(nèi)皮干細(xì)胞取自 于捐贈(zèng)者的內(nèi)皮層。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于該內(nèi)皮層為一周邊的角膜內(nèi)皮層。
8. 根據(jù)權(quán)利要求3至7中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于該載體為角膜圓 片或羊膜層片。
9. 根據(jù)權(quán)利要求3至8中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于該載體厚度小于 約100pm。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于該載體為角膜圓片。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于該角膜圓片為裸露的角膜后層。
12. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于該角膜圓片為含有后彈力 膜的角膜后層。
13. —種根據(jù)權(quán)利要求3-12中任一項(xiàng)所述的方法制備的外科移植物。
14. 一種治療病患缺乏角膜內(nèi)皮細(xì)胞的損傷部位的方法，該方法包括a) 提供含或不含羊膜細(xì)胞的羊膜，其中該羊膜含細(xì)胞外間質(zhì)；b) 將一內(nèi)皮層片或含人類角膜內(nèi)皮干細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液置于該羊膜上；及c) 于該羊膜上培養(yǎng)角膜內(nèi)皮細(xì)胞一段足使上述角膜內(nèi)皮干細(xì)胞擴(kuò)增至一適 當(dāng)面積的時(shí)間；d) 自該羊膜分離上述經(jīng)培養(yǎng)的角膜內(nèi)皮細(xì)胞；及e) 將步驟d)中得到的上述細(xì)胞移植至一載體上，以制得外科移植物；及f) 將步驟e)中得到的該外科移植物移植于該損傷部位。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于于該羊膜的基底膜側(cè)上進(jìn) 行上述角膜內(nèi)皮干細(xì)胞的活體外培養(yǎng)。
16. 根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的方法，其特征在于上述角膜內(nèi)皮干細(xì)胞 取自于在該病患的健康眼睛進(jìn)行后輪部組織切片的角膜內(nèi)皮層。
17. 根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的方法，其特征在于上述角膜內(nèi)皮干細(xì)胞 取自于捐贈(zèng)者的內(nèi)皮層。
18. 根據(jù)權(quán)利要求14至17中任一項(xiàng)的方法，其特征在于該內(nèi)皮層為一周 邊的角膜內(nèi)皮層。
19. 根據(jù)權(quán)利要求14至18中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于該載體為角 膜圓片或羊膜層片。
20. 根據(jù)權(quán)利要求14至19中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于該載體厚度 小于約100pm。
21. 根據(jù)權(quán)利要求14至20中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于該載體為角 膜圓片。
22. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于該角膜圓片為裸露的角膜 后層。
23. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于該角膜圓片為含有后彈力 膜的角膜后層。
全文摘要
一種擴(kuò)增人類角膜內(nèi)皮細(xì)胞的方法，其包括a)提供含或不含羊膜細(xì)胞的羊膜，其中該羊膜含細(xì)胞外間質(zhì)；b)將內(nèi)皮層片或含人類角膜內(nèi)皮干細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液置于該羊膜上；及c)于該羊膜上培養(yǎng)角膜內(nèi)皮細(xì)胞一段足使上述角膜內(nèi)皮干細(xì)胞擴(kuò)增至一適當(dāng)面積的時(shí)間。本發(fā)明也關(guān)于一種使用上述擴(kuò)增人類角膜內(nèi)皮細(xì)胞的方法產(chǎn)生施用于病患植入部位(recipient site)的外科移植物的方法，及由該方法制備的外科移植物。
文檔編號(hào)C12N5/02GK101437939SQ200780015455
公開(kāi)日2009年5月20日 申請(qǐng)日期2007年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月28日
發(fā)明者蔡瑞芳 申請(qǐng)人:蔡曜年;蔡瑞芳