專利名稱：用于dna-照相術(shù)的分子信標的制作方法
用于DNA-照相術(shù)的分子信標 描述
本發(fā)明涉及 一 種4吏用黑白照相術(shù)(black-and-white photography )原理的對于分析物的檢測方法和實施所述方法的試劑 盒。該新技術(shù)可應(yīng)用于在避開PCR的必要性的應(yīng)用中在納摩爾濃度的 范圍內(nèi)檢測生物學(xué)上相關(guān)的核酸序列。該方法適合于在基因組診斷學(xué) 和蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域中的廣泛多樣的應(yīng)用。
引言
在醫(yī)學(xué)、科學(xué)和非科學(xué)團體中對于能夠檢測生物物質(zhì)(例如寡核 苷酸、DNA、 RNA和蛋白質(zhì))的快速且簡單的診斷測定法存在強烈需求。 目前可采用的方法需要昂貴的設(shè)備和技術(shù)，并且它們專有地適合于專 業(yè)化的使用者。在DNA檢測的情況中，聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR) [l]或 者相當(dāng)?shù)陌袛U增方法由于其可靠性和靈敏度(5-10個DNA分子)仍然 被最為廣泛地使用。 一些情況下，這些方法在特異性方面存在缺點并 且需要昂貴的多組分測定法。近來已經(jīng)開發(fā)出直接檢測方法，其使用 了復(fù)雜的技術(shù)，例如熒光、化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)、放射性方法，或者精 細材料，例如納米顆粒[2-8]。盡管這些新的測定法可以在皮摩爾、飛 摩爾以及甚至阿摩爾濃度的范圍內(nèi)檢測所選的寡核苷酸，但是其應(yīng)用
需要特殊的科學(xué)背景，從而使該方法局限于高度專業(yè)化的實驗室。
用于檢測DNA和RM而不需要任何特殊科學(xué)背景的新型方法將會 成為里程碑式的成果，以便使這些類型的診斷法擴展至廣泛多樣的應(yīng) 用。這種所提出的方法應(yīng)該覆蓋下列領(lǐng)域人體外診斷學(xué)，例如用于 傳染性和生物恐怖因子的測試或者基因測試，肺瘤學(xué)，研究，以及許多更多的領(lǐng)域。本發(fā)明的目標為開發(fā)一種用于所有這些領(lǐng)域的簡便易 用的方法，而無需涉及精細和昂貴的儀器設(shè)備。
對相紙或者含有面化銀晶體乳劑進行照射產(chǎn)生作為潛伏影像
(latent images)的Ag4核[9]。通過隨后的還原性顯影過程將那些 簇集體(clusters)選擇性地放大?？梢钥吹皆擄@影步驟為原始信號
(潛伏影像)以1()n倍數(shù)的擴增。此類乳劑或相紙的敏感性被稱作"固 有敏感性"，并且受到卣化銀所吸收的波長的限制。稱作光鐠敏化的 過程引發(fā)了對可見光譜的較長波長的敏感性，其中使用了吸附于乳劑 顆粒的被稱為光譜敏化劑(spectral sensitizer )的染料[IO]。花青、 部花青和頻哪氰醇染料組成了迄今所使用的光譜敏化劑的主體，盡管 在認可花青為對于該應(yīng)用最佳的染料種類之前在照相術(shù)中使用了許多 其他分子[ll]。
PCT/EP2006/004017公開一種用于高靈敏性的DNA檢測的方法， 其可在許多領(lǐng)域中(甚至對于非專業(yè)化的使用者，而無需專業(yè)實驗室) 并且以非常簡單的方式而實現(xiàn)。根據(jù)該方法，寡核苷酸或DNA雙鏈用 在照相術(shù)中使用的光敏劑進行標記。將含有該經(jīng)標記的寡核苷酸(0DN ) 的溶液點在相紙上。即使沒有任何光鐠敏化，該方法也允許在相紙的 照射和顯影后以皮摩爾濃度的靈敏度(300阿摩爾)檢測經(jīng)標記的DNA。
本發(fā)明者已經(jīng)進行了這樣的實驗，其涉及將報告分子(例如報告 核酸分子)應(yīng)用于光敏介質(zhì)(photosensitive medium)(例如相紙或 任何其他光敏感的介質(zhì))，其中報告分子攜帶有光敏劑基團和淬滅劑 基團。在分析物不存在時，光敏劑基團被淬滅。例如，報告分子可以 具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)，在分子的末端或靠近末端的光敏劑和淬滅劑基團具有 緊密的空間關(guān)系。當(dāng)報告分子呈現(xiàn)發(fā)卡結(jié)構(gòu)時，光敏劑基團被淬滅(根 據(jù)巳知的分子信標技術(shù))。因此，當(dāng)向光敏介質(zhì)照射光線時具有完整 發(fā)卡結(jié)構(gòu)的報告分子不能實現(xiàn)敏化作用。在分析物存在時，發(fā)卡結(jié)構(gòu) 被破壞。分析物可為互補核酸鏈或者切割發(fā)卡結(jié)構(gòu)的酶或者與發(fā)卡結(jié) 合從而破壞該結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。光敏劑基團與淬滅劑基團相分開，并因 此能夠進行光敏化。在這種情況下，光線照射導(dǎo)致照相介質(zhì)敏化并因此實現(xiàn)對分析物的檢測。
本發(fā)明涉及用于檢測樣品中的分析物的方法，其包括下列步驟 (i)提供樣品；
(i i)提供報告分子，其含有光敏劑基團或用于引入光敏劑基團的 柄基團(handle group)以及淬滅劑基團，其中所述光敏劑基團在待 檢測分析物不存在時被淬滅，
(iii)將所述樣品與所述報告分子在這樣的條件下進行接觸，所
止，
(iv) 如有必要，將柄基團與含有光敏劑基團的反應(yīng)伙伴進行反
應(yīng)，
(v) 在這樣的的條件下照射與光敏介質(zhì)接觸的所述報告分子，所 述條件為在所述報告分子中存在未淬滅的光敏劑基團時，在所述光敏 介質(zhì)中形成標記物基團，和
(vi) 檢測所述標記物基團。
進一步地，本發(fā)明涉及用于檢測樣品中的分析物的試劑盒，其包
含
(a) 報告分子，其含有光敏劑基團或用于引入光敏劑基團的柄基 團以及淬滅劑基團，其中所述光敏劑基團在待檢測分析物不存在時被 淬滅，
(b) 可選地，含有光敏劑基團的關(guān)于柄基團的反應(yīng)伙伴，以及
(c) 光敏介質(zhì)，其在照射未淬滅的光敏劑基團后形成標記物基團。 本發(fā)明允許實現(xiàn)對生物樣品(例如臨床樣品、環(huán)境樣品或農(nóng)業(yè)樣
品)中的分析物(例如核酸或核酸結(jié)合蛋白質(zhì)的高靈敏度的檢測。優(yōu) 選的應(yīng)用包括但不限于檢測遺傳變異性，例如單核苷酸多態(tài)性(SNPs )， 殺蟲劑或藥物抗性、耐受性或不耐性，基因分型，例如檢測生物的物 種或林系、檢測遺傳修飾生物或林系或檢測病原體或有害生物，以及 診斷疾病，例如遺傳疾病、變應(yīng)性疾病、自身免疫疾病或傳染病。進 一步優(yōu)選的應(yīng)用為在樣品中檢測核酸以用于品牌保護，其中產(chǎn)品例如農(nóng)業(yè)產(chǎn)品、食物產(chǎn)品或有價值的貨物和/或這些產(chǎn)品的包裝用產(chǎn)品特異 性信息進行編碼，例如但不限于生產(chǎn)地點、生產(chǎn)日期、銷售商等，并 且其中該信息使用上述方法進行檢測。
優(yōu)選實施方案的詳述
本發(fā)明包括對分析物的檢測。該檢測可以為定性檢測，例如測定 待分析的樣品中分析物(例如特定核酸序列)的存在或不存在。但是， 本發(fā)明還允許定量檢測待分析的樣品中的分析物(例如核酸序列)。 定性和/或定量檢測可包括根據(jù)本領(lǐng)域已知方法測定標記性基團。
待檢測的分析物優(yōu)選選自核酸，以及結(jié)合核苷、核苷酸或核酸的 分子，例如結(jié)合核苷、核苷酸或核酸的蛋白質(zhì)。更優(yōu)選地，分析物為 核酸，例如根據(jù)已知技術(shù)(特別是雜交技術(shù))可以檢測的任何類型的
核酸。例如，核酸分析物可選自DNA (例如雙鏈或單鏈DNA) 、 RNA或 者DNA-RNA雜合體。核酸分析物的具體例子為基因組DNA、 mRNA或由 此衍生的產(chǎn)物，例如cDNA。
在一個優(yōu)選實施方案中，所述檢測涉及在懷疑含有分析物的樣品 和報告分子存在時照射光敏介質(zhì)，其中所述報告分子包含光敏劑基團 和淬滅劑基團，能夠?qū)崿F(xiàn)向光敏介質(zhì)的能量傳遞，其中標記物基團可 在該介質(zhì)中形成。在分析物不存在時，光敏劑基團被淬滅。在分析物 存在時，光敏劑基團的淬滅被減少或終止。在這種情況下，光敏劑基 團可以在照射后在光敏介質(zhì)中誘導(dǎo)形成標記物基團，例如金屬原子或 金屬原子簇集體。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述報告分子為分子信標(MB ) [12]。分子信標為單鏈雜交探針，例如形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的核酸或核酸類 似物探針。所述環(huán)可以含有與靶序列互補的探針序列，和所述莖由位 于探針序列兩側(cè)的互補的臂序列退火形成。光敏劑例如熒光團共價連 接在一個臂的末端，和淬滅劑共價連接在另一個臂的末端。當(dāng)游離在 溶液中時，分子信標不發(fā)出熒光。然而，當(dāng)它們與包含乾序列的核酸鏈雜交時，它們經(jīng)歷構(gòu)象改變，這使其能明亮地發(fā)出熒光。
許多用于這些探針的"熒光團，，和淬滅劑是在黑白照相術(shù)中用作
光譜敏化劑的相同染料[13]，例如花青、部花青或頻哪氰醇染料。分 子信標工作原理可概括如下在靶標不存在時，探針是暗的，因為莖
子，從而消除了熒光團發(fā)熒光的能力。當(dāng)探針遇到靶分子時，它形成 探針-靶標雜交體，其比莖狀雜交體更長并且更穩(wěn)定。探針-靶標雜交 體的剛性和長度排除了莖狀雜交體的同時存在。因而，分子信標經(jīng)歷 自發(fā)的構(gòu)象重組，這強制莖狀雜交體解開，以及熒光團和淬滅劑相互 離開，從而恢復(fù)熒光。
本發(fā)明證實了分子信標在其閉合和開放形式時的熒光測量與在相 紙上檢測到的相對信號之間的相關(guān)性。該技術(shù)被稱為基于分子信標的 DNA-照相術(shù)(Molecular Beacon based-DNA-Photography, MBDP )。
分子信標報告分子的長度優(yōu)選為15-100個核苷酸，和更優(yōu)選為 20-60個核苷酸。分子信標分子可選自核酸例如DNA或RNA分子，或 者核酸類似物。報告分子(例如分子信標分子)可根據(jù)標準工序進行 制造。
樣品可為任何含有待檢測的分析物的樣品。例如，樣品可為生物 樣品，例如農(nóng)業(yè)樣品，例如含有植物材料和/或與植物生長、植物材料 儲存或加工的地點相關(guān)的材料的樣品。另一方面，樣品還可以為臨床 樣品，例如組織樣品或體液樣品如血液、血清、血漿等，特別是人來 源的。其他類型的樣品包括但不限于環(huán)境樣品、土壤樣品、食品樣品、 法醫(yī)樣品或者來自貴重貨物的樣品(對其進行測試以用于品牌保護)。
由于其高靈敏度，本發(fā)明的方法適合于直接檢測分析物而無需擴 增。根據(jù)本發(fā)明，即使微量的分析物，例如核酸，例如O. lng或更低、 優(yōu)選0. 01 ng或更低、更優(yōu)選1 pg或更低、更加優(yōu)選0. 1 pg或更低、 更為優(yōu)選0. 01 pg或更低以及最優(yōu)選0. 001 pg或更低，也可以進行測 定，甚至無需擴增。
本發(fā)明的方法的高靈敏度允許在皮摩爾濃度的范圍內(nèi)檢測分析物，并且甚至有可能在仄摩爾濃度的范圍內(nèi)檢測分析物。在仄摩爾濃
度的范圍內(nèi)的分析允許檢測單個DNA分子。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，進行了分析物的序列特異性的 檢測，其中例如將具有特定序列的核酸與樣品中的其他核酸序列區(qū)分 開，或者將能夠結(jié)合特定核酸序列的多肽與樣品中的其他多肽區(qū)分開。 這種序列特異性的檢測優(yōu)選包括序列特異性的雜交反應(yīng)，通過該雜交 反應(yīng)，待檢測的核酸序列與報告分子發(fā)生結(jié)合。
接觸，例:通過將其中可能存在有結(jié)合產(chǎn):的樣品或樣品i分試樣轉(zhuǎn) 移至光敏介質(zhì)上，所述轉(zhuǎn)移例如通過點樣、移液等來進行。在照射后， 實現(xiàn)從光敏劑基團到光敏介質(zhì)的能量傳遞，從而在光敏劑基團存在時 而不是在光敏劑基團不存在時，在光敏介質(zhì)中形成標記物基團例如金 屬(例如銀)核。如有必要，標記物基團可經(jīng)歷顯影工序，例如根據(jù) 照相術(shù)技術(shù)的化學(xué)或光化學(xué)顯影工序。光敏介質(zhì)可以為任何固體支持 物或任何支持材料，其能夠形成標記物基團，例如金屬核。優(yōu)選地， 光敏介質(zhì)為光敏感的介質(zhì)，例如光敏感紙，或在支持材料上的光敏感 乳劑或凝膠。更優(yōu)選地，光敏介質(zhì)為照相介質(zhì)例如相紙。照射在例如 一定的照射光的波長和/或強度的條件下進行，在所述波長和/或強度 下在光敏劑基團存在時形成選擇性的標記物基團。優(yōu)選地，用紅外線 和/或用長波可見光來進行照射，取決于介質(zhì)的敏感性。對于可見光， 照射波長可為例如500 nm或更高、520 nm或更高、540 nm或更高、 560 nm或更高、580 nm或更高，或者對于紅外線，照射波長可為700 nm至10 jim。
光敏劑基團為能夠?qū)崿F(xiàn)能量轉(zhuǎn)移的基團，例如將光能轉(zhuǎn)移至光敏 介質(zhì)，即照相介質(zhì)例如相紙。光敏劑基團可選自已知的熒光和/或染料 標記性基團，例如基于花青的二氫吲哚基團、喹啉基團，例如市售的 熒光基團例如Cy5或Cy5. 5。
淬滅劑基團為能夠淬滅從光敏劑基團向光敏介質(zhì)的能量傳遞的基 團。優(yōu)選地，淬滅劑基團能夠淬滅光能的轉(zhuǎn)移。淬滅劑基團可選自已知的淬滅劑基團，例如在分子信標報告分子中已知的淬滅劑基團，例
如在參考文獻[12-16](通過提及而合并入本文)中所述的。
在某些實施方案中，報告分子可包含柄基團，即用于通過與合適 的反應(yīng)伙伴(即包含上述基團之一的化合物)反應(yīng)來引入光敏劑基團 的基團。在一個優(yōu)選實施方案中，柄基團選自Click官能化的基團， 即可以與合適的反應(yīng)伙伴在環(huán)加成反應(yīng)中進行反應(yīng)的基團，其中在
Click官能團和反應(yīng)伙伴之間形成環(huán)狀例如雜環(huán)連接，并且其中反應(yīng) 伙伴包含光敏劑基團。這種Click反應(yīng)的一個特別優(yōu)選的例子為疊氮 基團和炔烴基團之間的(3+2)環(huán)加成，其導(dǎo)致形成1，2,3-三唑環(huán)。因 此，可通過施行疊氮化物或炔烴柄基團和相應(yīng)的反應(yīng)伙伴(即含有互 補的炔烴基團或疊氮基團和另外還含有光敏劑基團的反應(yīng)伙伴)的 Click反應(yīng)來產(chǎn)成光敏劑基團。
優(yōu)選地，報告分子為核酸分子，更優(yōu)選地為單鏈核酸分子。根據(jù) 本發(fā)明，術(shù)語"核酸"特別地涉及核糖核苷酸、2'-脫氧核糖核苷酸或 2' ， -雙脫氧核糖核苷酸。核普酸類似物可選自在糖或主鏈上經(jīng)修飾 的核苷酸，特別是可酶促地摻入核酸中的核苷酸類似物。在優(yōu)選的在 糖上經(jīng)修飾的核普酸中，核糖的2'-0H或H-基團被選自0R、 R、卣素、 SH、 SR、 NH2、 NHR、 NR2或CN的基團替代，其中R為C「Ce烷基、烯基 或炔基，和鹵素為F、 Cl、 Br或I。核糖自身可被其他碳環(huán)或雜環(huán)的 5-或6-元基團(例如環(huán)戊烷或環(huán)己烯基團)替代。在優(yōu)選的在主鏈上 經(jīng)修飾的核苷酸中，磷酸(三)酯基團可被經(jīng)修飾的基團替代，例如被 硫代磷酸酯基團或H-膦酸酯基團替代。進一步優(yōu)選的核苷酸類似物包 括用于合成核酸類似物(例如嗎啉代核酸、肽核酸或鎖定核酸)的構(gòu) 建部件。
在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的方法和試劑盒用于農(nóng)業(yè)應(yīng)用。 例如，本發(fā)明適合于檢測來自植物、植物病原體或植物有害生物例如 病毒、細菌、真菌或昆蟲的核酸。進一步地，本發(fā)明適合于檢測植物 或植物部分、植物病原體或植物有害生物例如昆蟲中的遺傳變異性， 例如SNPs。其他用途為在生物體或生物群體中檢測或監(jiān)控除草劑、殺真菌劑 或殺蟲劑抗性、耐受性或不耐性，例如在真菌、昆蟲或植物中的抗性、 耐受性或不耐性。本發(fā)明還適合于快速的基因分型，例如用于真菌、 昆蟲或植物物種或林系的快速檢測和/或辨別。進一步地，可能對遺傳 修飾生物或林系(例如，真菌、昆蟲或植物的生物或抹系)進行檢測 和/或辨別。
本發(fā)明的方法特別適合于植物或種子的檢測和表征。特別地，通 過使用本發(fā)明的方法或者與之相配的測試試劑盒或測試條，可以就制 造商、產(chǎn)品類型和該產(chǎn)品中所含的化合物或內(nèi)含物對產(chǎn)品(例如植物 或種子)進行分析。特別地，可以檢測分析物來源于何處，和特別地 來源于哪個制造商。這是可能的，因為即使與野生型(例如植物野生 型)的微小差異或偏離也可以由根據(jù)本發(fā)明的方法進行檢測。進一步 地，使用根據(jù)本發(fā)明的方法可以檢測分析物是否已經(jīng)遺傳工程改造以 及改造到何種程度。進一步有可能檢測分析物是否包含某一抗性基因 或者分析物是否由于遺傳工程改造而含有其他特性。此類修飾通常包 括僅僅一個或兩個堿基的替換。不過即使如此微小的修飾也可以用根 據(jù)本發(fā)明的方法來檢測。根據(jù)本發(fā)明的方法使得可以確定產(chǎn)品本身， 即發(fā)現(xiàn)其是否為小麥、油菜籽、稻等。最終可以確定資源含量，或確 切地說某些試劑的含量。例如，可以測定油菜籽中的油含量或者對于 干旱脅迫具有抗性的基因的存在。因此，根據(jù)本發(fā)明的方法可以用于 對產(chǎn)品的特性進行控制和監(jiān)控，特別是對已經(jīng)承諾的產(chǎn)品特性。這種 應(yīng)用在營養(yǎng)品以及制藥領(lǐng)域中尤其有用?？梢杂酶鶕?jù)本發(fā)明的方法就 其來源和實際特性來評估通過種植農(nóng)事而生產(chǎn)和分銷的植物。
特別優(yōu)選的是允許對產(chǎn)品或產(chǎn)品特性進行控制和配置的測試試劑 盒或測試條。
由于本發(fā)明的高靈敏度，病原體的早期診斷成為可能，即在可見 到病原體存在的最初癥狀之前的診斷。對于大豆銹菌(豆薯層銹菌
(戶力ai:oi ;7ora pac^rr/z/))或者其他病原體(例如禾布氏白粉菌 (^/w/z7er/fl ^TS2Z7/./7is) 、 'J、麥殼針孢(Se/7for/a fr/f/c/)或$卩菌或其他只可能進行控制的病原體)的診斷來說，如果在其可從視覺上 識別之前就檢測到它們的存在，這就特別重要。
進一步地，本發(fā)明適合于醫(yī)學(xué)、診斷和法醫(yī)應(yīng)用，例如在人或獸 醫(yī)醫(yī)學(xué)中，例如用于檢測來自病原體(例如人病原體或者牲畜或?qū)櫸?動物的病原體)的核酸。特別地，可以檢測例如病毒或細菌。
進一步優(yōu)選的應(yīng)用包括檢測人類中的遺傳變異性例如SNPs，或者 檢測藥物抗性、耐受性或不耐性或者過敏癥。進一步地，本發(fā)明適合 于基因分型，特別是人的基因分型，以便測定與素因(predisposition) 相關(guān)或者與病癥、過敏癥和不耐性的風(fēng)險增加相關(guān)的突變。本發(fā)明還 可用于檢測遺傳修飾生物或林系，細菌或病毒的生物或抹系，還有遺 傳修飾的牲畜動物等。本發(fā)明特別適合于快速診斷疾病，例如遺傳疾 病、變應(yīng)性疾病、自身免疫病或傳染病。
進一步地，本發(fā)明適合于檢測基因的功能和/或表達，例如用于研 究目的。
更進一步的實施方案為使用本方法用于品牌保護，例如用于檢測 編碼在產(chǎn)品中的特定信息，所述產(chǎn)品例如為貴重貨物如植物保護產(chǎn)品、 藥物、化妝品和精細化學(xué)制品(例如維生素和氨基酸)，以及飲料產(chǎn) 品、燃料產(chǎn)品(例如汽油和柴油)、消費電器，其可以進行標記。進 一步地，這些和其他產(chǎn)品的包裝可以進行標記。該信息由核酸或核酸 類似物編碼，所述核酸或核酸類似物已經(jīng)摻入產(chǎn)品中和/或摻入產(chǎn)品的 包裝中。該信息可涉及制造商的身份、生產(chǎn)地點、生產(chǎn)日期和/或銷售 商。借助于本發(fā)明，可實現(xiàn)產(chǎn)品特異性的數(shù)據(jù)的快速檢測。可以從產(chǎn) 品的等分試樣中制備樣品，然后將其與 一種或幾種能夠檢測樣品中由 核酸編碼的信息存在的、序列特異性的、官能化的雜交探針接觸。
本發(fā)明還適合于營養(yǎng)品領(lǐng)域，例如在飼料領(lǐng)域中，動物營養(yǎng)品(例 如玉米)補充有較大量的防腐劑(例如丙酸)。通過應(yīng)用本發(fā)明的方 法，可以減少防腐劑的添加。進一步地，使用本發(fā)明方法的基因組分 析使得能夠預(yù)測個體使用特定營養(yǎng)品的接受能力(營養(yǎng)基因組學(xué))。


圖1:分子信標的工作原理。a)用于使分子信標的發(fā)卡結(jié)構(gòu)變性 的兩種不同的途徑，其中通過與發(fā)卡的環(huán)狀區(qū)域退火的把(頂部)， 和通過溫度、變性劑或ssDM結(jié)合蛋白(底部)。b)開放(上方的線) 和閉合(下方的線)形式的分子信標的典型熒光/溫度光鐠。
圖2:基于分子信標的DNA-照相術(shù)(MBDP)的工作原理的示意圖。 只有其中分子信標與靶T退火的待分析混和物在相紙上產(chǎn)生作為黑色 斑點的陽性信號。閉合形式的分子信標在相紙上未產(chǎn)生信號。
圖3: MB1、 T、 F和Cy3-0DN的圖示以及其序列。左邊列出了典 型染料的吸收和發(fā)射波長。
圖4:熒光分光計的測量結(jié)果(于570 nm的發(fā)射)。a)下方曲 線為0. 2|aM MB1從25匸至85X:的光鐠，而紅色曲線為在相同溶液中 加入1. 2 jliM的T后的光鐠。b)向含有0. 2 pM的MB1和不同雜交緩沖 液的溶液中加入1. 2 jliM的T的熒光發(fā)射-時間獲取圖。
圖5:兩個典型光實驗的掃描儀復(fù)制圖。在a和b中，將經(jīng)Cy3 標記的0DN以IOiliM至100 fM的稀釋系列點樣在re/.道中。在a'和 t/中，報道了與MBDP實驗相關(guān)的放大。斑點1和5 =雜交緩沖液； 斑點2 = 10pM的T;斑點3 = 1 pM的MB1;斑點4 =MB1 + T ( 1: 10)。
圖6:顯影后相紙的掃描儀復(fù)制圖。所使用的樣品在表l中列出。
圖7:顯影后相紙的掃描儀復(fù)制圖。所使用的樣品在表2中列出。
實施例
1.材料和方法
為了證明這一構(gòu)思及其有效性，選擇了與鼠疫耶爾森氏菌 (Fem'"/a /7eW")相關(guān)的寡脫氧核苷酸(0DN )序列 (5'-AGCCACGCCTCAAGGG-3')，在此簡稱為把(T)。該序列對于生物恐怖主義和生物戰(zhàn)應(yīng)用很重要，并且在文獻中已經(jīng)有所研究[14]。具 體地，我們設(shè)計了與從鼠疫耶爾森氏菌16S rRNA基因產(chǎn)生的擴增子相 結(jié)合的分子信標。我們選擇使用市售的被設(shè)計用于靶鼠疫耶爾森氏菌 (靶T)的MB1。將未修飾的寡核苷酸r設(shè)計為與T互補，并且當(dāng)需 要時將其捕獲。圖3中顯示了所述序列以及所用的染料和它們的吸收 及發(fā)射波長。
實際上，Cy3染料為在黑白照相術(shù)中使用的染料之一，并且黑洞 淬滅劑BHQ2對于Cy3具有97 %的良好淬滅效率[13]。在本工作中使 用了不同的緩沖液，在此列出了它們的列表 H = 1 M Tris-HCl pH 8， 100 mM MgCl2 HI = 1 M Tris-HCl pH 8，權(quán)mM MgCl2， 150 mM KC1 H2 = 900 mM NaCl， 90 mM杵檬酸鈉 H3 = 1 M KH2P04 H4 = 1 M曱酸鈉 H5 = 1 M乙酸鈉 H6 = 1 M檸檬酸三鈉 H7 = 1 M四硼酸鈉 H8 - 1 M K2C03 。
我們首先用熒光分光計(/a"0,-7M)測試了 MB1 識別其靶標的能力。MB1與過量的T在高于5mM的鹽濃度存在下雜交。 我們使用不同的濃度測試了如上所述的不同的雜交緩沖液和鹽，以用 在溶液中的最低鹽濃度獲得最佳結(jié)果。鹽濃度確實影響了相紙的敏化 過程。MB1的熒光行為通常與在文獻中所報道的數(shù)據(jù)一致[15]。在此， 我們報道幾個在不同操作條件下我們的分子信標的焚光分析的實例。
在一個典型MBDP實驗中，將1 ja L分析物溶液置于相紙上。溶劑 的蒸發(fā)和樣品向相紙的樹脂中的滲透可以在室溫下緩慢完成(30-60 分鐘)或者通過將相紙置于低于40"C的溫暖表面快速地完成(1-5分 鐘)。后一種方法似乎可以改善樣品向相紙中的吸附，正如通過改善 的靈敏度而突出強調(diào)的。值得注意的是，只有吸附至鹵化銀表面的染料才能有效地作為敏化劑[11]。將Ilfospeed RC Deluxe (Ilford) 用作相紙。
一旦1 luL的液滴被吸附進相紙中，就用經(jīng)過550 nm截止濾鏡和 0. 5 OD密度濾鏡的白色光進行照射。使用標準且市售的溶液來完成相 紙的顯影。整個過程在暗室內(nèi)進行。僅有的在這些實驗中使用的但未 包括在標準暗室中的儀器為用于樣品沉積的微量移液器和熒光分光計。
2.結(jié)果和討論 2. 1初步實驗
制備lnL MB1在包含Tris-HC1 ( pH 8， 10 mM)和MgCls (1 mM) 的水中的溶液。向一批該溶液中加入大量過量的T ( 10juL)。將批樣 和其中只存在T ( 10juM)的溶液(10 mM Tris-HC1 pH 8， 1 mM MgCl2) 的小瓶加熱至80t: 5分鐘，然后緩慢冷卻。所有樣品通過熒光分光術(shù) 以及平行地通過將所述三種溶液(加上含有雜交緩沖液的參照溶液) 各1 M L點樣在市售相紙上進行分析。
該首次實驗的結(jié)果顯示在圖5中。在這些條件下，已經(jīng)可以區(qū)分 斑點3中的閉合形式的MB1 (lyL的1 jaM溶液=1 pmol )和斑點4 中的開放形式(其中MB1與T進行退火(1: 10))。盡管斑點3也產(chǎn) 生微弱的陽性信號，但這是由于在該首次實驗中所使用的高濃度以及 染料的非定量淬滅。實際上，甚至在低溫下，閉合形式的MB1也具有 殘留的熒光信號(可通過熒光分光計檢測到)(圖4中的a)。斑點1 和5為參照，并且它們的白色(假陰性)與涉及靶T ( 1 pL的10jaM 溶液=10 pmol)的斑點2 (其中缺少任何敏化劑(染料))的外觀 形成對比。參照斑點的白色外觀可能是由于在參照溶液(10 mM Tris-HCl pH 8， 1 mMMgCl2)中存在的氯化物陰離子與相紙的銀陽離 子的相互作用。實際上，在使用這些條件(高Cl—濃度)的情況下，當(dāng) 任何經(jīng)Cy3-標記的ODN的濃度低于0. 05 u M時，我們可以檢測到陰性的白色信號。在這個濃度以上，相紙的光譜敏化作用由于經(jīng)標記的0DN 的染料而超出鹽的陰性效應(yīng)。未標記的0DN由于高濃度而產(chǎn)生微弱的 假陽性結(jié)果。根據(jù)該實驗證據(jù)，可以解釋與靶T的溶液相關(guān)的斑點2。 通過如此簡單的實驗，我們證實，分子信標原理可運用于DNA-照 相術(shù)技術(shù)，檢測出IO皮摩爾的T。然后，我們研究了不同的條件以改 善信號/背景比率以及多項其他參數(shù)，以便將本方法的適用性擴展至檢 測亞皮摩爾(<10—12摩爾)的乾標。
2.2檢測600飛摩爾的乾T
圖6 (表l)所顯示的實驗的黑點不如前面實驗中的強。然而，通 過熒光分光計的平行使用可對該實驗進行解釋。分辨率的缺乏是由于 樣品的低濃度和如上所提到的鹽效應(yīng)。在該實驗的A道中，我們確立 了基于雜交作用的該過程的可逆性。 一旦MB1與其靶T退火(表l中 以及圖6中的A4)，就可以將通過加入相反鏈r (A5中)所產(chǎn)生的 信號"切斷，，。該鏈與T雜交，并且與MB1竟爭。通過所使用的大量 過量的T'以及通過熱力學(xué)因素(MB1可形成穩(wěn)定的發(fā)卡結(jié)構(gòu))，相比 于T/MB1雜交，會更傾向于T/r雜交。在A6中，通過加入T使熒光 分光計中混和物的熒光以及相紙上的斑點得以恢復(fù)。通過T/r雜交形 成的未標記的DNA在相紙上形成陰性斑點(A7)，即使在此使用1.2 juM的高濃度。
表l
1Z345678
AH20TMBMB + T 1:6MB + T + T' 1:6:12MB+T + T' + T 1:6:12:24T + r 1:2H20
BH'0MB 0,1 pMT 0'6nMMB + T 1:6MB 0,1 uMH20Cy3-ODNCy3-ODN 0,1 fiM = 0. 1 m m; [t〗=0. 6 p m( 6倍過量)。t' = (5' -cccttgaggcgtggct-3') t的相反鏈
在圖6的B道中，MB1濃度比首次實驗低十倍。使用6倍過量的T，并且將緩沖液濃度降低至5 mM的Tris-HC1 ( pH 8 )和0. 5 mM的MgCl2。 在這樣的實驗條件下，仍然可以檢測出在斑點B4中以0. 6pM的濃度 存在的耙T。因此，用此測定法檢測到了 600飛摩爾的T。此處將斑點 B7和B8用作參照。它們由含有濃度分別為lpM和0. ljLiM的市售經(jīng) Cy3標記的ODN (Cy3-0DN)的緩沖溶液(5 mM Tris-HCl pH 8和0. 5 mM MgCl2)組成。值得注意的是，斑點B8的強度與斑點B4相當(dāng)(并 且更加弱一點)。這使我們得出兩個結(jié)論。在B8中，相紙以依賴于濃 度的方式顯示出存在經(jīng)標記的0DN，這對于不同ODN均是可靠的。實 際上，在不存在任何鹽時，使用相同的照射和顯影條件，對于相同的 濃度Cy3-ODN產(chǎn)生了更強的信號(參見，即圖6中的B8對圖7中的 B3)。
2.3篩選不同的雜交緩沖液
測試了不同的緩沖液和鹽，以便達到在具有最少的對于相紙的鹽 效應(yīng)的情況下實現(xiàn)MB1和T的雜交。所選擇的用于該目的的緩沖液的 列表可在"材料和方法"部分中找到。這些緩沖液中沒有任何一種改 善了在使用緩沖液H用于MBDP應(yīng)用時所已經(jīng)達到的性能，盡管它們中 許多表現(xiàn)出良好的通過熒光監(jiān)控的雜交特性(圖4)。 一些實例在A 道中顯示(圖7，表2)。
表2
123456789101112
AH20TMB*(MB+T), 1:3丁"(MB+T)**(MB+T)*"
BCy3-ODNCy3-ODN lpMCy3-ODN lOOnMCy3《DN 30nMCy3-ODN 10nMCy3-ODN 3nMCy3-ODN InMCy3-ODN lOOpMCy3-ODN 10pMCy3-ODN IpMCy3-ODN 100fM
CH!OH20 + HIH20 + H2H20 + H3H20 + H4H0 + H5H20 + H6H20 + H8H30 + H6 cone.(MB+ T)# = 0. 2 |i M; [T] = 0. 6 jLi M ( 3倍過量)。* + 5 ja L H; ** + 5 p L H6; *** + 3|iL H3 + IOjjL H6。 # + 30pL H3
18在該特殊的情況下，我們使用0. 2 y M濃度的MB1和僅3倍過量的 T。如A3和A4 (圖7)中所示，少量過量的T足夠用于有效的雜交， 并且已經(jīng)通過焚光監(jiān)控得到了確認。斑點A6和A7由于在樣品混合物 中存在不同的鹽而不產(chǎn)生信號。
在C道(圖7)中，將僅含有水和緩沖液的參照溶液以相同濃度 進行點樣以用于雜交實驗。甚至在氯離子不存在時， 一些緩沖液也與 相紙發(fā)生相互作用。在一些情況下，甚至可以檢測到陽性結(jié)果，如在 圖7的C8中對于H8和在圖7的C9中對于H6。表2和圖7中的B道 為已經(jīng)提到的參照Cy3-0DN。在此簡單地將該0DN溶解在水中，并且 以10jaM至100fM的稀釋系列進行點樣。我們作出結(jié)論，在我們的實 驗中所使用的鹽的性質(zhì)以及其濃度可以強烈地影響本方法的靈敏度。
3.結(jié)論
本發(fā)明描述了 一種使用黑白照相術(shù)原理來檢測生物分子的新型方 法。無需大范圍的優(yōu)化便可達到皮摩爾濃度的靈敏度水平。該技術(shù)基 于DNA的高度特異的雜交特性。初步實驗表明該技術(shù)易于使用并且不 昂貴，盡管使用其已經(jīng)可以得到驚人的結(jié)果。迄今為止，使用上述商 業(yè)相紙和此處所報道的條件，我們的檢測極限為600飛摩爾的靶T/1 luL的所分析的溶液。該極限依賴于所使用的鹽和相紙的性質(zhì)，并且 可通過使用不同的染料和不同的光源來進行調(diào)節(jié)。對于如此簡單和快 速的方法來說，以納摩爾濃度的范圍(飛摩爾的把)內(nèi)檢測出所選DNA 序列是一個令人驚訝的結(jié)果。
由于這些探針的特異性在文獻中已經(jīng)得到很好的確認[16],因而 使用不同的分子信標可同時檢測不同的靶。實際上，將分子信標應(yīng)用 于單核苷酸多態(tài)性(SNP )研究中，以及也應(yīng)用于不同靶的多重檢測中 [17]。已報道的對于分子信標結(jié)構(gòu)的修飾(例如在基于鎖定核酸的MB (LNA-MB )中[18])或者對于染料/淬滅劑對的修飾(例如關(guān)于具有超 級淬滅劑(superquencher ) [19]或具有金-淬滅劑[17]的MB )，使這些分子信標成為用于多種應(yīng)用的理想候選物。另外，甚至還可以設(shè)計 特別的相紙條，其中已經(jīng)吸收了許多分子信標。通過對每種分子信標 使用不同的光源(或不同濾鏡)，可以同時檢測不同的特定靶標。此
外，通過使用在我們的實驗室中開發(fā)的DM的Click-化學(xué)官能化，可 以設(shè)計和合成經(jīng)多重修飾的分子信標，從而以模塊的和實用的方式顯 著地增加特定分子信標的可用性。
在本申請中所引用的文獻的內(nèi)容通過提及而合并入本文。參考文獻
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權(quán)利要求
1. 用于檢測樣品中的分析物的方法，其包括下列步驟(i)提供樣品；(ii)提供報告分子，其含有光敏劑基團或用于引入光敏劑基團的柄基團以及淬滅劑基團，其中所述光敏劑基團在待檢測分析物不存在時被淬滅，(iii)將所述樣品與所述報告分子在這樣的條件下進行接觸，所述條件為在分析物存在時所述光敏劑基團的淬滅至少部分地減少或終止，(iv)如有必要，將柄基團與含有光敏劑基團的反應(yīng)伙伴進行反應(yīng)，(v)在這樣的的條件下照射與光敏介質(zhì)接觸的所述報告分子，所述條件為在所述報告分子中存在未淬滅的光敏劑基團時，在所述光敏介質(zhì)中形成標記物基團，和(vi)檢測所述標記物基團。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述分析物選自核酸和結(jié)合核苷、核 苷酸或核酸的分子。
3. 權(quán)利要求1或2的方法，其中待檢測的分析物為選自DNA和 RNA的核酸。
4. 權(quán)利要求1至3中任一項的方法，其中所述樣品為生物樣品。
5. 權(quán)利要求4的方法，其中所述樣品為農(nóng)業(yè)樣品、營養(yǎng)物樣品或 臨床一羊品。
6. 權(quán)利要求1至5中任一項的方法，其中所述檢測直接進行而無 需擴增。
7. 權(quán)利要求1至8中任一項的方法，其中所述檢測與擴增步驟相 組合地進行。
8. 權(quán)利要求1至10中任一項的方法，其中報告分子為核酸分子。
9. 權(quán)利要求1至8中任一項的方法，其中所述柄基團選自疊氮基團和炔烴基團。
10. 權(quán)利要求9的方法，其中所述疊氮基團通過進行Click反應(yīng) 而與包含光敏劑基團的反應(yīng)伙伴中的炔烴基團反應(yīng)。
11. 權(quán)利要求9的方法，其中所述炔烴基團通過進行Click反應(yīng) 而與包含光敏劑基團的反應(yīng)伙伴中的疊氮基團反應(yīng)。
12. 權(quán)利要求1至11中任一項的方法，其中所述光敏劑基團選自 熒光染料基團。
13. 權(quán)利要求12的方法，其中所述光敏劑基團選自基于花青的二 氬巧l咮基團和會啉基團。
14. 權(quán)利要求1-13中任一項的方法，其中所述光敏介質(zhì)包含能夠 形成金屬核的金屬原子或離子。
15. 權(quán)利要求14的方法，其中所述金屬為銀。
16. 權(quán)利要求1-15中任一項的方法，其中所述光敏介質(zhì)為光敏感 紙例如相紙，或在支持材料上的光敏感乳劑或凝膠。
17. 權(quán)利要求1-16中任一項的方法，其中照射步驟(v)使用長波 可見光和/或使用紅外線來完成。
18. 用于檢測樣品中的分析物的試劑盒，其包含(a) 報告分子，其含有光敏劑基團或用于引入光敏劑基團的柄基 團以及淬滅劑基團，其中所述光敏劑基團在待檢測分析物不存在時被 淬滅，(b) 可選地，含有光敏劑基團的關(guān)于柄基團的反應(yīng)伙伴，以及(c) 光敏介質(zhì)，其在照射未淬滅的光敏劑基團后形成標記物基團。
19. 權(quán)利要求18的試劑盒，其中所述報告分子作為浸滲入光敏介 質(zhì)中的試劑存在。
20. 權(quán)利要求18或19的試劑盒在利要求1 - 17中任一項的方法 中的用途。
21. 權(quán)利要求1 - 17中任一項的方法或者權(quán)利要求18或19的試 劑盒的用途，所述用途為用于農(nóng)業(yè)應(yīng)用；用于醫(yī)學(xué)、診斷和法醫(yī)應(yīng)用， 檢測基因的功能和/或表達；用于品牌保護；或者用于營養(yǎng)應(yīng)用，特別地在祠料領(lǐng)域。
22. 權(quán)利要求1-17中任一項的方法，其用于檢測通過遺傳工程 而經(jīng)修飾的分析物。
23. 權(quán)利要求1-17中任一項的方法，其用于檢測分析物，所述 分析物為遺傳修飾生物的產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種使用黑白照相術(shù)原理的對于分析物的檢測方法和實施所述方法的試劑盒。進一步地，應(yīng)用該新技術(shù)以在避開PCR的必要性的應(yīng)用中在納摩爾濃度(飛摩爾)的范圍內(nèi)檢測生物學(xué)上相關(guān)的序列。還存在許多途徑來優(yōu)化本方法，從而適合于在基因組診斷學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域中的廣泛多樣的應(yīng)用。
文檔編號C12Q1/68GK101448956SQ200780015474
公開日2009年6月3日 申請日期2007年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月28日
發(fā)明者A·施沃格勒, T·卡瑞爾 申請人:巴斯夫歐洲公司