專利名稱：：規(guī)?？烧{(diào)的aav生產(chǎn)方法規(guī)?？烧{(diào)的AAV生產(chǎn)方法針對聯(lián)邦資助研究或開發(fā)的聲明本申請描述的工作至少部分由國立健康研究院資助，NHLBI資助號是P01-HL-059407。美國政府擁有本發(fā)明的某些權(quán)利。
背景技術(shù)：
：本發(fā)明描述一種新的獲得和生產(chǎn)AAV的方法。腺病毒相關(guān)病毒(AAV)是細(xì)小病毒家族的一員，它無包膜，是二十面體病毒，具有4.7千堿基對(kb)至6kb的單鏈線性DNA基因組。AAV被歸于依賴病毒屬，因為它被發(fā)現(xiàn)是純化的腺病毒群中的污染物。AAV的生活周期包括潛伏期(感染后AAV基因組整合到宿主基因組)和感染期的(腺病毒或者單純皰疹病毒感染后，整合的AAV基因組接著被拯救、復(fù)制以及包裝成能感染的病毒)。AAV具有非病原性，寬寄主范圍(包括非分裂細(xì)胞)的傳染性，以及能夠整合的性質(zhì)，是吸引人的運輸載體。描述了多種不同的AAV序列和從組織中分離它們的方法。已描述來自猿或人組織來源的AAV1-6、AAV7、AAV9和AAV9及其他AAV序列。參見例如，國際專利公開WO02/33269，WO02/386122(AAV8)，和國際專利公開WO2005/033321。于是，出現(xiàn)了這樣一種趨勢，即不再嚴(yán)格按照血清學(xué)交叉反應(yīng)性(血清型)來定義AAV。最近的一些文獻按照種系發(fā)生的關(guān)聯(lián)性定義AAV之間的關(guān)系，并提出了稱為"亞型(clades)"的分組。參見例如，Gao等人，JVirol78(12):6381-6388(2004年6月);國際專利公開WO2005/033321。AAV2是細(xì)胞伴隨病毒(cell-associated)，因此認(rèn)為它主要位于其生產(chǎn)細(xì)胞中，如今生產(chǎn)AAV的方法主要基于這樣的觀點。所以，大多數(shù)現(xiàn)有AAV生產(chǎn)策略是從生產(chǎn)細(xì)胞系的細(xì)胞沉淀中分離載體顆粒。這些策略都采用某些方法來將載體從細(xì)胞沉淀中釋放出來，例如采用超聲處理、酶法、化學(xué)或物理裂解。不幸地是，這會讓所有的胞內(nèi)蛋白質(zhì)和碎片釋放到病毒收獲物中。因此還需要后續(xù)的純化過程。因為生產(chǎn)和純化的效率都比較低，所以就需要在開始時采用大量的生產(chǎn)細(xì)胞。因此，需要高效的生產(chǎn)和純化AAV的方法。發(fā)明概述本發(fā)明提供生產(chǎn)AAV的方法，不需要終止病毒生產(chǎn)細(xì)胞的培養(yǎng)。該方法包括收獲釋放到上清液中的AAV，無需收集細(xì)胞沉淀或裂解細(xì)胞。在實施方案之一中，所述方法包括修飾或改造AAV衣殼、細(xì)胞和/或培養(yǎng)條件，以此大量減少或消除AAV肝素結(jié)合位點與生產(chǎn)細(xì)胞之間的結(jié)合，從而使AAV進入上清液即培養(yǎng)基。這樣，本發(fā)明的方法提供包含高得率AAV的上清液，與采用細(xì)胞收集和/或細(xì)胞裂解步驟的AAV生產(chǎn)方法相比，它能使與細(xì)胞膜和胞內(nèi)物質(zhì)分離的產(chǎn)物純度更高。本發(fā)明的技術(shù)可用于高效且不同規(guī)模的AAV生產(chǎn)，從而顯著提高經(jīng)濟和時間成本效率。本發(fā)明技術(shù)能進行小規(guī)模的AAV生產(chǎn)，還可以在商業(yè)上用于研究用的萬有試劑盒(all-inclusivekit)。由于可以多次從上清液中收獲AAV，采用連續(xù)的系統(tǒng)或生物反應(yīng)器就能夠使得病毒顆粒的產(chǎn)量達(dá)到臨床應(yīng)用或制藥應(yīng)用所需，由此擺脫細(xì)胞基料對產(chǎn)能的限制。任選地與采用不含或低含量血清或蛋白質(zhì)的生長培養(yǎng)基結(jié)合，則純化可大大簡化。與現(xiàn)有生產(chǎn)方法和/或存在大量胞內(nèi)物質(zhì)的情況相比，本本發(fā)明技術(shù)能夠與更高效的純化和濃縮方法聯(lián)合使用。從本發(fā)明的詳細(xì)說明中還可以看到本發(fā)明的其他優(yōu)勢。附圖簡要說明圖1顯示血清存在(S)或不存在(SF)的條件下，硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)作用于AAV2和AAV2HSPG的效果，以AAV2/8的生產(chǎn)為陽性對照。圖2顯示陽性對照AAV2/8的上清液中的(I)、松散細(xì)胞伴隨的(looselycellassociated)(II)和緊密細(xì)胞伴隨的(tightlycellassociated)(III)耐DNA酶(DNase-resistant)AAV顆粒(drp)分配的定量。圖2B-2E顯示血清存在(血清或S)或不存在(無血清或SF)的條件下，AAV2和AAV2HSPG-的上述分配。圖3顯示單個15cm培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)染所得AAV分離株得率。各非肝素結(jié)合分離株的總得率都高于2X10"GC，最高達(dá)1X10"GC。由圖可見，AAV2和分離株hu.51結(jié)合肝素，因而其產(chǎn)量受到了限制。圖4是柱狀圖，顯示多種AAV免疫的T細(xì)胞活化結(jié)果。Balb/c小鼠用1X10"GC的AAV2/6、AAV2/6.1、AAV2/6.2、AAV2/6丄2、AAV2/1或AAV2載體免疫。13天后，每組取3只小鼠的脾細(xì)胞并混合。進行ELISPOT試驗，用Balb/cAAV表位IPQYGYLTL[SEQIDNO:l]體外刺激等量脾細(xì)胞。圖5是柱狀圖，顯示在293細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，所示各AAV病毒載體三重瞬時轉(zhuǎn)染后，各載體釋放到上清液的分配比例。發(fā)明的詳細(xì)說明本發(fā)明提供一種無需細(xì)胞裂解的生產(chǎn)AAV的方法。該方法包括從病毒生產(chǎn)培養(yǎng)物的上清液中收獲AAV。對于不表現(xiàn)出與硫酸乙酰肝素蛋白多糖或肝素的親合力的AAVs(大多數(shù)AAV具有這種性質(zhì))，大部分耐DNA酶的感染性顆粒在培養(yǎng)物上清液中或者僅松弛地與細(xì)胞相伴。未有誘導(dǎo)產(chǎn)生的病毒性裂解、滲透壓裂解(osmolytic)或其他類型的細(xì)胞裂解。本發(fā)明提供規(guī)模可調(diào)的生產(chǎn)AAV的技術(shù)，AVV可用于多種基因轉(zhuǎn)移和/或疫苗應(yīng)用。當(dāng)本發(fā)明方法與低蛋白污染或無蛋白污染的培養(yǎng)基聯(lián)合使用進行收獲時，還能顯著降低對純化步驟的壓力。這種生產(chǎn)方法可與合適的純化和濃縮方法聯(lián)合使用，包括，例如用于純化和濃縮的色譜法、過濾或沉淀。.由于目前的AAV生產(chǎn)策略使用細(xì)胞沉淀作為分離顆粒的基料，這些方法可稱為一種可反復(fù)重來的過程，但無法實現(xiàn)連續(xù)的收集。與目前的方法不同，在實施方式之一中，本發(fā)明方法以上清液作為多種AAV的主要來源。這允許對同一批生產(chǎn)細(xì)胞進行重復(fù)或連續(xù)的收獲，從7而大量生產(chǎn)AAV以滿足臨床或臨床前研究或治療性應(yīng)用所需。在目前收集細(xì)胞沉淀隨后進行純化的方法中，需要大量顆粒才能提供可用的病毒滴度。所以，存在一個閾值，低于該閥值，回收有用數(shù)量的顆粒在技術(shù)上將是不可行的。在實施方式之一中，某種AAV載體能由生產(chǎn)該病毒的細(xì)胞分泌出至少約10%耐DNA酶的載體顆?；蚧蚪M(d卬vg)。這樣的d卬vg代表了包裝在AAV衣殼中的基因組序列(例如，小基因、表達(dá)盒和/或AAV核酸序列)。在另一個實施方案中，某種AAV載體分泌至少約20Xdrpvg。在另一個實施方案中，某種AAV載體分泌至少約40。/。drpvg?；诒景l(fā)明更高效的生產(chǎn)策略，能夠調(diào)節(jié)生產(chǎn)規(guī)模來滿足對少量和大量病毒顆粒的需求。由此，病毒生產(chǎn)可以根據(jù)預(yù)期需求量來定制，而無需細(xì)胞裂解或終止細(xì)胞培養(yǎng)。例如，已發(fā)現(xiàn)，在一種基于293細(xì)胞的三重轉(zhuǎn)染生產(chǎn)系統(tǒng)中，AAV8載體的病毒顆粒中超過40。/。(平均值)分泌進入上清液。還發(fā)現(xiàn)基于AAV7和rh8R的其他一些載體的分泌比率也在這一范圍內(nèi)。還發(fā)現(xiàn)，在這一系統(tǒng)中，有些載體的病毒顆粒有超過30°/。(平均值)分泌進入上清液中，例如，AAV1[衣殼蛋白見SEQIDNO:2]、AAV6[AAV6衣殼蛋白質(zhì)見SEQIDNO:3]、AAV6.1[SEQIDNO:3，該衣殼蛋白質(zhì)含K531E改變]、AAV6.1.2[SEQIDNO:3，K531E，F(xiàn)129L]、rh.32.33[衣殼蛋白質(zhì)見SEQIDNO:4]、rh.10[衣殼蛋白質(zhì)見SEQIDNO:5]和rh64Rl[rh64衣殼蛋白質(zhì)見SEQIDNO:6，R697W]和rh8R[rh8衣殼蛋白質(zhì)見SEQIDNO:7，D531E]。在另一個實施例中發(fā)現(xiàn)，在上述系統(tǒng)中，三重轉(zhuǎn)染生產(chǎn)中，有些AAV載體的病毒顆粒中超過20。/。(平均值)分泌進入上清液。還發(fā)現(xiàn)，另有一些AAV載體，例如基于AAV9[衣殼蛋白質(zhì)見SEQIDNO:8]的載體，病毒顆粒中超過10%分泌進入上述系統(tǒng)的上清液中。其他例子還包括病毒顆粒中超過10%分泌進入上清液的AAVs,它們也可用于本發(fā)明的方法。在實施方案之一中，據(jù)此產(chǎn)生的載體來自于天然從產(chǎn)生該載體的細(xì)胞中分泌出來的AAVs。在另一個實施方案中，AAVs接受了令其能被分泌的修飾。在實施方案之一中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn):具有肝素結(jié)合域且轉(zhuǎn)導(dǎo)(感染)能力被肝素封閉(blocked)的AAV無法測得其分泌。這種AAV的例子是AAV2[衣殼蛋白質(zhì)見SEQIDNO:9](它在生產(chǎn)過程中主要呈細(xì)胞伴隨形式)和AAV3[衣殼蛋白質(zhì)見SEQIDNO:10]。因此，在一個實施力案屮，本發(fā)明方法包括修飾或改造AAV衣殼、細(xì)胞、和/或培養(yǎng)條件來顯著減少或消除AAV肝素結(jié)合位點與該生產(chǎn)者細(xì)胞之間的結(jié)合，從而使AAV進入上清液即培養(yǎng)基。本發(fā)明的方法提供包含高得率AAV的上清液，與細(xì)胞裂解后回收AAV的方法相比，能更高純度地使產(chǎn)物與細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和胞內(nèi)物質(zhì)分離。在一個實施方案中，本發(fā)明從沒有進行溶菌的上清液開始，因此簡化了后續(xù)純化。在正常培養(yǎng)物的上清液中發(fā)現(xiàn)含量極其有限的細(xì)胞碎片，蛋白質(zhì)污染物顯著減少。在一個實施方案中，使用無血清培養(yǎng)基以避免由生長培養(yǎng)基帶入的血清或其他蛋白質(zhì)的污染。一方面，本發(fā)明提供在病毒生產(chǎn)培養(yǎng)物中生產(chǎn)AAV的方法。多種AAV的序列已被公開。參見例如，AAV1(US專利號6,759,237)、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、rh32.33、rh.10、hu.ll，其他人源或非人源AAV，參見例如，國際專利公開WO02/33269、WO02/386122(AAV8)和GenBank，以及校正了單堿基誤差(singletonerrors)的序列，例如，AAV6.2、AAV6.1、AAV6丄2、rh64Rl和rh8R[參見例如，WO2006/110689，2006年10月19日公開)。或者，可如本發(fā)明所述對其它AAV序列，包括本領(lǐng)域技術(shù)人員使用常規(guī)技術(shù)[參見，例如，國際專利公開號WO2005/033321和GenBank]或其它方式鑒定的序列，進行修飾。某些AAV序列天然缺失上述肝素結(jié)合位點。對于肝素結(jié)合位點缺失的AAV，例如，AAV8[衣殼蛋白質(zhì)見SEQIDNO:ll]，不需要修飾或改造AAV序列、細(xì)胞或培養(yǎng)基。利用各種AAV結(jié)合試驗和結(jié)合AAV的肝素及其部分，可以方便地測定AAV衣殼結(jié)合肝素的能力。而且，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠方便地測定肝素封閉AAV感染/轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力。例如，確定肝素封閉AAV感染/轉(zhuǎn)導(dǎo)能力的適當(dāng)實驗可見于C.Halbertetal，JVirol，75(14):6615-6624(July200)andC.E.WalshandH.Chao'Haemophilia,8(Suppl.2)，p.60-67(2002)。其他AAV序列，例如AAV6，具有肝素結(jié)合位點，但是AAV6的感染能力因肝素的存在被部分抑制，而不是封閉(blocked)。AAV6vpl衣殼序列，據(jù)記載，具有調(diào)節(jié)肝素結(jié)合的單個氨基酸殘基，即第531位的天然賴氨酸。[AAV6序列記載于國際專利申請PCT/US06/13375，根據(jù)該國際申請中的方案編號(參見表格等)。在這種情況下，不需要修飾該AAV序列，因為發(fā)現(xiàn)它只與細(xì)胞松散伴隨。在一個實施方案中，對于具有肝素結(jié)合位點且感染/轉(zhuǎn)染細(xì)胞的能力被肝素封閉的AAV，本發(fā)明對該AAV進行修飾，以減少或消除肝素結(jié)合，從而增加分泌到上清液中的病毒顆粒的數(shù)量。在一個實施方案中，肝素結(jié)合域是Arg-Xaa-Xaa-Arg(RxxR)[SEQIDNO:12]基序，與記載中AAV2中的一樣(即，AAV2vpl衣殼蛋白質(zhì)的585到588位氨基酸，SEQIDNO:9，Kern等人，JVirol77:11072-81;Opie等人，JVirol77:6995-7006(基于WO02/33269中的編號)]。Xaa表示任意氨基酸。發(fā)明人已鑒定到含有RxxR基序的其它AAV衣殼，包括幾種亞型B的AAV。這種具有RxxR基序的AAV衣殼的例子包括hu.51[SEQIDNO:13]、hu.34[SEQIDNO:14]、hu.35[SEQIDNO:15]、hu.45[SEQIDNO:16]，禾卩hu.47[SEQIDNO:17]。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠從已知AAV序列中方便地鑒別到其他具有RxxR結(jié)構(gòu)域的AAV。另外，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)可以容易地鑒定到其他肝素結(jié)合位點。在另一個實施例中，AAV3結(jié)合肝素，但它不含RxxR結(jié)構(gòu)域。發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)對肝素結(jié)合序列的一個或多個氨基酸殘基進行改變從而引入非保守性氨基酸變化，不僅能夠消除(ablate)肝素結(jié)合，還能夠顯著降低T細(xì)胞活化。這正是本申請人的另一申請一"具有降低的衣殼免疫原性的修飾AAV載體及其用途"一的主題，它要求美國臨時申請?zhí)?0/795，965(申請日為2006年4月28日)的優(yōu)先權(quán)，此處將其引為參考。在一個實施方案中，本發(fā)明提供在病毒培養(yǎng)物中生產(chǎn)AAV的方法，其中，所述AAV接受了去肝素結(jié)合域修飾。在一個實施方案中，采用定點突變技術(shù)修卞布編碼AAV衣殼肝素結(jié)合位點的核酸序列，其中，對負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)肝素結(jié)合的一個或多個氨基酸殘基密碼子進行改變，從而在編碼氨基酸中制造非保守性改變。非保守氨基酸改變的例子包括例如，用不同化學(xué)結(jié)構(gòu)(性質(zhì))的氨基酸去取代某氨基酸，由此影響到蛋白質(zhì)功能。下表說明最常見的氨基酸及其性質(zhì)。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>例如，用定點突變技術(shù)修飾編碼肝素結(jié)合位點的核酸序列。例如，在RxxR基序[SEQIDNO:3]中，改變基序的首個和/或末尾精氨酸的密碼子，將其中之一(或兩個)改變?yōu)榉潜Ｊ匕被帷Ｒ寻l(fā)現(xiàn)，改變基序中這兩個精氨酸中的任何一個都能阻止肝素的結(jié)合。如本文所述，如果肝素結(jié)合基序是RxxR，經(jīng)修飾硫酸肝素糖蛋白結(jié)合位點的第一個氨基酸可以從Arg變?yōu)镾er或GIu。在另一個實施方案中，經(jīng)修飾的硫酸肝素糖蛋白結(jié)合位點的末尾氨基酸從Arg變?yōu)門hr。在另一個實施方案中，AAV6vpl衣殼蛋白質(zhì)[SEQIDNO:3]的第531位賴氨酸被變?yōu)榉潜Ｊ匕被?。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可選擇除本文所述之外的其它非保守氨基酸改變。類似地，可用本領(lǐng)域已知技術(shù)鑒定其他肝素結(jié)合域，并用定點突變或其它合適技術(shù)改變精氨酸的編碼序列來修飾這些肝素結(jié)合域。參見例如，Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor出版社(ColdSpringColdSpringHarbor,NY)。另外，可以用其他改變肝素結(jié)合域序列的方法來防止肝素結(jié)合。在另一個實施方案，通過不同于改變肝素結(jié)合位點序列的方法來消除肝素與包含肝素結(jié)合位點的AAV的結(jié)合。例如，可以為AAV衣殼提供一個分子，該分子能夠在生產(chǎn)者細(xì)胞中屏蔽肝素結(jié)合位點。在另一個實施方案中，可以通過改造生產(chǎn)細(xì)胞來消除或顯著減少肝素的產(chǎn)生，例如，用RNA對肝素生物合成中的重要基因進行突變或用RNA靶向所述重要基因，這些可以是瞬時性的也可以是長效的。在另一個實施方案，可以采用肝素生物合成天然缺陷型生產(chǎn)細(xì)胞系。病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物使用的細(xì)胞(穩(wěn)定地或者瞬時地)至少含有產(chǎn)生AAV顆粒所需的最基本元件，生產(chǎn)包含AAV耐DNA酶基因組的病毒顆粒包括將表達(dá)盒包裝入AAV衣殼。所需最基本元件包括，待包裝入AAV衣殼的表達(dá)盒、AAVcap和AAVrep或其功能片段，以及輔助功能因子(helperfunctions)。已描述了多種適合用于產(chǎn)生AAV的細(xì)胞和細(xì)胞系。細(xì)胞自身可從各種生物有機體中選擇，包括原核生物(例如細(xì)菌)細(xì)胞，和真核細(xì)胞，包括昆蟲細(xì)胞，酵母細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞。特別合適的宿主細(xì)胞選自各種哺乳動物細(xì)胞，包括但不限于以下細(xì)胞A549、WEHI、3T3、10Tl/2、BHK、MDCK、COS1、COS7、BSC1、BSC40、BMT10、VERO、WI38、HeLa、HEK293細(xì)胞(它們表達(dá)功能腺病毒El)、Saos、C2C12、L細(xì)胞、HT1080、HepG2和初級成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞和成肌細(xì)胞，它們來源于人、猴子、小鼠、大鼠、兔子和倉鼠等哺乳動物。本發(fā)明對提供細(xì)胞的哺乳動物的種類沒有限制，對于哺乳動物細(xì)胞的類型也沒有限制，即不限于成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等。AAV序列可從多種來源獲得。例如適當(dāng)?shù)腁AV序列可如WO2005/033321所述獲得或來自已知來源，例如，美國典型菌種保藏中心，或者載體核心研發(fā)機構(gòu)(academicvectorcorefacilities).或者，根據(jù)已發(fā)表序列利用已知技術(shù)合成合適的序列。此處提供了合適的AAV序列例子。通常，表達(dá)盒的至少包括5'反向末端重復(fù)(ITR)，編碼所需治療劑、免疫原或抗原的核酸序列以及3'AAVITR，所述編碼核酸序列與調(diào)控其表達(dá)的調(diào)控序列操作性連接。在一個實施方案中，使用血清型2AAV的5'ITR和/或3'ITR。然而，也可選用其他適當(dāng)來源的5'ITR和3'ITR。要被包裝到衣殼蛋白中從而形成AAV病毒體(顆粒)的是所述表達(dá)盒。除了表達(dá)盒之外，細(xì)胞還包含與表達(dá)盒中的AAVITR序列來自相同或與之交叉互補的來源的r印序列和驅(qū)動AAV衣殼在細(xì)胞中表達(dá)的序列(ca;序列)。所述AAVc^和rep序列可以分別選自不同的AAV親本序列，用本領(lǐng)域已知的適當(dāng)方式導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。雖然可以使用全長r印基因，但已發(fā)現(xiàn)，其小片段，即r印78/68和";52/40，足以允許AAV的復(fù)制和包裝。細(xì)胞還需要輔助功能因子來進行本發(fā)明AAV的包裝。任選地，所述輔助功能因子可由皰疹病毒提供。在另一個實施方案，必要的輔助功能因子分別由人或非人靈長類腺病毒源提供，例如可從多種來源獲得的那些，所述來源包括美國典型菌種保藏中心(ATCC)，Manassas,VA(US)。已經(jīng)知道多種合適的腺病毒的序列。參見例如，黑猩猩腺病毒Cl和C68[US專利6,083,716];Pan5、Pan6和Pan7[WO02/33645]，雜交腺病毒[例如WO05/001103中所述]和GenBank。在一個實施方案中，宿主細(xì)胞至少包含表達(dá)Ela基因產(chǎn)物、Elb基因產(chǎn)物、E2a基因產(chǎn)物和/或E40RF6基因產(chǎn)物所需的基本必要腺病毒DNA序列。宿主細(xì)胞可包含其他腺病毒基因，比如VAIRNA，但這些基因不是必需的。在一個實施方案中，使用的細(xì)胞不含除El、E2a禾卩/或E4ORF6之外的腺病毒基因；不包含任何可能在rAAV產(chǎn)生過程中造成雜病毒同源重組的其他病毒基因；并且，它能夠被DNA感染或轉(zhuǎn)染并表達(dá)轉(zhuǎn)入的基因?？捎糜诒景l(fā)明的一種細(xì)胞是用編碼rep序列和編碼c叩的序列穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，并用腺病毒E1、E2a和E40RF6DNA和攜帶上述表達(dá)盒的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。也可類似地使用穩(wěn)定表達(dá)r印和/或ca;的細(xì)胞系，例如B-50(國際專利申請公開WO99/15685)或美國專利5,658,785中描述的細(xì)胞系。另一種合適的宿主細(xì)胞包含表達(dá)E4ORF6所需的基本必要腺病毒DNA。還可用本發(fā)明新的經(jīng)修飾cM序列構(gòu)造其他細(xì)胞系。本發(fā)明宿主細(xì)胞的制備包括諸如選定DNA序列的組裝等技術(shù)。這種組裝可利用常規(guī)方法完成。相關(guān)技術(shù)包括公知的cDNA和基因組克隆，可參考Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor出版社，ColdSpringHarborNY.，包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、合成法，以及能夠提供所需核苷酸序列的其他各種合適的方法。AAV生產(chǎn)必需的元件(例如，腺病毒Ela、Elb、E2a禾P/或E40RF6基因產(chǎn)物、rep或其片段、c叩、表達(dá)盒，以及其他各種所需輔助功能因子)可以以各種傳遞所攜序列的遺傳元件的形式各自或聯(lián)合進入宿主細(xì)胞。本文中，遺傳元件(載體)包括例如，裸DNA、質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、粘粒、游離基因、非病毒運載體(例如，脂類載體)中的蛋白質(zhì)、病毒等等，它們傳遞所攜帶的序列。選定的載體可以用各種適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM行遞送，包括轉(zhuǎn)染、電穿孔、脂質(zhì)體運送、膜融合技術(shù)、高速DNA包被小球(highvelocityDNAcoatedpellets)、病毒感染和原生質(zhì)體融合。本發(fā)明各實施方案使用的方法都是核酸操作領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，包括遺傳工程、重組工程和合成技術(shù)。參見例如，Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor出版社，ColdSpringHarbor,NY.。參見例如，K.Fisher等人，J.Virol.，70:520-532(1993)和美國專利號5,478,745。在一個實施方案中，一個或多個腺病毒基因穩(wěn)定整合到宿主細(xì)胞的基因組中或者作為游離基因穩(wěn)定表達(dá)。各腺病毒基因的啟動子可以各自選自組成型啟動子、誘導(dǎo)型啟動子或者天然的腺病毒啟動子。例如，可利用有機體或細(xì)胞的某種特定生理狀態(tài)(即，利用分化狀態(tài)或者正在復(fù)制的細(xì)胞或者休眠細(xì)胞)或者通過添加外源因子來調(diào)節(jié)這些啟動子。在一個實施方案中，穩(wěn)定的宿主細(xì)胞含有處于誘導(dǎo)型啟動子調(diào)控下的所述必要元件。然而，所述必要元件也可由組成型啟動子來調(diào)控。誘導(dǎo)型啟動子使得基因的表達(dá)可被如下控制提供外源化合物，環(huán)境因素(諸如溫度)，或者特定的生理狀態(tài)(例如，急性期，細(xì)胞的特定分化狀態(tài)或僅限于正在復(fù)制的細(xì)胞)。誘導(dǎo)型啟動子和系統(tǒng)有多種商業(yè)來源，包括但不限于，Invitrogen、Clontech和Ariad。還公開了許多其他系統(tǒng)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可方便地做出選擇。通過外源提供促動劑來調(diào)節(jié)的啟動子的例子包括鋅誘導(dǎo)羊金屬硫蛋白(MT)啟動子，地塞米松(Dex)誘導(dǎo)小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)啟動子，T7聚合酶啟動子系統(tǒng)[WO98/10088];蛻皮激素昆蟲啟動子[No等人，Proc.翻.Acad.Sci.USA，93:3346-3351(1996)]，四環(huán)素阻遏系統(tǒng)[Gossen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89:5547-5551(1992)]，四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)[Gossen等人，Science,268:1766-1769(1995)，也參見Harvey等人，Curr.Opin.Chem.Biol，2:512-518(1998)]，RU486誘導(dǎo)系統(tǒng)[Wang等人，Nat.Biotech,15:239-243(1997)和Wang等，GeneTher.，4:432-441(1997)]和雷帕霉素誘導(dǎo)系統(tǒng)[Magari等，J.CHn.Invest.,100:2865-2872(1997)]。本發(fā)明可用的其他誘導(dǎo)型啟動子是受特定生理狀態(tài)調(diào)控的啟動子，所述狀態(tài)例如溫度、急性期、細(xì)胞特定分化狀態(tài)調(diào)控或僅限于正在復(fù)制的細(xì)胞。在另一個實施方案，使用天然的啟動子。當(dāng)需要基因產(chǎn)物的表達(dá)擬似天然表達(dá)時，可以使用天然啟動子。必須暫時或者根據(jù)發(fā)育(developmentally)或者組織特異性地或者應(yīng)答特異的轉(zhuǎn)錄刺激來調(diào)控轉(zhuǎn)基因表達(dá)時，可以使用天然啟動子。在另一實施方案中，還可以采用其他天然表達(dá)控制元件，比如增強子元件、多腺苷酸化位點或Kozak共有序列來模擬天然表達(dá)。轉(zhuǎn)基因的另一個實施方案包括與組織特異性啟動子操作性相連的轉(zhuǎn)基因。例如，如果要求在骨骼肌中表達(dá)，應(yīng)該使用在肌肉中有活性的啟動子。此類啟動子包括來自編碼骨(3肌動蛋白、肌球蛋白輕鏈2A、抗肌萎縮蛋白、肌肉肌酸激酶基因的啟動子，以及比天然啟動子活性更高的合成肌肉啟動子(見Li等，Nat.Biotech.，17:241-245(1999))。組織特異性啟動子的例子已知的有肝特異性的(白蛋白，Miyatake等，J.Virol.,71:5124-32(1997);乙型肝炎病毒核心啟動子，Sandig等，GeneTher.，3:1002-9(1996);甲胎蛋白(AFP)，Arbuthnot等，Hum.GeneTher.，7:1503-14(1996))，骨鈣素(Stein等，Mol.Biol.Rep.，24:185-96(1997));骨唾液蛋白的(Chen等，J.BoneMiner-Res.,11:654-64(1996))，淋巴細(xì)胞(CD2，Hansal等，J.Immunol,161:1063-8(1998);免疫球蛋白重鏈；T細(xì)胞受體a鏈)，神經(jīng)元的例如神經(jīng)元特異的烯醇酶(NSE)啟動子(Andersen等，Cell.MolNenrobiol，13:503-15(1993))，神經(jīng)絲輕鏈基因的(Piccioli等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88:5611-5(1991))，和神經(jīng)元特異性vgf基因(Piccioli等，Neuron,15:373-84(1995))的，及其他。適當(dāng)?shù)目苫罨瘑幼雍徒M成型啟動子的例子是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。在另一個替換方式中，選定的穩(wěn)定宿主細(xì)胞可以包含組成型啟動子調(diào)控下的一個或多個選定元件，和一個或多個誘導(dǎo)型啟動子調(diào)控下的其它一個或多個其他選定元件。例如，穩(wěn)定的宿主細(xì)胞可由293細(xì)胞(它包含El輔助因子，由組成型啟動子調(diào)控)來制備，但是該細(xì)胞包含受誘導(dǎo)型啟動子調(diào)控的rep和/或cap蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠構(gòu)建出其他的穩(wěn)定宿主細(xì)胞?；蛘?，可以用適當(dāng)?shù)倪z傳元件將需要在宿主細(xì)胞中培養(yǎng)從而將表達(dá)盒包裝進AAV所需的元件中的一個或多個以轉(zhuǎn)入方式(in^Ym》提供給宿主細(xì)胞。一旦選定了合適的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，細(xì)胞在允許AAV包裝的條件下于適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)，收集培養(yǎng)物上清液，從中分離AAV。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)規(guī)模可調(diào)的系統(tǒng)，它允許在維持細(xì)胞的培養(yǎng)長達(dá)整個連續(xù)生產(chǎn)過程，即，不需要為了收集而進行細(xì)胞破壞和/或細(xì)胞裂解。在一個實施方案中，這樣的系統(tǒng)維持著一個活性細(xì)胞培養(yǎng)。在另一個實施方案，細(xì)胞培養(yǎng)物中包含活細(xì)胞和非活細(xì)胞的混合群。在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基的加入可以是在培養(yǎng)過程中和/或在收集上清液時進行，從而形成連續(xù)的生產(chǎn)過程。培養(yǎng)基、新鮮細(xì)胞、和/或諸如調(diào)節(jié)劑等必要營養(yǎng)物和其他元素的加入可以重復(fù)至少兩次，如兩次到100次，或者多于100次，具體視細(xì)胞培養(yǎng)周期而定。雖然本發(fā)明的方法能夠進行病毒的連續(xù)生產(chǎn)，當(dāng)完成一次生產(chǎn)周期后，較好的是，在進行生產(chǎn)細(xì)胞破壞之前從中提取所有殘留的AAV?？墒褂贸Ｒ?guī)方法進行提取。典型的此類方法包括除去上清液，通過凍/融或超聲處理技術(shù)裂解細(xì)胞，然后用去垢劑處理(例如benzonase)。純化通常通過三次CsCl梯度離心，滲析和濃縮來進行。在一個實施方案中，本發(fā)明提供將細(xì)胞培養(yǎng)在適當(dāng)培養(yǎng)基中形成的細(xì)胞培養(yǎng)。任選地，在生產(chǎn)前，或在生產(chǎn)中的適當(dāng)時機提供激活或誘導(dǎo)所需基因產(chǎn)物表達(dá)所需的各種組分或病毒粒子生產(chǎn)所需的各種組分。這些組分可以隨培養(yǎng)基一同加入或另行加入。例如，可將攜帶有一個或多個所需組分的一個或多個適當(dāng)?shù)倪z傳元件(例如質(zhì)粒)轉(zhuǎn)染到合意的細(xì)胞系中。在一個實施方案中，培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基，比如Dulbecco's改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)，它包含無機鹽(如CaCl2(無水)、Fe(N03)9H20、KC1、MgS04(無水)、NaCl和NaH2P04H20)，氨基酸(如L-精氨酸HC1、L-胱氨酸2HC1、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸HC1H20、異亮氨酸、賴氨酸HC1、甲硫氨酸、苯基丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸2Na2H20和纈氨酸)，維生素(如D-Ca泛酸鹽、氯化膽堿、葉酸、i-環(huán)己六醇、煙酰胺、核黃素和硫胺HC1)以及其他組分(如D-葡萄糖、酚紅和丙酮酸鈉)?？蛇x甩其他合適的無血清培養(yǎng)基。較好的是，本發(fā)明在無血清條件下(即在無血清培養(yǎng)基中)產(chǎn)生的細(xì)胞還具有這樣的優(yōu)點，即，它可以在無血清或者無血清相關(guān)成分的條件下進行培養(yǎng)。這樣，簡化了分離并降低了成本，且提高了安全性，系統(tǒng)具有良好的可靠性(合成培養(yǎng)基對再現(xiàn)性來說是最好的)。本發(fā)明的細(xì)胞，特別是那些基于初級細(xì)胞的細(xì)胞，能夠進行正常(就人類而言)的翻譯后修飾、翻譯中修飾(peri-translationalmodification)和組裝。這意味著它們非常適于制備用于治療藥物和疫苗組合物的病毒蛋白質(zhì)和病毒。在另一個實施方案，可以選用含血清的培養(yǎng)基。此外或與此不同，可在培養(yǎng)過程前或中間將培養(yǎng)基與必需的營養(yǎng)物、活化(誘導(dǎo))劑或血清(DMEM+10%胎牛血清)混合。在另一個實施方案，可以使用無蛋白的培養(yǎng)基。提供(例如用蠕動泵或其他合適的方法)新鮮培養(yǎng)基和各種必要的誘導(dǎo)劑或活化劑的流速與從培養(yǎng)容器除去用過的培養(yǎng)基的流速相同。保持培養(yǎng)體積恒定，稀釋比可以通過改變泵速來改變。啟動后，培養(yǎng)物維持在所選細(xì)胞培養(yǎng)物的合適的溫度范圍(例如，大約室溫到37°C)，同時攪拌。根據(jù)所選的細(xì)胞類型，培養(yǎng)可以是有氧的或厭氧的。估計，對于穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系來說，轉(zhuǎn)染后或培養(yǎng)開始后約24小時需要添加培養(yǎng)基。然而，可以定期地對培養(yǎng)物進行采樣，以確定宿主細(xì)胞的濃度和上清液中AAV的濃度，從而更加準(zhǔn)確地預(yù)測上清液收集的時機和培養(yǎng)基添加的時機。這樣，在一個實施方案中，本發(fā)明提供AAV病毒的連續(xù)生產(chǎn)系統(tǒng)。在一個實施方案中，采用分批培養(yǎng)。例如，各批培養(yǎng)可以采用懸浮細(xì)胞和/或貼壁細(xì)胞，加料分批培養(yǎng)，充排式培養(yǎng)(fillanddraw)。多種分批培養(yǎng)系統(tǒng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的，它們使用例如生物反應(yīng)器、發(fā)酵罐、微載體系統(tǒng)、靜態(tài)燒瓶(staticflasks)、細(xì)胞工廠、搖瓶(rollerbottles)、一次性培養(yǎng)袋(disposablebags)(例如，WaveTM系統(tǒng))、不銹鋼容器和玻璃容器。也可以使用其他系統(tǒng)進行AAV病毒生產(chǎn)，例如灌注系統(tǒng)，如中空纖維生物反應(yīng)器，微載體系統(tǒng)、貼壁細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(cellcubesystem(Corning))，旋轉(zhuǎn)濾膜，填充床生物反應(yīng)器(例如纖維小管(fibrecell))，細(xì)胞微囊技術(shù)。在一個連續(xù)系統(tǒng)中，本領(lǐng)域技術(shù)人員都知道如何在不同階段取樣，測定傳染力、基因組滴定或用其他適當(dāng)方法來測定病毒濃度。一旦達(dá)得適當(dāng)?shù)臐舛?，就可將上清液引入到視需要而定的凈化系統(tǒng)中。同時，向細(xì)胞培養(yǎng)物中添加適量的置換培養(yǎng)基和各種其他的必要元素。上清液中的AAV可用本領(lǐng)域已知的各種合適的技術(shù)迸行收獲。例如，單柱技術(shù)(monolithcolumn)(例如離子交換、親合層析或IMAC模式)，色譜法(例如捕獲色譜法、固定化色譜法和擴展床色譜法)，過濾和沉淀，都能用于純化和濃縮。這些方法可單用，也可聯(lián)用。在一個實施方案中，捕獲色譜法(包括柱式系統(tǒng)或膜式系統(tǒng))與過濾和沉淀聯(lián)用。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠輕易地選擇合適的沉淀法，例如利用聚乙二醇(PEG)8000和NH3SO4，可由。其后，沉淀物可用benzonase處理，使用適當(dāng)技術(shù)純化。在一個實施方案中，有利地，用本發(fā)明方法生產(chǎn)的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的AAV明顯高于留在細(xì)胞中的AAV。在某些實施方案中，上清液含有至少60%得率的AAV。目前，發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)有超過30種重組AAV，從上清液中收獲這些AAV，比之從細(xì)胞小球中收獲，提高了AAV的生產(chǎn)效率。于是，本發(fā)明還提供按照本發(fā)明的方法或用途獲得的用于治療組合物或疫苗組合物的病毒，這些病毒或病毒蛋白質(zhì)不含有任何非人哺乳動物的蛋白質(zhì)性物質(zhì)，本發(fā)明還提供包含這樣的病毒和/或病毒蛋白質(zhì)的藥物制劑。這樣的病毒例子包括申請人另一同日申請，"具有降低的衣殼免疫原性的修飾的AAV載體及其用途"中描述的例子，該申請要求美國臨時專利申請60/795，965的(申請日2006年4月28日)的優(yōu)先權(quán)。于是，在一個實施方案中，本發(fā)明提供用于如本發(fā)明所述生產(chǎn)AAV的試劑盒。這樣的試劑盒可以包含一個或多個下列元件?？梢蕴峁┠軌蛑笇?dǎo)AAV病毒顆粒包裝的生產(chǎn)細(xì)胞。這樣的生產(chǎn)細(xì)胞可以經(jīng)改造而含有AAV生產(chǎn)的全部必要元件?；蛘?，這樣的生產(chǎn)細(xì)胞可以經(jīng)改變而不能夠表達(dá)能與肝素結(jié)合位點結(jié)合的肝素。其他合適的元件可以包括轉(zhuǎn)染試劑，用于載體構(gòu)建的質(zhì)粒元件，收集、純化、濃縮或者收獲組裝后AAV顆粒所必需的元件，用于通過正選或負(fù)選純化病毒顆粒的試劑，用于濃縮病毒制劑的試劑和/或用于酶法消化病毒制劑中污染物的試劑。下列實施例是對按照本發(fā)明在細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中生產(chǎn)AAV顆粒的方法說明。實施例1:19實邀用CaP04和生產(chǎn)AAV所需因子的多種質(zhì)粒一同轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，所述質(zhì)粒為AAV2rep、腺病毒輔助構(gòu)建體以及兩側(cè)為ITR的轉(zhuǎn)基因盒。所述AAV2rep質(zhì)粒還包含所研究特定病毒的c"/7序列。所有實驗中，唯有c"p序列可變。這些實驗對數(shù)種轉(zhuǎn)基因盒進行了重復(fù)。在含血清的DMEM中，轉(zhuǎn)染后二十四小時，培養(yǎng)基被替換為含有或不含有血清的新鮮培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后三(3)天，從293貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)基中取樣品(I)。接著，將細(xì)胞脫壁(scrape)，轉(zhuǎn)移到一個容器中。在離心除去細(xì)胞沉淀以后，從脫壁后上清液中取樣品(11)。接下來，通過三次連續(xù)的凍融循環(huán)(-80'C到37。C)裂解細(xì)胞。除去細(xì)胞碎片，從培養(yǎng)基中取樣品(ni)。采用TaqmanPCR，通過耐DNA酶基因組滴定來定量樣品中的AAV。上述轉(zhuǎn)染得到的總生產(chǎn)得率等于樣品III的病毒顆粒濃度。其中包括三部分培養(yǎng)上清液部分，細(xì)胞沉淀部分和經(jīng)細(xì)胞脫壁和此后的離心而釋放的部分。各部分的絕對值如下獲得。上清液的顆粒數(shù)=樣品I的顆粒數(shù)脫壁和離心出來的那部分顆粒數(shù)(與細(xì)胞松散伴隨)=樣品II的顆粒數(shù)減去樣品I的顆粒數(shù)細(xì)胞沉淀中的那部分顆粒數(shù)=樣品III的顆粒數(shù)減去樣品II的顆粒數(shù)。智菜RxxR[SEQIDNO:12]基序(區(qū)域)的存在不僅將AAV顆粒主要局限在細(xì)胞沉淀中，還可能因飽和效應(yīng)限制了由細(xì)胞底物到病毒顆粒的生產(chǎn)。這種限制在非肝素結(jié)合性AAV2同源病毒或AAV8中未觀察到(圖1和2)。血清的存在(S)或不存在(SF)(圖2)看來對非肝素結(jié)合性AAV的生產(chǎn)沒有顯著影響。另一方面，肝素結(jié)合性AAV2的飽和效應(yīng)在血清存在下似乎有所減輕。在另一個實施例中，在實驗室規(guī)模下采用現(xiàn)有方法，預(yù)期40個15cm的培養(yǎng)皿將總共產(chǎn)出約4X10"的AAV2/7顆粒(平均值)。本發(fā)明，包括上清液，能達(dá)到單個培養(yǎng)皿收獲4.7乂1012顆粒。此外，結(jié)合無血清培養(yǎng)基的使用，本發(fā)明技術(shù)顯著減輕后續(xù)純化工作的負(fù)擔(dān)。更具體地說，將本發(fā)明上清液收集法生產(chǎn)的AAV2/1和AAV2/8與使用現(xiàn)有方法產(chǎn)生并經(jīng)CsCl梯度純化的AAV2/1和AAV2/8進行比較。對于兩種病毒，在一系列濃度范圍上，本發(fā)明上清液收集方法得到的AAV2/1和AAV2/8顆粒明顯具有更高的傳染性。對于許多AAV分離株來說，用腺病毒輔助質(zhì)粒AF6、包裝所需表達(dá)AAVrep-cap的反式質(zhì)粒(transplasmid)和提供載體基因組的AAV2.CMV.eGFP順式質(zhì)粒(cisplasmid)，可由單個15em培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)染生產(chǎn)耐DNA酶顆粒，該生產(chǎn)具有可再現(xiàn)性。這些非肝素結(jié)合性分離株小規(guī)模純化的滴度可累計達(dá)每個培養(yǎng)皿1012至1013個含基因組顆粒(圖3)。這些數(shù)量足夠?qū)嶒炇殷w外或體內(nèi)實驗所需。實蕭2:對血清型l、2、3、5、6、7、8禾B9，以及新載體rh32.33、rh.10、hu.ll、AAV6.2、AAV6.1、AAV6丄2、rh64Rl和rh8R載體進入上清液的情況進行了研究。AAV2，AAV2/3和AAV2/5被發(fā)現(xiàn)分泌最少(少于總耐DNA酶載體基因組或顆粒(drpVg)的10%)。AAV2/9在病毒載體生產(chǎn)期間釋放到上清液中的程度一般(超過總drpvg的10%，低于20%)。三重轉(zhuǎn)染后，其他所有被檢載體以293細(xì)胞進行生產(chǎn)過程中都分泌超過20%的病毒顆粒到上清液中。比較從上清液中獲得的載體、純化(CsCl純化，僅AAV2用肝素純化)獲得的載體以及從細(xì)胞沉淀裂解物中獲得的載體的傳染性。在用1、2、6、8或9以及AAV2HSPG-分離株進行的293細(xì)胞AAV載體轉(zhuǎn)導(dǎo)試驗中發(fā)現(xiàn)，從上清液中獲得的AAV的傳染性等同或高于后兩部分的載體。載體向上清液中的釋放似乎與它的肝素親合力相關(guān)。通過對天然AAV2(SEQIDNO:9)的RGNR[SEQIDNO:18]肝素結(jié)合基序迸行基因突變(變成SGNT，SEQIDNO:19)以除去這一親合力，使得釋放到上清液中的那部分載體增加超過40%。在AAV8衣殼(非肝素結(jié)合性，SEQIDNO:1l)的同源位置上導(dǎo)入致肝素結(jié)合的兩個精氨酸產(chǎn)生AAV8RQNR載體，在收獲病毒載體時，所得載體幾乎完全集結(jié)于細(xì)胞沉淀。與其親本載體AAV8形成對比，親本AAV8的可回收基因組顆粒中(平均)超過40。/。釋放到上清液中。實施例3:進行免疫研究，評定具有不同衣殼的各種AAV載體對T細(xì)胞活化的效果。該研究比較了天然AAV6衣殼和三種經(jīng)修飾的AAV，前者己知在第531位賴氨酸具有一個肝素結(jié)合域，三種經(jīng)修飾的AAV的衣殼含有定點修飾。使用的這些AAV被稱為AAV2/6.2(含有不在K531位置上的修飾)，AAV2/6.1(具有的AAV6衣殼[SEQIDNO:3]在531位被修飾而包含一個谷氨酸(即非保守性氨基酸改變)；和AAV2/6丄2，所含AAV6衣殼同時含有AAV6.2和AAV6.1的衣殼修飾。這些載體的序列和產(chǎn)生記載于國際專利申請PCT/US06/13375。以AAV1作為陰性對照，AAV2作為陽性對照。Balb/c小鼠(雄性)用1X10"GC的AAV2/6、AAV2/6.1、AAV2/6.2、AAV2/6丄2、AAV2/1或AAV2載體進行肌肉注射免疫。十三(13)天后，取每組三只小鼠的脾細(xì)胞，混合。進行ELISPOT試驗，取等量的脾細(xì)胞用Balb/cAAV抗原表位IPQYGYLTL[SEQIDNO:l]進行體外刺激。參見圖4結(jié)果顯示，含未修飾AAV6衣殼的病毒載體誘導(dǎo)的T細(xì)胞水平與AAV2衣殼誘導(dǎo)的相當(dāng)。相比之下，除去了肝素結(jié)合域的經(jīng)修飾AAV6載體(AAV2/6.1和AAV2/6丄2)所誘導(dǎo)的T細(xì)胞應(yīng)答與負(fù)對照(AAV1)沒有顯著區(qū)別。這證明將介導(dǎo)肝素與AAV衣殼結(jié)合的氨基酸殘基變?yōu)榉潜Ｊ匕被釟埢粌H消除了肝素結(jié)合，而且明顯降低T細(xì)胞活化。實施例4評定幾種血清型的AAVs結(jié)合陰離子交換膜(MustangQ，PallScientific)的能力，緩沖液pH從6.0到9.0，用0到500mM的鹽梯度跟蹤洗脫。高pH緩沖液對每一被檢血清型的結(jié)合和洗脫來說都是最適合的(表1)。三種血清型(AAV8，AAV7和Rh8Rc)在100到150mM梯度范圍內(nèi)洗脫，另兩種(AAV9和Rh64Rl)—加梯度洗脫液就開始洗脫。上樣物質(zhì)的回收率為50%(AAV7)到100%(Rh64Rl)。表1新的AAV血清型在MustangQ膜上的結(jié)合和洗脫特征<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>數(shù)據(jù)顯示，陰離子交換膜技術(shù)適用于多種AAV血清型的純化。由于膜大孔結(jié)構(gòu)提供的高流速和高結(jié)合容量，該技術(shù)尤其適合從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中純化AAV。數(shù)據(jù)表明，為了獲得適當(dāng)?shù)柠}濃度從而使AAV結(jié)合到陰離子交換膜上，有必要進行上清液稀釋或改換緩沖液。本說明書引用的全部出版物此處以參考文獻引入。盡管以特別優(yōu)選的方式勾畫出本發(fā)明，但要承認(rèn)可以出現(xiàn)不背離本發(fā)明精神的修飾。權(quán)利要求1.生產(chǎn)AAV的方法，所述方法包括以下步驟(a)在細(xì)胞培養(yǎng)中培養(yǎng)肝素結(jié)合位點缺失的AAV；(b)從培養(yǎng)物中收集上清液；和(c)從上清液中分離AAV。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述方法進一步包括維持活細(xì)胞培養(yǎng)物。3.如權(quán)利要求2所述的方法，進一步包括在上清液收集過程中或者之后加入培養(yǎng)基以實現(xiàn)連續(xù)生產(chǎn)過程的步驟。4.如權(quán)利要求1至3中任一項所述的方法，其中，所述方法的步驟至少重復(fù)兩次。5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述方法的步驟至少重復(fù)2到100次。6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述AAV是AAV8。7.如權(quán)利要求l所述的方法，其中，所述AAV接受了去天然肝素結(jié)合位點的修飾。8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述肝素結(jié)合位點的特征為氨基酸序列RxxR(SEQIDNO:12)，X為任何氨基酸。9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述AAV選自由AAV2、hu.51、hu.34、hu.35、hu.45和hu.47組成的組。10.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述肝素結(jié)合位點在RxxR序列(SEQIDNO:12)的第一個氨基酸被修飾。11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中，經(jīng)修飾肝素結(jié)合位點的第一個氨基酸由Arg變成Ser或Glu。12.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述肝素結(jié)合位點在RxxR序列(SEQIDNO:12)的最后一個氨基酸被修飾。13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中，經(jīng)修飾肝素結(jié)合位點的最后一個氨基酸由Arg變成Thr。14.如權(quán)利要求l所述的方法，其中，所述培養(yǎng)步驟在無血清培養(yǎng)基中進行。15.如權(quán)利要求l所述的方法，其中，在HEK293細(xì)胞中培養(yǎng)AAV。16.如權(quán)利要求1的所述方法，其中，所述分離步驟進一步包括通過選自色譜法、過濾和沉淀的方法濃縮AAV。17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述色譜法是柱式色譜。18.如權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述色譜法是膜式色譜。19.生產(chǎn)AAV的方法，所述方法包括以下步驟(a)在經(jīng)改造的哺乳動物細(xì)胞中培養(yǎng)AAV，所述哺乳動物細(xì)胞接受了為避免肝素胞內(nèi)表達(dá)或肝素結(jié)合的修飾；(b)從培養(yǎng)物中收集上清液；和(c)從上清液中分離AAV。20.按照權(quán)利要求1至19中任一項所述方法從所述細(xì)胞培養(yǎng)物中收集得到的細(xì)胞培養(yǎng)上清液。21.如權(quán)利要求20所述的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，其中，所述上清液包含得率至少60%的AAV。22.生產(chǎn)耐耐DNA酶的AAV顆粒的方法，包括(a)培養(yǎng)細(xì)胞，所述細(xì)胞具有進行包裝所需的腺病毒輔助功能因子，足夠用于包裝的AAVrep蛋白質(zhì)，足夠用于包裝的AAVcap蛋白質(zhì)，和待包裝的AAV基因組；(b)從(a)所述的細(xì)胞培養(yǎng)中收集上清液；(c)分離AAV顆粒。23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中，所述細(xì)胞被以編碼腺病毒輔助功能因子的序列穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。24.如權(quán)利要求22所述的方法，其中，所述腺病毒輔助功能因子在可活化或可誘導(dǎo)的啟動子的調(diào)控下表達(dá)。25.如權(quán)利要求22所述的方法，其中，所述細(xì)胞被以編碼AAVrep蛋白和/或AAVcap蛋白的序列穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中，所述AAVrep蛋白禾口/或AAVcap蛋白在可活化或可誘導(dǎo)的啟動子的調(diào)控下表達(dá)。27.如權(quán)利要求22所述的方法，其中，所述細(xì)胞被以待包裝AAV基因組穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。28.用于從上清液中生產(chǎn)肝素結(jié)合位點缺失的AAV的試劑盒，所述試劑盒包括一個或多個以下元件(a)能引導(dǎo)AAV病毒顆粒包裝的生產(chǎn)細(xì)胞；(b)轉(zhuǎn)染試劑；(C)用于載體構(gòu)建的質(zhì)粒元件；(d)收集、純化、濃縮或收獲已組裝AAV顆粒所需的元件；(e)用于病毒顆粒負(fù)選或正選以純化病毒的試劑；(f)用于濃縮病毒制劑的試劑；和(g)在酶法消化病毒制劑中污染物的試劑。29.如權(quán)利要求28所述的試劑盒，其中，所述生產(chǎn)細(xì)胞是一種哺乳動物細(xì)胞，它缺乏表達(dá)能與肝素結(jié)合位點結(jié)合的肝素的能力。全文摘要本發(fā)明描述一種無需細(xì)胞裂解而產(chǎn)生AAV的方法。該方法包括從上清液中獲得AAV。如果AAV的衣殼具有肝素結(jié)合位點，則該方法包括修飾AAV衣殼和/或培養(yǎng)條件，來消除AAV肝素結(jié)合位點和細(xì)胞之間的結(jié)合，從而使AAV進入上清液，即培養(yǎng)基。這樣，本發(fā)明的方法提供高得率的AAV上清液，與使用細(xì)胞裂解步驟產(chǎn)生的AAV相比，它能使與細(xì)胞膜和胞內(nèi)物質(zhì)分離的產(chǎn)物純度更高。文檔編號C12N7/02GK101528916SQ200780014975公開日2009年9月9日申請日期2007年4月27日優(yōu)先權(quán)日2006年4月28日發(fā)明者J·M·威爾森,L·H·范登伯格,M·洛克申請人:賓夕法尼亞州立大學(xué)托管會