專利名稱：：仿生化二氧化硅固定β-葡萄糖醛酸苷酶的納米顆粒制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種仿生化二氧化硅固定e-葡萄糖醛酸苷酶的納米顆粒制備方法，屬于酶的固定化技術(shù)。
背景技術(shù)：
：二氧化硅凝膠是一種常用的固定化酶載體。目前，二氧化硅作載體固定化酶主要釆用包埋法或吸附法。吸附法操作簡單，但是酶易脫落，重復(fù)使用性差。包埋法負載率高，有利于維持酶的結(jié)構(gòu)完整性，進而提高酶的活性維持率，而且二氧化硅具有介孔結(jié)構(gòu)，有利于反應(yīng)物和產(chǎn)物傳遞。目前普遍采用溶膠-凝膠(sol-gel)法，以酸或堿為催化劑，利用硅酸鈉或有機硅烷前驅(qū)體的水解和縮聚在常溫下合成具有較高比表面積和介孔結(jié)構(gòu)的二氧化硅材料。這種方法雖然簡單易行，但過程中產(chǎn)生的醇類副產(chǎn)物對生物酶的活力維持有著不利影響，導(dǎo)致活性下降甚至完全失活。仿生硅化為二氧化硅材料的制備提供了一條新途徑。自然界中的硅藻利用水中溶解的微量硅可形成堅硬的硅質(zhì)細胞壁。研究表明，這類硅藻植物都是通過在有機質(zhì)參與下的生物硅化作用來構(gòu)建細胞壁的，即由一定的有機模板通過靜電吸引作用促進和調(diào)控二氧化硅的沉積。某些天然或合成的有機物，如silaffins、聚賴氨酸、聚乙烯亞胺等可在室溫和中性條件下調(diào)控二氧化硅的快速聚合。仿生硅化過程避免了酸堿催化劑的使用，所用原料均具有很好的生物相容性且包埋條件更加溫和，酶或生物分子可在二氧化硅形成過程中直接被包埋，適用范圍更廣。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種仿生化二氧化硅固定e-葡萄糖醛酸苷酶的納米顆粒制備方法。以該方法所制得的固定e-葡萄糖醛酸苷酶的納米顆粒，e-葡萄糖醛酸苷酶的活力維持率高，穩(wěn)定性好，重復(fù)使用性好。本發(fā)明是通過下述技術(shù)方加以案實現(xiàn)的，一種仿生化二氧化硅固定e-葡萄糖醛酸苷酶的納米顆粒制備方法，其特征在于包括以下過程(1)將硫酸魚精蛋白溶于濃度為0.05mol/L的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tirs-HC1)緩沖液中或去離子水中，配制成濃度為215mg/mL的硫酸魚精蛋白溶液，將P-葡萄糖醛酸苷酶溶于濃度為0.05mol/L的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tirs-HCl)緩沖液中或去離子水中，配制成濃度為0.Img/mL的e-葡萄糖醛酸苷酶溶液，然后將硫酸魚精蛋白溶液與e-葡萄糖醛酸苷酶溶液按體積比為1:1的混合均勻制得混合液；(2)將硅酸鈉溶于去離子水或濃度為215mg/mL的鹽水中，并用2mol/LHC1調(diào)節(jié)溶液的pH至7.0，配制1030畫ol/L的硅酸鈉溶液；(3)按照體積比為1:710的比例，將步驟(1)得到的混合液加入到步驟(2)制得的硅酸鈉溶液中，靜置520min，離心分離，去除上清液，用去離子水洗滌至上清液中無e-葡萄糖醛酸苷酶存在為止，再經(jīng)冷凍干燥，得到仿生化二氧化硅固定P-葡萄糖醛酸苷酶的納米顆粒。本發(fā)明提出的制備方法的優(yōu)點在于制備條件溫和，制備工藝簡單易行，所得二氧化硅沉淀對酶具有很好的固定能力，固定化e-葡萄糖醛酸苷酶的活力維持率高，重復(fù)使用穩(wěn)定性好。圖i為本發(fā)明實施例二制備的仿生化的二氧化硅固定e-葡萄糖醛酸苷酶的納米顆粒的掃描電鏡(SEM)照片。圖2為本發(fā)明實施例二制備的仿生化的二氧化硅固定e-葡萄糖醛酸苷酶的納米顆粒的透射電鏡(TEM)照片。圖3為本發(fā)明實施例二制備的仿生化的二氧化硅固定e-葡萄糖醛酸苷酶的納米顆粒的孔徑分布圖。圖4為采用本發(fā)明實施例二制備的仿生化二氧化硅所固定的e-葡萄糖醛酸苷酶的納米顆粒的循環(huán)使用酶活力的變化圖。具體實施方式實施例一準(zhǔn)確稱取e-葡萄糖醛酸苷酶l.Omg，溶解于0.05mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖溶液中，定容至10mL，得到0.Img/mLe-葡萄糖醛酸苷酶液。稱取300mg硫酸魚精蛋白，溶解于0.05mol/LTris-HC1緩沖溶液中，定容至20mL，得到15mg/mL硫酸魚精蛋白溶液。用去離子水溶解硅酸鈉，并用2mol/LHCl調(diào)節(jié)溶液的pH至7.0，制備10mmol/L硅酸鈉溶液。e-葡萄糖醛酸苷酶液和硫酸魚精蛋白溶液各取0.5ml，混合均勻后加入到7mL新鮮配制的硅酸鈉溶液中，靜置5min，設(shè)置離心機轉(zhuǎn)速為4500r/min，離心分離10min。將上清液倒出，再用去離子水清洗，再離心10min，倒出上清液。反復(fù)清洗2-3次。通過黃芩苷的轉(zhuǎn)化反應(yīng)分析上清液中的e-葡萄糖醛酸苷酶含量，發(fā)現(xiàn)上清液無e-葡萄糖醛酸苷酶存在，對P-葡萄糖醛酸苷酶的固定率為100%。將仿生化二氧化硅固定e-葡萄糖醛酸苷酶的納米顆粒置于真空冷凍干燥器中，-30'C下干燥，稱重，沉淀量為19.5mg，于4'C下保存。將固定0-葡萄糖酸酸苷酶的納米顆粒加入到8mL黃芩苷濃度為0.09mol/L的中性溶液中。并于37'C、攪拌條件下進行黃芩苷的轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)lh后，用高效液相色譜確定黃芩素的生成量，黃芩苷的轉(zhuǎn)化率為2i.8%，相對游離e-葡萄糖醛酸苷酶的反應(yīng)活性，酶活保持率41.7%。實施例二準(zhǔn)確稱取6-葡萄糖醛酸苷酶l.Omg，溶解于0.05mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HC1)緩沖溶液中，定容至10mL，得到0.lmg/mLe-葡萄糖醛酸苷酶液。稱取40mg硫酸魚精蛋白，溶解于0.05mol/LTris-HCl緩沖溶液中，定容至20mL，得到2mg/mL硫酸魚精蛋白溶液。用去離子水溶解硅酸鈉，并用2mol/LHCl調(diào)節(jié)溶液的pH至7.0,制備30國ol/L硅酸鈉溶液。e-葡萄糖醛酸苷酶液和硫酸魚精蛋白溶液各取0.5mL，混合均勻后加入到7mL新鮮配制的硅酸鈉溶液中，靜置10min，設(shè)置離心機轉(zhuǎn)速為4500r/min，離心分離10min。將上清液倒出，再用去離子水清洗，再離心10min，倒出上清液。反復(fù)清洗2-3次。通過黃苳苷的轉(zhuǎn)化反應(yīng)分析上清液中的e-葡萄糖醛酸苷酶含量，發(fā)現(xiàn)上清液無e-葡萄糖醛酸苷酶存在，對e-葡萄糖醛酸苷酶的固定率為100%。將仿生化二氧化硅固定e-葡萄糖醛酸苷酶的納米顆粒置于真空冷凍干燥器中，-30'C下干燥，稱重，沉淀量為14.6mg，于4'C下保存。將固定e-葡萄糖醛酸苷酶的納米顆粒加入到8mL黃芩苷濃度為0.09mol/L的中性溶液中。并于37-C、攪拌條件下進行黃苳苷的轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)lh后，用高效液相色譜確定黃苳素的生成量，黃零苷的轉(zhuǎn)化率為23.5%，相對游離e-葡萄糖醛酸苷酶的反應(yīng)活性，酶活保持率44.91實施例三準(zhǔn)確稱取e-葡萄糖醛酸苷酶l.Omg，溶解于去離子水中，定容至10ml，得到0.lmg/mie-葡萄糖醛酸苷酶液。稱取300mg硫酸魚精蛋白，溶解于去離子水中，定容至20ml，得到15mg/ml硫酸魚精蛋白溶液。用去離子水溶解硅酸鈉，并用2mol/LHC1調(diào)節(jié)溶液的pH至7.0，制備0.03腿ol/L硅酸鈉溶液。P-葡萄糖醛酸苷酶液和硫酸魚精蛋白溶液各取0.5mL，混合均勻后加入到10mL新鮮配制的硅酸鈉溶液中，靜置5min，設(shè)置離心機轉(zhuǎn)速為4500r/min，離心分離10min。將上清液倒出，再用去離子水清洗，再離心10min，倒出上清液。反復(fù)清洗2-3次。通過黃芩苷的轉(zhuǎn)化反應(yīng)分析上清液中的P-葡萄糖醛酸苷酶含量，發(fā)現(xiàn)上清液無e-葡萄糖醛酸苷5酶存在，對e-葡萄糖醛酸苷酶的固定率為100%。將仿生化二氧化硅固定e-葡萄糖醛酸苷酶的納米顆粒置于真空冷凍干燥器中，-30'C下干燥，稱重，沉淀量為23.9mg，于4'C下保存。將固定e-葡萄糖醛酸苷酶的納米顆粒加入到8mL黃芩苷濃度為0.09mol/L的中性溶液中。并于37'C、攪拌條件下進行黃芩苷的轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)lh后，用高效液相色譜確定黃芩素的生成量，黃芩苷的轉(zhuǎn)化率為2i.i%，相對游離e-葡萄糖醛酸苷酶的反應(yīng)活性，酶活保持率40.4%。實施例四準(zhǔn)確稱取e-葡萄糖醛酸苷酶l.Omg,溶解于去離子水中，定容至10mU得到0.l呢/mLe-葡萄糖醛酸苷酶液。稱取40mg硫酸魚精蛋白，溶解于去離子水中，定容至20mL，得到2mg/mL硫酸魚精蛋白溶液。用去離子水溶解硅酸鈉，并用2mol/LHC1調(diào)節(jié)溶液的pH至7.0，制備0.03mol/L硅酸鈉溶液。e-葡萄糖醛酸苷酶液和硫酸魚精蛋白溶液各取0.5mL，混合均勻后加入到8mL新鮮配制的硅酸鈉溶液中，靜置5min，設(shè)置離心機轉(zhuǎn)速為4500r/min，離心分離10min。將上清液倒出，再用去離子水清洗，再離心10min，倒出上清液。反復(fù)清洗2-3次。通過黃芩苷的轉(zhuǎn)化反應(yīng)分析上清液中的葡萄糖醛酸苷酶含量，發(fā)現(xiàn)上清液無葡萄糖醛酸苷酶存在，對e-葡萄糖醛酸苷酶的固定率為100%。將仿生化二氧化硅固定e-葡萄糖醛酸苷酶的納米顆粒置于真空冷凍干燥器中，-30'C下干燥，稱重，沉淀量為13.5mg，于4。C下保存。將固定e-葡萄糖醛酸苷酶的納米顆粒加入到8mL黃芩苷濃度為0.09mol/L的中性溶液中。并于37'C、攪拌條件下進行黃芩苷的轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)lh后，用高效液相色譜確定黃芩素的生成量，黃芩苷的轉(zhuǎn)化率為24.2°/。，相對游離e-葡萄糖醛酸苷酶的反應(yīng)活性，酶活保持率46.3%。實施例五準(zhǔn)確稱取0-葡萄糖醛酸苷酶l.Omg，溶解于0.05mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖溶液中，定容至10mL，得到0.lmg/mLe-葡萄糖醛酸苷酶液。稱取100mg硫酸魚精蛋白，溶解于0.05mol/LTris-HC1緩沖溶液中，定容至20mL，得到5mg/mL硫酸魚精蛋白溶液。用濃度為15mg/mL的鹽水溶解硅酸鈉，并用2mol/LHC1調(diào)節(jié)溶液的pH至7.0，制備0.03mol/L硅酸鈉的鹽水溶液。P-葡萄糖醛酸苷酶液和硫酸魚精蛋白溶液各取0.5mL，混合均勻后加入到7mL新鮮配制的硅酸鈉溶液中，靜置5min，設(shè)置離心機轉(zhuǎn)速為4500r/min，離心分離10min。將上清液倒出，再用去離子水清洗，再離心10min，倒出上清液。反復(fù)清洗2-3次。通過黃芩苷的轉(zhuǎn)化反應(yīng)分析上清液中的e-葡萄糖醛酸苷酶含量，發(fā)現(xiàn)上清液無e-葡萄糖醛酸苷酶存在，對e-葡萄糖醛酸苷酶的固定率為100%。將仿生化二氧化硅固定e-葡萄糖醛酸苷酶的納米顆粒置于真空冷凍干燥器中，-30"C下干燥，稱重，沉淀量為33.6mg，于4t:下保存。將固定P-葡萄糖醛酸苷酶的納米顆粒加入到8mL黃芩苷濃度為0.09mol/L的中性溶液中。并于37'C、攪袢條件下進行黃芩苷的轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)lh后，用高效液相色譜確定黃芩素的生成量，黃芩苷的轉(zhuǎn)化率為23.9%，相對游離e-葡萄糖醛酸苷酶的反應(yīng)活性，酶活保持率45.7%。實施例六準(zhǔn)確稱取葡萄糖醛酸苷酶l.Omg，溶解于0.05mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖溶液中，定容至10mL，得到0.lmg/mLe-葡萄糖醛酸苷酶液。稱取100mg硫酸魚精蛋白，溶解于0.05mol/LTris-HC1緩沖溶液中，定容至20mL，得到5mg/mL硫酸魚精蛋白溶液。用濃度為2mg/mL的鹽水溶解硅酸鈉，并用2mol/LHC1調(diào)節(jié)溶液的pH至7.0，制備30mmol/L硅酸鈉的鹽水溶液。e-葡萄糖醛酸苷酶液和硫酸魚精蛋白溶液各取0.5mL，混合均勻后加入到7mL新鮮配制的硅酸鈉溶液中，靜置15min，設(shè)置離心機轉(zhuǎn)速為4500r/min，離心分離10min。將上清液倒出，再用去離子水清洗，再離心10min，倒出上清液。反復(fù)清洗2-3次。通過黃苳苷的轉(zhuǎn)化反應(yīng)分析上清液中的e-葡萄糖醛酸苷酶含量，發(fā)現(xiàn)上清液無e-葡萄糖醛酸苷酶存在，對葡萄糖醛酸苷酶的固定率為100%。將仿生化二氧化硅固定e-葡萄糖醛酸苷酶的納米顆粒置于真空冷凍干燥器中，-30'C下干燥，稱重，沉淀量為21.1mg，于4'C下保存。將固定P-葡萄糖醛酸苷酶的納米顆粒加入到8mL黃芩苷濃度為0.09mol/L的中性溶液中。并于37。C、攪拌條件下進行黃芩苷的轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)lh后，用高效液相色譜確定黃芩素的生成量，黃芩苷的轉(zhuǎn)化率為22.1%，相對游離3-葡萄糖醛酸苷酶的反應(yīng)活性，酶活保持率42.3%。實施例七循環(huán)使用穩(wěn)定性的測定對本發(fā)明實施例二制備的固定0-葡萄糖醛酸苷酶的納米顆粒的循環(huán)使用穩(wěn)定性進行將黃芩苷和無水亞硫酸鈉溶解到0.03mol/LTris-HC1緩沖溶液中，配成黃芩苷濃度為0.09mol/L，無水亞硫酸鈉濃度為0.1%w/v的溶液，加入實施例二制備的固定化e-葡萄糖醛酸苷酶的納米顆粒，在37°C，攪拌的條件下進行黃芩苷的轉(zhuǎn)化反應(yīng)，用高效液相色譜確定黃芩素的生成量，得到固定化e-葡萄糖醛酸苷酶的酶活力，并以此酶活力為初始酶活力，定義為100%。將反應(yīng)懸浮液離心分離10min(離心機轉(zhuǎn)速為4500r/min)，用去離子水清洗顆粒至上清液中無黃芩苷和黃芩素。重復(fù)上述反應(yīng)過程，得到第二次重復(fù)使用的鹵定化e-葡萄糖醛酸苷酶的酶活力，與初始活力相比，此時的相對酶活力為97%。重復(fù)分離和反應(yīng)過程，得到第三次重復(fù)使用的固定化e-葡萄糖醛酸苷酶的相對酶活力為90%;第四次重復(fù)使用的固定化e-葡萄糖醛酸苷酶的相對酶活力為80%;第五次重復(fù)使用的固定化e-葡萄糖醛酸苷酶的相對酶活力為78%;第六次重復(fù)使用的固定化e-葡萄糖醛酸苷酶的相對酶活力為57%。實施例八將本發(fā)明實施例二制備的固定e-葡萄糖醛酸苷酶的納米顆粒在4'C條件下存儲30天，然后測定其酶活力將黃芩苷和無水亞硫酸鈉溶解到0.03mol/LTris-HCl緩沖溶液中，配成黃芩苷濃度為0.09mol/L，無水亞硫酸鈉濃度為0.1%w/v的溶液，加入在4'C條件下存儲了30天的實施例二制備的固定3-葡萄糖醛酸苷酶的納米顆粒，在37'C，攪拌的條件下進行黃芩苷的轉(zhuǎn)化反應(yīng)，在一定的時間間隔內(nèi)，取出100uL反應(yīng)液，用高效液相色譜確定黃芩素的生成量，得到固定化e-葡萄糖醛酸苷酶的酶活力，與新鮮制備的固定化e-葡萄糖醛酸苷酶的酶活力相比，相對酶活力為99%。表i所示為實施例七和實施例八測定的固定化e-葡萄糖醛酸苷酶及其在4'c條件下存儲30天后進行黃芩苷轉(zhuǎn)化反應(yīng)的相對酶活力。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>從對比結(jié)果可見，4'C條件下存儲30天固定化e-葡萄糖醛酸苷酶用于黃芩苷的轉(zhuǎn)化反應(yīng)，相對酶活力與固定化e-葡萄糖醛酸苷酶的相對酶活力基本相當(dāng)。權(quán)利要求1.一種仿生化二氧化硅固定β-葡萄糖醛酸苷酶的納米顆粒制備方法，其特征在于包括以下過程(1)將硫酸魚精蛋白溶于濃度為0.05mol/L的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液中或去離子水中，配制成濃度為2～15mg/mL的硫酸魚精蛋白溶液，將β-葡萄糖醛酸苷酶溶于濃度為0.05mol/L的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液中或去離子水中，配制成濃度為0.1mg/mL的β-葡萄糖醛酸苷酶溶液，然后將硫酸魚精蛋白溶液與β-葡萄糖醛酸苷酶溶液按體積比為1∶1的混合均勻制得混合液；(2)將硅酸鈉溶于去離子水或濃度為2～15mg/mL的鹽水中，并用2mol/LHCl調(diào)節(jié)溶液的pH至7.0，配制10～30mmol/L的硅酸鈉溶液；(3)按照體積比為1∶7～10的比例，將步驟(1)得到的混合液加入到步驟(2)制得的硅酸鈉溶液中，靜置5～20分鐘，離心分離，去除上清液，用去離子水洗滌至上清液中無β-葡萄糖醛酸苷酶存在為止，再經(jīng)冷凍干燥，得到仿生化二氧化硅固定β-葡萄糖醛酸苷酶的納米顆粒。全文摘要本發(fā)明公開了一種仿生化二氧化硅固定β-葡萄糖醛酸苷酶的納米顆粒制備方法。該方法過程包括，將硫酸魚精蛋白溶于三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液或去離子水中，配制硫酸魚精蛋白溶液，將β-葡萄糖醛酸苷酶溶于三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液中或去離子水中，配制β-葡萄糖醛酸苷酶溶液，硫酸魚精蛋白溶液與β-葡萄糖醛酸苷酶溶液混合制得混合液；將硅酸鈉溶于去離子水或鹽水中，并調(diào)節(jié)pH值得硅酸鈉溶液；將混合液加入硅酸鈉溶液中，經(jīng)靜置，分離，去除上清液，洗滌，冷凍干燥，得到仿生化二氧化硅固定β-葡萄糖醛酸苷酶的納米顆粒。本發(fā)明的優(yōu)點在于制備工藝簡單，所固定的β-葡萄糖醛酸苷酶的活力維持率高，重復(fù)使用穩(wěn)定性好。文檔編號C12N11/14GK101182511SQ20071015025公開日2008年5月21日申請日期2007年11月21日優(yōu)先權(quán)日2007年11月21日發(fā)明者洪吳,姜忠義,張羽飛,林李申請人:天津大學(xué)