專利名稱：采用低能N⁺離子注入技術(shù)誘變選育中性蛋白酶高產(chǎn)菌株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程和酶學(xué)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種采用低能N+離子注入技術(shù)誘變選育中性蛋白酶高產(chǎn)菌株的方法。

背景技術(shù)：
中性蛋白酶是指最適作用pH介于6.0～7.5之間的一類蛋白酶，能催化蛋白質(zhì)肽鍵水解。由于其具有催化反應(yīng)速度快、無工業(yè)污染、催化反應(yīng)條件適應(yīng)性寬等性質(zhì)和優(yōu)點，被廣泛地應(yīng)用于食品、制藥、化妝品、洗滌劑、絲紡、毛皮軟化等行業(yè)。中性蛋白酶可以從動植物組織中提取，但由于此種方法具有局限性，人們越來越多地把目光投入到微生物蛋白酶上。
近些年來，離子束作為一種新的誘變源在誘變育種方面因其獨特的誘變機(jī)理和生物學(xué)效應(yīng)而發(fā)展極為迅速。與傳統(tǒng)誘變源相比，離子注入除了具有能量沉積效應(yīng)外，還具有動量傳遞、質(zhì)量沉積及電荷中和與交換等效應(yīng)。它將物理誘變與化學(xué)誘變特性于一身，能夠在低劑量注入的情況下，顯著提高生物的變異率，獲得損傷輕、突變率高、突變譜廣、遺傳穩(wěn)定的誘變效果。離子注入技術(shù)被廣泛應(yīng)用于微生物優(yōu)良菌株的選育和改良研究中，已選育出一些在工業(yè)上具有較大應(yīng)用前景的生物新品種，并取得了顯著的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。
目前尚未發(fā)現(xiàn)采用離子注入技術(shù)誘變選育中性蛋白酶高產(chǎn)菌株的方法。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種采用低能N+離子注入技術(shù)誘變選育中性蛋白酶高產(chǎn)菌株的方法，可有效提高中性蛋白酶的產(chǎn)量。
本發(fā)明采取的技術(shù)方案是 一種采用低能N+離子注入技術(shù)誘變選育中性蛋白酶高產(chǎn)菌株的方法，其步驟是 (1).篩分出發(fā)菌株挑取一環(huán)枯草芽孢桿菌AS1.398接入種子培養(yǎng)基中，選擇酶活較高且較穩(wěn)定的菌株作為出發(fā)菌株； (2).N+離子注入誘變將枯草芽孢桿菌出發(fā)菌株于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后立即進(jìn)行N+離子注入，將經(jīng)過N+離子注入的培養(yǎng)皿用無菌水洗脫，稀釋后涂布于牛肉膏蛋白胨平板上培養(yǎng)； (3).篩選高產(chǎn)菌株將經(jīng)離子束注入后在牛肉膏蛋白胨平板上培養(yǎng)的菌株用無菌水洗下，適當(dāng)稀釋后涂布于酪素篩選平板上，待菌落長成后，視菌落周圍透明圈的大小挑選相對菌落小透明圈大的菌落轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)； (4).N+離子注入誘變將菌液采用最佳注入劑量對菌株進(jìn)一步誘變篩選，挑取菌落周圍透明圈比對照株透明圈大的菌落轉(zhuǎn)接入斜面培養(yǎng)基中，待菌落長成后經(jīng)搖瓶培養(yǎng)，取發(fā)酵液用Folin法測定所產(chǎn)中性蛋白酶的活力，經(jīng)復(fù)篩得到中性蛋白酶活力大于8120U/mL的高產(chǎn)突變株； (5).中性蛋白酶高產(chǎn)菌株的確定對以上誘變試驗中篩選得到的高產(chǎn)突變株進(jìn)行連續(xù)傳代試驗，考察其遺傳性狀的穩(wěn)定性，最終篩選到作為最終應(yīng)用于生產(chǎn)上的菌株。
而且，所述的N+離子注入條件為注入能量為30keV，注入劑量為50×1014ions/cm2，靶室真空度為10-3pa，以5s脈沖式注入，間隔為15s。
而且，所述的菌液采用的最佳注入劑量為50×1014ions/cm2。
而且，利用涂布平板上菌落周圍透明圈的大小來篩選高產(chǎn)菌株，所用篩選培養(yǎng)基為(g/L)KH2PO4 0.36、MgSO4·7H2O 0.5、ZnCl20.014、Na2HPO4·7H2O 1.07、NaCl 0.16、CaCl2 0.002、FeSO4 0.002、酪素4、瓊脂20。
本發(fā)明的優(yōu)點及積極效果是 1.本發(fā)明中的中性蛋白酶是由枯草芽孢桿菌(B.subtilis)AS1.398經(jīng)過發(fā)酵而得，該菌種在經(jīng)過紫外線、微波、氯化鋰及N-甲基-硝基-N-亞硝基呱等傳統(tǒng)誘變方法處理后，已導(dǎo)致負(fù)突變和抗性飽和，而采用離子注入進(jìn)行誘變具有上述誘變因子所不具有的優(yōu)點，它能夠打破此瓶頸，獲得以目標(biāo)產(chǎn)物為目的的高產(chǎn)優(yōu)良菌株。因此，本發(fā)明通過低能N+離子注入誘變選育中性蛋白酶的生產(chǎn)菌株，有效地提高了菌株的產(chǎn)酶能力，降低了生產(chǎn)成本，并獲得良好的經(jīng)濟(jì)效益。
2.本發(fā)明利用N+離子注入技術(shù)對產(chǎn)生中性蛋白酶的枯草芽孢桿菌AS1.398進(jìn)行誘變，并經(jīng)不同劑量的N+離子注入后，菌株的存活率呈典型的“馬鞍型”劑量-效應(yīng)曲線，可在最佳注射劑量50×1014ions/cm2下篩選到一株具有良好遺傳穩(wěn)定性的高產(chǎn)突變菌株NP131，其中性蛋白酶的搖瓶活力在8230U/mL左右，較出發(fā)菌株提高了81.3％。結(jié)果表明，離子注入技術(shù)能夠應(yīng)用于中性蛋白酶高產(chǎn)菌株的誘變選育中，對微生物來說具有較高的突變率和較寬的突變譜，誘變效果好，是一種比較理想的微生物菌種選育方法。



圖1為本發(fā)明N+離子注入對菌株存活率的影響曲線； 圖2為本發(fā)明菌株NP131和出發(fā)菌株BS18的產(chǎn)酶曲線。

具體實施例方式 下面通過實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明；下述實施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實施例來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
一種采用低能N+離子注入技術(shù)誘變選育中性蛋白酶高產(chǎn)菌株的方法，其步驟是 1.出發(fā)菌株的篩分 從斜面上挑取一環(huán)枯草芽孢桿菌AS1.398接入種子培養(yǎng)基中，于32℃、180r/min條件下培養(yǎng)24h后，取0.1mL涂布于平皿上，繼續(xù)于32℃下培養(yǎng)48h。再從平皿中挑取20個單菌落轉(zhuǎn)接入斜面中，將這20株菌接到種子培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h，測定中性蛋白酶活力，選擇酶活較高且較穩(wěn)定的菌株作為出發(fā)菌株。其結(jié)果為(見表1)原始出發(fā)菌株經(jīng)過復(fù)壯后，菌株的酶活大多在3900～4200U/mL范圍，BS2和BS18兩株的酶活較高，可達(dá)4500U/mL。
將上述試驗中酶活較高的菌株BS2和BS18進(jìn)行傳代試驗，考察菌株遺傳性狀的穩(wěn)定性。其結(jié)果為(見表2)BS18菌株高產(chǎn)且穩(wěn)定性好，適合作為離子注入誘變的出發(fā)菌株。
2.N+離子注入誘變 (1).樣品的前處理將枯草芽孢桿菌出發(fā)菌株于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期，取0.1mL菌液均勻地涂布于無菌載玻片上，用無菌風(fēng)吹干后立即進(jìn)行N+離子注入。
(2).離子注入條件注入能量為30keV，靶室真空度為10-3pa，以5s脈沖式注入，間隔為15s，單次注入劑量為1×1014ions/cm2。注入劑量分別為3、8、10、30、50、80、100、200×1014ions/cm2，每個注入劑量做一個真空對照，計算其在各劑量下的存活率，繪制存活率曲線。其結(jié)果為(見圖1)在N+離子注入劑量達(dá)到30×1014ions/cm2之前，隨N+離子注入劑量的增加，菌株存活率迅速降低，當(dāng)劑量達(dá)到30×1014ions/cm2后，存活率有短暫的回升，后又逐漸下降，整個過程呈“馬鞍型”變化曲線，注入劑量超過200×1014ions/cm2后存活率趨于零。這種曲線與其它誘變因子造成的“指數(shù)型”劑量-效應(yīng)曲線有所不同，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是離子注入細(xì)胞的射程較短，低劑量時離子只對細(xì)胞表面進(jìn)行損傷和刻蝕，能量沉積所產(chǎn)生的大量自由基導(dǎo)致DNA和生物膜等其它生物大分子損傷，從而造成存活率下降；劑量繼續(xù)增加，大量連續(xù)注入電荷的堆積會產(chǎn)生很強(qiáng)的庫侖斥力，這種斥力能對被注入的細(xì)胞形成一個“保護(hù)屏障”，阻礙后續(xù)注入離子對細(xì)胞的損傷，而且大量堆積的電荷可形成一個弱電場，這種電場的刺激效應(yīng)可以激活菌內(nèi)的各種修復(fù)機(jī)制和修復(fù)酶，誘導(dǎo)產(chǎn)生Mn-SOD、CAT酶的活性升高，使得菌株存活率有所回升；當(dāng)劑量上升到一定程度時，聚集于細(xì)胞表面的電荷產(chǎn)生庫侖爆炸，使細(xì)胞失去了電荷屏蔽而使存活率再次下降。離子注入微生物體內(nèi)誘發(fā)物理、化學(xué)、生物等方面的反應(yīng)，其相互之間又不是截然分開，而是相互聯(lián)系，相互影響的，整個作用過程十分復(fù)雜。存活率曲線、誘變機(jī)理、生物學(xué)效應(yīng)之間的關(guān)系也有待于進(jìn)一步的探討。
每個處理及其相應(yīng)的真空對照在離子注入前預(yù)抽真空5min，以消除因真空干燥程度不同可能帶來的影響。
(3).樣品的后處理將經(jīng)過N+離子注入的培養(yǎng)皿和真空對照的培養(yǎng)皿分別用無菌水洗脫，適當(dāng)稀釋后涂布于牛肉膏蛋白胨平板上，置32℃下培養(yǎng)48h后計數(shù)，以計算存活率。存活率為經(jīng)N+離子注入處理的存活菌落數(shù)與經(jīng)真空對照處理的存活菌落數(shù)的比值。
(4).存活率曲線的繪制吸取離子注入后的孢子懸液1mL，注入裝有9mL無菌水的試管中，制成10-1稀釋液；反復(fù)吹吸10-1的稀釋液，使其混合均勻后吸取1mL，注入裝有9mL無菌水的試管中，制成10-2稀釋液；按上述程序操作，制備10-3稀釋液；選擇適宜濃度的稀釋液，分別取0.1mL涂布于平皿中，每個稀釋度做3個平行；于32℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，取出計數(shù)。以注入劑量為橫坐標(biāo)，存活率為縱坐標(biāo)，繪制存活率與注入劑量的關(guān)系曲線。
3.高產(chǎn)菌株的篩選 將經(jīng)離子束注入后的平板用無菌水洗下，適當(dāng)稀釋后涂布于酪素篩選平板上。待菌落長成后，視菌落周圍透明圈的大小挑選相對菌落小透明圈大的菌落轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上，以待復(fù)篩。將初篩獲得的菌株轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基中逐個發(fā)酵，于32℃下培養(yǎng)48h后，進(jìn)行中性蛋白酶活力的測定。
4.N+離子注入對菌株突變率的影響 以出發(fā)菌株作為對照，隨機(jī)選取接受輻照后的單菌落分別進(jìn)行發(fā)酵實驗，每個劑量挑取30個菌株，以考察菌株的產(chǎn)酶能力。其中產(chǎn)酶比出發(fā)菌株低5％的視為負(fù)突變菌株，高于5％的為正突變菌株，在5％以內(nèi)的為無義異株。負(fù)突變率是指負(fù)突變菌株占全部被考察的菌株的比率，正突變率是指正突變菌株占全部被考察的菌株的比率。以注入劑量為橫坐標(biāo)，突變率為縱坐標(biāo)繪制突變率與注入劑量的關(guān)系曲線。比較菌株的突變率情況，確定最佳注入能量和劑量。
5.N+離子注入誘變 采用所確定的最佳注入能量和注入劑量對菌株進(jìn)一步誘變篩選，然后對篩選出來的優(yōu)良菌株作遺傳穩(wěn)定性考察。
隨機(jī)選取經(jīng)不同劑量N+離子注入處理的單菌落分別進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，測定其產(chǎn)生的中性蛋白酶的活力，同時與出發(fā)菌株對照計算突變率。其結(jié)果為(見表3)隨著注入劑量的增加，菌株的突變率也隨之增加；注入劑量在30～50×1014ions/cm2范圍內(nèi)時，菌株的正突變率較高；注入劑量超過50×1014ions/cm2以后，雖然菌株的突變率繼續(xù)增加，但正突變率呈下降的趨勢。這可能是由于低劑量注入后的菌株容易發(fā)生回復(fù)突變，而高劑量使DNA及生物膜等大分子的損傷嚴(yán)重，造成較高的突變率和低的正突變率。在“馬鞍”區(qū)域內(nèi)，由于注射劑量適宜，使突變率相對較高，DNA的損傷并不很嚴(yán)重，且具有良好的修復(fù)能力，所以能夠篩選到正突變率較高的菌株。
將菌液在最佳注入劑量50×1014ions/cm2下進(jìn)行N+離子注入誘變處理，適當(dāng)稀釋后涂布于0.4％的酪素篩選平板上，挑取菌落周圍透明圈比對照株透明圈大的菌落(340個)轉(zhuǎn)接入斜面培養(yǎng)基中，待菌落長成后經(jīng)搖瓶培養(yǎng)，取發(fā)酵液用Folin法測定所產(chǎn)中性蛋白酶的活力。其結(jié)果為(見表4)經(jīng)復(fù)篩得到中性蛋白酶活力大于8120U/mL的三個高產(chǎn)突變株，分別命名為NP131、NP135和NP247。從復(fù)篩的結(jié)果可以看出，經(jīng)過初篩得到的菌落周圍透明圈大的菌株，其中性蛋白酶活力均較高。
6.中性蛋白酶菌株的確定 對以上誘變試驗中篩選得到的三株高產(chǎn)突變株進(jìn)行連續(xù)傳代試驗，考察其遺傳性狀的穩(wěn)定性。連續(xù)傳代4代，每次傳代后的菌株經(jīng)培養(yǎng)以測定其產(chǎn)生的中性蛋白酶活力。其結(jié)果為(見表5)菌株NP131的產(chǎn)量較高，且遺傳特征穩(wěn)定，其中性蛋白酶的搖瓶活力穩(wěn)定在8230U/mL左右，較出發(fā)菌株提高了81.3％；而菌株NP135及NP247分別在傳三代和傳二代后生產(chǎn)性能有所改變，中性蛋白酶的產(chǎn)量迅速下降，這可能是由于回復(fù)突變的原因，因此選擇NP131作為最終應(yīng)用于生產(chǎn)上的菌株。
將最終篩選到的菌株NP131和出發(fā)菌株BS18分別于7L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵試驗，定時取樣，繪制產(chǎn)酶曲線。其結(jié)果為(見圖2)N+離子注入后菌株NP131的產(chǎn)酶曲線變化規(guī)律與出發(fā)菌株一致，說明離子注入并沒有改變NP131所產(chǎn)中性蛋白酶的產(chǎn)酶過程，兩個菌株都于9h開始產(chǎn)生中性蛋白酶，然后酶活逐漸升高，到40h時達(dá)到最大值。
7.中性蛋白酶活力的測定 采用《中華人民共和國輕工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》QB/T1805.3-93工業(yè)酶制劑通用實驗方法，即福林(Folin)法。其原理為蛋白酶在一定的溫度與pH條件下，水解酪素底物，產(chǎn)生含有酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等)，在堿性條件下，將福林試劑還原，生成鉬藍(lán)與鎢藍(lán)，用分光光度法測定，計算其酶活力。蛋白酶活力定義1mL液體酶(或1g固體酶粉)在40℃、pH7.5的條件下，1min水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸所需的酶量為一個酶活力單位，以U/mL(或U/g)來表示。
測定步驟如下 (1).配制不同濃度的酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(0、10、20、30、40、50μg/mL)，分別取不同濃度的酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1.00mL，各加0.4mol/L的碳酸鈉溶液5.00mL、福林試劑使用溶液1.00mL，置于(40±0.2)℃水浴中顯色20min，取出，用分光光度計測定其吸光度A680，以不含酪氨酸的0管為空白。以吸光度為縱坐標(biāo)，酪氨酸的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)作圖計算出當(dāng)吸光度為1時的酪氨酸的量(μg)，即為吸光常數(shù)K值，其值應(yīng)在95～100范圍內(nèi)； (2).取1mL酶液，平行作2組，置40℃水浴保溫2min； (3).一組加入0.4mol/L的三氯乙酸2mL滅活(搖勻)，并置40℃水浴保溫10min，作為空白組，另一組加入1mL酪素(搖勻)后于40℃精確保溫10min； (4).保溫時間到時，在空白組中加入1mL酪素(搖勻)，在另一組中加入三氯乙酸2mL(搖勻)終止反應(yīng)； (5).取出室溫放置10min，過濾； (6).取1mL濾液，加0.4mol/L碳酸鈉溶液5mL，福林試劑1mL于40℃顯色20min； (7).以空白為對照，于680nm波長測定OD值； (8).在標(biāo)準(zhǔn)曲線上換算成酪氨酸的濃度。
酶活力計算酶活力＝A×K×4/10×n(A-樣品平行試驗的平均吸光度、K-吸光常數(shù)、4-反應(yīng)試劑的總體積(mL)、10-反應(yīng)時間(min)、n-稀釋倍數(shù)) 測定中所需試劑的配制如下 (1).福林酚試劑50g鎢酸鈉、12.5g鉬酸鈉、350mL蒸餾水、25mL 85％的磷酸、50mL濃鹽酸放入1000mL的圓底燒瓶中，文火回流(保持微沸)10h，下冷凝器，加150g硫酸鋰、250mL蒸餾水，混合加5mL溴水脫色，直至金黃色為止，再微沸15min，驅(qū)除殘溴，冷卻，用4號耐酸細(xì)菌漏斗過濾，定容到500mL，盛于洗干凈且干燥的棕色瓶中，使用時以1∶2的比例稀釋。
(2).10g/L酪素溶液精確稱取酪素1.000g，用少量0.5mol/L氫氧化鈉溶液濕潤后，加入適量的各種適宜pH的緩沖液約80mL，在沸水浴中邊加熱邊攪拌，直至完全溶解，冷卻后，轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中，用適宜的pH緩沖溶液稀釋至刻度。此溶液在冰箱內(nèi)保存，有效期為3天。
(3).0.4mol/L碳酸鈉溶液稱取無水碳酸鈉42.4g，用水溶解并定容至1000mL。
(4).0.4mol/L三氯乙酸溶液稱取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000mL。
(5).磷酸緩沖液(pH＝7.5)稱取磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)6.02g和磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)0.5g，加水溶解并定容至1000mL。
(6).1mol/L鹽酸量取84mL濃鹽酸，用水稀釋并定容至1000mL。
(7).0.1mol/L鹽酸量取9.4mL濃鹽酸，用水稀釋并定容至1000mL。
(8).100μg/mL L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液稱取預(yù)先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g(精確至0.0002g)，用1mol/L的鹽酸60mL溶解后定容至100mL，即1mg/mL的酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液；然后吸取1mg/mL酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液10.00mL，用0.1mol/L的鹽酸定容至100mL，即得到100μg/mL L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。
培養(yǎng)基 (1).斜面培養(yǎng)基(g/L)牛肉膏5、蛋白胨10、NaCl 10、瓊脂16、pH7.0～7.2； (2).篩選培養(yǎng)基(g/L)KH2PO4 0.36、MgSO4·7H2O 0.5、ZnCl2 0.014、Na2HPO4·7H2O 1.07、NaCl 0.16、CaCl2 0.002、FeSO4 0.002、酪素4、瓊脂20； (3).種子培養(yǎng)基(g/L)牛肉膏10、蛋白胨10、NaCl 5、pH 7.0～7.2； (4).發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)豆餅粉20、玉米粉30、KH2PO4 0.5、Na2HPO44，pH自然，培養(yǎng)基用1000mL 2.5％的麩皮水配制所得。
表1原始菌株的酶活 表2出發(fā)菌株傳代試驗結(jié)果 表3N+離子注入對菌株突變率及正突變率的影響 表4中性蛋白酶高產(chǎn)菌株的誘變篩選結(jié)果 注試驗從340個菌株中進(jìn)行篩選，以上為部分試驗結(jié)果。
表5中性蛋白酶高產(chǎn)菌株穩(wěn)定性試驗結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種采用低能N+離子注入技術(shù)誘變選育中性蛋白酶高產(chǎn)菌株的方法，其特征在于其步驟是
(1).篩分出發(fā)菌株挑取一環(huán)枯草芽孢桿菌AS1.398接入種子培養(yǎng)基中，選擇酶活較高且較穩(wěn)定的菌株作為出發(fā)菌株；
(2).N+離子注入誘變將枯草芽孢桿菌出發(fā)菌株于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后立即進(jìn)行N+離子注入，將經(jīng)過N+離子注入的培養(yǎng)皿用無菌水洗脫，稀釋后涂布于牛肉膏蛋白胨平板上培養(yǎng)；
(3).篩選高產(chǎn)菌株將經(jīng)離子束注入后在牛肉膏蛋白胨平板上培養(yǎng)的菌株用無菌水洗下，適當(dāng)稀釋后涂布于酪素篩選平板上，待菌落長成后，視菌落周圍透明圈的大小挑選相對菌落小透明圈大的菌落轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)；
(4).N+離子注入誘變將菌液采用最佳注入劑量對菌株進(jìn)一步誘變篩選，挑取菌落周圍透明圈比對照株透明圈大的菌落轉(zhuǎn)接入斜面培養(yǎng)基中，待菌落長成后經(jīng)搖瓶培養(yǎng)，取發(fā)酵液用Folin法測定所產(chǎn)中性蛋白酶的活力，經(jīng)復(fù)篩得到中性蛋白酶活力大于8120U/mL的高產(chǎn)突變株；
(5).中性蛋白酶高產(chǎn)菌株的確定對以上誘變試驗中篩選得到的高產(chǎn)突變株進(jìn)行連續(xù)傳代試驗，考察其遺傳性狀的穩(wěn)定性，最終篩選到作為最終應(yīng)用于生產(chǎn)上的菌株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用低能N+離子注入技術(shù)誘變選育中性蛋白酶高產(chǎn)菌株的方法，其特征在于所述的N+離子注入條件為注入能量為30keV，注入劑量為50×1014ions/cm2，靶室真空度為10-3pa，以5s脈沖式注入，間隔為15s。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用低能N+離子注入技術(shù)誘變選育中性蛋白酶高產(chǎn)菌株的方法，其特征在于所述的菌液采用的最佳注入劑量為50×1014ions/cm2。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用低能N+離子注入技術(shù)誘變選育中性蛋白酶高產(chǎn)菌株的方法，其特征在于利用涂布平板上菌落周圍透明圈的大小來篩選高產(chǎn)菌株，所用篩選培養(yǎng)基為(g/L)KH2PO4 0.36、MgSO4·7H2O 0.5、ZnCl2 0.014、Na2HPO4·7H2O 1.07、NaCl 0.16、CaCl2 0.002、FeSO4 0.002、酪素4、瓊脂20。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種采用低能N+離子注入技術(shù)誘變選育中性蛋白酶高產(chǎn)菌株的方法，其步驟是(1)篩分出發(fā)菌株；(2)N+離子注入誘變；(3)篩選高產(chǎn)菌株；(4)N+離子注入誘變；(5)中性蛋白酶高產(chǎn)菌株的確定。本發(fā)明利用N+離子注入技術(shù)對產(chǎn)生中性蛋白酶的枯草芽孢桿菌AS1.398進(jìn)行誘變，并經(jīng)不同劑量的N+離子注入后，菌株的存活率呈典型的“馬鞍型”劑量-效應(yīng)曲線，可在最佳注射劑量50×1014ions/cm2下篩選到一株具有良好遺傳穩(wěn)定性的高產(chǎn)突變菌株，其中性蛋白酶的搖瓶活力在8230U/mL左右，較出發(fā)菌株提高了81.3％。在離子注入技術(shù)能夠應(yīng)用于中性蛋白酶高產(chǎn)菌株的誘變選育中，對微生物來說具有較高的突變率和較寬的突變譜，誘變效果好，是一種比較理想的微生物菌種選育方法。
文檔編號C12N15/01GK101182513SQ20071015028
公開日2008年5月21日 申請日期2007年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月22日
發(fā)明者路福平, 杜連祥, 敏 張, 王海寬, 玉 李, 王春霞, 王建玲, 吳雅倩 申請人:天津科技大學(xué)