專(zhuān)利名稱(chēng)：：巴氏桿菌耐藥性檢測(cè)芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本案屬于生物物質(zhì)檢測(cè)領(lǐng)域，特別涉及檢測(cè)巴氏桿菌耐藥性的芯片。背景4支術(shù)巴氏桿菌病(pasteurellosis)主要是由特定血清型的多殺性巴氏桿菌(Pasteurellosismultocida)引起畜禽共患的一種烈性傳染病。該病的發(fā)病率和死亡率很高，常給養(yǎng)殖業(yè)造成較為嚴(yán)重的損失。大量流行病學(xué)調(diào)查資料顯示，由于抗菌藥物的大量使用，導(dǎo)致巴氏桿菌細(xì)菌耐藥性普遍存在，特別是高耐藥菌林的出現(xiàn)，致使多數(shù)藥物對(duì)耐藥菌的臨床療效降低或無(wú)效。針對(duì)目前巴氏桿菌耐藥性日益增強(qiáng)的趨勢(shì)，臨床上選擇有效的抗巴氏桿菌藥物及提高對(duì)化學(xué)療法的響應(yīng)程度，要求對(duì)藥物的敏感性進(jìn)行測(cè)試。常規(guī)檢測(cè)耐藥性的方法有藥物敏感試驗(yàn)、質(zhì)粒消除試驗(yàn)、質(zhì)粒指紋圖鐠技術(shù)、基因探針、Southern-blot、PCR、RT-PCR等方法，但是這些方法只能對(duì)少量樣品進(jìn)行分析，大約需要一周的時(shí)間。目前業(yè)界在引用基因技術(shù)提高檢測(cè)效率方面作出了許多貢獻(xiàn)。已知的技術(shù)，如中國(guó)專(zhuān)利01105981.8公開(kāi)了一種檢測(cè)豬產(chǎn)毒多殺性巴氐桿菌毒素抗體的ELISA試劑盒及應(yīng)用，涉及結(jié)核分支桿菌耐藥性檢測(cè)芯片及其制作方法和應(yīng)用方法，主要是根據(jù)已知的結(jié)核分支桿菌耐利福平、異煙辨等的基因突變信息，設(shè)計(jì)相應(yīng)的結(jié)核分支桿菌耐藥性寡核苷酸探針，然后禱合成的探針固定在經(jīng)修飾的玻片上，從而構(gòu)成結(jié)核分支桿菌耐藥性檢測(cè)芯片，利用設(shè)計(jì)的相應(yīng)引物將結(jié)核分支桿菌DNA樣品擴(kuò)增并加入熒光標(biāo)記處理以后，與芯片雜交，然后用芯片信號(hào)分析系統(tǒng)掃描芯片，并對(duì)雜交信號(hào)進(jìn)行分析，獲得有關(guān)結(jié)核分支桿菌的耐藥性信息。又如中國(guó)專(zhuān)利200520119230.6公開(kāi)了一種結(jié)核桿菌基因突變型檢測(cè)芯片，涉及結(jié)核桿菌的DNA水平診斷的三項(xiàng)指標(biāo)集成檢測(cè)基因芯片和基因芯片試劑盒，所述的基因芯片包括基片和反應(yīng)區(qū)域，所述的反應(yīng)區(qū)域包括12-200個(gè)探針點(diǎn)，l-10個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品點(diǎn)。再如中國(guó)專(zhuān)利01105981.8公開(kāi)了一種結(jié)核分支桿菌耐藥性檢測(cè)芯片及其制作方法和應(yīng)用方法，主要是才艮據(jù)已知的結(jié)核分支桿菌耐利福平、異煙肼等的基因突變信息，設(shè)計(jì)相應(yīng)的結(jié)核分支桿菌耐藥性寡核苷酸探針，然后將合成的探針固定在經(jīng)修飾的玻片上，從而構(gòu)成結(jié)核分支桿菌耐藥性檢測(cè)芯片，利用設(shè)計(jì)的相應(yīng)引物將結(jié)核分支桿菌DNA樣品擴(kuò)增并加入熒光標(biāo)記處理以后，與芯片雜交，然后用芯片信號(hào)分析系統(tǒng)掃描芯片，并對(duì)雜交信號(hào)進(jìn)行分析，獲得有關(guān)結(jié)核分支桿菌的耐藥性信息。已知的技術(shù)尚沒(méi)有針對(duì)巴氏桿菌耐藥性的檢測(cè)芯片問(wèn)世。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的問(wèn)題在于，克服襲用技術(shù)存在的上述缺陷，而提供一種巴氏桿菌耐藥性檢測(cè)芯片。本發(fā)明解決技術(shù)問(wèn)題是采取以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的，依據(jù)本發(fā)明提供一種巴氏桿菌耐藥性檢測(cè)芯片，包括經(jīng)過(guò)修飾的栽玻片，該載玻片上固定一譽(yù)列寡核苷酸點(diǎn)陣探針，其中所述栽玻片為醛基修飾基片，預(yù)制合成的寡核苷酸探針點(diǎn)制于醛基修飾的玻片上，所述探針為針對(duì)磺胺耐藥基因sull、sulll、鏈霉素耐藥基因strA、strBy、氯霉素耐藥基因CatB2和四環(huán)素耐藥基因TetG及其突變基因設(shè)計(jì)的探針。本發(fā)明解決技術(shù)問(wèn)題還可以采用以下措施進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)前述的巴氏桿菌耐藥性檢測(cè)芯片，其中所述探針點(diǎn)4個(gè)一重復(fù)；每個(gè)探針長(zhǎng)度設(shè)計(jì)為15-30bp。前述的巴氏桿菌耐藥性檢測(cè)芯片，其中針對(duì)磺胺耐藥基因sulll的突變位點(diǎn)合成的探針是<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>前述的巴氏桿菌耐藥性檢測(cè)芯片，其中針對(duì)鏈霉素耐藥基因strA的突L位點(diǎn)合成的探針是<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>前述的巴氏桿菌耐藥性檢測(cè)芯片，其中合成所述探針的引物序列為<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有顯著的優(yōu)點(diǎn)和有益效果。由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明在優(yōu)異的結(jié)構(gòu)配置下，至少有如下的優(yōu)點(diǎn)本案以從巴氏桿菌中擴(kuò)增得到的磺胺耐藥基因suii、suin、鏈霉素耐藥基因strA、strBy、氯霉素耐藥基因CatB2和四環(huán)素耐藥基因TetG等6種耐藥基因?yàn)榘鸦?，?gòu)建了耐藥基因的基因檢測(cè)芯片，為巴氏桿菌耐藥基因的高通量、并行化、自動(dòng)化和快速檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。本案述及的巴氏桿菌耐藥性檢測(cè)芯片，克服了前述現(xiàn)有技術(shù)的不足，能夠針對(duì)巴氏桿菌對(duì)常用抗菌藥物產(chǎn)生的耐藥性進(jìn)行檢測(cè)和篩選，在一次反應(yīng)中進(jìn)行多種信息的平行分析。由于其在檢測(cè)中的高效率，因此要優(yōu)越于傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)檢測(cè)技術(shù)。應(yīng)用該技術(shù)將有利于巴氏桿菌病治療方案的合理安排，提高巴氏桿菌病的防治水平。因此基因芯片技術(shù)在細(xì)菌耐藥性檢測(cè)中有著巨大的應(yīng)用價(jià)值，具有廣闊的應(yīng)用前景。本發(fā)明的具體實(shí)施方式由以下實(shí)施例及其附圖詳細(xì)給出。圖1為本發(fā)明檢測(cè)芯片的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為本發(fā)明中檢測(cè)探針在芯片上的陣列示意圖；圖3為本發(fā)明的制備框圖；圖4為本發(fā)明基因芯片雜交后的掃描圖片。具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖及較佳實(shí)施例，對(duì)依據(jù)本發(fā)明提供的具體實(shí)施方式、結(jié)構(gòu)、特征及其功效，詳細(xì)說(shuō)明如后。參見(jiàn)圖1-2所示，一種巴氏桿菌耐藥性檢測(cè)芯片，包括經(jīng)過(guò)修飾的載玻片1,該載玻片上固定一系列寡核苷酸點(diǎn)陣探針2，其中所述栽玻片l為醛基修飾基片，預(yù)制合成的寡核苷酸探針點(diǎn)制于^基修飾的玻片上，每條探針點(diǎn)4個(gè)重復(fù)；每個(gè)探針長(zhǎng)度設(shè)計(jì)為15-30bp;所迷的探針為針對(duì)磺胺耐藥基因sull、sulll、鏈霉素耐藥基因strA、strBy、氯霉素耐藥基因CatB2和四環(huán)素耐藥基因TetG及其突變基因設(shè)計(jì)的探針。參見(jiàn)圖3所示，制備巴氏桿菌耐藥性檢測(cè)芯片的材料與方法1.菌種和菌抹來(lái)源巴氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌林和耐藥林為公知材料，源于中國(guó)藥品生物制品監(jiān)察所。2.巴氏桿菌菌株藥敏試驗(yàn)采用肉湯稀釋法(公知方法)進(jìn)行最小抑菌濃度(MIC)測(cè)定，試驗(yàn)操作程序及結(jié)果的判定均嚴(yán)格按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS)的新規(guī)定及標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)用菌均對(duì)磺胺、鏈霉素、氯霉素、四環(huán)素高度耐藥。3.細(xì)菌DM的制備采用標(biāo)本處理試劑盒提取DNA，置-2(TC保存?zhèn)溆谩?.引物和探針的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)巴氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和耐藥抹細(xì)菌的耐藥基因測(cè)序結(jié)果及基因庫(kù)已公布的基因序列，識(shí)別菌種間多態(tài)性位點(diǎn)，使用DNAStar及引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)通用及菌種特異性探針。根據(jù)磺胺耐藥基因sull、sulll、鏈霉素耐藥基因strA、strBy、氯霉素耐藥基因CatB2和四環(huán)素耐藥基因TetG序列多態(tài)性位點(diǎn)分布，設(shè)計(jì)特異性探針。以包含磺胺耐藥基因sulll的突變位點(diǎn)合成的探針是:<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>以包M霉素耐藥基因strA的突變位點(diǎn)合成的探針是<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>合成M針的引物序列根據(jù)巴氏桿菌基因組序列設(shè)計(jì)為:<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>5.基因芯片制備對(duì)巴氏桿菌的6個(gè)耐藥基因的常見(jiàn)基因型和突變型設(shè)計(jì)寡核苷酸探針后，進(jìn)行合成，以DMSO作為點(diǎn)樣液，采用微量點(diǎn)樣技術(shù)通過(guò)自動(dòng)點(diǎn)樣儀將事先合成好的寡核香酸探針直接點(diǎn)制于醛基修飾的玻片上。每條探針點(diǎn)4個(gè)重復(fù)。將點(diǎn)樣后的玻片進(jìn)行水合、干燥等點(diǎn)樣后處理，使DNA結(jié)合在醛基修飾的玻片上，對(duì)芯片進(jìn)^"封閉，以避免在雜交過(guò)程中的非特異性吸附。用5'端熒洗滌后，用scanarray基因芯片掃描儀掃描DNA陣列，通過(guò)GenePixPro4.0軟件分析TAMRA熒光信號(hào)的強(qiáng)度。6.基因芯片的雜交與洗滌將PCR擴(kuò)增的巴氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌抹和耐藥抹細(xì)菌的6種耐藥基因混合后，用Cy5-dUTP標(biāo)記，乙醇沉淀O.5h后溶解在20jiiL5xSSC+2g/LSDS雜交液中；將基因芯片和雜交探針?lè)謩e在95。C水浴中變性5min。將探針加在基因芯片上，用蓋玻片封片，置于42"C雜交16h,雜交后分別用lxSSC+0.03。/。SDS60'C洗滌20min;0.2xSSC37。C洗滌15min;0.05xSSC37t:洗滌15rain;超純水沖洗10次，乙醇浸泡lmin。最后放入37。C培養(yǎng)箱內(nèi)干燥。整個(gè)過(guò)程避光。7.檢測(cè)與分析采用與耙基因完全一致的探針?lè)謩e與芯片雜交，觀察芯片雜交的特異性；再用所有探針與芯片同時(shí)雜交，觀察芯片檢測(cè)的并行性。選用制備好的芯片IO張，用sull、sulll、strA、strBy、CatB2、tetA探針進(jìn)行同批次重復(fù)試驗(yàn)研究，觀察芯片檢測(cè)的重復(fù)性。用scanarray基因芯片掃描儀掃描芯片，觀察掃描結(jié)果，根據(jù)相關(guān)軟件分析Cy5熒光信號(hào)的強(qiáng)度。檢測(cè)結(jié)果是利用磺胺耐藥基因sull、sulll、鏈霉素耐藥基因strA、strBy、氯霉素耐藥基因CatB2和四環(huán)素耐藥基因TetG檢測(cè)芯片得到的結(jié)果與藥敏檢測(cè)結(jié)果的比較，檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確率為99%。鏈霉素、磺胺、氯霉素和四環(huán)素對(duì)耐藥株巴氏桿菌的MIC值(mg/L)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注PA為標(biāo)準(zhǔn)株巴氏桿菌；PB—PH為耐藥株巴氏桿菌參見(jiàn)圖4，基因芯片雜交后掃描，結(jié)果信號(hào)清晰、富有層次、且背景均勻(雜交信號(hào)較強(qiáng)的點(diǎn)陣說(shuō)明耐藥基因#序列與探針g序列互補(bǔ)，雜交信號(hào)較弱的點(diǎn)陣說(shuō)明耐藥基因序列與探針堿基序列不完全互補(bǔ)，在芯片的點(diǎn)陣中同時(shí)設(shè)有陰性對(duì)照)?；蛐酒瑨呙杞Y(jié)果經(jīng)分析與上述藥敏檢測(cè)結(jié)果相符合。寡核苷酸芯片的mi:用藥敏實(shí)驗(yàn)檢測(cè)出來(lái)的確胺耐藥野生型、鏈霉素耐藥野生型、氯霉素耐藥野生型和四環(huán)素耐藥野生型和突變型;^莫板進(jìn)行不對(duì)稱(chēng)PCR擴(kuò)增后，將擴(kuò)增產(chǎn)物混和，并和制備的芯片進(jìn)行雜交，結(jié)果顯示在不同探針的相應(yīng)位置上出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)(圖4-1、圖4-2、圖4-3、圖4-4、圖4-5)。在用野生型進(jìn)行對(duì)照時(shí)，圖4-6、圖4-7的野生型探針出現(xiàn)強(qiáng)信號(hào)。掃描結(jié)果顯示信號(hào)清晰、富有層次、且背景均勻(雜交信號(hào)較強(qiáng)的點(diǎn)陣說(shuō)明耐藥基因堿基序列與探針堿基序列互補(bǔ)，雜交信號(hào)較弱的點(diǎn)陣說(shuō)明耐藥基因序列與探針堿基序列不完全互補(bǔ)，在芯片的點(diǎn)陣中同時(shí)設(shè)有陰性對(duì)照，見(jiàn)圖4-0。應(yīng)用寡核苷酸微芯片對(duì)Hp致病性相關(guān)的基因型及耐藥基因點(diǎn)突變進(jìn)行檢測(cè)，在同一芯片上同時(shí)可獲得多種臨床需要的相關(guān)信息。經(jīng)過(guò)反復(fù)的優(yōu)化，寡核苷酸微陣列檢測(cè)時(shí)對(duì)樣品取材和保存的要求不高；可同時(shí)對(duì)多個(gè)樣品進(jìn)行檢測(cè)；具有較高的準(zhǔn)確性；寡核苷酸微芯片的制備采用了合成后交聯(lián)的方法，大大降低了成本。芯片雜交特異性高，重復(fù)性好，實(shí)現(xiàn)了6種耐藥基因的同時(shí)檢測(cè)。綜上，利用/〉知的PCR(PolymeraseChainReaction)才支術(shù)從巴氏桿菌敏感林和耐藥林中擴(kuò)增出相關(guān)耐藥基因，在基因克隆及同源性分析的基礎(chǔ)上利用分子生物學(xué)和基因芯片技術(shù)定位巴氏桿菌耐藥基因和基因突變位點(diǎn)，研制用于巴氏桿菌耐藥性檢測(cè)的基因芯片，使其能夠快速、準(zhǔn)確、高效地樸對(duì)巴氏桿菌對(duì)多種藥物產(chǎn)生的耐藥性進(jìn)行檢測(cè)和篩選，在一次反應(yīng)中進(jìn)行多種信息的平行分析，在巴氏桿菌耐藥性檢測(cè)過(guò)程中突顯優(yōu)越于傳統(tǒng)的藥理學(xué)檢測(cè)技術(shù)。以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制，凡是依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。權(quán)利要求1.一種巴氏桿茵耐藥性檢測(cè)芯片，包括經(jīng)過(guò)修飾的載玻片，該載玻片上固定一系列寡核苷酸點(diǎn)陣探針，其特征在于所述載玻片為醛基修飾基片，預(yù)制合成的寡核苷酸探針點(diǎn)制于醛基修飾的玻片上，所述探針為針對(duì)磺胺耐藥基因sulI、sulII、鏈霉素耐藥基因strA、strBy、氯霉素耐藥基因CatB2和四環(huán)素耐藥基因TetG及其突變基因設(shè)計(jì)的探針。2.如權(quán)利要求1所述的巴氏桿菌耐藥性檢測(cè)芯片，其特征在于所述探針點(diǎn)4個(gè)一重復(fù)；每個(gè)探針長(zhǎng)度設(shè)計(jì)為15-30bp。3.如權(quán)利要求1或2所述的巴氏桿菌耐藥性檢測(cè)芯片，其特征在于針對(duì)磺胺耐藥基因sulll的突變位點(diǎn)合成的探針是<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table>4.如權(quán)利要求3所述的巴氏桿菌耐藥性檢測(cè)芯片，其特征在于針對(duì)鏈;素耐藥基因strA的突變位點(diǎn)合成的探針是<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table>5.如權(quán)利要求1、2、4之一所述的巴氏桿菌耐藥性檢測(cè)芯片，其特征在于合成所述探針的引物序列為探針號(hào)序列Pi:5'-GGATCCGCCCCCATGTCGCTC-3'P2:5'-AAGCTTCAATAAATCTCTTGC陽(yáng)3'P3:5'-GGATCCGCCCCCATGAATAAATCGCTC-3'P3:5'-GGATCCGCCCCCATGAATAAATCGCTC-3'P4:5'-AAGCTTGTGCAGTTAACGAATTCTTGC-3'P5:5'-GGATCCGCCCCCATGAATAAATCGCTC-3'P6:5'-AAGCTTGTGCAGTTAACGAATTCTTGC-3'P7:5'-GGATCCATGTTCATGCCG-3'P8:5'-AAGCTTGATATCAAGCGA-3'P9-5'-GGATCCTACAGGCTAGCA-3'5'-AAGCTTAAAATTTGTACC-3'P11:5'-GGATCCTTAAATTGG-3'P,2:5'-AAGCTTGGCGTCGAG-3'全文摘要一種巴氏桿菌耐藥性檢測(cè)芯片，涉及檢測(cè)巴氏桿菌耐藥性的芯片。它包括經(jīng)過(guò)修飾的載玻片，該載玻片上固定一系列寡核苷酸點(diǎn)陣探針，其中載玻片為醛基修飾基片，預(yù)制合成的寡核苷酸探針點(diǎn)制于醛基修飾的玻片上，探針為針對(duì)磺胺耐藥基因sulI、sulII、鏈霉素耐藥基因strA、strBy、氯霉素耐藥基因CatB2和四環(huán)素耐藥基因TetG及其突變基因設(shè)計(jì)的探針。本案以從巴氏桿菌中擴(kuò)增得到的耐藥基因?yàn)榘谢?，?gòu)建了耐藥基因的基因檢測(cè)芯片，為巴氏桿菌耐藥基因的高通量、并行化、自動(dòng)化和快速檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101186946SQ20071015023公開(kāi)日2008年5月28日申請(qǐng)日期2007年11月20日優(yōu)先權(quán)日2007年11月20日發(fā)明者劉海學(xué),偉張,李向陽(yáng),武迎紅,段縣平,毛景東,程漢良,金天明申請(qǐng)人:天津農(nóng)學(xué)院