專利名稱：植物葉際微生物基因組dna提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及植物葉際微生物基因組DNA提取方法。
背景技術(shù)：
植物地上部分(包括葉、莖、花、果等)的表面和內(nèi)部存在有大量的各種類型的微生物。 這些在葉際生存的微生物稱為葉際微生物。這些葉際微生物既有阻礙植物生長(zhǎng)、發(fā)育的病原 微生物，又有拮抗病原物的生防微生物，還有固氮作用和對(duì)葉面農(nóng)藥殘留有降解作用的微生 物，而更多的是尚不明確其生態(tài)功能的微生物，因此研究葉際微生物的群落既可以了解葉際 微生物的生態(tài)功能，又可能篩選出環(huán)境友好的微生物資源，為綠色農(nóng)業(yè)的發(fā)展和環(huán)境保護(hù)提 供依據(jù)，具有重要的理論意義和實(shí)際意義。
過(guò)去對(duì)葉際微生物的研究主要采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法。而基于純培養(yǎng)的傳統(tǒng)方法得到的微 生物只占到環(huán)境中總微生物數(shù)量的0.1-10%,只能獲得一小部分微生物群落的信息。最近，一 些研究人員利用PCR-DGGE，基因克隆文庫(kù)技術(shù)等分子生物學(xué)方法研究不同生境的微生物群 落的特征。這些技術(shù)都是建立在獲得高質(zhì)量基因組DNA之上的。目前用于提取其它環(huán)境中 (如土壤、活性污泥、植物根際、水體)基因組DNA方法較多，但是由于利用分子生物學(xué) 方法對(duì)植物葉際微生物的研究在國(guó)內(nèi)外才剛剛起步，因此關(guān)于葉際微生物DNA提取的方法 還不成熟。葉際微生物基因組DNA的提取是研究葉際微生物的前提和基礎(chǔ)，這就需要我們 尋找一種快速、有效、經(jīng)濟(jì)適用的葉際微生物基因組DNA提取的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)植物葉際微生物這一類特殊樣品，提供一種新的、高效、快速， 可用于直接PCR擴(kuò)增的植物葉際微生物基因組DNA提取方法，滿足對(duì)不同植物葉際微生物 群落結(jié)構(gòu)研究的需要。
所述的植物葉際微生物基因組DNA的提取方法，其包括以下步驟
1、 葉際微生物與植物葉片的分離將植物葉片樣品置于三角瓶中，浸泡在滅菌的磷酸鹽緩沖 液中，緩沖液中加有少量表面活性劑，搖床震蕩處理10—30分鐘，然后用超聲波處理2 一8min，使葉片上附生的微生物與葉片分離。
2、 菌體收集從三角瓶中取出植物葉子(無(wú)菌操作)，將菌懸液裝入無(wú)菌的離心管，8000 Xg 離心10分鐘收集菌體，棄上清。
3、 菌體洗滌將收集好的菌體用0.1%的焦磷酸鈉溶液和洗滌緩沖液分別洗滌兩次，最后
8000 Xg離心10分鐘收集菌體。
4、 菌體裂解釋放DNA:將菌體沉淀重懸于裂解緩沖液中，加入溶菌酶至終濃度10mg/mL， 37'C水浴處理30分鐘，每隔10分鐘上下顛倒混勻液體。再加入蛋白酶K至終濃度5 mg/mL, 37。C水浴處理30分鐘，每隔10分鐘上下顛倒混勻液體；最后加SDS至終濃度3 %， 6(TC水浴處理2小時(shí)，每隔IO分鐘上下顛倒混勻液體。
5、 抽提蛋白將裂解后的溶液9000 Xg離心10分鐘，取上清，加等體積的氯仿抽提至蛋 白層消失，取上層水相。
6、 沉淀基因組DNA:向上層水相中加入0.6倍體積異丙醇，一2(TC放置2小時(shí)或室溫過(guò)夜， 12000 Xg離心30分鐘，收集DNA沉淀。
7、 溶解DNA沉淀DNA沉淀用75。/。的乙醇洗滌一次，自然干燥，然后用50 mL TE緩沖 液溶解，并加入l pL濃度為l嗎/mL的RNase，即得到高質(zhì)量、可直接用于PCR擴(kuò)增 的葉際微生物基因組DNA。
所述的植物葉際微生物基因組DNA的提取方法中，其所述第1步中磷酸鹽緩沖液的成 分為100 mmol/L NaH2P04- Na2HP04緩沖液，其pH值為7.0;
所述的植物葉際微生物基因組DNA的提取方法中，其所述第1步中超聲波的工作頻率 為40 KHz;
所述的植物葉際微生物基因組DNA的提取方法中，其所述第3步中洗滌緩沖液的成分 為0.33 mol/L Tris-HCl (pH 8.0), 1 mmol/L EDTA (pH 8.0)， 100 mmol/ NaCl, 20 mg/mL PVP(聚 乙烯吡咯垸酮；
所述的植物葉際微生物基因組DNA的提取方法中，其所述第4步中裂解緩沖液的成分 為lOOmmol/LTris-HCl, 100mmol/L EDTA, 1.5 mol/LNaCl, 1% CTAB， pH 8.0;
所述的植物葉際微生物基因組DNA的提取方法中，其所述第7步中TE緩沖液的成分為 10畫ol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA ， pH 8.0;
采用本發(fā)明的方法可以得到高質(zhì)量片斷大小大于21kb的植物葉際微生物基因組DNA樣 品。不需要用試劑盒純化可直接用于PCR擴(kuò)增，用作DGGE、 SSCP以及基因文庫(kù)構(gòu)建等分 子生態(tài)學(xué)研究。


附圖1是DNA的瓊脂糖電泳圖譜，其中的Marker是人噬菌體DNA經(jīng)Hindm限制型內(nèi) 切酶酶切后的電泳圖譜；1-5泳道分別為下面兩個(gè)實(shí)施例的基因組DNA提取實(shí)施例的效果圖。
附圖2是提取的葉際微生物基因組DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后實(shí)施例的效果圖。M為DL2000 標(biāo)準(zhǔn)分子量圖譜。l-5泳道分別為菠菜葉際DNA、芹菜葉際DNA、黃瓜葉經(jīng)氯氰菊脂處理后 2天、6天和12天的葉際DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后電泳圖。
以下通過(guò)具體實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明發(fā)明的實(shí)施，目的在于幫助讀者更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)， 但不作為對(duì)本發(fā)明實(shí)施范圍的限定。
實(shí)施例1:
在北京某蔬菜基地分別采集菠菜葉和芹菜葉樣品，提取其葉際微生物基因組DNA。分別 取IO克葉子放入200ml滅菌的磷酸鹽緩沖液中，經(jīng)震蕩培養(yǎng)和超聲波處理后收集菌體，0.1% 焦磷酸鈉溶液和洗滌緩沖液洗滌菌體，然后分別經(jīng)溶菌酶、蛋白酶和SDS裂解，其基因組 DNA的提取結(jié)果見(jiàn)附圖1第1-2泳道。
實(shí)施例2:
在北京某蔬菜基地用氯氰菊脂噴灑黃瓜葉子表面，分別取施藥后第2天、6天和12天的 黃瓜葉子，提取經(jīng)氯氰菊脂處理后的黃瓜葉子微生物基因組DNA。分別取10克葉子放入200 mL滅菌的磷酸鹽緩沖液中，經(jīng)震蕩培養(yǎng)和超聲波處理后收集菌體，焦磷酸鈉和洗滌緩沖液洗 滌菌體，然后分別經(jīng)溶菌酶、蛋白酶和SDS裂解，其基因組DNA的提取結(jié)果見(jiàn)附圖1第3-5 泳道。
通過(guò)PCR擴(kuò)增來(lái)驗(yàn)證葉際微生物基因組DNA提取的效果。將提取的總基因組DNA用 TE溶解后直接用于16S rDNA V3區(qū)的PCR擴(kuò)增取得了很好的效果，具體實(shí)施方案如下
以提取的基因組DNA為模板，引物為338f(5，-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')與518r (5，-ATTACCGCGGCTGCTGG-3 ，)擴(kuò)增16S rDNA V3區(qū)的片斷。
50 pl的PCR反應(yīng)體系組成如下模板IO ng、每種引物30 pmol、 dNTPs (每種IO mmol/L)、 10xPCRbuffer5nl、 MgCl2 2 mmol/L、 TaqDNA聚合酶3U，適量的雙蒸水補(bǔ)足至 50 nl。 PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性條件為92。C 3 min， 92。C變性l min， 55。C退火l min和72。C延伸 lmin,共30個(gè)循環(huán)，最后在72'C下延伸10min。 PCR反應(yīng)的產(chǎn)物用1.2M瓊脂糖凝膠電泳檢領(lǐng)！(。 結(jié)果見(jiàn)圖2。圖2中可以看出擴(kuò)增的特異性很強(qiáng)，沒(méi)有雜帶，所有提取的DNA都能成功的擴(kuò)增 出目的片斷。
權(quán)利要求
1.一種可直接用于PCR擴(kuò)增的植物葉際微生物基因組DNA的提取方法，其特征在于，提取步驟包括將植物葉片樣品浸泡在滅菌的磷酸鹽緩沖液中，搖床震蕩處理10—30min，然后用超聲波處理2—8min，使葉片上附生的微生物與葉片分離；離心收集菌體，用0.1％的焦磷酸鈉和洗滌緩沖液分別洗滌兩次；裂解液中分別加入溶菌酶、蛋白酶K和十二烷基硫酸鈉處理，使菌體裂解釋放出DNA；然后經(jīng)氯仿抽提蛋白，異丙醇沉淀即得到高質(zhì)量的可直接用于PCR擴(kuò)增的植物葉際基因組DNA。
2. 權(quán)利要求1所述的植物葉際微生物基因組DNA提取方法，其特征在于，磷酸鹽緩沖液的 成分為100 mmol/L NaH2P04- Na2HP04緩沖液，其pH值為7.0。
3. 權(quán)利要求1所述的植物葉際微生物基因組DNA提取方法，其特征在于，洗滌緩沖液的成 分為0.33mol/LTris-HCl， lmmol/LEDTA， 100 mmol/NaCl， 20 mg/mL聚乙烯吡咯烷酮， 其pH值為8.0。
4. 權(quán)利要求1所述的植物葉際微生物基因組DNA提取方法，其特征在于，分別用溶菌酶和 蛋白酶K處理菌懸液各30分鐘，溶菌酶和蛋白酶K的終濃度分別為10 mg/mL和5 mg/mL。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種可用于PCR擴(kuò)增的植物葉際微生物基因組DNA提取方法。將葉子樣品浸泡在滅菌的磷酸鹽緩沖液中，經(jīng)恒溫?fù)u床震蕩和超聲波處理使葉際微生物與植物葉子分離，收集好的菌體用0.1％的焦磷酸鈉和洗滌緩沖液分別洗滌，然后依次用適量的溶菌酶、蛋白酶K和SDS處理，裂解細(xì)胞使DNA釋放出來(lái)，最后經(jīng)氯仿抽提蛋白，異丙醇沉淀即得到高質(zhì)量的可直接用于PCR擴(kuò)增的植物葉際基因組DNA。
文檔編號(hào)C12P19/00GK101372703SQ20071012051
公開(kāi)日2009年2月25日 申請(qǐng)日期2007年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月21日
發(fā)明者玲 唐, 張保國(guó), 張洪勛, 杜方舟, 白志輝, 谷立坤 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心