專利名稱：G－csf受體興奮劑抗體及其篩選方法
相關(guān)申請本申請是申請?zhí)枮?9805606.5，申請日為1999年04月30日，名稱為“G-CSF受體興奮劑抗體及其篩選方法”的中國發(fā)明專利申請的分案申請。
背景技術(shù)：
骨髓中血細(xì)胞生長，分裂及分化過程稱為造血過程(Dexter，T.M.及Spooneer，E.，細(xì)胞生物學(xué)年鑒，3423，1987)。有許多不同類型的血細(xì)胞屬于可區(qū)別細(xì)胞譜系。各不同血細(xì)胞類型源自多能干細(xì)胞，其可進行自我更新，或生成祖先細(xì)胞而得分化成所有不同的成熟細(xì)胞型?；铙w內(nèi)一般細(xì)胞有三種型式紅血球細(xì)胞，血小板及白血球細(xì)胞，大多數(shù)白血球細(xì)胞參與宿主免疫防御反應(yīng)。
造血前體細(xì)胞的增生及分化由一個細(xì)胞因子家族調(diào)節(jié)，含集落刺激因子(CSFs)及白細(xì)胞介素(Arai，K-I.，等人，Annu.Rev.Biochem.1990，59783-836)。至少四種細(xì)胞因子涉及產(chǎn)生嗜中性白血球及巨噬細(xì)胞，即白細(xì)胞介素-3(IL-3)，粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)及巨噬細(xì)胞刺激因子(M-CSF)。其中，G-CSF專一作用于限于嗜中性白血球粒細(xì)胞譜系的細(xì)胞(Demetri，G.D.，and Griffin，J.D.，Blood，1991，782791-2808)。G-CSF于活體內(nèi)的主要生物作用為從指定的祖先細(xì)胞增加嗜中性白血球的增生及分化(Cohen，A.M.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1987，842484-2488)。G-CSF也可促進成熟嗜中性白血球的遷移，存活及功能，包括增加吞噬細(xì)胞活性及抗微生物的殺傷性(Crawford，J.，等人，N.Engl.J.Med.，1991，325164-170，Moore，M.A.S.，Annu.Rev.Immunol.1991，9159)。此生理過程可作為關(guān)鍵性宿主防御系統(tǒng)的基礎(chǔ)且可于活體內(nèi)大規(guī)模發(fā)生。
市售重組人類G-CSF(Neupogen，Amgen，Inc.)于活體內(nèi)的半壽期僅為3.5小時，且應(yīng)每日用藥以維持臨界值量的G-CSF以刺激嗜中性白血球的生成(Physician’s Desk Reference，53rd，1999，532-537)。高劑量重組人類粒細(xì)胞集落刺激因子(″rhG-CSF″)療法的主要副作用為骨疼痛，很可能是因注射后活體內(nèi)rhG-CSF瞬時量過高；然而，此較不常發(fā)生于接受低劑量rhG-CSF的病人。
已研發(fā)各種方法以延長rhG-CSF的活體內(nèi)半壽期，包括偶合以聚乙二醇(PEG)。然而，一個近來報導(dǎo)指出PEG偶合物較未修飾蛋白質(zhì)活性為低，因偶合至蛋白質(zhì)的PEG組域分子量與活體外活性有反關(guān)連。參見BowenS.，等人，Exp.Hemat.，1999，27425-432。此外，動物研究的數(shù)據(jù)指出rhG-CSF偶合以PEG可延長半壽期至1～3天，但不超過此。
與PEG偶合至rhG-CSF相反，單克隆抗體(″mAb″)的活體內(nèi)半壽期約為2-3周，是視抗體同種型而定。預(yù)期單次注射入抗人體粒細(xì)胞集落刺激因子受體的興奮劑抗體可提供粒細(xì)胞集落刺激因子樣活性數(shù)周。因此，化療及嚴(yán)重慢性嗜中性白血球減少癥的病人將受益于此，因興奮劑單克隆抗體的較長生物活性而降低到醫(yī)院次數(shù)。此外，血液循環(huán)中興奮劑抗體的持久水平可持續(xù)刺激嗜中性白血球祖先細(xì)胞的增生及分化，而表現(xiàn)較高潛力，造成低劑量用量且降低Neupogen或其它rhG-CSF衍生物的副作用。
各種G-CSF作用是由經(jīng)其2個分離結(jié)合位結(jié)合G-CSF至其受體，形成1∶2配體/受體復(fù)合物而引發(fā)。此粒細(xì)胞集落刺激因子受體，在嗜中性粒性白血球的祖先細(xì)胞及在成熟的定形細(xì)胞上表達，是屬于細(xì)胞因子/造血受體的超家族。雖然多數(shù)此家族成員，包括白細(xì)胞介素-2(IL-2)至白介素-7(IL-7)的白介素受體及GM-CSF，是由形成含α，β，及有時甚至γ亞基的雜聚復(fù)合物而活化，粒細(xì)胞集落刺激因子受體蛋白質(zhì)，由單鏈多肽組成，已知可由配體結(jié)合形成同二聚復(fù)合物(Fukunaga，R.，等人，J.Bio.Chem.，1990，26514008)。
已知G-CSF受體的同二聚化為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)所必需(Wells，J.A.，and Vos，A.M.，Annu.Rev.Biochem.，1996，65609)。G-CSF受體不含內(nèi)部蛋白激酶功能域，雖然酪氨酸激酶活性為轉(zhuǎn)導(dǎo)粒細(xì)胞集落刺激因子信號所必需。由G-CSF誘導(dǎo)的受體同型二聚化導(dǎo)致的G-CSF受體活化信號可由非共價結(jié)合各種酪氨酸激酶來介導(dǎo)，如JAK1及JAK2(Barge，R.M.Y.，等人，Blood，1996，872148-2153)，隨后磷酸化轉(zhuǎn)錄因子Stats如Stat3及Stat5(Tian，S-S.，等人，Blood，1994，841760-1764；Watowich，S.S.，等人，Annu.Rev細(xì)胞Dev.Biol.，1996，1291；Dong F.，等人，J.Immunol.，1998，1616503-6509)。這些酪氨酸激酶為G-CSF受體磷酸化及與G-CSF反應(yīng)的Stat活化所必需(Tian S-S.等人，blood，1996，884435-4444；Shimoda，K.，等人，Blood，1997，90597-604)。
除了G-CSF受體，但紅細(xì)胞生成素(″EPO″)受體，生長激素(″GH″)，催乳素受體(″PRL″)及血小板生成素(″TPO″)也顯示可由配體引發(fā)受體同二聚化，造成特定激酶磷酸化而觸發(fā)(Youssoufian，H.，等人Blood，1993，812223；Alexander，W.S.，等人，EMBO，1995，145569；Heldin C.H.，Cell，1995，83213)。因此，本發(fā)明公開的篩選方法，是用以篩選粒細(xì)胞集落刺激因子受體興奮劑，它基于其引起經(jīng)同型二聚體化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及攜帶受體的細(xì)胞的增生，該方法也可用以篩選針對其它受體的興奮劑。
發(fā)明概要本發(fā)明是關(guān)于對粒細(xì)胞集落刺激因子受體及其它同二聚化細(xì)胞因子受體有反應(yīng)力的興奮劑分子，其是借結(jié)合至此受體或與其相互作用，起著與配體相同的生物學(xué)作用。本發(fā)明包括興奮劑分子，其可結(jié)合2個細(xì)胞因子受體蛋白質(zhì)或與其相互作用，更優(yōu)選的是，與2個相同細(xì)胞因子受體蛋白質(zhì)，如2個G-CSF受體蛋白質(zhì)結(jié)合或相互作用。此興奮劑分子含整個抗體分子，包括多克隆及單克隆抗體，及修飾或其衍生物，含免疫球蛋白片段如Fab，scFv及雙價F(ab’)2，及可引起與天然G-CSF相同或類似興奮劑效應(yīng)的同源物或其類似物。此興奮劑抗體及片段可源自動物，人-小鼠嵌合體，人源化，去免疫化抗體或全部源自人。
在優(yōu)選的實施方案中，G-CSF受體興奮劑可刺激表達G-CSF受體的細(xì)胞生長及/或分化。其是由結(jié)合自G-CSF受體細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，將G-CSF受體二聚化及/或?qū)⑴cG-CSF受體相關(guān)激酶活化磷酸化。此表達G-CSF受體的細(xì)胞一般含原始干細(xì)胞/造血祖先細(xì)胞，因此興奮劑可促進原始造血細(xì)胞分化及/或增生導(dǎo)至嗜中性粒性白血球譜系的細(xì)胞再生。
本發(fā)明另一領(lǐng)域是關(guān)于篩選同二聚化細(xì)胞激素受體興奮劑的方法，如G-CSF受體興奮劑抗體，使用活體外細(xì)胞分析系統(tǒng)。如下述，將細(xì)胞轉(zhuǎn)染以G-CSF受體，或G-CSF受體部份當(dāng)結(jié)合興奮劑后可被活化，細(xì)胞可于存在興奮劑分子下臨測其增生。
本發(fā)明也關(guān)于使用此興奮劑，含興奮劑抗體，用于診斷及治療。此雜交瘤產(chǎn)生興奮劑抗體命名為單克隆抗體mAb163-93及單克隆抗體mAb174-74-11，存于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，10801UniversityBlvd.，Manassas，VA20110-2209，地址美國，弗吉尼亞州，馬那賽斯，保藏日期均為1999.4.29，保藏號碼為HB12699，分類命名為mAb163-93；保藏號碼為HB12700，分類命名為mAb174-74-11。此雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生單克隆抗體，其有G-CSF受體興奮劑活性，已存于ATCC且保藏號碼為HB-12524，保藏日期為1998.4.29，分類命名為mAb163-126。
附圖的簡要說明

圖1A顯示由MTT分析得知親代鼠細(xì)胞32D-c123的增生可由重組小鼠IL-3激活，但不被重組人類G-CSF(R&D Biosystems)激活。
圖1B顯示32D-c123用完整人類G-CSF受體轉(zhuǎn)染，由MTT分析得知轉(zhuǎn)染的D4細(xì)胞可分別被重組小鼠IL-3及重組人類G-CSF(R&D Biosystems)激活。
圖1C顯示轉(zhuǎn)染株D4細(xì)胞當(dāng)生長于培養(yǎng)液含重組小鼠IL-3或重組人類G-CSF但不含對照單克隆抗體mAb時，對3H-胸腺嘧啶的吸收以濃度依賴形式增加。
圖2顯示以重組人類G-CSF引發(fā)完整長度人類G-CSF受體轉(zhuǎn)染的D4細(xì)胞的JAK1激酶的酪氨酸磷酸化。相同JAK1激酶的酪氨酸磷酸化基至于存在重組人類G-CSF(R&D Biosystems)下，仍無法在親代細(xì)胞32D-c123測得。正對照組中，人類G-CSF細(xì)胞AML-193(ATCC，保藏號碼為CRL-9589)其表達基本人類G-CSF受體，也顯示JAK1激酶的酪氨酸磷酸化可由重組人類G-CSF刺激而引發(fā)。IP免疫沉淀圖中的抗體。印跡監(jiān)測以HRP-偶合抗體。抗pTyr抗磷酪氨酸抗體4G10(Upstate Biotechnology，LakePlacid，NY)。
圖3為由ELISA顯示結(jié)合單克隆抗體mAb163-93至G-CSF受體/IgG4(Fx)嵌合體蛋白質(zhì)。人類G-CSF受體/IgG4(Fc)被山羊抗人IgG(Fc)抗體被覆于Immulon 2平板而捕捉。結(jié)合小鼠抗體mAb163-93至人類G-CSF受體/IgG4(Fc)嵌合體蛋白質(zhì)可由結(jié)合山羊抗-鼠IgG(Fc)抗體偶合以HRP而監(jiān)測。
圖4A顯示單克隆抗體mAb163-93，但非異形對照單克隆抗體mAb G3-519，對完整人類G-CSF受體轉(zhuǎn)染小鼠細(xì)胞D4的結(jié)合百分比，由FACS分析知以濃度依賴形式增加。圖4B顯示單克隆抗體mAb163-93可專一結(jié)合至小鼠細(xì)胞D4表達完整人類G-CSF受體，并不結(jié)合至親代細(xì)胞32D-c123，由細(xì)胞結(jié)合百分比所示。
圖5A及5B顯示人類G-CSF受體轉(zhuǎn)染小鼠細(xì)胞D4的增生可由各種小鼠單克隆興奮劑抗體激活，含單克隆抗體mAb163-93及單克隆抗體mAb174-74-11，其是由MTT分析測得。同種型匹配的單克隆抗體mAb G3-519抗HIV-gpt120及重組人類G-CSF(R&D Biosystems)各為負(fù)及正對照。
圖5C顯示單克隆抗體，含單克隆抗體mAb163-93及單克隆抗體mAb174-74-11，可刺激人類G-CSF受體轉(zhuǎn)染小鼠細(xì)胞D4的增生，以3H-胸腺嘧啶嵌入量增加表示。
圖6A及6B顯示激酶JAK2(圖6A)及轉(zhuǎn)錄因子(圖6B)的酪氨酸磷酸化，在人類G-CSF受體轉(zhuǎn)染小鼠細(xì)胞D4刺激以細(xì)胞因子重組小鼠IL-3，重組人類G-CSF，及興奮劑單克隆抗體mAb163-93。
圖7A及7B顯示由人類G-CSF生成的量分析圖7A重組人類G-CSF及小鼠單克隆抗體mAb163-93(對照單克隆抗體mAbG3-519為單克隆抗體mAb163-93同種型抗體)及圖7B其它小鼠興奮劑單克隆抗體。
圖8顯示人類骨髓生成嗜中性粒性集落是刺激以8A單克隆抗體mAbG3-519的異形對照；8B重組人類G-CSF(R&D Biosystems)；8C興奮劑單克隆抗體mAb163-938D8C中集落當(dāng)以細(xì)胞染色后的細(xì)胞外形。
圖9顯示小鼠單克隆抗體mAb163-93可以濃度依賴形式激活黑猩猩骨髓形成粒細(xì)胞集落。
圖10顯示黑猩猩骨髓生成嗜中性粒性集落是刺激以10A同種型單克隆抗體G3-519(濃度50微毫摩爾)10B重組人類G-CSF(R&D Biosystems)(濃度0.5微毫摩爾)；10C興奮劑單克隆抗體mAb163-93(濃度5微毫摩爾)10DC中集落當(dāng)以細(xì)胞染色后的細(xì)胞外形。
圖11顯示抗人類G-CSF受體的興奮劑單克隆抗體mAb163-93可刺激小鼠細(xì)胞NFS60表達內(nèi)質(zhì)小鼠G-CSF受體的增生。
所列序列的說明SEQ ID號碼1～6為各種引物用于克隆G-CSF受體。
SEO ID號碼7～14為各種引物用于克隆本發(fā)明二個興奮劑抗體的變化區(qū)域。
SEO ID號碼15～26為本發(fā)明二個興奮劑抗體的CDR的氨基酸序列(輕鏈及重鏈)。
SEO ID號碼27為人類G-CSF受體細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。
制備本發(fā)明及其用途1.制備本發(fā)明興奮劑此處所述G-CSF受體興奮劑宜為G-CSF受體于細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的標(biāo)的表位。興奮劑例子含由雜交瘤細(xì)胞株163-93及174-74-11生的單克隆抗體。
本發(fā)明單克隆興奮劑抗體可由免疫化及融合產(chǎn)生(參見下文實施例4)，或由單離淋巴瘤細(xì)胞使用EBV轉(zhuǎn)形，或由人類G-CSF受體轉(zhuǎn)染昆蟲或動物細(xì)胞。興奮劑抗體宜為嵌合體，去免疫化抗體，人源化或人類抗體以臨床用途。此抗體可降低免疫性而避免人抗小鼠(HAMA)抗體反應(yīng)。宜為抗體IgG4，IgG2或其它基因突變IgG或IgM，其不擴大抗體依賴細(xì)胞毒性(S.M.Canfield及S.L.Morrison，J.Exp.Med.，19911731483-1491)及補體活化細(xì)胞分解(Y.Xu等人，J.Biol.Chem.，19942693468-3474；V.L.Pulito等人，J.Immunol.，1996；1562840-2850)。
嵌合抗體可由熟知的重組DNA方法產(chǎn)生，且有動物變化區(qū)域及人共同區(qū)域。人抗體較嵌合體抗體具有較高程度的人肽序列。在人抗體中，僅補體決定區(qū)域(CDRs)，其負(fù)責(zé)抗原結(jié)合及專一性，源自動物及含胺基酸序列相對于動物抗體，及幾近所有分子剩余部份(除某些例子中，在變化區(qū)域主干的小部份)源自人及相對于人抗體的氨基酸序列。參見L.Riechmann等人，Nature，1988；332323-327；G.Winter，美國專利號5,225,539；C.Queen等人，美國專利號5,530,101。
去免疫化抗體為抗體其中已除去T及B細(xì)胞的表位，如世界專利申請書PCT/GB98/01473所述。其當(dāng)投予活體內(nèi)時并無或免疫性顯著降低。
人抗體可由數(shù)法制得，含使用人免疫球蛋白表達文庫(StratageneCorp.，La Jolla，California)產(chǎn)生人抗體的片段(VH，VL，F(xiàn)v，F(xiàn)d，F(xiàn)ab，或F(ab’)2)，及使用此片段以構(gòu)建完整人抗體，是使用似產(chǎn)生嵌合抗體的技術(shù)。也可由轉(zhuǎn)基因小鼠與人免疫球蛋白染色體產(chǎn)生人抗體。此小鼠可得自Abgenix，Inc.，F(xiàn)remont，California，及Medarex，Inc.，Annandale，New Jersey。
所有完整及部份人抗體的免疫性較完整鼠類單克隆抗體mAbs低。雙價片段(也用于本發(fā)明)免疫性也較低。因此所有此型抗體較不會引發(fā)人的免疫反應(yīng)。同時，其較完整動物抗體更適于活體內(nèi)投予至人，尤以需重復(fù)或長期投予者，也在本發(fā)明興奮劑抗體所預(yù)期。
另一投予抗體至病人為由基因療法產(chǎn)生本質(zhì)興奮劑抗體。DNA序列編碼興奮劑抗體，其片段，衍生物或其類似物可由活體內(nèi)以基因療法傳遞，含腺病毒，AAV或反轉(zhuǎn)錄病毒，或非載體傳遞系統(tǒng)。表達興奮劑抗體，其片段，衍生物或其類似物可有額外優(yōu)點用于臨床治療慢性嗜中性白血球減少癥。
此處興奮劑分子也含小分子，如肽或有機化合物其可專一結(jié)合或反應(yīng)與G-CSF受體，造成其同二聚化及活化。此小分子也顯示較低免疫性。
人類G-CSF受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(本發(fā)明中用以產(chǎn)生抗體抗人類G-CSF受體)可使用熟知的分子重組DNA方法產(chǎn)生。細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域于成熟人類G-CSF受體中，由N端的1-603氨基酸基(SEQ ID號碼27)。參見美國專利號5,589,456；5,422,248；5,574,136。然而，也可使用純化或部份純化形式的人類G-CSF受體細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域為免疫原。
人類G-CSF受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域可直接作為免疫原以免疫動物(如小鼠)，或可先融含以載體分子以于免疫前增加其免疫性。適當(dāng)載體分子含肽，如Tag，F(xiàn)lag，白胺酸-拉鏈，或蛋白質(zhì)如麩胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)，堿磷酸酶(AP)，或免疫球蛋白的共同區(qū)域(如下用以制備興奮劑抗體)。載體分子可由重組DNA方法偶合至G-CSF。除了增強免疫性，此嵌合體蛋白質(zhì)含G-CSF受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域也可助于純化抗原，其中使用親合層析。此DNA片段編碼此抗原含此G-CSF受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域可置于表達載體，其可轉(zhuǎn)染至寄主細(xì)胞，如E.coli，酵母菌，昆蟲細(xì)胞，及動物細(xì)胞，含COS細(xì)胞，中國田鼠子宮(CHO)細(xì)胞或黑瘤細(xì)胞。此法產(chǎn)生抗原可由通常方法純化。
適當(dāng)免疫原含天然或野生型G-CSF受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，含取代，刪除或嵌入，由人工或天然產(chǎn)生。細(xì)胞表達G-CSF受體或其類似物也可作為免疫原。此細(xì)胞含原人類細(xì)胞及細(xì)胞株如AML-193，人類或小鼠細(xì)胞(或任意昆蟲細(xì)胞使用baculovirus為表達載體)轉(zhuǎn)染以載體以表達完整或部份G-CSF受體，或嵌合體蛋白質(zhì)含G-CSF受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(Takhashi，T.，等人，J.Biol.Chem.1996，27117555-17560)。
為產(chǎn)生興奮劑抗體抗G-CSF受體(多株或單株)，可使用此處的抗原以致免疫嚙齒類動物(例如老鼠，白鼠，黃金鼠及天竺鼠)或其它動物，例如免子，山羊，綿羊，非人的靈長類，或基因轉(zhuǎn)形小鼠表達人免疫球蛋白及移植以人的B淋巴細(xì)胞或人骨髓至嚴(yán)重結(jié)合免疫不足(SCID)小鼠，是由常用方法達到。雜交瘤可由常用方法由融合已免疫動物的B淋巴細(xì)胞以黑瘤細(xì)胞而得(例如Sp2/0及NSO)，如G.Kohler及C.Milstein(Nature，1975256495-497)所述。抗G-CSF受體的抗體也可由噬菌體表達系統(tǒng)，由篩選人B淋巴細(xì)胞或人骨髓的重組單鏈Fv或Fab文庫而得(Hoogenboom及Winter，J.Mol.Biol.，1991，227381；Marks等人，J.Mol.Biol.，1991，222581)。
篩選G-CSF受體的專一抗體可由常用ELISA方法進行，如直接及間接夾層分析，其中將抗原，或優(yōu)選為G-CSF受體/IgG4(Fc)嵌合體蛋白質(zhì)，直接或間接被覆于平板。由酵素標(biāo)記免疫吸附法ELISA測得單克隆抗體mAb163-93與嵌合體蛋白質(zhì)的結(jié)合示于圖3。使用競爭酵素標(biāo)記免疫吸附法ELISA以監(jiān)測抗體其表位與配體相近或重疊(Current protocols inmolecular biology，ed.Ausubel，F(xiàn).M.等人，published by WileyInterscience，1996)。
在競爭性ELISA中當(dāng)G-CSF受體/IgG4(Fc)嵌合體蛋白質(zhì)直接或間接被覆于ELISA平板后，可使用重組人類G-CSF(R&D Biosystems，Minneapolis，NAN)?？贵w與G-CSF受體的結(jié)合可由加入二次抗小鼠抗體，如羊抗-小鼠抗體而監(jiān)測。此二次抗小鼠抗體可偶合以各種化合物及蛋白質(zhì)以監(jiān)測，含辣根過氧酶。
抗體與表達于細(xì)胞表面的人類G-CSF受體的結(jié)合專一性，如下文轉(zhuǎn)染小鼠細(xì)胞D4，可由FACS分析測得(實施例6)。如圖4A所述，小鼠單克隆抗體mAb 163-93可特異性地結(jié)合至小鼠轉(zhuǎn)染細(xì)胞D4表達人類G-CSF受體，但對照單克隆抗體mAb無法結(jié)合。此外，單克隆抗體mAb163-93可特異性地結(jié)合至D4細(xì)胞表達人類G-CSF受體，但無法結(jié)合至其親代細(xì)胞32D-c123(圖4B)。
由活體外細(xì)胞生物功能分析的G-CSF受體興奮劑篩選方法也在本發(fā)明范圍內(nèi)。大量篩選興奮劑中，含構(gòu)建G-CSF-反應(yīng)細(xì)胞株如NFS60，其中構(gòu)建片夾以表達報導(dǎo)基因并由所嵌入G-CSF-反應(yīng)基因促進子所控制(Schindler，C.及Darnell，J.E.，Annu.Rev.Biochem.，1995，64621)。此處所用報導(dǎo)基因可為發(fā)光酶，或β-半乳糖酶，綠螢光蛋白質(zhì)或二氫葉酸還原酶(Pelletier，J.N.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998，954290)。由測量刺激后細(xì)胞中酶活性或螢光強度，G-CSF受體的興奮劑可由高速篩選而選出。
興奮劑的活體外細(xì)胞生物功能分析，含興奮劑抗體，也含活體外細(xì)胞增生分析。本發(fā)明優(yōu)選實施例之一中，構(gòu)建小鼠細(xì)胞株D4表達完整人類G-CSF受體以大量篩選興奮劑抗體，其結(jié)合以MTT的比色分析。使用MTT的比色分析系是設(shè)計以光學(xué)定量細(xì)胞因應(yīng)細(xì)胞因子及其興奮劑的生長，而不需使用放射線同位素。親代小鼠細(xì)胞株，如BaF3及FDC-P1，或最好為本發(fā)明實施例7的32D-c123，為小鼠白介素-3小鼠IL-3依賴及適當(dāng)宿主細(xì)胞以表達完整人類G-CSF受體(Hapel，A.J.，等人，Blood，1984，64786-790)。當(dāng)轉(zhuǎn)染以載體其中完整人類G-CSF受體的表達是于持續(xù)人類CMV促進子所控制，篩選后，轉(zhuǎn)染株，如D4，也成為可因應(yīng)以G-CSF，是由MTT的比色分析及3H-胸腺嘧啶的吸收測定，如下文實施例7所述，并示于圖1。
小鼠轉(zhuǎn)染細(xì)胞株D4中酪氨酸激酶JAK1的磷酸化可由重組人類G-CSF(R&D Biosystems)引發(fā)，形式同于人類細(xì)胞株AML-193)表達本質(zhì)人類G-CSF受體(圖2)。如實施例7所述，使用人類G-CSF受體轉(zhuǎn)染小鼠細(xì)胞株D4結(jié)合以MTT分析可大大地促進興奮劑的篩選過程，尤為興奮劑抗體。也可使用此篩選方法于天然G-CSF-依賴人類細(xì)胞株，如AML-193，小鼠細(xì)胞株表達人類G-CSF受體突變株，或嵌合體蛋白質(zhì)含人類G-CSF受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域融合以另一細(xì)胞因子受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，如促紅細(xì)胞生成素受體(Goldsmith，M.A.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1998，957006-7011)或Fas受體(Takahashi，T.等人，J.Biol Chem.，1996，27117555-17560)。
也可使用人類骨髓的粒細(xì)胞集落形成分析以篩選本發(fā)明的興奮劑抗體。此外，也可使用此分析以測定興奮劑抗體于刺激人類骨髓增生及分化嗜中性粒性白血球的強度，有效性及專一性，及其與非人靈長類的相互反應(yīng)力。此分析結(jié)果顯示本發(fā)明的興奮劑抗體可作為重組人類G-CSF，并可以濃度依賴方式專一地刺激人類骨髓增生及分化嗜中性粒性白血球。此外，此分析顯示興奮劑單克隆抗體mAb163-93有效性與重組人類G-CSF(圖7)相同。此外，由興奮劑單克隆抗體刺激人類骨髓所得集落的細(xì)胞顯示典型嗜中性白血球外形(圖8D)。需知注射后，重組人類G-CSF會快速地由活體循環(huán)系清除，主要經(jīng)由腎，造成短期藥效應(yīng)(Tanaka，H.，等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.1989，2511198-1203；Layton，J.E.，等人，Blood，1989，741303-1307)。反之，本發(fā)明的粒細(xì)胞集落形成分析，重組人類G-CSF表現(xiàn)實質(zhì)活性以自人類骨髓激活嗜中性白血球的增生及分化，因無活體內(nèi)的清除機制?？深A(yù)期興奮劑抗體mAb163-93，因其活體內(nèi)半壽期長，而刺激嗜中性白血球的增生及分化潛力將與重組人類G-CSF相當(dāng)或更高，其為比較長半壽期的PEG化的人類生長激素及人類生長激素得知(Clark，R.，等人，J.Bio.Chem.，1996，27121969-21977)。
使用上述篩選技術(shù)，制備單克隆興奮劑抗體，含單克隆抗體mAb163-93及單克隆抗體mAb174-74-11，以抗人類G-CSF受體。興奮劑抗體mAb163-93作用如重組人類G-CSF，活化G-CSF受體，含酪氨酸激酶JAK1的磷酸化(圖6A，左方，其中磷酸化以抗pTyr抗體測得)及轉(zhuǎn)錄因子(圖6B，左方，其中磷酸化以抗pTyr抗體測得)。本發(fā)明數(shù)個興奮劑抗體于此圖抗體中顯示可于活體外刺激G-CSF因應(yīng)細(xì)胞的增生(圖5A-C)。單克隆抗體mAb163-93顯示可特異性地結(jié)合至G-CSF受體于細(xì)胞表面(圖4A及4B)。此外，人類G-CSF受體興奮劑抗體可特異性地刺激人類骨髓形成嗜中性粒性白血球集落，又再度顯示其活體內(nèi)有效性(Figs.7A，7B及8A-C)。此為第一個單克隆抗體可由人類骨髓刺嗜中性粒性白血球集落的形成。
人類G-CSF受體興奮劑抗體的種間交叉活性也可使用粒細(xì)胞集落形成分析測定。人類G-CSF受體興奮劑抗體，如單克隆抗體mAb163-93，可特異性地由非人靈長類骨髓刺激不同程度嗜中性粒性白血球的增生及分化(下表1)。于黑猩猩骨髓由興奮劑單克隆抗體mAb163-93刺激粒細(xì)胞集落形成是以濃度-依賴方式增加(圖9)。細(xì)胞染色結(jié)果顯示此興奮劑單克隆抗體可特異性地由黑猩猩骨髓刺激嗜中性白血球的增生及分化(圖10)。也可使用此種間交叉活性分析以選擇適當(dāng)動物模型于臨床前研究。
表1.由非人靈長類骨髓刺激嗜中性粒性白血球集落形成
上文闡明雙價興奮劑抗體可活化G-CSF受體，即可交叉連結(jié)G-CSF受體以模擬G-CSF形成復(fù)合物能力并活化受體。此外，如下所示，抗體的單價部份如scFv及Fab，其僅結(jié)合至一個受體分子，也作為拮抗劑以與G-CSF競爭。
2.使用本發(fā)明興奮劑重組人類G-CSF為第一個由重組DNA技術(shù)制得的細(xì)胞因子且成功地用于治療用途。巳廣泛使用此細(xì)胞因子以降低中介以各種先天及醫(yī)原的感染。至今，美國FDA已通過5種疾病以重組人類G-CSF治療(1)癌癥病人進行骨髓抑制化療；(2)病人具急性骨髓白血病引發(fā)或堅實化療；(3)癌癥病人進行骨髓移植；(4)癌癥病人進行周圍血祖先細(xì)胞收集及治療；及(5)病人具慢性嗜中性白血球減少癥(Physican’s Desk Reference，53rd edition，1999，532-537)。重組人類G-CSF于嗜中性粒性白血球源增生及分化的獨特功能專一性也使其可用于其它疾病，含HIV病人，病人具系統(tǒng)發(fā)炎反應(yīng)癥(SIRS)及敗血病，及病人具糖尿病性腳感染及其它感染疾病(Miles，S.A.，等人，Blood 1990，752137-2142；Kuritzkes，D.R.，等人，AIDS 1998，1265-74；Weiss，M.等人，Blood 1999，93425-439；Lancet 1997，350855-859；Deresinski，S.C.，等人，Infect.Med.1998，15856-70)。
此處公開的人類G-CSF受體興奮劑及抗體可作為重組人類G-CSF，經(jīng)由引起JAK1激酶及轉(zhuǎn)錄因子的酪氨酸磷酸化機制而專一結(jié)合至細(xì)胞表面G-CSF受體，因而活化G-CSF受體及其增生。此外，人類G-CSF受體興奮劑抗體可如重組人類G-CSF，可特異性地自人類骨髓激活嗜中性白血球集落的增生及分化。因此此處公開人類G-CSF受體興奮劑及抗體預(yù)期可用于所有與重組人類G-CSF相同的治療應(yīng)用。此外，興奮劑抗體較長內(nèi)半壽期及活體內(nèi)穩(wěn)定度提供優(yōu)于重組人類G-CSF治療的潛力。
本發(fā)明興奮劑及興奮劑抗體可由適當(dāng)制藥處方以各種途徑投予，含肌肉內(nèi)，腹膜內(nèi)及皮下注射，但不限于此。劑量可由動物模型及臨床試驗而定。
本發(fā)明興奮劑及興奮劑抗體可用以由重組細(xì)胞或天然來源親合純化G-CSF受體?？墒褂萌魏纬Ｓ糜H合性純化技術(shù)。
本發(fā)明抗體可免疫反應(yīng)與G-CSF受體及細(xì)胞表達G-CSF受體表面的水溶性細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。因此，本發(fā)明也提供使用常用免疫方法，免疫監(jiān)測及測定水溶性及/或細(xì)胞表面G-CSF受體的方法。此外，興奮劑抗體單價片段如Fab及scFv，及其衍生物可作為拮抗劑以預(yù)防G-CSF競爭反應(yīng)與G-CSF受體，因而抑制G-CSF生物功能，其可用于治療特定腫瘤及癌癥。正常，異?；蛲蛔兪荏w結(jié)構(gòu)或受體表達也可使用此處公開的抗體，經(jīng)由免疫活性研究測定。此結(jié)果可用于診斷及治療目的。
實施例1.克隆人類G-CSF受體蛋白質(zhì)的細(xì)胞外部份克隆G-CSF受體蛋白質(zhì)如下示。使用1微毫克人類骨髓cDNA(Clontech，Palo Alto，CA)為PCR模板。總反應(yīng)體積為100微升，含引物AAG TGGTGC TAT GGC AAG GCT G(SEQ ID號碼1)；及CAC TCC AGC TGT GCC CAGGTC TT(SEQ ID號碼2)，終濃度為500微毫摩爾。已知此引物與編碼人類G-CSF受體細(xì)胞外部份的cDNA5’及3’端有同源性。反應(yīng)條件如下1分于94℃；30秒于62℃；3分于72℃；重復(fù)40次。
依BIO101(Vista，CA)方法，自瓊脂膠分離PCR的DNA片段(約1.6kb)，嵌入TA克隆載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)，得重組質(zhì)粒pT1-11。嵌入DNA序列可使用測序組購自United States Biochemical(Cleveland，Ohio)測定二端序列。將含編碼人類G-CSF受體細(xì)胞外部份的DNA片段(使用由Fukunaga，R.等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA，1990，878702定義的序列)的pT1-11切割以EcoRIt，終端以Klenow片段填入。嵌入至質(zhì)粒pFc1含IgG4(Fc)編碼cDNA，其已切割以Xbal。將終端以Klenow片段填入，得質(zhì)粒pFT1-9。將DNA片段編碼人類G-CSF受體細(xì)胞外部份及IgG4(Fc)于pFT1-9切割以Asel及HincII，填入以Klenow片段，再嵌入動物表達載體pcDNA3(Invitrogen)。將此載體切割以EcoRV及HincII，填入以Klenow片段，可得質(zhì)粒pCGC23，其中人類G-CSF受體/IgG4(Fc)細(xì)胞外部份的表達是由人類CMV促進子控制。
實施例2.表達人類G-CSF受體/IgG4(Fc)嵌合體蛋白質(zhì)的細(xì)胞外部份于動物細(xì)胞將NSO細(xì)胞依下文轉(zhuǎn)染以線形pCGC23。收集4×107對數(shù)生長期NSO細(xì)胞并懸浮于0.8毫升IMDM培養(yǎng)液補充以2％FBS。于冰上培養(yǎng)以10微克線形質(zhì)粒DNA 10分鐘后，將細(xì)胞液使用BioRad apparatus電擊于200伏特及960μF。于冰上培養(yǎng)20分鐘后，將100微升稀釋細(xì)胞液加至約20個96井平板的各井中。2天后，加入相同IMDM培養(yǎng)液且含G418(Gibeo BRL，Gaithersburg，MD)100微升至各井中得終濃度G418為0.8毫克/毫升。10天后，取出培養(yǎng)上清液，由如下ELISA篩選表達人類G-CSF受體/IgG4(Fc)細(xì)胞外部份的嵌合蛋白質(zhì)。
將Immulon 2(Dynatech Laboratories，Chantilly，VA)微測試平板的井被覆以50微升抗人IgG(Fc)抗體(1微克/毫升)，于室溫下過夜。拍打平板除去被覆溶液后，于室溫下加入200微升的BLOTTO(5％無脂奶粉于PBS)至各井以封閉非專一性位。1小時后，將井清洗以緩沖液PBST(PBS含0.05％Tween 20)。收集50毫升各井的培養(yǎng)上清液，混與50微升BLOTTO，再加至微測試平板各井中。于室溫下培養(yǎng)1小時后，將井清洗以PBST。已結(jié)合人類G-CSF受體/IgG4(Fc)嵌合蛋白質(zhì)細(xì)胞外部份可由與辣根過氧酶(HRP)偶合以羊抗人IgG(H+L)(Jackson lmmunoresearchLaboratories，West Grove，PA)反應(yīng)，稀釋以1∶2000 BLOTTO而測得。過氧酶受質(zhì)溶液含0.1％的3，3’5，5’四甲基聯(lián)苯胺(Sigma，St.Louis，MO)及0.0003％過氧化氫(sigma)至各井中以比色30分。加入50微升的0.2M H2SO4至各井中以中止反應(yīng)。使用BioTek酵素標(biāo)記免疫吸附法ELISA計數(shù)器(BioTek Instruments，Winooski，VM)讀取反應(yīng)液OD450-570。
收集轉(zhuǎn)染株具高OD450-570讀值，使用限制稀釋方法作單細(xì)胞克隆。同樣以上述ELISA再篩選高產(chǎn)生細(xì)胞株表達嵌合蛋白質(zhì)含人類G-CSF受體及IgG4(Fc)細(xì)胞外部份。
實施例3純化人類G-CSF受體/IgG4(Fc)細(xì)胞外部份的嵌合蛋白質(zhì)收集1升轉(zhuǎn)染株表達人類G-CSF受體/IgG4(Fc)細(xì)胞外部份的嵌合蛋白質(zhì)的上清液，由Prosep-A親合性層析并依廠商說明(Bioprecessing Inc.Princeton，NJ)自上清液純化嵌合蛋白質(zhì)。再以羊抗人IgG(Fc)親合柱純化蛋白質(zhì)。以SDS-PAGE及免疫方法測定此嵌合蛋白質(zhì)的純度。
實施例4制備雜交瘤將BALB/c小鼠(Harlan，Houston，TX)，皮下注射以50微克純化融合蛋白質(zhì)含人類G-CSF受體及IgG4(Fc)細(xì)胞外部份于完全Freund氏佐劑(Difco Laboratories，Detroit，MI)及200微升磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，pH7.4)。2周及4周后各再注射以相同融合蛋白質(zhì)于不完全Freund氏佐劑。2周后及殺死前3天，將小鼠再由腹膜內(nèi)注射相同融合蛋白質(zhì)。將脾細(xì)胞融合以Sp2/0黑瘤細(xì)胞。將5×108的Sp2/0及5×108脾細(xì)胞融合于培養(yǎng)液含50％聚乙二醇(MW 1450)(Kodak，Rochester，NY)及5％二甲亞砜(Sigma St.Louis，MO)。將細(xì)胞調(diào)至5×104脾細(xì)胞/200微升懸浮液于lscove培養(yǎng)液(Gibco，BRL，Gaithersburg，MD)，補充以5％FBS，100單位/毫升青霉素，100微克/毫升鏈霉素，0.1毫摩爾次黃嘌呤，0.4毫摩爾氨基喋呤，及16毫摩爾胸腺嘧啶。將200毫升細(xì)胞懸浮液加至約100個微培養(yǎng)平板井中。約10天后取出培養(yǎng)上清液，以實施例7所述活體外細(xì)胞增生分析篩選。
實施例5克隆cDNA編碼完整人類G-CSF受體
將全RNA自人細(xì)胞株AML-193(ATCC保藏號CRL-9598)分離，由Ultraspec-3RNA分離試劑盒并按廠商說明書施行(Biotex LaboratoriesInc.，Houston，TX)。使用10微克來自人細(xì)胞株AML-193的全RNA為模板，依廠商說明書(Gibco，BRL，Gaithersburg，MD)于反轉(zhuǎn)錄合成第一股cDNA。為擴制cDNA編碼人類G-CSF受體的C端，于50微升反應(yīng)液含2個引物進行PCRNhe1CCC CCC CAG CGC TAG CAA TAG CAA CAA GAC CTG GAG G(SEQID號碼3)；及R10GGA ATT CCT AGA AGC TCC CCA GCG CCT CC(SEQID號碼4)，使用所得第一鏈cDNA為模板。反應(yīng)條件如下94℃下1分鐘；60℃下1分鐘；及72℃下3分鐘；重復(fù)40次。將PCR產(chǎn)物克隆至克隆載體pUC19切割以SmaI得質(zhì)粒pC3。為制造新酶切位點Nhe1于cDNA片段編碼人類G-CSF受體的N端，以2個引物進行PCR并使用質(zhì)粒pCGC23 DNA為模板。引物為T7PAAT ACG ACT CAC TAT AG(SEQ ID號碼5)；及Nhe2AGG TCT TGT TGC TAT TGC TAG CGC TGG GGG GGC CCA GG(SEQ ID號碼6)。將PCR所得DNA片段，其編碼人類G-CSF受體的N端，克隆至載體pCR-Blunt(Invitrogen，carlsbad，CA)，得質(zhì)粒pB12。為得完整人類G-CSF受體，將質(zhì)粒pB12 G-CSF受體的N端DNA片段，嵌入至質(zhì)粒pC3切割以Nhel及HincII，得質(zhì)粒pCB1。質(zhì)粒cDNA片段編碼完整人類G-CSF受體嵌入動物表達載體pcDNA3(Invitrogen，Carlsbad，CA)得質(zhì)粒pCGF4。
實施例6建立并鑒定G-CSF依賴性小鼠及人類細(xì)胞株將人類完整G-CSF受體表達質(zhì)粒pCGF4，先切割以BspC1線性化，以如實施例2所述電擊轉(zhuǎn)染至小鼠細(xì)胞株32D-c123，或人類細(xì)胞株TF-1(ATCC，VA)。將轉(zhuǎn)染株篩選生長于RPMI 1640補充以10％FBS，G418(0.8毫克/毫升)及小鼠IL-3(1微毫克/毫升)，或人類GM-CSF(1微毫克/毫升)(R&D Systems，Minneapollis，MN)，再以如實施例7所述MTT分析使用RPMI 1640補充以10％FBS，G418(0.6毫克/毫升)及重組人類G-CSF(1微毫克/毫升)(R&D Systems)篩選。轉(zhuǎn)染株其生長可由人類G-CSF刺激者可再以限制稀釋法作單細(xì)胞克隆。
人及小鼠轉(zhuǎn)染株，其含人類完整G-CSF受體表達質(zhì)粒，其增生依賴人類G-CSF，是以如實施例7所述由生長此轉(zhuǎn)染株于存在或無人類G-CSF，人類GM-CSF或小鼠IL-3下測定。轉(zhuǎn)染株增生依賴此細(xì)胞因子是以如實施例7所述使用MTT分析及3H-胸腺嘧啶的吸收測定。
轉(zhuǎn)染株表達人類G-CSF受體于細(xì)胞膜表面是由FACS分析確定。清洗以PBS含1％BSA，將純化單克隆抗體加至轉(zhuǎn)染細(xì)胞且終濃度為5微克/毫升。將細(xì)胞液培養(yǎng)以冰上30分并每15分搖晃。清洗以冷PBS3次，加入羊抗小鼠IgG[F(ab’)2]偶合以FITC以1∶50稀釋至轉(zhuǎn)染細(xì)胞并培養(yǎng)以冰上30分鐘。用冷PBS清洗3次，將細(xì)胞固定以1％三聚甲醛過夜。將轉(zhuǎn)染細(xì)胞與單克隆抗體的結(jié)合百分比以FACS分析。
實施例7.活體外細(xì)胞增生分析使用基于MTT的比色分析(te Boekhorst P.A.，等人，Leukemia 1993，71637-44)以篩選，并測定興奮劑抗體刺激人類G-CSF受體轉(zhuǎn)染小鼠或人類細(xì)胞株的增生能力。將轉(zhuǎn)染細(xì)胞預(yù)生長于RPMI培養(yǎng)液含10％FBS及1微毫克/毫升的小鼠IL-3，清洗以RPMI含10％FBS3次除去小鼠IL-3，以2-5×104/井種于RPMI含10％FBS。將得自雜交瘤平板或純化抗體的上清液加至各井。培養(yǎng)3天后，加入10微升MTT(2.5毫克/毫升于PBS，Boehringer-Mainiheim Biochemical)至各井。培養(yǎng)6小時后，加入100微升溶液含10％SDS及0.01N HCI至裂解細(xì)胞，將平板培養(yǎng)過夜。G-CSF依賴細(xì)胞激活以興奮劑抗體的增生可由OD540-690讀值測得。于MTT分析中為測得純化抗體的興奮劑活性，將重組人類G-CSF及抗體以2倍系列稀釋并作2次或3次重復(fù)。
此興奮劑抗體刺激人類G-CSF受體轉(zhuǎn)染細(xì)胞的能力可使用3H-胸腺嘧啶的吸收測得。清洗以無細(xì)胞因子培養(yǎng)液含10％FBS3次后，將1-2×104轉(zhuǎn)染細(xì)胞(50微升/井)混以各種濃度的小鼠IL-3，重組人類G-CSF(R&DBiosystems)，雜交瘤培養(yǎng)上清液或純化抗體于96-井平板含RPMI 1640及10％滲析FBS。將1μCi的3H-胸腺嘧啶(專一活性6.7Ci/毫摩爾，NewEngland Nuclear)混以50微升相同培養(yǎng)液，并加至各井。培養(yǎng)48小時后，由細(xì)胞收集機收集細(xì)胞(Skatron，VA)，以液體放射分析計(Packard，IL)分析3H-胸腺嘧啶的吸收并作3次重復(fù)。
實施例8.純?nèi)祟怗-CSF受體興奮劑單克隆抗體將得自雜交瘤的抗體由Prosep-A親合性層析并依廠商說明(Bioprecessing Inc.Princeton，NJ)純化。以SDS-PAGE及免疫方法測定此人類G-CSF受體興奮劑抗體的純度。純化2種單克隆抗體各命名為mAb163-93及mAb174-74-11。
實施例9.骨髓集落形成分析自健康自愿者收集約10毫升的人類骨髓，依標(biāo)準(zhǔn)方法進行Ficoll-Paque分離。以巴斯德吸管小心收集界面的細(xì)胞，懸浮于3倍體積IMDM及2％FBS，離心于400g 5分鐘。依此法可得終骨髓細(xì)胞懸浮液富含2-4倍量的原細(xì)胞，是因較成熱及密度較高脊髓細(xì)胞與紅血球一起移除。為測定此人類G-CSF受體興奮劑抗體專一性，依廠商說明書方法(StemCellTechnologies Inc.，Vancouver，Canada)進行粒細(xì)胞集落形成分析。為定量分析興奮劑抗體刺激人類或黑猩猩骨髓形成嗜中性粒性集落的潛力及有效性，使用一系列不同濃度的興奮劑抗體或重組人類G-CSF并作2次重復(fù)于此分析。如圖7及9所示，興奮劑單克隆抗體mAb163-93)，如重組人類G-CSF(R&D Biosystems)，可以濃度依賴形式刺激人類或黑猩猩骨髓形成嗜中性粒性集落。由細(xì)胞染色結(jié)果顯示此興奮劑單克隆抗體刺激人類及黑猩猩骨髓嗜中性白血球的增生及分化專一性(圖8及10)。
實施例10.酪氨酸磷酸化分析由細(xì)胞因子及興奮劑抗體引起酪氨酸磷酸化的分析如下。收集約2×107對數(shù)生長期細(xì)胞，清洗以無血清培養(yǎng)液3次后置于無血清RPMI培養(yǎng)液4小時。將所收集細(xì)胞刺激以小鼠IL-3，重組人類單克隆抗體(R&DBiosystems)或興奮劑單克隆抗體其終濃度為2.6微毫摩爾15分鐘，并離心收集。將細(xì)胞裂解于0.5毫升裂解緩沖液(50毫摩爾Tris.HCI，pH7.5/150毫摩爾NaCl/1％(vol/vol)Triton X-100/1毫摩爾EDTA并加入1毫摩爾Na3VO4，1微摩爾pepstatin，50微摩爾3，4，二氯異熏草素，1毫摩爾苯甲磺酰氟化物，1毫摩爾1，10-啡啉，亮肽素(10微克/毫升)及抑肽酶(10微克/毫升)。于冰上培養(yǎng)30分鐘后，將裂解液于14,000rpm離心15分鐘。于免疫沉淀中，將兔子對JAKI，JAK2，或Stat3的多克隆抗體(Upstate Biotechnology，Lake Placid，NY)加至清裂解液并于4℃培養(yǎng)2小時。加入50微升蛋白質(zhì)A珠(Gibco，BRL)至各裂解液并于4℃培養(yǎng)2小時。培養(yǎng)后，將珠清洗以裂解緩沖液3次并懸浮于35微升的Laemmli’s樣本緩沖液(62.5毫摩爾TrispH7.6，2％SDS，10％甘油，及5％2-硫基乙醇(2-mercaptoethanol))。將懸浮液加熱至9℃5分鐘并于4％-7.5％SDS-PAGE下電泳。印跡后將膜依廠商說明書方法，于4℃下培養(yǎng)以HRP-偶合小鼠單克隆抗磷酪氨酸抗體4G10(Upstate Biotechnology)過夜。用含0.05％Tween-20的PBS及PBS清洗，將膜依廠商說明書方法用SuperSignalSubstrate kit(Pierce.Rockford，IL)監(jiān)測。將硝纖維素膜再如所示探針以抗體及二次抗體偶合以辣根過氧酶(HRP)。
實施例11克隆并分析DNA片段編碼雜交瘤細(xì)胞興奮劑抗體的變化區(qū)域?qū)⑷玆NA分離自產(chǎn)生興奮劑抗體的雜交瘤細(xì)胞，并如實施例1所示作為RT-PCR模板。PCR反應(yīng)所用引物為如下SEQ ID號碼7～14。將PCR所得DNA片段克隆至克隆載體pCR-Blunt(Invitrogen)，使用自動DNAsequencer Genetic Analyzer 310(PE Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)并依廠商說明分析。分析由二次不同RT-PCR反應(yīng)所得個別重組載體以確定重鏈及輕鏈變化區(qū)域DNA序列是來自興奮劑抗體。
用以克隆變化區(qū)域所用引物的DNA序列用以克隆單克隆抗體mAb163-93變化區(qū)域所用引物輕鏈5’MKV7ATG GGC WTC AAG ATG GAG TCA CAK WYY CWG G(SEQ ID號碼7)3’MKCACT GGA TGG TGG GAA GAT GG(SEQ ID號碼8)
重鏈5’NHV9ATG GMT TGG GTG TGG AMC TTG CTA TTC CTG(SEQ ID號碼9)3’MHCG1CAG TGG ATA GAC AGA TGG GGG(SEQ ID號碼10)用以克隆單克隆抗體mAb174-74-11所用引物輕鏈5’MKV5ATG GAT TTW CAG GTG CAG ATT WTC AGC TTC(SEQ ID號碼11)3’MKCACT GGA TGG TGG GAA GAT GG(SEQ ID號碼12)重鏈5’NHV4ATG RAC TTT GGG YTC AGC TTG RTT T(SEQ ID號碼13)3’MHCG2aCAG TGG ATA GAC CGA TGG GGC(SEQ ID號碼14)此抗體變化區(qū)域的互補確定區(qū)域含如下序列單克隆抗體mAb163-93(IgG1亞型)變化區(qū)域重鏈CDR序列CDR1Asn Tyr Gly Met Asn(SEQ ID號碼15)CDR2Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gly AspPhe Lys Gly(SEQ ID號碼16)CDR3Glu Gly Phe Tyr Gly Gly His Pro Gly Phe Asp Tyr(SEQ ID號碼17)單克隆抗體mAb163-93變化區(qū)域輕鏈CDR序列CDR1Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ser Ser Arg Thr Arg Lys AsnTyr Leu Ala(SEQ ID號碼18)CDR2Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser(SEQ ID號碼19)CDR3Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Arg Thr(SEQ ID號碼20)
單克隆抗體mAb174-74-11(IgG2a亞型)變化區(qū)域重鏈CDR序列CDR1Ser Tyr Ala Met Ser(SEQ ID號碼21)CDR2Gly Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Ser Tyr Tyr Pro Gly ThrLeu Lys Gly(SEQ ID號碼22)CDR3Glu Ala Tyr Asn Asn Tyr Asp Ala Leu Asp Tyr(SEQ ID號碼23)單克隆抗體mAb174-74-11變化區(qū)域輕鏈CDR序列CDR1Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Val His(SEQ ID號碼24)CDR2Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser(SEQ ID號碼25)CDR3Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Phe Thr(SEQ ID號碼26)需知上述用詞，表達，實施例及具體實施例僅作例示用而不限于此，本發(fā)明范圍由如下申請專利范圍所定義，并含所有與本發(fā)明申請專利范圍相當(dāng)者。
序列表<110>倪寶福比爾.N.C.孫舍西利.R.Y.孫<120>G-CSF受體興奮劑抗體及其篩選方法<130>98-3<150>60/083,575<151>1998-04-30<160>27<170>FastsEQ for Windows Version 3.0<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>1aagtggtgct atggcaaggc tg22<210>2<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>2cactccagct gtgcccaggt ctt23<210>3<211>37<212>DNA<213>人工序列<400>3cccccccagc gctagcaata gcaacaagac ctggagg37<210>4<211>29<212>DNA
<213>人工序列<400>4ggaattccta gaagctcccc agcgcctcc29<210>5<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>小鼠<400>5aatacgactc actatag17<210>6<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>6aggtcttgtt gctattgcta gcgctggggg ggcccagg38<210>7<211>31<212>DNA<213>小鼠<400>7atgggcwtca agatggagtc acakwyycwg g31<210>8<211>20<212>DNA<213>小鼠<400>8actggatggt gggaagatgg20<210>9<211>30<212>DNA<213>小鼠
<400>9atggmttggg tgtggamctt gctattcctg30<210>10<211>21<212>DNA<213>小鼠<400>10cagtggatag acagatgggg g21<210>11<211>30<212>DNA<213>小鼠<400>11atggatttwc aggcgcagat twtcagctcc30<210>12<211>20<212>DNA<213>小鼠<400>12actggatggt gggaagatgg20<210>13<211>25<212>DNA<213>小鼠<400>13atgractttg ggytcagctt grttt25<210>14<211>21<212>DNA<213>小鼠<400>14cagtggatag accgatgggg c21<210>15
<211>5<212>PRT<213>小鼠<400>15Asn Tyr Gly Met Asn1 5<210>16<211>17<212>PRT<213>小鼠<400>16Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gly Asp Phe Lys1 5 10 15Gly<210>17<211>12<212>PRT<213>小鼠<400>17Glu Gly Phe Tyr Gly Gly His Pro Gly Phe Asp Tyr1 5 10<210>18<211>17<212>PRT<213>小鼠<400>18Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ser Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu15 10 15Ala<210>19<211>7<212>PRT<213>小鼠<400>19Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser1 5<210>20<211>8
<212>PRT<213>小鼠<400>20Lys Gln SerTyr Asn Leu Arg Thr1 5<210>21<211>5<212>PRT<213>小鼠<400>21Ser Tyr Ala Met Ser1 5<210>22<211>17<212>PRT<213>小鼠<400>22Gly Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Ser Tyr Tyr Pro Gly Thr Leu Lys1 5 10 15Gly<210>23<211>11<212>PRT<213>小鼠<400>23Glu Ala Tyr Asn Asn Tyr Asp Ala Leu Asp Tyr1 5 10<210>24<211>10<212>PRT<213>小鼠<400>24Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Val His1 5 10<210>25
<211>7<212>PRT<213>小鼠<400>25Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser1 5<210>26<211>9<212>PRT<213>小鼠<400>26Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Phe Thr1 5<210>27<211>603<212>PRT<213>人類<400>27Glu Glu Cys Gly His Ile Ser Val Ser Ala Pro Ile Val His Leu Gly1 5 10 15Asp ProIle Thr Ala Ser Cys Ile Ile Lys Gln Asn Cys Ser His Leu20 25 30Asp Pro Glu Pro Gln Ile Leu Trp Arg Leu Gly Ala Glu Leu Gly Pro35 40 45Gly Gly Arg Gln Gln Arg Leu Ser Asp Gly Thr Gln Glu Ser Ile Ile50 55 60Thr Leu Pro His Leu Asn His Thr Gln Ala Phe Leu Ser Cys Cys Leu65 70 7580Asn Trp Gly Asn Ser Leu Gln Ile Leu Asp Gln Val Glu Leu Arg Ala85 90 95Gly Tyr Pro Pro Ala Ile Pro His Asn Leu Ser Cys Leu Met Asn Leu100 105 110Thr Thr Ser Ser Leu Ile Cys Gln Trp Glu Pro Gly Pro Glu Thr His115 120 125Leu Pro Thr Ser Phe Thr Leu Lys Ser Phe Lys Ser Arg Gly Asn Cys130 135 140Gln Thr Gln Gly Asp Ser Ile Leu Asp Cys Val Pro Lys Asp Gly Gln145 150 155 160Ser His Cys Cys Ile Pro Arg Lys His Leu Leu Leu Tyr Gln Asn Met165 170 175Gly Ile Trp Val Gln Ala Glu Asn Ala Leu Gly Thr Ser Met Ser Pro180 185 190
Gln Leu Cys Leu Asp Pro Met Asp Val Val Lys Leu Glu Pro Pro Met195 200 205Leu Arg Thr Met Asp Pro Ser Pro Glu Ala Ala Pro Pro Gln Ala Gly210 215 220Cys Leu Gln Leu Cys Trp Glu Pro Trp Gln Pro Gly Leu His Ile Asn225 230 235 240Gln Lys Cys Glu Leu Arg His Lys Pro Gln Arg Gly Glu Ala Ser Trp245 250 255Ala Leu Val Gly Pro Leu Pro Leu Glu Ala Leu Gln Tyr Glu Leu Cys260 265 270Gly Leu Leu Pro Ala Thr Ala Tyr Thr Leu Gln Ile Arg Cys Ile Arg275 280 285Trp Pro Leu Pro Gly His Trp Ser Asp Trp Ser Pro Ser Leu Glu Leu290 295 300Arg Thr Thr Glu Arg Ala Pro Thr Val Arg Leu Asp Thr Trp Trp Arg305 310 315 320Gln Arg Gln Leu Asp Pro Arg Thr Val Gln Leu Phe Trp Lys Pro Val325 330 335Pro Leu Glu Glu Asp Ser Gly Arg Ile Gln Gly Tyr Val Val Ser Trp340 345 350Arg Pro Ser Gly Gln Ala Gly Ala Ile Leu Pro Leu Cys Asn Thr Thr355 360 365Glu Leu Ser Cys Thr Phe His Leu Pro Ser Glu Ala Gln Glu Val Ala370 375 380Leu Val Ala Tyr Asn Ser Ala Gly Thr Ser Arg Pro Thr Pro Val Val385 390 395 400Phe Ser Glu Ser Arg Gly Pro Ala Leu Thr Arg Leu His Ala Met Ala405 410 415Arg Asp Pro His Ser Leu Trp Val Gly Trp Glu Pro Pro Asn Pro Trp420 425 430Pro Gln Gly Tyr Val Ile Glu Trp Gly Leu Gly Pro Pro Ser Ala Ser435 440 445Asn Ser Asn Lys Thr Trp Arg Met Glu Gln Asn Gly Arg Ala Thr Gly450 455 460Phe Leu Leu Lys Glu Asn Ile Arg Pro Phe Gln Leu Tyr Glu Ile Ile465 470 475 480Val Thr Pro Leu Tyr Gln Asp Thr Met Gly Pro Ser Gln His Val Tyr485 490 495Ala Tyr Ser Gln Glu Met Ala Pro Ser His Ala Pro Glu Leu His Leu500 505 510Lys His Ile Gly Lys Thr Trp Ala Gln Leu Glu Trp Val Pro Glu Pro515 520 525Pro Glu Leu Gly Lys Ser Pro Leu Thr His Tyr Thr Ile Phe Trp Thr530 535 540Asn Ala Gln Asn Gln Ser Phe Ser Ala Ile Leu Asn Ala Ser Ser Arg545 550 555 560Gly Phe Val Leu His Gly Leu Glu Pro Ala Ser Leu Tyr His Ile His565 570 575
Leu Met Ala Ala Ser Gln Ala Gly Ala Thr Asn Ser Thr Val Leu Thr580 585 590Leu Met Thr Leu Thr pro Glu Gly Ser Glu Leu595 600
權(quán)利要求
1.一種興奮劑分子，其可特異性地結(jié)合人類G-CSF受體或與其相互作用以刺激細(xì)胞增生及分化。
2.權(quán)利要求1所述的興奮劑分子，其可刺激嗜中性粒細(xì)胞或其祖先細(xì)胞的增生及分化。
3.一種興奮劑分子，其可特異性地結(jié)合人類G-CSF受體與其相互作用并將受體二聚化或活化與此受體相關(guān)激酶磷酸化，以刺激細(xì)胞增生及分化。
4.權(quán)利要求1所述的人類G-CSF受體，其為天然人類G-CSF受體，或其具取代，插入或缺失的突變體。
5.權(quán)利要求1或3所述的興奮劑分子，其可與人類G-CSF受體的細(xì)胞外部份相互作用。
6.權(quán)利要求5所述的興奮劑分子，其可與G-CSF受體氨基酸殘基1-603(SEQ ID號碼27)區(qū)域相互作用。
7.權(quán)利要求5所述的人類G-CSF受體細(xì)胞外部份，其為權(quán)利要求4的人類G-CSF受體細(xì)胞外部份。
8.權(quán)利要求1或3所述的興奮劑分子，其為單克隆抗體，或片斷，同源物或其類似物，或肽或有機化合物。
9.權(quán)利要求6所述的片斷，其為F(ab)’2，F(xiàn)ab或scFv。
10.權(quán)利要求8所述的單克隆興奮劑抗體，其包括mAb163-93及mAb174-74-11。
11.一種興奮劑分子，其結(jié)合至與單克隆抗體mAb163-93或mAb174-74-11相同的表位。
12.權(quán)利要求1或3所述的興奮劑分子，其由體外增生分析測定可刺激表達人類G-CSF受體的人類或小鼠細(xì)胞增生。
13.權(quán)利要求10所述的單克隆興奮劑抗體mAb163-93，其屬于IgG1亞型，其中可變區(qū)域重鏈CDRs含一種或多種如下氨基酸序列CDR1Asn Tyr Gly Met Asn(SEQ ID號碼15)CDR2Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gly AspPhe Lys Gly(SEQ ID號碼16)CDR3Glu Gly Phe Tyr Gly Gly His Pro Gly Phe Asp Tyr(SEQID號碼17)或可變區(qū)輕鏈CDRs包括一種或多種如下氨基酸序列CDR1Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ser Ser Arg Thr Arg Lys AsnTyr Leu Ala(SEQ ID號碼18)CDR2Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser(SEQ ID號碼19)CDR3Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Arg Thr(SEQ ID號碼20)。
14.權(quán)利要求10所述的單克隆興奮劑抗體mAb174-74-11，其屬于IgG2a亞型，其中可變區(qū)重鏈CDRs包括一種或多種如下氨基酸序列CDR1Ser Tyr Ala Met Ser(SEQ ID號碼21)CDR2Gly Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Ser Tyr Tyr Pro Gly ThrLeu Lys Gly(SEQ ID號碼22)CDR3Glu Ala Tyr Asn Asn Tyr Asp Ala Leu Asp Tyr(SEQ ID號碼23)或可變區(qū)輕鏈CDRs序列含一種或多種如下氨基酸序列CDR1Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Val His(SEQ ID號碼24)CDR2Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser(SEQ ID號碼25)CDR3Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Phe Thr(SEQ ID號碼26)。
15.一種雜交瘤細(xì)胞株，其能產(chǎn)生權(quán)利要求8所述的單克隆興奮劑抗體，片斷，同源物，類似物或肽。
16.權(quán)利要求13所述的雜交瘤細(xì)胞株，其為雜交瘤細(xì)胞株163-93或174-74-11。
17.DNA序列，它編碼權(quán)利要求8所述的單克隆興奮劑抗體，片斷，同源物，類似物或肽。
18.一種基因傳遞系統(tǒng)，它包括的DNA序列編碼權(quán)利要求8所述的單克隆興奮劑抗體，片斷，同源物，類似物或肽。
19.一種基因傳遞系統(tǒng)，它包括一段以上的列于SEQ ID號碼15～26的DNA序列。
20.權(quán)利要求16所述的基因傳遞系統(tǒng)，其中該系統(tǒng)包括病毒載體，質(zhì)?；蚍禽d體傳遞系統(tǒng)。
21.一種治療嗜中性白血球減少癥的方法，含投予權(quán)利要求1-3所述中任一項之分子。
22.一種治療嗜中性白血球減少癥的方法，含投予權(quán)利要求5所述的分子。
23.一種治療嗜中性白血球減少癥的方法，含投予權(quán)利要求8所述的分子。
24.一種篩選G-CSF興奮劑活性分子的方法，含確定分子是否可刺激G-CSF依賴細(xì)胞的增生。
25.權(quán)利要求22所述的方法，其中使用體外分析測量。
26.權(quán)利要求23所述的方法，其中該分析方法為基于MTT的比色分析或使用表達G-CSF受體的細(xì)胞的3H-胸腺嘧啶的吸收分析。
27.權(quán)利要求22所述的G-CSF依賴細(xì)胞，其表達具G-CSF受體細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域序列或其部份的蛋白質(zhì)或其片斷于細(xì)胞膜表面。
28.一種以免疫學(xué)檢測人類G-CSF受體的方法，是使用權(quán)利要求8所述的抗體。
29.一種以免疫學(xué)檢測表達人類G-CSF受體于細(xì)胞表面的細(xì)胞的方法，是使用權(quán)利要求8所述的抗體。
30.一種以免疫學(xué)檢測并測定水溶性人類F-CSF受體的方法，是使用權(quán)利要求8所述的抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種興奮劑分子，其可特異性地結(jié)合人體G－CSF受體或與其相互作用，并將受體二聚化或活化與受體相關(guān)連的激酶磷酸化而刺激細(xì)胞增生和分化。此興奮劑分子包括單克隆抗體，或片段，同源物或其類似物，或肽或有機化合物。公開了二種小鼠單克隆興奮劑抗體的例子mAb163－93及mAb174－74－11。
文檔編號C12N15/63GK101070344SQ200710107599
公開日2007年11月14日 申請日期1999年4月30日 優(yōu)先權(quán)日1998年4月30日
發(fā)明者倪寶福, 比爾·N·C·孫, 舍西利·R·Y·孫 申請人:泰諾士公司