專利名稱：武夷菌素高產(chǎn)菌株f64及發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物新菌株，具體地說是一種不吸水鏈霉菌武夷變種的高產(chǎn)菌株(Streptomyces anhygroscopicus var.wuyiensis)F64，本發(fā)明還涉及利用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)生物農(nóng)藥-武夷菌素的方法。
背景技術(shù)：
生物農(nóng)藥是21世紀農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的新方向，其中抗生素類殺菌劑是生物農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)化發(fā)展最快的產(chǎn)品之一。武夷菌素是中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研制的具有防病增產(chǎn)效果的生物農(nóng)藥產(chǎn)品，其來源于不吸水鏈霉菌武夷變種(Streptomyces anhygroscopicus var.wuyiensis)產(chǎn)生的一種抗生素(微生物學(xué)報，24401-402，1984)，主要用于防治農(nóng)作物真菌病害，具有高效、廣譜、低毒、環(huán)境安全的特點，因此，在生態(tài)農(nóng)業(yè)和綠色食品生產(chǎn)中具有廣闊的應(yīng)用前景。武夷菌素的生產(chǎn)是利用培養(yǎng)武夷菌素產(chǎn)生菌，通過生物深層發(fā)酵產(chǎn)生的微生物的次生代謝產(chǎn)物。工廠化發(fā)酵生產(chǎn)過程中所使用產(chǎn)生菌產(chǎn)素能力的高低以及培養(yǎng)基配方的優(yōu)劣是決定抗生素生產(chǎn)成本、防效的關(guān)鍵因素。因此，通過遺傳育種技術(shù)選育高產(chǎn)生產(chǎn)菌株、優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分以及營養(yǎng)成分的配比，對于降低武夷菌素的生產(chǎn)成本、能耗，提高防治農(nóng)作物病害的效果，加快我國自主研發(fā)的農(nóng)用抗生素產(chǎn)業(yè)化發(fā)展具有重要意義。
目前，武夷菌素產(chǎn)品的生產(chǎn)方法為二級生物發(fā)酵，生產(chǎn)上使用的產(chǎn)生菌生物效價約為2500-3000ug/ml，發(fā)酵培養(yǎng)時間為120小時。近幾年，隨著生產(chǎn)菌株傳代增加，菌株退化嚴重，目前效價只有1800-2000ug/ml，培養(yǎng)時間也明顯增加，同時，由于用原來的培養(yǎng)基配方生產(chǎn)武夷菌素發(fā)酵液中含糖過多，后處理的成本增加。耗能、費時。過高生產(chǎn)成本的嚴重影響武夷菌素的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
研究武夷菌素殺菌劑的高產(chǎn)、高效的生產(chǎn)方法，對于提高我國的農(nóng)用抗生素自行開發(fā)、創(chuàng)制的能力和水平，提高具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新微生物農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)化程度，不僅直接為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供新生物農(nóng)藥品種，而且為開發(fā)微生物農(nóng)藥產(chǎn)品提供基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的是提供一種生產(chǎn)生物農(nóng)藥-武夷菌素的高產(chǎn)菌株(Streptomyces anhygroscopicus var.wuyiensis)F64。該菌株已于2007年3月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.1967。
本發(fā)明的另一個目的在于提供利用該菌株生產(chǎn)武夷菌素的發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)法。
本發(fā)明以不吸水鏈霉菌武夷變種(Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis)BO-10(韋日清等，微生物學(xué)報24401-402，1984)為出發(fā)菌株，通過物理、化學(xué)和高能離子注入的誘變技術(shù)改進武夷菌素生產(chǎn)菌株，通過室內(nèi)生物測定的方法篩選該菌種的高產(chǎn)突變菌株并確定菌株產(chǎn)素的穩(wěn)定性，得到不吸水鏈霉菌武夷變種的高產(chǎn)菌株F64(Streptomyces anhygroscopicus var.wuyiensis F64)(保藏號為CGMCC1967)。該菌株在合成培養(yǎng)基上孢子絲呈十分緊密的長螺旋形，一般為5-12圈，孢子為橢圓或卵圓形，大小均勻，表面帶細刺。在深層發(fā)酵條件下，菌絲生長呈網(wǎng)狀；在高氏合成一號瓊脂、察氏瓊脂等培養(yǎng)基上培養(yǎng)，氣生菌絲由灰白變?yōu)橄蠡?、褐色；基?nèi)菌絲體為淡黃、麥秸黃或淺黃，并由淡黃、微黃色的可溶性色素產(chǎn)生。生理特性水解淀粉，液化明膠塊，纖維素上不生長，不產(chǎn)生硫化氫；利用D-木糖、D-葡萄糖、鼠李糖、棉子糖、甘露糖等，不利用L-阿拉伯糖。功能特性對革蘭氏陽性、陰性細菌，酵母菌及真菌有抑制作用，如枯草桿菌(Escherichia coli)，稻瘟病菌(Piricularia oryzae)，棉花枯萎病菌(Verticillium dahliae)等病原真菌。
本發(fā)明以F64為發(fā)酵生產(chǎn)菌株，以利用部分因子設(shè)計法(FractionalFactorial Design，F(xiàn)FD)對武夷菌素發(fā)酵生產(chǎn)培養(yǎng)基配方中營養(yǎng)因子包括淀粉、葡萄糖、玉米粉、豆餅粉、氯化鈣、氯化銨、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、氯化鈉共10種營養(yǎng)成分的主效應(yīng)進行考察，篩選影響武夷菌素效價的關(guān)鍵因子；根據(jù)JMP軟件中的響應(yīng)面設(shè)計模塊程序，采用2因素5水平(共13組實驗)的中心組合設(shè)計法(CentralComposite Design，CCD)對關(guān)鍵因子進行優(yōu)化。根據(jù)實驗所得數(shù)據(jù)進行二次多項式的回歸擬和，預(yù)測武夷菌素產(chǎn)量的最大值及其所對應(yīng)的關(guān)鍵因子的濃度。以多元二次方程所預(yù)測的最佳培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基并進行多組發(fā)酵實驗，確定優(yōu)化的武夷菌素培養(yǎng)基配方。
通過上述方法獲得的優(yōu)化培養(yǎng)配方為玉米粉15-25mg/ml，黃豆餅粉20-35mg/ml，葡萄糖20-35mg/ml，氯化銨1-5mg/ml，碳酸鈣1-5mg/ml，硫酸鎂0.1-0.5mg/ml，硫酸亞鐵0.1-0.5mg/ml，氯化鈉0.1-0.5mg/ml，磷酸氫二鉀0.1-0.5mg/ml。更優(yōu)選為玉米粉20mg/ml，黃豆餅粉32mg/ml，葡萄糖27.2mg/ml，氯化銨3mg/ml，碳酸鈣3mg/ml，硫酸鎂0.2mg/ml，硫酸亞鐵0.2mg/ml，氯化鈉0.2mg/ml，磷酸氫二鉀0.2mg/ml。與傳統(tǒng)的發(fā)酵培養(yǎng)基配方相比，主要營養(yǎng)成份減少，增加了微量元素成份，總的成本降低。
發(fā)酵條件為轉(zhuǎn)速150～200rpm，溫度25～35℃，罐壓0.01～0.15MPa，通氣量1∶0.5～1，發(fā)酵時間50～100小時，發(fā)酵50～108小時。優(yōu)選為轉(zhuǎn)速180rpm，溫度28℃，罐壓0.10MPa，通氣量1∶0.9，發(fā)酵時間78小時。
武夷菌素生物檢測方法以深紅酵母AS2.282(Rhodotorula rubra)為檢測菌，馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基20％土豆汁，2％葡萄糖，0.8％瓊脂)為檢測培養(yǎng)基(中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)編菌種目錄，第三版，中國農(nóng)業(yè)科技出版社，1997年)，采用管碟法檢測武夷菌素的生物活性。
本發(fā)明中的所述的通氣量是指每分鐘通過單位體積發(fā)酵液的氣體的量，即每分鐘本發(fā)明提供的武夷菌素高產(chǎn)菌株F64，采用常規(guī)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，效價可達5000u/ml；通過優(yōu)選的發(fā)酵方法，其效價可達6500u/ml。本發(fā)明的武夷菌素發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)，可以用于生物農(nóng)藥武夷菌素的工廠化生產(chǎn)，采用該方法生產(chǎn)武夷菌素殺菌劑發(fā)酵液濃縮倍數(shù)2-3倍，可達效價10000-11000u/mL。在相同發(fā)酵罐和發(fā)酵條件下，比原有方法產(chǎn)品產(chǎn)量提高40-50％，節(jié)約成本20-30％，防病效果提高15-20％。綜上所述，本發(fā)明提供了一種高產(chǎn)、節(jié)本、增效的武夷菌素殺菌劑發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)，對于實現(xiàn)我國自主創(chuàng)新生物農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，擴大使用范圍，促進農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展有著主要意義。
具體實施例方式
下面實施例用于對本發(fā)明的進一步說明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
實施例1 培養(yǎng)基配方配方1玉米粉20mg/ml，黃豆餅粉32mg/ml，葡萄糖27.2mg/ml，氯化銨3mg/ml，碳酸鈣3mg/ml，硫酸鎂0.2mg/ml，硫酸亞鐵0.2mg/ml，氯化鈉0.2mg/ml，磷酸氫二鉀0.2mg/ml；配方2玉米粉15mg/ml，黃豆餅粉35mg/ml，葡萄糖35mg/ml，氯化銨1mg/ml，碳酸鈣1mg/ml，硫酸鎂0.5mg/ml，硫酸亞鐵0.5mg/ml，氯化鈉0.1mg/ml，磷酸氫二鉀0.5mg/ml；配方3玉米粉25mg/ml，黃豆餅粉20mg/ml，葡萄糖20mg/ml，氯化銨5mg/ml，碳酸鈣5mg/ml，硫酸鎂0.1mg/ml，硫酸亞鐵0.1mg/ml，氯化鈉0.5mg/ml，磷酸氫二鉀0.1mg/ml。
實施例2 搖床發(fā)酵生產(chǎn)方法在含有玉米粉20mg/ml，黃豆餅粉32mg/ml，葡萄糖27.2mg/ml，氯化銨3mg/ml，碳酸鈣3mg/ml，硫酸鎂0.2mg/ml，硫酸亞鐵0.2mg/ml，氯化鈉0.2mg/ml，磷酸氫二鉀0.2mg/ml的培養(yǎng)基中接種F64，28℃搖床震蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為180rpm/分鐘，時間為72小時。發(fā)酵液過濾后去除菌絲體，采用生物效價檢測法測定效價達到6500u/ml。濃縮2倍效價可達或超過有效成份為1％的武夷菌素產(chǎn)品質(zhì)量標準(10000u/ml)，該濃縮液可直接作為殺菌機使用。
實施例3 發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)方法取F64菌株活化后，經(jīng)一級種子培養(yǎng)32小時，按照10％(v/v)的接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基，在發(fā)酵罐中擴大培養(yǎng)40-50小時。
發(fā)酵培養(yǎng)基為玉米粉20mg/ml，黃豆餅粉32mg/ml，葡萄糖27.2mg/ml，氯化銨3mg/ml，碳酸鈣3mg/ml，硫酸鎂0.2mg/ml，硫酸亞鐵0.2mg/ml，氯化鈉0.2mg/ml，磷酸氫二鉀0.2mg/ml。
發(fā)酵條件為溫度30℃，轉(zhuǎn)速200rpm，通氣量1∶0.9，罐壓0.10MPa。發(fā)酵78小時。發(fā)酵液過濾后去除菌絲體，采用管碟法測定效價。
結(jié)果效價達到6500u/ml，濃縮2倍效價可達10000u/ml的濃縮液即可作為殺菌機使用。
實施例4 武夷菌素有效成分的分離純化及理化性質(zhì)收集發(fā)酵培養(yǎng)物，用0.5～1％草酸酸化到pH2.5，攪拌后靜置過夜，過濾；濾液經(jīng)顆粒活性炭柱脫色，活性碳流出液用732#陽離子樹脂柱(河北新河新光化工有限公司)吸附，先用水洗脫，再用0.5mol/L氨水洗脫，當流出液pH大于7.0后開始接收，濃縮接收液至小體積(30～50ml)；再過中性氧化鋁柱脫色，先用水洗脫，再用3％氨水洗脫，收集活性高的流出液濃縮至干；干粉用少量水溶解，上LH-20凝膠柱(北京慧德易科技有限公司)，用蒸餾水洗脫，收集活性高的流出液濃縮至干，即得武夷菌素粗品。武夷菌素粗品經(jīng)Sephadex-G-25柱層析(上海君創(chuàng)生物科技有限公司)，水洗脫，經(jīng)HPLC檢測后將主要成分含量在75％以上部分合并，冷凍干燥后再經(jīng)HPLC半制備柱進行制備，制備后可得到只含武夷菌素A和武夷菌素B的精制品，其中主要成分武夷菌素A的含量可達到86％左右，武夷菌素B的含量為13％左右。采用多種方法分離，武夷菌素A和武夷菌素B的含量之比始終保持在7∶1。武夷菌素的理化性質(zhì)武夷菌素精制品的冷干物為微黃色粉末，易吸潮，熔點239℃(碳化)，極易溶于水，微溶于甲醇，不溶于丙酮、氯仿、吡啶等有機溶劑。
實施例5 武夷菌素田間用藥的制備收集實施例2的發(fā)酵培養(yǎng)物，過濾，濾液經(jīng)減壓濃縮2-3倍，濃縮溫度60℃，得到的武夷菌素含量為10000-12000u/ml濃縮液即可用于田間蔬菜、果樹和糧食作物真菌病害的防治。
實施例6 武夷菌素的田間應(yīng)用武夷菌素防治蔬菜白粉病黃瓜白粉病(Sphaerotheca fuliginea)是黃瓜主要病害之一，一般造成減產(chǎn)10～20％，嚴重的達50％以上。取實施例5的濃縮液稀釋200-400倍噴霧防治黃瓜白粉病，每畝噴200斤水，防治效果為91.46％，同時使用的化學(xué)農(nóng)藥粉銹寧稀釋500倍，防治效果96.36％(黃仲生、楊玉茹，生物防治通報1(4)47，1985)。
武夷菌素防治番茄葉霉病番茄葉霉病(Cladosporium fulvum)是保護地番茄主要病害之一。取實施例5的武夷菌素濃縮液分別稀釋200倍、250倍、300倍防治番茄葉霉病，每畝噴200斤水，防治效果分別為86.93％、83.07％、54.21％，使用的對照農(nóng)藥為75％代森錳鋅300倍稀釋液，防效效果64.41％。
武夷菌素防治茶樹病茶樹云紋葉枯病(Guignardia camelliae)和輪斑病(Pestalotia guepini)是茶樹上發(fā)生最普遍，危害最嚴重的病害之一，一般茶園茶樹發(fā)病率58.4％和15.5％。取實施例5的武夷菌素濃縮液分別稀釋600倍噴施兩次，間隔14天，對云紋葉枯病、輪斑病的防治效果分別為78.60％、84.00％。
武夷菌素防治棉花枯萎病棉花枯萎病(Fusarium oxysporum f.vasinfectum)是棉花生產(chǎn)中最嚴重的病害，被稱為棉花的癌癥。在我國所有棉區(qū)均有發(fā)生，常常導(dǎo)致棉花絕產(chǎn)和絕收。取實施例5的武夷菌素濃縮液分別稀釋200倍浸種24小時，同時采用稀釋500倍液噴施兩次，間隔14天，對棉花枯萎病的防治效果為61.83-67.97％，以50％多菌靈膠懸劑進行相同處理為對照，防病效果為2.28％，幾乎無效。
權(quán)利要求
1.不吸水鏈霉菌武夷變種(Streptomyces anhygroscopicus var.wuyiensis)F64 CGMCC No.1967。
2.權(quán)利要求1所述的菌株在制備生物農(nóng)藥-武夷菌素中的應(yīng)用。
3.一種用于培養(yǎng)權(quán)利要求1所述菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于每100毫升培養(yǎng)基中含有玉米粉15～25mg，黃豆餅粉20～35mg，葡萄糖20～35mg，氯化銨1～5mg，碳酸鈣1～5mg，硫酸鎂0.1～0.5mg，硫酸亞鐵0.1～0.5mg，氯化鈉0.1～0.5mg，磷酸氫二鉀0.1～0.5mg。
4.如權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)基，其特征在于每100毫升培養(yǎng)基中含有玉米粉20mg，黃豆餅粉32mg，葡萄糖27.2mg，氯化銨3mg，碳酸鈣3mg，硫酸鎂0.2mg，硫酸亞鐵0.2mg，氯化鈉0.2mg，磷酸氫二鉀0.2mg。
5.一種深層發(fā)酵法制備生物農(nóng)藥-武夷菌素的方法，其特征在于，發(fā)酵條件為轉(zhuǎn)速150～200rpm，溫度25～35℃，罐壓0.01～0.15MPa，通氣量1∶0.5～1，發(fā)酵時間50～100小時，接種量為5-20％；發(fā)酵所用的培養(yǎng)基為權(quán)利要求3或4所述的培養(yǎng)基；發(fā)酵所用的菌株為權(quán)利要求1所述的菌株。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)條件為轉(zhuǎn)速180rpm，溫度28℃，罐壓0.10MPa，通氣量1∶0.9，發(fā)酵72小時，接種量為10％。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法得到的生物農(nóng)藥武夷菌素發(fā)酵液和濃縮液。
8.權(quán)利要求7所述的發(fā)酵液和濃縮液在農(nóng)作物真菌病害防治中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種不吸水鏈霉菌武夷變種(Streptomycesanhygroscopicus var.wuyiensis)的誘變菌株F64 CGMCC No.1967。在常規(guī)培養(yǎng)條件下用本發(fā)明的菌株來制備一種新型生物農(nóng)藥－武夷菌素，其發(fā)酵液效價可以達到5000u/ml以上。本發(fā)明還進一步優(yōu)化了該菌株的發(fā)酵培養(yǎng)方法。利用優(yōu)化的培養(yǎng)方法，特別是新的培養(yǎng)基配方發(fā)酵生產(chǎn)武夷菌素，其發(fā)酵液效價可以達到6000～6500u/ml，比利用現(xiàn)有的技術(shù)和出發(fā)菌種制備武夷菌素縮短發(fā)酵生產(chǎn)時間5～10小時，發(fā)酵液的效價提高150～200％，產(chǎn)量提高100％，節(jié)約成本20～30％，防病效果提高15～20％。
文檔編號C12P1/04GK101050441SQ20071006501
公開日2007年10月10日 申請日期2007年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月30日
發(fā)明者張克誠, 石義萍, 付月靈, 王立東, 阿拉坦夫, 王萬群, 展麗然 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所