專利名稱：一種用于單細胞電穿孔的納電極和系統(tǒng)的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種微型細胞電轉(zhuǎn)染的相關裝置，特別是涉及一種用于單細胞電穿孔的納電極和電穿孔系統(tǒng)。
背景技術：
基因轉(zhuǎn)導是指將來自供體的遺傳物質(zhì)(如DNA分子)轉(zhuǎn)移至受體細胞的過程。近年來，隨著分子遺傳學、重組DNA技術等方面的發(fā)展，迫切需要建立快速、高效的基因轉(zhuǎn)導方法。目前已發(fā)展了多種基于物理、化學、生物、生物物理方法的基因?qū)爰夹g，如基因槍法、顯微注射法、聚乙二醇介導法、脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)化法等。其中，電擊穿孔(簡稱電穿孔)法屬于一種生物物理的方法，利用外加的高電場引起細胞質(zhì)膜結(jié)構的重新分布，當跨膜電勢超過質(zhì)膜的擊穿電壓(0.2～1.5V)時，質(zhì)膜上會瞬間出現(xiàn)可逆微孔(一般為數(shù)十納米)，從而使正常情況下無法進入細胞的外源物質(zhì)(DNA、蛋白質(zhì)、氨基酸、藥物、染色劑等)通過這些微孔進入細胞內(nèi)部。電穿孔轉(zhuǎn)導具有對受體細胞的副作用小，電穿孔的脈沖參數(shù)和過程容易控制等特點，因此是一種很有前途的基因轉(zhuǎn)導方法。同時，這種方法操作簡單、轉(zhuǎn)化效率高、沒有細胞種屬的限制，已廣泛應用于細胞工程和基因工程等方面，成為實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)導的一種常用方法。
隨著生命科學的發(fā)展，特別是生物學在單細胞、亞細胞甚至更深層次上研究的逐漸深入，人們迫切需要能夠?qū)毎w特定靶區(qū)進行超微量導入的單細胞電穿孔技術。根據(jù)電穿孔現(xiàn)象的原理，如果能夠使細胞彼此隔離，并且能夠利用超微小的電極將電場聚集在細胞膜微小區(qū)域和實現(xiàn)對跨膜電勢的控制，就可實現(xiàn)對單細胞的低壓、微區(qū)、可控、高效、微損的基因電轉(zhuǎn)導。目前，一些學者已進行了基于微電極的單細胞電穿孔技術的研究，如1 998年，Lundqvis等，參考文獻[1]J.Anders Lundqvist，Owe Orwar，Maria.A.I.Aberg，et al.Altering the biochemical state of individual cultured cells and organelles withultramicroelectrode.Proc.Natl.Acad.Sci.1998，9510356-10360.；采用直徑為5微米的碳纖維微電極首先實現(xiàn)了單細胞電穿孔(圖1為原理示意圖)，他們將熒光素和Fluo-3成功地導入到rat hippocampus的原代細胞中；再如美國冷泉港實驗室的H.T.Cline等人，參考文章[2]Kurt Haas，Wun-Chey Sin，Ashkan Javaherian，et al.Single-Cell Electroporationfor Gene Transfer In Vivo.Neuron.2001，March，Vol.29583-591.；利用尖端直徑為0.6～1微米的玻璃微吸管實現(xiàn)了對蝌蚪單個腦細胞的電穿孔，他們將綠色熒光蛋白導入并實現(xiàn)了在神經(jīng)細胞和神經(jīng)膠質(zhì)中的表達。他們進行單細胞電穿孔實驗的裝置，包括玻璃微吸管、微操作器、顯微鏡、電壓脈沖發(fā)生器、示波器等。
雖然利用微電極已經(jīng)可以實現(xiàn)單細胞的電穿孔，但是當前基于微電極的單細胞基因電轉(zhuǎn)導技術還存在一些問題(1)使用的是微米尺度的電極，與細胞的尺度相近，因此難以實現(xiàn)對單細胞指定微區(qū)進行微損、微量的基因?qū)耄?2)微電極產(chǎn)生的場強仍不夠集中，電穿孔電壓還需進一步減小，以減小對細胞的損傷；(3)對微電極、細胞體和周圍介質(zhì)組成的超微電極系統(tǒng)的電模型還缺乏研究，無法實現(xiàn)對單細胞基因電轉(zhuǎn)導過程的精確監(jiān)控。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是克服當前單細胞基因電轉(zhuǎn)導技術使用的是微米尺度的電極，與細胞的尺度相近，因此難以實現(xiàn)對單細胞指定微區(qū)進行微損、微量的基因?qū)耄?2)目的之二是克服當前單細胞基因電轉(zhuǎn)導技術使用的微電極產(chǎn)生的場強仍不夠集中，電穿孔電壓不夠小，而會對細胞產(chǎn)生損傷的缺陷；從而提供一種用于單細胞電穿孔的納電極和電穿孔系統(tǒng)。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的本發(fā)明提供的用于單細胞電穿孔的納電極，由一根本體，所述的本體頭部具有尖端形狀部分，和在該本體的其余部分(除尖端狀的部分外)覆蓋的絕緣層，以及固定在所述本體另一端的一根電極引線組成；其特征在于，所述本體的尖端狀部分直徑為1nm-10μm×長度1nm-100μm。
本發(fā)明提供的用于單細胞電穿孔的系統(tǒng)，包括微操作器、電穿孔信號發(fā)生器、生物顯微鏡；其特征在于，還包括納電極和微電極；所述的微電極安裝在一根玻璃微吸管內(nèi)，該玻璃微吸管管口直徑為100nm～100μm；所述的納電極和微電極分別安裝在2個所述的微操作器上；一盛裝培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿放置在納電極和微電極的下方，該納電極和微電極的電極引線分別與電穿孔信號發(fā)生器電連接，在進行單細胞基因電轉(zhuǎn)導過程中，其納電極的尖端和微電極前端與培養(yǎng)液中的細胞接觸，組成單細胞阻抗檢測電路；顯微鏡放置在盛裝培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿下方；玻璃微吸管在微操作器的控制下可實現(xiàn)對單個細胞的捕捉；單細胞阻抗檢測電路可實現(xiàn)對單細胞基因電轉(zhuǎn)導過程的實時監(jiān)控。
在上述的技術方案中，還包括吸引器、橡皮導管，其中所述的吸引器通過所述的橡皮導管連接到玻璃微吸管上。
在上述的技術方案中，還包括電阻抗測試儀，所述的納電極、微電極與所述的電阻抗測試儀的輸入端電連接，構成電阻抗檢測電路。
在上述的技術方案中，所述的納電極的本體可采用金屬、半導體或碳納米管、納米線等材料制作；所述的金屬包括鎢、鉑銥合金、金、銀等。
在上述的技術方案中，所述的納電極本體表面涂覆的絕緣材料，包括硅酮樹脂、硝酸纖維或二甲基硅氧烷(PDMS)。
在上述的技術方案中，所述的玻璃微吸管中的微電極可采用Ag/AgCl、Pt、飽和甘汞或標準氫等電極。
利用電阻抗法實現(xiàn)對單細胞基因電轉(zhuǎn)導過程的監(jiān)控既可采用直流阻抗法也可采用交流阻抗法；既可采用3電極法也可采用2電極法。
本發(fā)明的優(yōu)點在于本發(fā)明利用納電極實現(xiàn)對單細胞的基因電轉(zhuǎn)導技術，由于納電極具有常規(guī)電極不具備的表面、小尺度等納效應，因此該種電導入技術具有高效、微區(qū)、低電壓(小于1伏)、低發(fā)熱量、細胞損傷小等優(yōu)點。
本發(fā)明提供的用于單細胞電穿孔的納電極達到如下主要技術指標納電極的尖端直徑1納米-10微米；玻璃微吸管的尖端直徑100納米-100微米；微操作器x，y，z方向的定位精度0.1微米-10微米；電穿孔信號發(fā)生器能夠產(chǎn)生的信號幅值0.01V-100V，波形方波或指數(shù)波；電阻抗測試儀的測試范圍直流-100kHz。
本發(fā)明提供的利用本發(fā)明制作的納電極所組成的對單細胞進行電穿孔的系統(tǒng)，可實現(xiàn)直徑1微米-1000微米的單細胞進行電穿孔。該系統(tǒng)不僅利用了納電極超小尺寸所具有的場強集中、微區(qū)、低電壓、低發(fā)熱量、損傷小等特點，并且實現(xiàn)了對單細胞的捕捉以及利用電阻抗法對基因電轉(zhuǎn)導過程的監(jiān)控。該項技術可應用于基因工程學、細胞電生理學等領域。


圖1(a)-(c)是已有技術采用直徑為5微米的碳纖維微電極實現(xiàn)單細胞電穿孔的原理示意圖其中圖1(a)表示電穿孔前；圖1(b)表示電穿孔中；圖1(c)表示電穿孔后圖2是本發(fā)明的基于納電極的單細胞電穿孔裝置的組成示意3是納電極的組成示意面說明1、顯微鏡；2、單細胞；3、培養(yǎng)液；4、培養(yǎng)皿；5、納電極；6、橡皮導管；7、微電極；8、玻璃微吸管；9、9’、微操作器；10、引線；11、絕緣層；12、納電極本體13、尖端狀部分14、信號發(fā)生器 15、電阻抗測試儀16、吸引器具體實施方式
下面結(jié)合實施例及附圖詳細對本發(fā)明進行說明實施例1參考圖3，制作一個納米鎢電極。
納米電極本體12為一根直徑為0.3mm×長3mm的鎢絲，配制2～5mol/L NaOH溶液，然后將直徑為0.3mm的鎢絲接到直流電源的陽極，將不銹鋼圈接到直流電源的陰極，在5-10V的直流電壓下，將鎢絲的一端部腐蝕為具有納米量級的尖端狀部分，例如尖端狀部分直徑為10納米、100納米、幾百納米或1微米，以及10微米，尖端長度為1納米-100微米；并且將本體除尖端以外的地方浸入到硝酸纖維的丙酮溶液中，然后取出，使鎢本體12尖端狀以外部分的表面包覆一層硝酸纖維絕緣層11，再在鎢絲的另一端部焊接一根電極引線10，得到納米鎢電極5。
實施例2參考圖3，在實施例1的基礎上將納米電極本體12的材料改變?yōu)殂y(換成另外的金屬)，制作一個本發(fā)明的納電極；其中該電極本體12的尖端直徑為600納米，尖端長度為10微米，其余部分涂敷硅酮樹脂絕緣層11。
實施例3參考圖3，在實施例1的基礎上將納米電極本體12的材料改變?yōu)榧{米碳管，該納米碳管直徑為10納米，其余部分涂敷二甲基硅氧烷(PDMS)絕緣層11。
實施例4參考圖3，將納米電極本體12的材料改變?yōu)殂K銥合金(換成另外的金屬)，然后采用拉制的方法制作一個本發(fā)明的納電極；其中該電極本體12的尖端直徑為1微米，尖端長度為10微米，其余部分涂敷二甲基硅氧烷絕緣層11。
實施例5圖2為本發(fā)明的基于納米電極的單細胞電穿孔最基本系統(tǒng)，利用實施例1-4制作的任一納電極，都可以制作本發(fā)明的單細胞電穿孔系統(tǒng)，本實施例的納電極5用實施例1的納米鎢電極，一根Ag/AgCl電極絲作為微電極7安裝在一根玻璃微吸管8內(nèi)，該玻璃微吸管8的管口直徑例如為100nm、900nm、1μm、50μm或100μm；所述的納電極5和微電極7分別安裝在2個所述的微操作器(9、9’)上，一盛裝培養(yǎng)液3的培養(yǎng)皿4放置在納電極5和微電極7的下方，該納電極5的電極引線10和微電極7分別與信號發(fā)生器14電連接，在進行單細胞基因電轉(zhuǎn)導過程中，納電極的尖端部分13和玻璃微吸管8前端與培養(yǎng)液3中的單細胞2接觸，組成單細胞阻抗檢測電路；顯微鏡1放置在盛裝培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿4下方；玻璃微吸管8在微操作器(9、9’)的控制下可實現(xiàn)對單個細胞的捕捉；所組成的單細胞阻抗檢測電路可實現(xiàn)對單細胞基因電轉(zhuǎn)導過程的實時監(jiān)控。
實施例6參考圖2，利用實施例1-4制作的任一納電極，都可以制作本發(fā)明的用于單細胞電穿孔的系統(tǒng)，本實施例的納電極5用實施例1的納米鎢電極，一根Ag/AgCl電極絲作為微電極7安裝在一根玻璃微吸管8內(nèi)，該玻璃微吸管8管口直徑例如為100nm、900nm、1μm、50μm或100μm；還包括一吸引器16(可用市場上購買的吸引器或用注射器代替)、一根橡皮導管6；其中吸引器16通過橡皮導管6連接到玻璃微吸管8上。一電阻抗測試儀15(例如，利用CHI660型電化學工作站的交流阻抗測試功能)的輸入端與納電極5的電極引線和微電極電連接，構成電阻抗檢測電路，所述的納電極5和微電極7分別安裝在2個所述的微操作器(9、9’)上，一盛裝培養(yǎng)液3的培養(yǎng)皿4放置在納電極5和微電極7的下方，該納電極5的電極引線10和微電極7分別與信號發(fā)生器14電連接，在進行單細胞基因電轉(zhuǎn)導過程中，納電極的尖端部分13和玻璃微吸管8前端與培養(yǎng)液3中的單細胞2接觸，組成單細胞阻抗檢測電路；顯微鏡1放置在盛裝培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿4下方；玻璃微吸管8在微操作器(9、9’)的控制下可實現(xiàn)對單個細胞的捕捉；所組成的單細胞阻抗檢測電路可實現(xiàn)對單細胞基因電轉(zhuǎn)導過程的實時監(jiān)控。
利用鎢納電極和實施例6的系統(tǒng)實現(xiàn)單細胞電穿孔的具體步驟如下培養(yǎng)皿中放入細胞和待轉(zhuǎn)染物質(zhì)(DNA、蛋白質(zhì)、氨基酸、藥物、染色劑等)，向帶有Ag/AgCl微電極的玻璃微吸管內(nèi)充注生理鹽水，使生理鹽水的液面高過Ag/AgCl微電極的下端。將玻璃微吸管和側(cè)壁絕緣的納電極安裝在微操作器上，并將電極尖端浸入培養(yǎng)皿。在顯微鏡下，移動微操作器，使玻璃微吸管的尖端接近待轉(zhuǎn)染的細胞表面，同時利用電阻抗測試儀監(jiān)測玻璃微電極和納電極之間的阻抗。當阻抗突然增加時，說明玻璃微電極的尖端已接觸到細胞表面，可停止移動玻璃微電極。啟動吸引器，利用負壓將細胞固定在玻璃微吸管尖端。然后將納電極移動到所固定細胞需要轉(zhuǎn)染的部位。將電路切換至電穿孔信號發(fā)生器，選擇合適的波形、峰值、占空比等參數(shù)，啟動電穿孔信號發(fā)生器，當跨膜電勢超過質(zhì)膜的擊穿電壓時，質(zhì)膜上會瞬間出現(xiàn)可逆微孔，從而使培養(yǎng)皿中的外源物質(zhì)通過這些微孔進入細胞內(nèi)部。由于質(zhì)膜發(fā)生穿孔后細胞的電阻抗會減小，因此同樣可采用電阻抗測試儀監(jiān)測細胞膜是否發(fā)生了穿孔。
權利要求
1.一種用于單細胞電穿孔的納電極，該納電極由一本體，所述的本體頭部具有尖端形狀部分，和在該本體的其余部分覆蓋的絕緣層，以及固定在所述本體另一端的一根電極引線組成；其特征在于，所述本體的尖端狀部分直徑為1nm-10μm×長度1nm-100μm。
2.按權利要求1所述的用于單細胞電穿孔的納電極，其特征在于，所述的本體采用金屬、半導體或碳納米管、納米線等材料制作；所述的金屬包括鎢、鉑銥合金、金、銀等。
3.按權利要求1所述的用于單細胞電穿孔的納電極，其特征在于，所述的納電極本體表面涂覆的絕緣材料，包括硅酮樹脂、硝酸纖維或二甲基硅氧烷。
4.一種用于單細胞電穿孔的系統(tǒng)，包括微操作器、電穿孔信號發(fā)生器、生物顯微鏡；其特征在于，還包括納電極和微電極；所述的微電極安裝在一根玻璃微吸管內(nèi)，該玻璃微吸管管口直徑為100nm-100μm；所述的納電極和微電極分別安裝在2個所述的微操作器上；一盛裝培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿放置在納電極和微電極的上方，該納電極和微電極的電極引線分別與電穿孔信號發(fā)生器電連接，在進行單細胞基因電轉(zhuǎn)導過程中，其納電極的尖端和玻璃微吸管前端與培養(yǎng)液中的細胞接觸，組成單細胞阻抗檢測電路；顯微鏡放置在盛裝培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿下方。
5.按權利要求4所述的用于單細胞電穿孔的系統(tǒng)；其特征在于，還包括一吸引器和橡皮導管；其中所述的吸引器通過所述的橡皮導管連接到玻璃微吸管上。
6.按權利要求4所述的用于單細胞電穿孔的系統(tǒng)；其特征在于，還包括電阻抗測試儀，所述的納電極、微電極與所述的電阻抗測試儀的輸入端電連接，構成電阻抗檢測電路。
7.按權利要求4所述的用于單細胞電穿孔的系統(tǒng)；其特征在于，所述的玻璃微吸管中的微電極采用Ag/AgCl、Pt、飽和甘汞或標準氫電極。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于單細胞電穿孔的納電極和系統(tǒng)，該納電極由一根本體，所述的本體頭部具有尖端形狀，和在該本體的其余部分覆蓋的絕緣層，以及固定在所述本體另一端的一根電極引線組成；其尖端狀部分的直徑為1nm－10μm×長度1nm－100μm。本發(fā)明的系統(tǒng)包括納電極和微電極，所述的微電極安裝在一根玻璃微吸管內(nèi)，該玻璃微吸管管口直徑為100nm－100μm；納電極和微電極分別安裝在2臺微操作器上，該納電極和微電極的電極引線分別與電穿孔信號發(fā)生器電連接，其納電極的尖端和微電極前端與培養(yǎng)液中的細胞組成單細胞阻抗檢測電路；玻璃微吸管在微操作器的控制下可實現(xiàn)對單個細胞的捕捉；單細胞阻抗檢測電路可實現(xiàn)對單細胞基因電轉(zhuǎn)導過程的實時監(jiān)控。本發(fā)明提出的這種單細胞電穿孔系統(tǒng)具有場強集中、微區(qū)、低電壓、低發(fā)熱量、對細胞損傷小等特點。
文檔編號C12M1/42GK101020892SQ20071006414
公開日2007年8月22日 申請日期2007年3月2日 優(yōu)先權日2007年3月2日
發(fā)明者楊興, 周兆英, 肖名飛, 王強, 李永安, 楊潤澤, 邵臣人 申請人:清華大學