專利名稱：表面增強拉曼光譜檢測動物活性單細胞樣品處理方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種單細胞表面增強拉曼光譜檢測樣品預處理方法，具體說是 一種將用于單細胞表面增強拉曼光譜檢測的檢測樣品一一動物活性細胞進行預 處理，并利用電穿孔法將金屬納米粒子導入檢測樣品內(nèi)的方法，屬于生物醫(yī)學 領域。
背景技術：
拉曼光譜屬于分子振動光譜，拉曼譜線的數(shù)目，位移值的大小和譜帶的強 度等都與物質分子的振動和轉動有關，這些信息反映了分子的構像及其所處的 環(huán)境。拉曼光譜可提供關于分子內(nèi)部各種簡正振動頻率及有關振動能級的情況， 從而可鑒定分子中存在的官能團及分子的特征結構。然而拉曼光譜散射的光強
僅約為入射光強的10"o，由于常規(guī)拉曼信號太弱，需要采取技術手段對拉曼信 號進行增強后進行檢測，表面增強拉曼散射(Surface-enhanced Raman spectroscopy,簡稱SERS)就是通常采用的一種具有表面選擇性的增強手段。 SERS是指當一些分子被吸附到某些粗糙的金屬(如銀、銅、金等)表面上時，它 們的拉曼散射強度會增加104 106倍。這就是所謂的SERS效應。SERS以其選 擇性好，高靈敏度，對某些分子其靈敏度比常規(guī)拉曼光譜高100萬倍，能檢測 .吸附在金屬表面的單分子層和亞單分子層，并提供豐富的分子結構信息，而得 到廣泛的應用。在生物醫(yī)學研究上，科學家目前采用在細胞內(nèi)部導入銀或金納米 粒子的以獲得SERS譜研究活性細胞，SERS具有非破壞性和指紋式的分辨能力， 對水溶液樣品的分析、樣品的選擇性激發(fā)和信號收集等方面都顯示出其獨特的 優(yōu)點，因此在生物醫(yī)學研究方面已經(jīng)展現(xiàn)出良好的應用前景。然而目前將銀或 金納米粒子導入活性細胞的手段還不多，通常采用直接與細胞孵育方式，利用
3細胞的胞吞作用將吸附在細胞表面的金屬粒子引入活性細胞，這種方式需要的 時間較長而且效率不高，另外細胞會將附著有金屬的納米粒子視作異物，并很 快將這些納米粒子清除干凈進一步降低了導入效率。
在正常的生理機能狀況下,細胞膜起著內(nèi)外環(huán)境的屏障作用，能較好地阻礙
內(nèi)外環(huán)境中納米粒子或分子的傳輸。但是當施加強度為KV/cm、持續(xù)時間為u s ms級的電脈沖刺激細胞膜時，細胞膜會出現(xiàn)微孔,導致細胞膜阻礙微粒滲透能 -力降低。這種由電脈沖產(chǎn)生的細胞膜滲透性通常稱之為電穿孔。如果通過調節(jié) 脈沖電場的強度和持續(xù)時間可以控制細胞膜的開孔直徑，在最佳條件下，保持微 孔直徑在20 100nm范圍內(nèi),并使微孔在10s左右自動愈合，可使細胞有效地通 透，又可使細胞損傷最小保持活性，達到既能將所需的金屬粒子導入細胞內(nèi)， 又能保持細胞的活性。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于就現(xiàn)有方法不足提供一種利用電穿孔法將金屬納米粒子快 速導入檢測樣品(動物活性細胞)的方法。與現(xiàn)有預處理技術需要8 24小時相 —比，本發(fā)明所述的進行表面增強拉曼光譜檢測樣品預處理過程所需要的時間縮 短至30分鐘以內(nèi)，具有簡單快速、可靠性高、通用性好的特點，它既不影響原 有細胞的活性，又有顯著的表面增強拉曼效果，可獲得活性細胞內(nèi)部清晰穩(wěn)定 的表面增強拉曼光譜。
為實現(xiàn)本發(fā)明的目的采用的技術方案是 (1)銀溶膠預制備
取9 12mg的固體硝酸銀溶于50ml去離子水中，加熱至IO(TC，然后將1 ml含有1% 3%的檸檬酸三鈉的水溶液逐滴加入，在加入過程中快速攪拌硝酸銀 溶液，滴加完后繼續(xù)保持沸騰2小時 6小時，得到銀溶膠的粗制品，待銀溶膠 自然冷卻后，用離心機離心分層，將上清液丟棄，取下層濃縮的銀溶膠在室溫 下避光密封以準備下面的細胞電穿孔步驟。(2) 單細胞懸液的制備
將待測的檢測樣品活性細胞首先用市售的RPMI 1640細胞培養(yǎng)液制成單細 胞懸液，然后通過血球記數(shù)板計算細胞的含量，控制細胞密度在105~106個/1111。
(3) 銀溶膠-單細胞懸液混合液的制備
取(1)中制備好的銀溶膠1 4ml于以8000rpm轉速進行第二次離心10分 鐘，棄上清液后向濃縮的銀溶膠中加入50 200ii 1市售的RPMI 1640細胞培養(yǎng) 液制成銀溶膠懸浮液。將銀溶膠懸浮液與(2)中制備的單細胞懸浮液按1 : 4 的體積比例混合于一試管管中，利用200ul的移液器通過反復抽吸的方式充分 將銀溶膠懸浮液和單細胞懸浮液混勻，制成銀溶膠-單細胞懸浮液并在室溫下保 存。
(4) 表面增強拉曼光譜檢測樣品預處理過程 將混合好的銀溶膠-單細胞懸浮液轉入電脈沖發(fā)生器的電擊杯樣品池中，進
行冰浴，5~10分鐘后將電擊杯置電脈沖發(fā)生器的電擊基架上，電擊杯電極間隙 范圍為1、 2、 3或4mm，電壓在350V 1000V之間,持續(xù)電擊時間50ms 100u s。 電穿孔后，立即使用300~500y 1市售RPMI 1640細胞培養(yǎng)液將銀溶膠-單細胞懸 浮液沖洗出樣品池，置冰浴中5 10min后,轉移到預熱后的培養(yǎng)箱中，37"C培養(yǎng) 10分鐘，然后利用共焦拉曼光譜儀檢測樣品以獲得樣品細胞的表面增強拉曼光
;並
本發(fā)明的優(yōu)勢在于，采用脈沖電場技術將金屬溶膠納米粒子順利通過細胞 膜導入細胞，具有轉移效率高及對細胞無傷害等顯著特點，從而為單細胞表面增 強拉曼光譜銀溶膠的導入細胞提供了有效而簡便的方法。
圖1是本發(fā)明對上皮腫瘤細胞表面增強拉曼光譜檢測譜線圖。 圖2是本發(fā)明對白血病腫瘤細胞表面增強拉曼光譜檢測譜線圖。 圖3是本發(fā)明對鼻咽癌腫瘤細胞表面增強拉曼光譜檢測譜線圖。圖1、圖2及圖3中采用的激光波長為785nm，功率為20mW，縱坐標為譜 線的強度，單位為任意單位(a.u)橫坐標為各特征譜線的峰位置，以波數(shù)(cm")表不。
具體實施例方式
下面對本發(fā)明的方案措施作進一步的說明。 實施例1
取9mg的硝酸銀溶于50ml去離子水中，加熱至IO(TC使之沸騰，然后將1 ml濃度為3%的檸檬酸三鈉逐滴加入，并快速攪拌，滴加完后繼續(xù)保持沸騰2 小時。待此銀溶膠自然冷卻后，用離心機離心分層，將上層清液丟棄，取下層 濃縮的銀溶膠在室溫下避光密封存放備用。
將待測的檢測樣品上皮腫瘤細胞(A431)首先用市售的RPMI 1640細胞培 養(yǎng)液制成上皮腫瘤細胞的單細胞懸液，然后通過血球記數(shù)板計算細胞的含量， 控制細胞密度為1()S個/ml。
分別取濃縮的銀溶膠與上皮腫瘤細胞(A431)的單細胞懸液80ul和320 ul，室溫下混合后轉入一電擊杯樣品池中,電擊杯電極間隙為lmm，其中細胞數(shù) 量約為2X10S個。將電擊杯冰浴5分鐘，然后置于電穿孔儀內(nèi),選擇手動控制, 加電壓350V,持續(xù)時間100ms，電穿孔后，立即使用400 tURPMI 1640細胞培養(yǎng) 基將細胞沖洗出樣品池，置冰浴中5min后，轉移到預熱后的培養(yǎng)箱中，37。C培養(yǎng) .10分鐘，然后利用共焦拉曼光譜儀進行單細胞表面增強拉曼光譜檢測。
實施例2
取12mg的硝酸銀溶于50ml去離子水中，加熱至IO(TC使之沸騰，然后將 lml濃度為1%的檸檬酸三鈉逐滴加入，并快速攪拌，滴加完后繼續(xù)保持沸騰4 小時。待此銀溶膠自然冷卻后，用離心機離心分層，將上層清液丟棄，取下層 濃縮的銀溶膠在室溫下避光密封存放備用。
將待測的檢測樣品白血病腫瘤細胞(HL60)首先用市售的RPMI 1640細胞培養(yǎng)液制成上皮腫瘤細胞的單細胞懸液，然后通過血球記數(shù)板計算細胞的含量， 控制細胞密度為106個/1111。
分別取濃縮的銀溶膠與白血病腫瘤細胞(HL60)的單細胞懸液120 1和480 tU室溫下混合后轉入一電擊杯樣品池中，電擊杯電極間隙為2mm，其中細胞數(shù) 量約為3X10S個。將電擊杯冰浴8分鐘，然后置于電穿孔儀內(nèi),選擇手動控制, 加電壓700V,持續(xù)時間50ms,電穿孔后，立即使用400 u 1RPMI 1640細胞培養(yǎng)基 將細胞沖洗出樣品池，置冰浴中8min后,轉移到預熱后的培養(yǎng)箱中，37。C培養(yǎng) 10分鐘，然后利用共焦拉曼光譜儀進行單細胞表面增強拉曼光譜檢測。 實施例3
取10mg的硝酸銀溶于50ml去離子水中，加熱至IOO'C使之沸騰，然后將 lml濃度為2。/。的檸檬酸三鈉逐滴加入，并快速攪拌，滴加完后繼續(xù)保持沸騰6 小時。待此銀溶膠自然冷卻后，用離心機離心分層，將上層清液丟棄，取下層 濃縮的銀溶膠在室溫下避光密封存放備用。
將待測的檢測樣品鼻咽癌腫瘤細胞(C66)首先用市售的RPMI 1640細胞培 養(yǎng)液制成上皮腫瘤細胞的單細胞懸液，然后通過血球記數(shù)板計算細胞的含量， 控制細胞密度為1()S個/ml。
分別取濃縮的銀溶膠與鼻咽癌腫瘤細胞(C66)的單細胞懸液160 tU和640 iU室溫混合后轉入一電擊杯樣品池中，電擊杯電極間隙為4mm，其中細胞數(shù)量 約為4X1()S個。將電擊杯冰浴10分鐘，然后置于電穿孔儀內(nèi)，選擇手動控制，加 電壓IOOOV,持續(xù)時間lms,電穿孔后，立即使用400lURPMI 1640細胞培養(yǎng)基將 細胞沖洗出樣品池，置冰浴中10min后,轉移到預熱后的培養(yǎng)箱中，37r培養(yǎng)10 分鐘，然后利用共焦拉曼光譜儀進行單細胞表面增強拉曼光譜檢測。
權利要求
1、一種表面增強拉曼光譜檢測動物活性單細胞樣品處理方法，其特征是(1)銀溶膠預制備取9～12mg的固體硝酸銀溶于50ml去離子水中，加熱至100℃，然后將1ml檸檬酸三鈉的水溶液逐滴加入，快速攪拌后繼續(xù)沸騰2小時～6小時，得到銀溶膠的粗制品，離心取下層濃縮的銀溶膠備用；(2)單細胞懸液的制備將待測的檢測樣品活性細胞首先用市售的RPMI1640細胞培養(yǎng)液制成單細胞懸液；(3)銀溶膠-單細胞懸液混合液的制備取(1)中制備好的銀溶膠1～4ml進行第二次離心10分鐘，棄上清液后加入50～200μl市售的RPMI1640細胞培養(yǎng)液制成銀溶膠懸浮液，將銀溶膠懸浮液與(2)中制備的單細胞懸浮液按1∶4的體積比例混合混勻，制成銀溶膠-單細胞懸浮液并在室溫下保存；(4)表面增強拉曼光譜檢測樣品預處理過程將混合好的銀溶膠-單細胞懸浮液轉入電擊杯樣品池中，進行冰浴，5～10分鐘后進行電穿孔，而后立即沖洗出樣品池，置冰浴中5～10min后，轉移到培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)10分鐘，即可利用共焦拉曼光譜儀檢測樣品。
2、 根據(jù)權利要求1所述的表面增強拉曼光譜檢測動物活性單細胞樣品處理方法， 其特征是所述的檸橄酸三鈉的水溶液中含有1% 3%的檸橄酸三鈉。
3、 根據(jù)權利要求1所述的表面增強拉曼光譜檢測動物活性單細胞樣品處理方法，其特征是所述的單細胞懸液中細胞密度在105~106個/1111之間。
4、 根據(jù)權利要求1所述的表面增強拉曼光譜檢測動物活性單細胞樣品處理方法， 其特征是所述的電擊杯電極間隙范圍為1、 2、 3或4mm。
5、 根據(jù)權利要求1所述的表面增強拉曼光譜檢測動物活性單細胞樣品處理方法， 其特征是所述的電穿孔電擊電壓在350V 1000V之間，持續(xù)電擊時間50ms~100 u s。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種表面增強拉曼光譜檢測動物活性單細胞樣品處理方法。過程是取固體硝酸銀溶于去離子水中，加熱至100℃，滴入檸檬酸三鈉的水溶液，攪拌后沸騰，離心取下層濃縮的銀溶膠；將待測的檢測樣品活性細胞用細胞培養(yǎng)液制成單細胞懸液；取制備好的銀溶膠進行第二次離心，棄上清液后加入細胞培養(yǎng)液制成銀溶膠懸浮液，將銀溶膠懸浮液與單細胞懸浮液按1∶4的體積比例混合混勻，轉入電擊杯樣品池中，進行冰浴后進行電穿孔，而后沖洗出樣品池，經(jīng)冰浴后轉移到培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，即可利用共焦拉曼光譜儀檢測樣品。本發(fā)明具有簡單快速、可靠性高、通用性好的特點，可獲得活性細胞內(nèi)部清晰穩(wěn)定的表面增強拉曼光譜。
文檔編號G01N21/63GK101482509SQ200910111129
公開日2009年7月15日 申請日期2009年3月3日 優(yōu)先權日2009年3月3日
發(fā)明者馮尚源, 李步洪, 李永增, 林居強, 蔡長美, 榮 陳, 陳偉煒, 黃祖芳 申請人:福建師范大學