專利名稱：支持HCV 1b亞基因組復制的體外細胞模型的建立的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明成功建立了支持中國人群HCV lb亞基因組復制子高效復制的體外細胞模 型，為HCV致病機制、治療藥物篩選和評價等方面的研究打下了基礎(chǔ)。具體地說，本發(fā)明涉 及針對中國人群的HCV lb亞型亞基因復制子的細胞模型的構(gòu)建工藝，包括體外轉(zhuǎn)錄HCV lb亞基因組復制子RNA和體外電穿孔技術(shù)將HCV lb亞基因組復制子RNA轉(zhuǎn)染到Huh-7. 5. 1 細胞系中，涉及使用RT-PCR技術(shù)和Western Blot技術(shù)驗證細胞中HCV亞基因組復制子的 存在，以及通過Real-time PCR檢測細胞中病毒的拷貝數(shù)。涉及該模型在未來的抗HCV藥 物篩選和評價中的醫(yī)學應用。
背景技術(shù)：
丙型肝炎病毒(h印atitis C virus, HCV)是丙型肝炎的致病體，丙型肝炎是世界 范圍內(nèi)的重要傳染病之一。據(jù)估計，目前，世界上有1.7億多人感染該病毒，占人口總數(shù)的 3 %，并呈上升趨勢，每年新發(fā)丙型肝炎病例約3. 5萬例[1]，我國HCV感染率達到3.2%，估計 有四千萬HCV感染者。成人感染HCV后，約50% -80%發(fā)展成慢性丙型肝炎，其中約20%可 發(fā)展成肝硬化，肝硬化患者中，每年約可發(fā)展為肝癌[2]，所以丙型肝炎成為全球性 嚴重危害人民健康的疾病。目前對HCV的預防和治療十分有限，迄今還沒有疫苗問世。HCV 感染者最有效的治療方法為聚乙二醇干擾素聯(lián)合利巴韋林，持續(xù)病毒學應答率可達54% 56%，但該療法對基因型有很強的依賴性，即不同的基因型對治療反應差異很大。此外，其 治療費用頗高，且具有顯著的副作用。因此，迫切需要更加有效的治療方法。HCV發(fā)病機制的研究，抗病毒藥物篩選和疫苗研制都離不開有效的體外細胞模型。 長期以來各國研究人員都在嘗試建立HCV lb亞型的體外細胞復制和感染模型，對于HCV lb亞型，細胞模型的發(fā)展主要經(jīng)歷了人淋巴細胞模型、肝細胞培養(yǎng)模型、HCV復制子轉(zhuǎn)染細 胞模型三個階段。由于前兩種模型普遍存在著細胞系維持時間短，病毒復制水平低等缺陷， 極大的限制了它們的應用價值。而隨著分子生物學的迅猛發(fā)展，HCV復制子轉(zhuǎn)染細胞模型 慢慢成為了廣大科研工作者的研究重點。直到1999年，Lohmarm[3]建立了在肝癌細胞中可 以高水平自主復制的亞基因組復制模型，為HCV致病機制研究及抗病毒藥物評價提供了一 個新的途徑。但是其缺點是細胞的轉(zhuǎn)染效率比較低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是研究建立我國人群中居多的HCV lb亞型亞基因組復制子細胞模型，提 高HCV亞基因組復制子的轉(zhuǎn)染效率。本發(fā)明克隆了中國人群中HCV感染者的亞基因組cDNA并構(gòu)建了具有藥物篩選標 簽的質(zhì)粒，采用體外轉(zhuǎn)錄的方法獲得HCV lb亞型亞基因組復制子RNA，并通過電穿孔的方 法轉(zhuǎn)染入細胞系Huh-7. 5. 1[4]中，經(jīng)過G418藥物篩選6周后，獲得了大量高效復制HCV lb 亞型亞基因組復制子的細胞集落。在此工作基礎(chǔ)上，為了篩選到具有穩(wěn)定遺傳和高效復制 的細胞單克隆，我們在獲得的細胞集落中，挑去90個單克隆進行單克隆化培養(yǎng)，最終得到三個具有穩(wěn)定遺傳和高效復制的細胞單克隆。本發(fā)明的目的在于為未來的HCV機制研究， 抗病毒藥物的篩選和評價提供有力的工具。本發(fā)明研究運用RT-PCR技術(shù)和Western Blot 技術(shù)驗證細胞中HCV亞基因組復制子的存在，并且通過Real-time PCR檢測細胞中病毒的 拷貝數(shù)。證實了細胞模型中存在HCV lb亞型亞基因組復制子，并且有大量的拷貝數(shù)。與此同時，本發(fā)明采用干擾素-a處理細胞模型，確定細胞中HCV亞基因組復制子 的拷貝數(shù)明顯下降。進一步證實了細胞模型中存在HCV lb亞型亞基因組復制子，并模擬了 藥物篩選的過程，為未來的抗病毒藥物的篩選和評價提供有力的工具和實驗方法。小結(jié)本發(fā)明涉及建立我國人群中居多的HCV lb亞型亞基因組復制子細胞模型， 通過RT-PCR技術(shù)和Western Blot技術(shù)驗證細胞中HCV亞基因組復制子的存在，并且通過 Real-time PCR檢測細胞中病毒的拷貝數(shù)。證實了細胞模型中存在HCV lb亞型亞基因組復 制子，并且有大量的拷貝數(shù)。并且采用干擾素_a處理細胞模型，模擬了藥物篩選的過程， 為未來的抗病毒藥物的篩選和評價提供有力的工具和實驗方法。本發(fā)明的主要技術(shù)特征在于(1)該細胞模型是針對我國人群中居多的HCV lb亞型，具有中國的地方特色，為 研究和治療我國丙型肝炎感染者打下基礎(chǔ)。(2)我們轉(zhuǎn)染的細胞系Huh-7. 5. 1具有很好的細胞容受性，克服了電轉(zhuǎn)染效率低 的缺點，獲得了大量的細胞集落。(3)我們采用干擾素-a處理細胞模型，模擬了藥物篩選的過程，為未來的抗病毒 藥物的篩選和評價提供有力的工具和實驗方法。


圖1實驗流程圖A和模擬演示圖B圖2HCV lb亞基因組復制子示意3體外獲得HCV亞基因組復制子RNA圖4體外獲得的支持HCV亞基因組復制子RNA復制的細胞集落圖 5RT-PCR 檢測 HCV NS4B圖 6ffestern Blot 檢測 HCV NS5B 蛋白圖7Real-time PCR檢測細胞中病毒的拷貝數(shù)
具體實施例方式在下面的實施例中進一步說明了本發(fā)明，但并不限制本發(fā)明的范圍。實施例1本發(fā)明中使用的引物序列及用途 實施例2體外轉(zhuǎn)錄HCV lb亞型亞基因組復制子RNA 用Sea I酶把含有HCV亞基因組的質(zhì)粒(pH()線性化，體系lOOul，酶切10ug的質(zhì) 粒，酶切時間4h。酶切結(jié)束后去2ul確認酶切成功。酶切成功后，把酶切體系擴大到200ul， 補充20ul NaAC(ph5. 2)和200ul的酚/氯仿/異丙醇(25 24 1)進行酚/氯仿抽提， 劇烈混勻，4度12000rpm離心15min，取出上層的水相，并加入等體積的氯仿200ul，劇烈混 勻，4度12000rpm離心15min，取出上層的水相，并加入2倍體積即400ul的無水乙醇，-20 度醇沉過夜。醇沉后4度12000rpm離心15min，棄上清，用lml 70%的乙醇洗滌沉淀，4度 12000rpm離心15min，將上清倒掉，放在超凈臺里開風使沉淀干燥15min，加20_30ul的dd 水使沉淀溶解，取2ul測濃度(濃度至少125ng/ul)。按照Ambion公司T7體外轉(zhuǎn)錄酶的實驗說明，以線性化的含有HCV亞基因組的 質(zhì)粒為模板進行體外轉(zhuǎn)錄RNA。體外轉(zhuǎn)錄的體系A(chǔ)TP 2ul，CTP 2ul, GTP 2ul，UTP 2ul， 10 X buffer 2ul, enzyme mix 2ul, template DNAlug，去離子水補充至 20ul。37°C 5. 5h。 加 lulDNase I 在 37 度孵育 30 分鐘，加 115ulRNA-free 水和 15ulNH4Ac，用(ph4. o)酚 / 氯 仿150ul抽提蛋白，4度12000rpm離心15min，取出上層的水相加150ul的氯仿抽提，4度 12000rpm離心15min，取出上層的水相，用120ul的異丙醇_20度過夜沉淀，4度12000rpm 離心15min，用lml 70%的乙醇洗滌沉淀，使沉淀干燥，用30ulRNA-free水溶解沉淀，取2ul 測濃度，質(zhì)量好的RNA應該是0D260/280值在2左右，且濃度不低于lug/ul。實施例3電穿孔技術(shù)把HCV lb亞型亞基因組復制子RNA轉(zhuǎn)染到細胞系Huh_7. 5. 1 Huh-7. 5. 1細胞培養(yǎng)與10cm培養(yǎng)皿上，用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基于37度，5% C02培養(yǎng)至細胞數(shù)量達到2xl07以上，將細胞消化后放入50ml的管子中，1600rpm離心5min， 將上清倒掉，用20ml的opti-MEM(Gibio)重懸，取3個10cm培養(yǎng)皿，每個10cm培養(yǎng)皿培養(yǎng) 5xl06Huh-7. 5. 1 作為 feed cell。將剩余的細胞1600rpm離心5min，倒掉上清，用合適的opti_MEM重懸(比如lml 的opti-MEM(Gibio)重懸)，吹散后計數(shù)，調(diào)整濃度使細胞濃度達到1x107ml，吸取400ul 的細胞懸液放入電轉(zhuǎn)杯同時加入5-10ug的RNA，電擊(Bio-rad電轉(zhuǎn)染儀器的設(shè)置270V， 950uf，電阻100歐，電轉(zhuǎn)杯子4cm)。電擊后的細胞放入5ml的完全培養(yǎng)基中(5. 4ml)，取出 54ul的細胞放入1/100的10cm dish中，取出5. 4ul的細胞放入1/1000的10cm dish中， 將剩余的細胞放入到一個10cm dish中。48h后加G418，使終濃度達到500mg/L。實施例4
單克隆化培養(yǎng)電轉(zhuǎn)染后的細胞在G418的篩選壓力下，經(jīng)過6周，1/1000稀釋的細胞會形成零星 分布的細胞集落。直到細胞培養(yǎng)過程中沒有再出現(xiàn)死亡的細胞為止，就可以進行挑取單克 隆。首先在顯微鏡下選取集落較大，細胞狀態(tài)較好的，作為挑取對象并用筆做好標記。用 PBS洗兩遍，倒掉并使細胞不能太干燥。吸取5ul Trypsin對準標記好的細胞克隆慢慢反復 吸取，將細胞克隆消化，轉(zhuǎn)移到96孔板中，加200ul培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。實施例5RT-PCR 檢測 HCV NS4B 6孔板中的細胞用500ulGTC溶液(含5mol/L異硫氰酸胍，100mmol/L 2-巰基乙 醇的25mmol/L枸櫞酸鈉緩沖液pH7. 0)裂解后，加50ul 2M PH4. ONaAC, 500ul PH4. 0酚， 200ul氯仿，混勻，4度12000rpm離心lOmin，取上清加500ul氯仿，混勻，4度12000rpm離心 lOmin，取上清加600ul異丙醇，_20度過夜沉淀。4度12000rpm離心15min，用lml 70%的 乙醇洗滌沉淀，使沉淀干燥，用30ulRNA-free水溶解沉淀，取2ul測濃度，質(zhì)量好的RNA應 該是0D260/280值在2左右，且濃度不低于lug/ul。
以提取的RNA為模板，隨機六聚體為引物反轉(zhuǎn)錄細胞的總cDNA。
RNAlug
Hexamer(10uM)2. 5ul
dNTP(lOuM)lul
DEPC water補充至 13ul
65度加熱5min，放置冰上。
5xBuffer4ul
DTTlul
核糖核酸酶抑制劑lul
RT 酶lul
25 度 lOmin, 50 度 60min, 70 度 15min
PCR體系(引物設(shè)計見實施例1)
10XPCR 緩沖液2 ill
dNTP(2. 5mM)1 u 1
上游引物(lOiiM)lu 1
上游引物(lOiiM)lu 1
DNA 聚合酶(5U/ ill) 1 ill cDNA 模板1 u 1
加去離子水至總體積 20 ill 實施例6
Western Blot 檢測 HCVNS5B 蛋白
細胞用RIPA溶液裂解后，加SDS煮沸5-10分鐘后聚丙烯酰胺凝膠電泳，并用抗體 檢測NS5B蛋白的表達。實施例7Real-time PCR檢測細胞中病毒的拷貝數(shù)
1)使用的引物(序列見實施例1)引物的設(shè)計原則1.保持G-C含量在20-80%之間。2.避免同一堿基重復過多。 特別是G，不可超過4個及以上。3.用Primer Express 軟件計算出來的Tm值應當在58_60°C 之間。4.在3'端的5個堿基中，G和C堿基加起來不要超過2個。2) Real-time PCR 體系配制(20ul)SYBR Green PCR 預混試劑10ul稀釋的模板lul引物對(5uM)2ul無菌去離子水7ul每種引物，每種模板，各3個平行管反應。3) Real-time PCR 反應程序95°C，lmin，95°C，15s 60°C，lmin。循環(huán)重復第 2，3 步 40 次。(儀器ABI7500 型)4)結(jié)果統(tǒng)計學處理計算同一個樣品HCV的Ct值與GAPDH的Ct值的比值，取3個 平行孔Ct比值的平均數(shù)。做圖時將未經(jīng)過藥物處理的細胞的Ct比值的平均數(shù)設(shè)為100，計 算出所有樣品的相對值后做圖。參考文獻[1]中華醫(yī)學會肝病學分會，中華醫(yī)學會傳染病與寄生蟲病學分會.丙型肝炎防 治指南[J].中華醫(yī)學雜志，2004，84 (9) 775-780.[2]莊輝.重視丙型肝炎的研究[J].中華肝病雜志，2004，12 (2) =65-66.[3]Lohmann V, Korner F, Koch J, et al. Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell line[J] Science,1999，285 (5424) 110-3.[4]Zhong J, Gastaminza P, Cheng G, et al. Robust hepatitis C virus infection in vitro[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,2005,102(26) :9294_9.
權(quán)利要求
構(gòu)建的支持中國人群HCV 1b亞型亞基因組復制子高效復制的細胞模型，采用干擾素-α處理細胞模型，確定細胞中HCV亞基因組復制子的拷貝數(shù)明顯下降。進一步證實了細胞模型中存在HCV 1b亞型亞基因組復制子，并模擬了藥物篩選的過程，為未來的抗病毒藥物的篩選和評價提供有力的工具和實驗方法。
2.一種含有權(quán)利要求1所述的含有中國人群HCV Ib亞型亞基因組復制子的真核表達 質(zhì)粒，即 Pi7K-HCVlb。
3.一種由權(quán)利要求2所述的質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄得到的中國人群HCV Ib亞型亞基因組復制 子 RNA。
4.一種含有權(quán)利要求3所述的HCV Ib亞型亞基因組復制子RNA的細胞模型。
全文摘要
本發(fā)明涉及建立我國人群中居多的HCV 1b亞型亞基因組復制子細胞模型，通過RT-PCR技術(shù)和Western Blot技術(shù)驗證細胞中HCV亞基因組復制子的存在，并且通過Real-time PCR檢測細胞中病毒的拷貝數(shù)。證實了細胞模型中存在HCV 1b亞型亞基因組復制子，并且有大量的拷貝數(shù)。并且采用干擾素-α處理細胞模型，模擬了藥物篩選的過程，為未來的抗病毒藥物的篩選和評價提供有力的工具和實驗方法。因此該模型為進一步研究HCV致病機制、治療藥物篩選及疫苗方面的研究打下了基礎(chǔ)。同時本發(fā)明體外轉(zhuǎn)錄了中國人群中居多的HCV 1b亞型亞基因組復制子RNA，為進一步研究中國丙型肝炎感染者提供了前提。
文檔編號C12N5/10GK101864397SQ200910081860
公開日2010年10月20日 申請日期2009年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月14日
發(fā)明者盧捷, 彭小忠, 李 瑞, 辛中帥, 陰彬, 陳慧毅, 龔燕華 申請人:中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所