專利名稱：：蘇云金芽孢桿菌ywc2-8及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種微生物新菌株及其應用，具體地說是一種蘇云金芽孢桿菌及其在農(nóng)業(yè)蟲害防治中的應用。
背景技術(shù)：
：在人類生產(chǎn)過程中，蟲害是造成農(nóng)業(yè)生產(chǎn)損失及影響人類健康的重要因素，據(jù)FAO統(tǒng)計，全世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)每年因蟲害造成的經(jīng)濟損失高達14%，病害損失達12%,草害損失達11%。損失額高達1260億美元，相當于中國農(nóng)業(yè)總產(chǎn)值的一半，英國的4倍多。另外，蚊媒病在預防醫(yī)學中占有重要位置，其中登革熱和黃熱病等紋媒病傳播力強、流行面廣、發(fā)病率高、危害性大。據(jù)WHO統(tǒng)計，全世界每年感染登革熱人數(shù)多達8000萬，我國的海南省在1980和1986年曾經(jīng)暴發(fā)過兩次登革熱，發(fā)病分別達到437469例和113589例。登革熱和黃熱病主要由埃及伊紋傳播。為了減少這些損失，多年來，對農(nóng)作物害蟲及蚊蟲普遍釆用化學防治手段進行防治，但由于化學農(nóng)藥的長期、大量使用，造成了對環(huán)境的污染，農(nóng)副產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留量增加，給人類的生存和健康帶來了危害。此外，化學農(nóng)藥在殺滅害蟲的同時，也殺傷了天敵及其它有益物，破壞了生態(tài)平衡。與化學防治相比，生物防治具有安全、有效、持久的特點。并且避免了化學防治帶來的一系列問題。因此，生物防治技術(shù)成了人們研究的熱點。在生物殺蟲劑中，蘇云金芽孢桿菌是目前世界上用途最廣、產(chǎn)量最大的一類微生物殺蟲劑。蘇云金芽孢桿菌(Sacz'〃w/2wW"g^ra^，簡稱Bt)是一種革蘭氏陽性細菌，它的分布極為廣泛，在芽孢形成的同時可形成具有殺蟲活性的由蛋白質(zhì)組成的伴胞晶體，又名殺蟲晶體蛋白(Insectididalcrystalproteins,簡稱ICPs)，ICPs是由cry基因編碼的，對敏感昆蟲有強烈毒性，而對高等動物和人無毒性。近幾十年來，Bt已廣泛應用于控制多種鱗翅目、雙翅目、鞘翅目等害蟲。此外，Bt還對膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目等多種害蟲及植物病原線蟲、螨類、原生動物有控害作用。目前在農(nóng)田害蟲、森林害蟲及衛(wèi)生害蟲的防治中Bt已成為化學合成農(nóng)藥的有力替代品，Bt還是轉(zhuǎn)基因抗蟲工程植物重要的基因來源。3自1981年Schnepf從菌株HD-lDipel中克隆了第一個能表達殺蟲活性的基因以來(AdangM.Je,a/,CharacterizedfUll-lengthandtruncatedplasmidclonesofthecrystalproteinof5ac/〃w//z訓'wgz'eww、subsp.Awr加A:/HD-73andtheirtoxicitytoManducasexta，Gene,1985，36(3):289~300.)，人們已經(jīng)分離克隆了390多種編碼殺蟲晶體蛋白的基因，根據(jù)編碼的氨基酸序列同源性它們被分別確定為不同的群、亞群、類和亞類(CrickmoreN，ZeiglerDR，F(xiàn)eitelsonJ,eZRevisionofthenomenclaturefortheZa".〃ws^2Mr/"g7'era7Jpesticidalcrystalproteins.MicrobiolMolBiolRev,1998,62:807-813;http:〃www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil—Crickmore/Bt/)。一般而言，Cryl,Cry2和Qy9等毒蛋白對鱗翅目害蟲有效；其中研究的最多的是Cryl和Cry9類蛋白，它們編碼的殺蟲晶體蛋白分子量為130-140kD，許多基因目前已被廣泛應用于植物的鱗翅目害蟲的防治(Kozie,M.G.,Beland，G.L.,Bowman,C.,W<a/.Fieldperformanceofelitetransgenicmaizeplantsexpressinganinsecticidalproteinderivedfrom5腦7/ws^7譜'，'e腦's.Bio/Technology，1993,11:194-200;Perlak,RJ.,Deaton,R."W.,Armstrong,T.A.，a/.Insectresistantcottonplants,bio/technology，1990;8:939-943;VanFrankenhuyzen，K.，Gringorten,L.,andGauhier,D.1997.Cry9Caltoxin,a5ac/〃附^2Mn."g/ms^insecticidalcrystalproteinwithhighactivityagainstthesprucebudworm(Choristoneurafnniferana).Appl.Environ,Microbviol.63:4132-4134;王飛，2001,蘇云金芽孢桿菌特異菌株生物學特性及cr;;9新基因的研究，碩士論文，南開大學)。蘇云金芽胞桿菌以色列亞種(i.,/z"W"g/era^subsp.^rae/m^，簡稱Bti)產(chǎn)生的毒素蛋白對蚨蟲具有很好殺蟲活性，被廣泛運用于紋蟲的防治(GoldbergLJ，andMargalitJ,1977.AbacterialsporedemonstratingrapidlarvicidalactivityagainstJwo//2e/esserge油'/,t/rawotaem'a,gz^cwto"，CWexUe《ae^/ri，andCWexp—era.MosqitoNews'37:355-358;)。同時，Cyt蛋白具有溶細胞性，對某些Cry蛋白具有增效作用及延緩昆蟲的抗性(Wu,D.,Johnson,J.J.，andFederici,B.A.1994.SynergismofmosquitocidaltoxicitybetweenCytAandCryIVDProteinsusinginclusionsproducedfromclonedgenesoffiordsAi/Wwg/em^.Mol.Microbiol.13:965-972;Wirth,M.C.,Georghiou,G.P"andFedereci，B.A.1997.CytAenablesCrylVendotoxinsof5a"7/w51Z/z腦."g/e腦'stoovercomehighlevelsofCrylVresistanceinthemosquito,Cw/ex，—Proc.Natl.Acad.Sci.94:10536—10540)自本世紀初發(fā)現(xiàn)蘇云金芽胞桿菌至今己有100多年的歷史，在農(nóng)作物和園藝植物害蟲、森林害蟲以及衛(wèi)生害蟲的防治方面得到廣泛的應用，也起到良好的效果。但是，由于大規(guī)模和反復使用蘇云金芽胞桿菌，許多昆蟲種群己相繼在不同程度上對殺蟲晶體蛋白產(chǎn)生了抗性。以Bt殺蟲晶體蛋白為基礎(chǔ)的殺蟲劑的使用已有50多年的歷史，最初一直沒有檢測到昆蟲對Bt的抗性，但是，上世紀80年中期開始，抗性問題不斷在實驗室及田間試驗中得至ll證實(McGaughey,W.H.1985.InsectresistancetothebiologicalinsecticideBac,7toAwh"g/e脂iScience.229:193-195)，原因主要是持續(xù)使用單品種及亞致劑量的Bt以及Bt轉(zhuǎn)基因抗蟲植物的應用造成昆蟲種群長期受到殺蟲劑的選擇壓力。1985年，McGaughey報道倉庫谷物害蟲印度谷螟(Plodiainterpunctella)在Dipel(Btsubsp.kurstaikHD-1的商品制劑)的選擇壓力下，繁殖15代后，抗性增加97倍；在高劑量選擇壓力下，抗性可增加250倍。1990年，在夏威夷首次證實大田中的小菜蛾對Bt殺蟲劑產(chǎn)生了明顯的抗性(Tabashnik，B.E.,Finson，N.,Groeters,F.R.,a/.1994.Reversalofresistanceto5ac/〃仏s^z鵬'wgz'em7i/"/V她〃ax>7cwfe〃(3.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.91:4120-4124)，上世紀卯年代以來，在我國應用Bt殺蟲劑時間較長的深圳、廣州、上海等地，發(fā)現(xiàn)Bt殺蟲劑對小菜蛾防治效果明顯下降，意味著抗性已經(jīng)形成(馮夏.1996.廣東小菜蛾對蘇云金桿菌的抗性研究.昆蟲學報，39(3):238-244;Hofte,H.,VanRie,J.,Jansens,S.，VanHoutven,A.，Vanderbruggen，H,,andVaeck,M.，1988.Monoclonalantibodyanalysisandinsecticidalspectrumofthreetypesoflepidopteran-specificinsecticidalcrystalproteinsof5鎖7/w5^2wn'"g/e腦i.App1.Environ.Microbiol.54:2010-2017)。目前發(fā)現(xiàn)在實驗室及田間至少有十幾種昆蟲對Bt及其殺蟲晶體蛋白產(chǎn)生了抗性，用選擇壓力數(shù)學模型預測到，在Bt轉(zhuǎn)基因抗蟲植物選擇壓力的條件下，昆蟲將會產(chǎn)生抗性(Schnepf,E.,Crickmore，N.,VanPie,J.，etal.1998.5a"7/wsAwn'wg/em^anditspesticidalCrystalproteins.Microbiol.Mol.Biol.Rev.65(3):775-806)另夕卜，有研究證明Bti在大田的使用中尚未發(fā)現(xiàn)抗性問題(RegisL，"2000.TheuseofbacteriallarvicidesinmosquitoandblackflycontrolprogramsinBrazil.Mem./m份wtoOswaWoOmz，95:207-210.),但是紋蟲對其抗性問題不斷在實驗室中得到證實，這種情況也可能會在大田中出現(xiàn)(GeorghiouGP,andWirthMC,1997.Influenceofexposuretosingleversusmultipletoxinsof5a"7/wsA,'Mg/e腦、subsp./srae/em7,sondevelopmentofresistanceinthemosquitoCWex，—w咖sc/ato(Diptera:Culicidae).j/p//e<i五"Wrawme齒/63:1095-1101.)。為避免抗性昆蟲所造成的損失，尋找新的高毒力菌株及基因資源是解決這個問題的有效途徑，這對我國的生物防治也有著十分重要的意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和衛(wèi)生安全領(lǐng)域的一些主要害蟲，特別是蔬菜、棉花、玉米、水稻、以及森林等同翅目、鞘翅目、鱗翅目害蟲和傳播登革熱和黃熱病等妖媒病的雙翅目害蟲具有較高毒力的蘇云金芽孢桿菌新菌株YWC2-8。本發(fā)明菌株是四川省成都平原土壤中分離得到的蘇云金芽孢桿菌(Sac/〃wAwn'"g/e"^)新菌株，該菌株已于2009年1月12日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京巿朝陽區(qū)大屯路甲3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)保藏，分類命名為蘇云金芽孢桿菌(S""7/w5^^"g〖my/5),保藏號為CGMCCNo.2860。YWC2-8具體通過如下方法篩選獲得采用醋酸鈉-抗生素分離法，稱取10g土樣放入裝有50ml醋酸鈉培養(yǎng)基的搖瓶中，分別加入青霉素鈉鹽和硫酸慶大霉素各400iag/ml,搖床培養(yǎng)(200r/min，30°C)4h。培養(yǎng)結(jié)東后取土壤懸液10ml，加入無菌的離心管3000r/min離心15min,取上層混濁液2ml于65。C水洛15min,取熱處理后的混濁液O.lml涂平板，將平板置3(TC培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48h后從平板上挑取類似Bt的菌株涂片。發(fā)現(xiàn)一株含有球狀晶體形態(tài)的Bt菌株，將其命名為YWC2-8。經(jīng)鑒定，關(guān)于該菌株的信息包括能形成芽胞，同時能形成球形伴胞晶體(見附圖1),SDS-PAGE電泳表明，菌株YWC2-8主要產(chǎn)生約130，70kDa左右大小的2種蛋白(見附圖2);其晶體蛋白在16小時開始表達，而生長曲線表明其16小時已進入停滯期(見附圖3)，表明該晶體蛋白啟動子可能為依賴芽孢形成的；生物學測定表明，該菌株對對鱗翅目棉鈴蟲殺蟲活性最高，丄G。為3.7嗎/mL;對同翅目灰飛虱殺蟲活性的lC5fl為13.6嗎/mL;對鞘翅目暗黑鰓金龜殺蟲活性的丄C5。為25.7cfU/mL;對雙翅目伊紋的丄C^為15.02嗎/mL(見表1)。表1YWC2-8的殺蟲活性<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>本發(fā)明進一步對菌株YWC2-8中的cr;;基因進行了鑒定。結(jié)果表明，YWC2-8中存在和cryM類基因。釆用基因組DNA純化試劑盒(購自賽百盛公司)提取菌株YWC2-8的總DNA;分別設計全長基因引物并以菌株YWC2-8總DNA為模板，分別擴增co^56和ctj4的全長基因，結(jié)果表明它們的全長分別約為2kb和3.5kb(圖4)。分別將純化后的PCR產(chǎn)物與pGEM-T載體連接，轉(zhuǎn)化，分別挑取有目的片段的陽性克隆，進行測序。將測序結(jié)果在GenBank上進行檢索，結(jié)果表明所獲的的基因均為新基因。cr_y56和cr少4基因的核苷酸序列分別如序列表SEQIDNo.1和3所示。現(xiàn)將它們分別命名為co^6AJ、co^CW。通過對YWC2-8的毒力測試表明，YWC2-8對鱗翅目害蟲、鞘翅目和雙翅目害蟲等等，均具有極高的毒力。因而，可以將本發(fā)明蘇云金芽孢桿菌YWC2-8或其發(fā)酵液制成殺蟲劑，用于農(nóng)作物害蟲的防治。從而使蘇云金芽孢桿菌殺蟲劑的產(chǎn)品多樣化和系列化，擴大了蘇云金芽孢桿菌殺蟲劑的使用范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以根據(jù)本發(fā)明公開的基因，將其轉(zhuǎn)化棉花、玉米、水稻、蔬菜等農(nóng)作物，使其具備相應的抗蟲活性。從而降低農(nóng)藥的使用量，減少環(huán)境污染，具有重要的經(jīng)濟價值和應用前景。圖1為YWC2-8菌株的球形伴孢晶體、芽孢及營養(yǎng)細胞(5000x);圖2為YWC2-8菌株SDS-PAGE電泳分析，其中M為蛋白質(zhì)Marker;圖3為YWC2-8菌株的生長曲線；圖4為YWC2-8菌株中基因型的PCR鑒定，其中M為DNAMarker100bp,l為cry4類基因擴增產(chǎn)物，2為cry56類基因擴增產(chǎn)物；圖5菌株YWC2-8中co;56和cr少4全長基因的PCR擴增產(chǎn)物，其中M為DNA分子量標準，1為cry4的PCR產(chǎn)物，2為cry56的PCR產(chǎn)物。具體實施方式以下實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實施例l蘇云金芽孢桿菌的條選與鑒定土壤釆自四川省成都溫江地區(qū)。采用醋酸鈉-抗生素分離法，稱取10g土樣放入裝有50ml醋酸鈉培養(yǎng)基的搖瓶中，分別加入青霉素鈉鹽和硫酸慶大霉素各400嗎/ml，搖床培養(yǎng)(200r/min,30°C)4h。培養(yǎng)結(jié)東后取土壤懸液10ml,加入無菌的離心管3000r/min離心15min，取上層混濁液2ml于65r水浴15min,取熱處理后的混濁液O.lml涂平板，將平板置3(TC培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48h后從平板上挑取類似Bt的菌株涂片。發(fā)現(xiàn)一株含有球狀晶體形態(tài)的Bt菌株(見附圖1)。經(jīng)用光學顯微鏡和電子顯微鏡觀察，該菌株細胞呈桿狀，兩端鈍圓，菌株大小為1.2-1.5|_imx3.5-4.4(^m,通常單個、或兩個、或短鏈細胞存在，一個營養(yǎng)細胞為一個孢子囊，每個孢子囊內(nèi)含有一個芽孢，次端生，另一端有一個伴孢晶體，孢子囊不膨大。將該Bt菌株命名為YWC2-8，并進行了保藏，保藏號為CGMCCNo.2860。實施例2菌株YWC2-8中c/^基因的鑒定采用基因組DNA純化試劑盒(購自賽百盛公司)提取菌株YWC2-8的總DNA。分別根據(jù)co;4和ct少56類基因保守序列設計特異對。根據(jù)cry4類基因設計一對特異引物5-GTGTCAAGAGAACCAACAGTATG-35陽ACTAAGTCTCCTCCTGTATGACCAG-3根據(jù)cry56類基因設計一對通用引物5-AATAAAAATGAATATGAAATATT-35-TTTCACAGCCGGAATTTGTGTAAT-3用下列PCR反應體系鑒定10Xbuffer2.5|ilMgCl2(25mM)1.5(_ilTaq酶0.2jildNTPs(2.5mM)2|al引物2^1模板5^1最終反應體積25|il熱循環(huán)反應94。C預變性5min;94。C變性lmin,56。C退火lmin,72。C延伸2min，30個循環(huán)；72'C延伸5min;4。C停止反應。擴增反應產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳，置凝膠成像系統(tǒng)中觀察PCR擴增結(jié)果(見附圖4)。實施例3菌株YWC2-8中co^和《j56基因的克隆采用基因組DNA純化試劑盒(購自賽百盛公司)提取菌株YWC2-8的總DNA;設計其全長基因引物P1、P2、P3、P4(引物序列如下)；以菌株YWC2-8總DNA為模板分別用所述引物進行PCR擴增，反應體系和反應程序同實施例2;以菌株YWC2-8總DNA為模板，用Pl和P2擴增cr^56全長基因，得到長約2kb的片段；用P3和P4擴增co;4全長基因，得到長約3.5kb的片段。分別將純化后的PCR產(chǎn)物與pGEM-T載體連接，轉(zhuǎn)化，分別挑取一個有目的片段的陽性克隆，測序，分別得到序列SEQIDNOl和SEQIDN03。P1:5，ATGAATTCATATCAAAATAAAAATGA3'P2:5，CTAGAGATTATTGGTAAACAAATCGT3'P3:5，ATGTCTAATCGTTATCAACGGTACCC3'P4:5，TCACTCGTTCATACAAATCAACTCGA3'1.co^56A基因的序列分析序列SEQIDNOl的全長為1992bp，分析表明，GC含量為37.15%,編碼663個氨基酸組成的蛋白。經(jīng)測定，其氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。在softberry網(wǎng)站采用bacterialsigma7.0promoter程序?qū)θ蛄羞M行預測表明，在基因編碼區(qū)上游含有RNA聚合酶活化位點的序列，將其命名為c^56A/。本發(fā)明進一步分析了Cry56Aal蛋白的氨基酸組成(見表2)。表2Cry56Aal蛋白的氨基酸組成<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>2.cry4Cb2基因的序列分析序列SEQIDN03的全長為3474bp，分析表明，GC含量為35.90%，編碼1157個氨基酸組成的蛋白。經(jīng)測定，其氨基酸序列如SEQIDN04所示。在softberry網(wǎng)站采用bacterialsigma7.0promoter程序?qū)θ蛄羞M行預測表明，在基因編碼區(qū)上游含有RNA聚合酶活化位點的序列。將其命名為crj^CW。本發(fā)明進一步分析了Cry4Cb2蛋白的氨基酸組成(見表3)。表3Cry4Cb2蛋白的氨基酸組成<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實施例4菌株YWC2-8的活性檢測對鱗翅目害蟲將菌株YWC2-8在液體LB培養(yǎng)基中30°C,200r/min振蕩培養(yǎng)30h;離心收集菌體(12,000r/min,15min,4°C),超凈工作臺風干，計量菌體重量；然后把菌株懸浮于蒸餾水中，配制成從l嗎/ml到100ng/ml6個不同濃度；選老嫩適中的卷心菜葉片洗凈，晾干；紫外燈下照射15min,剪成2x2cm2大小，分放在不同濃度菌液中，浸泡5min;取出瀝去多余的液體，放在消毒的培養(yǎng)皿中晾干，以LB浸泡葉片作為對照，每個培養(yǎng)皿放4片葉片；選放健康的2-3齡棉鈴蟲30頭；每處理重復3次，置室內(nèi)，于3d后調(diào)查幼蟲死亡情況，用SPSS10.0軟件計算LC5o;結(jié)果如表1,表明菌株對這類害蟲具有毒殺活性。對雙翅目害蟲將菌株YWC2-8在液體LB培養(yǎng)基中30°C,200r/min振蕩培養(yǎng)30h;離心收集菌體(12,000r/min,15min,4°C)，超凈工作臺風干，計量菌體重量；然后把菌株懸浮于蒸餾水中，配制成從l昭/ml到100ng/ml6個不同濃度；選放健康的4齡敗紋30頭于1L含不同菌體濃度懸浮液中；每處理重復3次，置28。C培養(yǎng)箱內(nèi)，于24h后調(diào)查幼蟲死亡情況，用SPSS10.0軟件計算LC5。；結(jié)果如表l，表明菌株對敗紋具毒殺活性。對鞘翅目害蟲Bt菌株在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天后，刮下并懸浮于無菌水中，釆用乳糖懸浮丙酮沉淀的方法，制備成粉劑備用。將上述粉劑按照2倍等比級差梯度濃度稀釋。將稀釋液，加入到均勻粗細土豆絲的滅菌細土中混勻，以20d暗黑鰓金龜作為供試蟲主，每個處理接蟲30頭，重復三次，以加入清水的處理作為空白對照，感染飼養(yǎng)7天、14天檢查死蟲數(shù)，用SPSS10.0軟件計算LC5。；結(jié)果如表1,表明菌株對暗黑鰓金龜具毒殺活性。對同翅目害蟲Bt菌株在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天后，刮下并懸浮于無菌水中，釆用乳糖懸浮丙酮沉淀的方法，制備成粉劑備用。將上述粉劑按照2倍等比級差梯度濃度用10%白糖水稀釋。用滅菌過的黃色吸水紙制成直徑為3mm的實心圖柱，于Bt懸浮液中浸泡30sec后，放于直徑為25cm的培養(yǎng)皿中，以3d齡灰飛虱作為供試蟲主，每個處理接蟲30頭，重復三次，以加入清水的處理作為空白對，照72h檢查死蟲數(shù)，用SPSS10.0軟件計算LCs。；結(jié)果如表l,表明菌株對灰飛虱具毒殺活性。序列表說明SEQIDNo.l&2、SEQIDNo.3&4分別是CT;^"a7基因和cry4Cb2的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列；SEQIDNo.5&6、SEQIDNo.7&8是用于擴增cr_y￥類和cr_y56基因保守序列的特異性引物；SEQIDNo.7&8、SEQIDNo.9&10用于擴增co;5"a7和cry4Cb2基因的特異性引物。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>165170175getaggttccacacagtaaatggtgettttgtaacagcaatgcgctta576A]aArgPheHisThrValAsnGlyAlaPheValThrAlaMetArgLeu5180185190ttcagaccggcaggtta.tgaagca.ttactgttaccagULatgcacaa624PheArgProAlaGlyTyrGluAlaLeuLeuLeuProValTyrAlaGin19520020510gcggc:gcgtcttcatttaetccatttacgagatggtgtcctgtttgcg672AlaAlaArgLeuHisLeuLeuHisLeuArgAspGlyVal.LeuPheAla21021522015aatg助tggggsctagetei朋ccagaccctggetgactta^catg3ccaa720AsnGluTrpGlyLeuAlaLysProAspProGlyAspLeuHisAspGin225230235240gaatttaatgetaaggecgetgagtatgcagattattgtgaattaacg76820GluPheAsnAlaLysAlaAlaGluTyrAlaAspTyrCysGluLeuThr245250255t.ataatacagagctaaaccgcattaaaactact.txaggtaaaacaLgg816TyrAsnTh.rGluLeuAsnArglieLysThrThrSerGlyLysThrTrp25260265270ittgattataal:caataccgacg'acttatgacatttgetgttttggat864PheAspTyrAsnGinTyrArgArgLeuMetThrPheAlaValLeuAsp27528028530glagttgetaaatttteaattttaaatcctcgcatatatagettaget912ValValAlaLysPheSerLieLeuAsnProArglieTyrSerLeuAla29029530035ttgcaaggagaaattetcactcga助aatatataccgatcctgttaat960LeuGinGlyGlulieLeuThrArgLyslieTyrThrAspProValAsn305310315320ttcteaccaggttctteaattgcagatgatgaaaatagatatacagtc100840PheSerProGlySerSerlieAlaAspAspGluAsnArgTyrThrVal325330335ccaccateacatgttagacsattagtcaacteaagattattta.ct.肌c1056ProProSerHisValArgGinLeuValAsnSerArgI」euPheThrAsn45340345350gtggcatctgttca,a,aatget.ggatttattggaaatcaa肪tcgttat1104ValAlaSerValGinAsnAlaGlyPhelieGlyAsnGinAsnArgTyr355360'36550a朋aatataggcgttagegatctagttgatggtcctataateggac朋1152LysAsnlieGlyValSerAsp1x、uValAspG丄yProlielieGlyGin37037538055teagtattcg朋aaagtggatgcagatataccgacti肌tgtateggtt1200ScrValPheG丄uLysValAspAlaAsplieProThrAsnValSerVal3853903954001:UPheg肌GlugttValggtGlyVal405肌tAsnggtGlyliecagGin犯cAsn410gatAsptatTyrCC￡lProcgaArg犯tAsn415lieL248ggtGlyttg匕eua朋Lys卿Lys420actThrcctPtoteaSerAsngcaAla425tttPhe3C3ThraatAsnAsntat丁yr430getAlaggaGly129610agtSerThr犯tAsn435aatAsnggtGlycctProtttPhe440actThracgThrValtctSerttgLeu445CCflProProLys134415AspgatAsp450LysProLeu糾AspcatHis455actThr犯tAsntttPheSercatHis460六rgttaLeutC￡LScrgatAsp139220atalie465attliecttLeucctProGlyAsn470紐gLysggcG丄yteaSertctSertttPhe475AlatggTrpactThrcatHisgttVal480144025gatAspata〗legtcValcctProgat.AspgetAlacctProThr500ax:3Thr485LysGlygcaAla肌cAsntctSertatTyrLeueta匕eu505teaSer490ProThrcttLeuactThrtegSer鄉(xiāng)LysttcPheliecagGln510犯tAsn495etaLeuttaLeu鄧a^Argl棚153630aagLys卿GlyPro515卿GlytttPheatalieGlyGly520gatAspLeuVal卿ArgLeu525哪AsnGly158435ValGly530lieSerTyrLysPhe535AsnttcPheGintecSertecScr540gatAspageScrtCELScrgetAla1632肌tAsn40545UtPheliecgtArg丄丄e550cgttatTyrAlaggtGlygcaAla555ggtGlyteaSerGlygetAlaagtSer560168045ggtGlyact:ThrGlytctSergggGlytggTrpcagGinGly580gt￡lVal細estHistatTyractThrtttPhe卿GlyLystttPhettaLeug￡LCAsp585gggGly570tctSerAsnAsntst犯"LAsnc肌GingtgValtctSer卿590cca_Pro575tatTyrgatAspaatAsn"28177650c肌GinUtPhe595ValLeugagGlucttLeuttgLeu600ggaGlyactThrAla卿GlyaacAsn605attlieThrgetAla182455肌cAsn明c八sp610ttgLeug肌Glulieliegta,Val615tggTrpThr觀gAspPro620gg丄GlygetAlatctSerAsp187214tttPhe625g肌Glugat10AspTyrLeuTyrAsnttgtt.tLeuPhegatAspg肌GluThr660CC￡iPro645犯tAsnttgLeu630caaGinaatAsng貼GluLysetcLeuttaLeuttgLeutag3tCCC3lieProgad3C3GluThr650<210>215<211>663<212>PRT<213>Bacillus<400>220MetAsnSer1thuringiensisYWC2-8TyrGinAsnLysAsnGluArg252025Ala40115120Leu45Leu14550TyrAla55130Tyr10GlyAlaAlalieAlaAlaAlaLeuThr100105GinGlyProAspValPheAsmGluLeuMetArgGlulieGluThrTyrValArg135LeuAlaLeuGluAspGinArgAlaTyr150TrpArgLeuHisProThrAspGlyAsn165170ArgPheHisThrValAsnGlyAlaPheatgacggggatateaacaMetThrGlylieSerThr635640gcc肌3el朋gcggtg肌cAlaLysLysAlaValAsn655AsnAsnSerAsnMetSerThrArgTyrGlulieSerAspAlaSer15ProArgTyrProLeuAla30AsnAsnProGinMetProMetArgAsnThr3540AlaMetCysAlaAspAsnLysAspAsnGlu305055LeuAspGinG丄uTrpArgThrValLeuPro657035AlaSerLeuThrGlyLeulieScrLeuPro8590AsnTyrLys45GinValPro60GluTrpLeulieSerPro180185lieLeuPheSerAlaAla7580ThrPhcGlyAlalieScr95SerlieL,euPheProSer110GlyAlaThrGluAsnLeu125GlyArgAlaAlaSerGlu140PheLysSerAlaPheAsp155160AlalieAlaThrValAla175ValThrAlaMeLAi'gLeu1901920l恥81992<image>imageseeoriginaldocumentpage16</image>lieProAlaThrLysAlaSerLys500LeuProLeuSerPheGinLeuArg505510LysGlyProGlyPhelieG丄yGly515520AspLeuValArgLeuGlyAsnGly52515Val10Asn545530TieSerTyr'LysPheAsn535PheArglieTyrArgPheGinSerSerAspSerSerAla540lie550ArgGlyGlyGlyGinValTyrPheLys565ThrSerTrpGlyHisThrGlyPhe580ArgTyrAlaGlyAlaGlySerGlyAlaSer555560LeuGlyAsnTyrGinSerProAsp570575AspSerAsnAsnValLysTyrAsn58559020GinPheLysValLeuGluLeuLeu595600GlyThrAlaGlyAsnlieThrA1e605AsnAspLeuGlulielieValTrp610615ThrArgAspProGlyAlaSerAsp62025Phe62530TyrLeuAspArgL>euG丄uLeu630GluTyrAsnGluProGinLysLeu645AspLeuPheThrAsnAsnLeu660丄丄eProMetThrGlylieSerTh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