專利名稱：一種構(gòu)建釀酒酵母乙醇高產(chǎn)菌株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種全基因組的改造方法,特別是涉及一種構(gòu)建釀酒酵母乙醇高產(chǎn)菌株的 方法。
技術(shù)背景釀酒酵母乙醇發(fā)酵的糖一醇轉(zhuǎn)化率、發(fā)酵速率以及對(duì)乙醇的耐受力是受多基因調(diào)控的 復(fù)雜遺傳性狀，很難通過(guò)傳統(tǒng)的誘變育種、代謝工程以及針對(duì)特定基因或代謝途徑的其它 遺傳操作方法進(jìn)行改善。因此采用全基因組系統(tǒng)工程的方法對(duì)釀酒酵母進(jìn)行遺傳改造無(wú)疑 是解決上述問(wèn)題的更有效途徑。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種構(gòu)建釀酵母乙醇高產(chǎn)菌株的方法。 本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下-一種構(gòu)建釀酒酵母乙醇高產(chǎn)菌株的方法，包括如下步驟(1) 以Ycplac33為載體，構(gòu)建帶有受半乳糖誘導(dǎo)啟動(dòng)子調(diào)控的//<9基因的質(zhì)粒 YCplac33-GHK;該質(zhì)粒載有基因的開放閱讀框和終止子，ZfO基因的啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型 啟動(dòng)子GAU，同時(shí)該質(zhì)粒還載有《fl"MY選擇標(biāo)記；(2) 將質(zhì)粒YCplac33-GHK轉(zhuǎn)入釀酒酵母雙倍體菌株M4raAx中，通過(guò)半乳糖誘導(dǎo)后 再做PCR驗(yàn)證菌株的交配型即可得到同宗配合的酵母雙倍體細(xì)胞M4ra/a和M4ra/a，將它 們進(jìn)行融合后通過(guò)PCR驗(yàn)證菌株的交配型，其中PCR產(chǎn)物有544bp和404bp兩條帶對(duì)于 的菌株即釀酒酵母四倍體；(3 )用芬苯達(dá)唑(methyl benzimidazole-2-yl-carba-mate， MBC)處理所述釀酒酵母四倍 體，使之發(fā)生染色體缺失，通過(guò)乙醇發(fā)酵得到非整倍體釀酒酵母乙醇高產(chǎn)菌株。 優(yōu)選的是所述步驟(1)為1) 提取酵母染色體DNA，并以其為模板，用引物GAL2-up和GAL2-dn，做PCR擴(kuò) 增，得到786bp的PCR產(chǎn)物，此DNA片段是04丄2基因啟動(dòng)子序列；所述引物GAL2-up 為5'-GGGCCCGAATTCATGCTTTCTGAAAACACGAC-3'， 所述引物GAL2-dn為 5'-GGGCCCGAGCTCGTTAAGACTGCATTCATCAC-3';2) 用體積比為1: 1的苯酚一氯仿混合物純化PCR產(chǎn)物；分別用五CORI和SflCl雙酶 切純化后的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒YCplac33;然后做連接并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 中，待含有IPTG和X-Gal的LBA平板上長(zhǎng)出轉(zhuǎn)化子后提質(zhì)粒；再用五coRI和Sacl雙酶 切，將酶切產(chǎn)物跑瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證，即得到質(zhì)粒YCplac33-G;3) 以HO質(zhì)粒為模板，用引物HO-up和HO-dn做PCR擴(kuò)增，得到2154 bp的PCR產(chǎn)物，此DNA片段是/ZO基因的ORF和終止子序列；分別用&cI和Swal雙酶切純化后的PCR產(chǎn)物和質(zhì) 粒YCplac33-G;然后做連接并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，待LBA平板上長(zhǎng)出 轉(zhuǎn)化子后提質(zhì)粒；再用5^d和S附"I雙酶切，將酶切產(chǎn)物跑瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證，即得 至ij 質(zhì) 粒 YCplac33-GH ; 所 述 引 物 HO-up 為 5'-GGGCCCGAGCTCCGCCAGATCTGTTTAGCTTG-3'; 所述引物HO-dn為 5'-GGGCCCCCCGGGAGTATCGAATCGACAGCAGT-3';4)以質(zhì)粒pFA6a-《fl"MW為模板，用引物KAN-up和KAN-dn做PCR擴(kuò)增，得到1446bp 的PCR產(chǎn)物，此DNA片段是^mM^因的啟動(dòng)子、ORF和終止子序列；分別用^fll和S; / I雙 酶切純化后的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒YCplac33-GH;然后做連接并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受 態(tài)細(xì)胞中，待LBA平板上長(zhǎng)出轉(zhuǎn)化子后提質(zhì)粒；再用ja"I和S/^I雙酶切，將酶切產(chǎn)物跑瓊 脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證，即得到質(zhì)粒YCplac33-GHK，所述引物KAN-up為 5'隱GGGCCCTCTAGAGCGAAGGCACATCTATTAC-3'，所述弓|物KAN-dn為 5'-GGGCCCGCATGCGTTCTCCTCAACTGCCATTA-3'。所述步驟(2)為1) 將質(zhì)粒YCplac33-GHK轉(zhuǎn)入釀酒酵母雙倍體菌株M4raAx中，并將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布在 YPD+G418選擇平板上；于30 'C下培養(yǎng)2d后，從上述YPD+G418平板上任意挑一些菌體 涂在YP+G418+Galacose平板上；于30 'C下誘導(dǎo)20h后，從中任意挑少量的菌體在丫 0+ G418平板上劃線；于30 'C下培養(yǎng)2d后，從YPD+G418平板上再任意挑出16個(gè)單菌落，做 菌落PCR驗(yàn)證它們的交配型；驗(yàn)證菌株交配型的引物為5'-AGTCACATCAAGATCGTTTATGG-3'、 5'-GCACGGAATATGGGACTACTTCG-3鄰 5'-ACTCCACTTCAAGTAAGAGTTTG-3'，以下不再贅述；將PCR產(chǎn)物跑瓊脂糖凝膠電泳進(jìn) 行驗(yàn)證，構(gòu)建出雙倍體菌株M4ra/a和雙倍體M47Wa;2) 將所述雙倍體菌株M4ra/a和雙倍體菌株M4ra/a，于30 'C培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)， 分別取1 OD6W)的菌體于1 ml的YPD中混合；于30 'C下靜止16 h后，任意挑取少量的菌 體在新YPD平板上劃線；于30'C下培養(yǎng)2d后，再任意挑23個(gè)單菌落做菌落PCR驗(yàn)證 它們的交配型；將PCR產(chǎn)物跑瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證，構(gòu)建出釀酒酵母四倍體,并命名 為HLH34。所述步驟(3)為將所述釀酒酵母四倍體接入YPD液體培養(yǎng)基中，于30 'C下振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；測(cè)定細(xì)胞 濃度，當(dāng)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，稀釋細(xì)胞使之濃度為3Xl()S 6X10Vml，加入終濃度為50pg/ml 的芬苯達(dá)唑，放入23'C搖床中，培養(yǎng)24h后；將培養(yǎng)液通過(guò)孔徑為0.45 pm的濾膜，利用 抽慮裝置用10倍體積的YP洗上述細(xì)胞；收集細(xì)胞并分別將其接種到初糖濃度為20%的發(fā) 酵培養(yǎng)基中；培養(yǎng)30d后，收集細(xì)胞分別將其涂布在YPD平板上。于30'C下培養(yǎng)2d， 將長(zhǎng)出的單菌落在初糖濃度為20%發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，發(fā)酵36h，測(cè)殘?zhí)菨舛?，從中篩選 殘?zhí)亲畹偷木?，將該菌株進(jìn)行產(chǎn)孢，發(fā)現(xiàn)不能產(chǎn)孢，由此說(shuō)明四倍體菌株HLH34在MBC 處理后發(fā)生了染色體缺失，即該菌株是非整倍體釀酒酵母乙醇高產(chǎn)菌株，并命名為碘化丙啶(PI) Sigma公司 美國(guó)2.試劑配制2.1 Lipofectamine 2000: 4 。C保存。2.2 Antisense-microRNAs-oligonucleotides (AMO):設(shè)計(jì)實(shí)施例1中所 述的針對(duì)白血病細(xì)胞K562中miR-21和miR-181a的反義寡核苷酸序列 AMO-miR-21和AMO-miR-181a:序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合 成，全硫代修飾，PAGE純化，于-20。C保存。用無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)基溶 解配制成100 u niol/L儲(chǔ)存溶液，置-20。C備用，用時(shí)稀釋成所需的使用濃度。2. 3含酚紅RPMI-1640培養(yǎng)基RPMI-1640干粉(10.4 g/包)，用三蒸水溶解，加入碳酸氫鈉2.0g， HEPES 5.0 g,磁力攪拌儀充分?jǐn)嚢?，定容至IOOO mL，過(guò)濾除菌，分裝，4 。C保存。 2.4 RPMI-1640液體培養(yǎng)基過(guò)濾除菌，分裝。 2.5新生牛血清56 °C、 30 min滅活，分裝于25 mL小瓶中，-20 °C保存。配制新鮮RPMI-1640 液時(shí)，每180mL培養(yǎng)液加入血清20mL，使最終細(xì)胞培養(yǎng)液中血清的體積分?jǐn)?shù) 為10 %。2.6 0.2 %臺(tái)盼藍(lán)工作液稱取0.2 g臺(tái)盼藍(lán)粉，用100 mL PBS(pH 7.2)溶解。 2. 7 ■酶配制成IO mg/mL的儲(chǔ)存液，_20°0保存，使用時(shí)配制成工作液濃度。 2.8碘化丙錠(PI)染液稱取20ug碘化丙啶，加入1000mL生理鹽水，即20ug/L濃度，分裝，4°C 避光保存。3主要儀器3.1 DL-2型臺(tái)式低速離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)3.2 C02培養(yǎng)箱(Thermo Forma,美國(guó)) 3.3超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠)3. 4 微量加樣器(0. 5-10 u L， 1-20 u L， 10-100 u L, 50-2003) 測(cè)定細(xì)胞濃度使之處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，稀釋細(xì)胞使之濃度為3xl0t6xl06/011，加入終 濃度為20 100 ng/ml的MBC。然后放入23 。C搖床中，培養(yǎng)12~24 h;4) 將上述培養(yǎng)液通過(guò)孔徑為0.45 pm的濾膜，利用抽慮裝置用10倍體積的YP洗細(xì)胞， 收集細(xì)胞將其接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中。2釀酒酵母乙醇高產(chǎn)菌株構(gòu)建2. 1質(zhì)粒YCplac33-GHK的構(gòu)建提取酵母染色體DNA并以其為模板，用引物GAL2-up和GAL2-dn (見表1, 5'端前 有6個(gè)保護(hù)堿基GGGCCC，其它帶有酶切位點(diǎn)的引物與此相同)做PCR擴(kuò)增，得到786 bp 的PCR產(chǎn)物，此DNA片段是04"基因啟動(dòng)子序列；用體積比l: l的苯酚一氯仿混合物 純化PCR產(chǎn)物；分別用AcoRI和雙酶切純化后的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒YCpac33;然后做 連接并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，待含有IPTG和X-Gal的LBA平板上長(zhǎng)出 轉(zhuǎn)化子后提質(zhì)粒；再用EcoRI和S"cI雙酶切，將酶切產(chǎn)物跑瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證，即 得到質(zhì)粒YCplac33-G;以M 質(zhì)粒為模板，用引物HO-叩和HO-dn做PCR擴(kuò)增，得到2154 bp的PCR產(chǎn)物， 此DNA片段是if<9基因的ORF和終止子序列；分別用Sad和Smal雙酶切純化后的PCR 產(chǎn)物和質(zhì)粒YCplac33-G;然后做連接并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，待LBA 平板上長(zhǎng)出轉(zhuǎn)化子后提質(zhì)粒;.再用5Wd和Swfll雙酶切，將酶切產(chǎn)物跑瓊脂糖凝膠電泳進(jìn) 行驗(yàn)證，即得到質(zhì)粒YCpac33-GH;以質(zhì)粒pFA6a-Xfl"MW為模板，用引物KAN-up和KAN-dn做PCR擴(kuò)增，得到1446 bp 的PCR產(chǎn)物，此DNA片段是《"wM^基因的啟動(dòng)子、ORF和終止子序列；分別用^al和 Sp/zl雙酶切純化后的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒YCplac33-GH;然后做連接并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸 桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，待LBA平板上長(zhǎng)出轉(zhuǎn)化子后提質(zhì)粒；再用力"I和S/^I雙酶切，將酶 切產(chǎn)物跑瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證，即得到質(zhì)粒YCplac33-GHK，結(jié)構(gòu)示意圖見

圖1。表l本發(fā)明所用的引物引物名稱引物序列酶切位點(diǎn)GAL2陽(yáng)up5'國(guó)GGGCCCGAATTCATGCTTTCTGAAAACACGAC-3'GAL2-dn5'-GGGCCCGAGCTCGTTAAGACTGCATTCATCAC-3'HO-up5'-GGGCCCGAGCTCCGCCAGATCTGTTTAGCTTG-3'SadHO-dn5'-GGGCCCCCCGGGAGTATCGAATCGACAGCAGT-3'腸IKAN-up5'-GGGCCCTCTAGAGCGAAGGCACATCTATTAC誦3'勘IKAN-dn5'-GGGCCCGCATGCGTTCTCCTCAACTGCCATTA-3'，1MAT-F5'-AGTCACATCAAGATCGTTTATGG-3'NoneMAT-a5'-GCACGGAATATGGGACTACTTCG-3'MoncMAT-a5'-ACTCCACTTCAAGTAAGAGTTTG-3'Nons2.2四倍體菌株的構(gòu)建將質(zhì)粒YCplac33-GHK轉(zhuǎn)入釀酒酵母雙倍體菌株M47Va中，并將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布在 YPD+G418選擇平板上；于30 。C下培養(yǎng)2d后，從上述YPD+G418平板上任意挑一些菌 體涂在YP+G418+Galacose平板上；于30 。C下誘導(dǎo)20h后，從中任意挑少量的菌體在 YPD+G418平板上劃線；于30 。C下培養(yǎng)2 d后，從YPD+G418平板上再任意挑出16個(gè) 單菌落，做菌落PCR驗(yàn)證它們的交配型；將PCR產(chǎn)物跑瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證，見圖2。 其中，1、 11、 13、 16號(hào)菌株為M4raAx雙倍體，3、 4、 8、 14號(hào)菌株為M4Fa/a雙倍體，2、 5、 6、 7、 9、 10、 12、 15號(hào)菌株為M4ra/a雙倍體。將上步得到的2號(hào)(M47Wa)和3號(hào)(M47a/a)菌株，于30 'C培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)， 分別取1 OD6(K)的菌體于1 ml的YPD中混合；于30 。C下靜止16 h后，任意挑取少量的菌 體在新YPD平板上劃線；于30 。C下培養(yǎng)2 d后，再#意挑23個(gè)單菌落做菌落PCR驗(yàn)證 它們的交配型；將PCR產(chǎn)物跑瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證，見圖3。其中，只有13號(hào)菌株是 所期望得到的菌株。將上步得到的13號(hào)菌株涂在產(chǎn)孢培養(yǎng)基上；于28 'C下培養(yǎng)3d后，用顯微操作儀拆 分四分體；于30 。C下培養(yǎng)2 d后，從中任選兩組孢子做菌落PCR驗(yàn)證它們的交配型；將 PCR產(chǎn)物跑瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證，見圖4。其中1、 2、 3、 4號(hào)孢子和5、 6、 7、 8號(hào) 孢子分別來(lái)自二個(gè)四分體。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明13號(hào)菌株就是四倍體(M47Va/a/a)，并命名為 HLH34;2. 3非整倍體菌株構(gòu)建將菌株HLH34接入YPD液體培養(yǎng)基中，于30'C下振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；測(cè)定細(xì)胞濃度，當(dāng) 處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，稀釋細(xì)胞使之濃度為3X106~6X106/ml，加入終濃度為50 pg/ml的 MBC，放入23"C搖床中。培養(yǎng)24h后，將培養(yǎng)液通過(guò)孔徑為0.45 nm的濾膜，利用抽慮 裝置用10倍體積的YP洗上述細(xì)胞；收集細(xì)胞并分別將其接種到初糖濃度為20%的發(fā)酵培 養(yǎng)基中；培養(yǎng)30d后，收集細(xì)胞分別將其涂布在YPD平板上。于30'C下培養(yǎng)2d，將長(zhǎng) 出的單菌落在初糖濃度為20%發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束時(shí)(36 h)測(cè)殘?zhí)菨舛?，從?篩選殘?zhí)亲畹偷木辍⒃摼赀M(jìn)行產(chǎn)孢，發(fā)現(xiàn)不能產(chǎn)孢，由此說(shuō)明四倍體菌株HLH34在 MBC處理后發(fā)生了染色體缺失，即該菌株是非整倍體菌株并命名為HLH34-M 3釀酒酵母乙醇高產(chǎn)菌株的濃醪發(fā)酵 '將非整倍體菌株HLH34-M和四倍體菌株HLH34及對(duì)照菌株即工業(yè)菌株在初糖濃度為 300g/L的玉米面發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行乙醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。發(fā)酵結(jié)果見圖5、圖6、圖7，并在發(fā)酵 結(jié)束時(shí)分別取50 ^的發(fā)酵液稀釋400倍后均勻的涂布到Y(jié)PD平板上。于30'C下培養(yǎng)兩天 后，數(shù)單菌落個(gè)數(shù)并計(jì)算出活菌濃度見圖8。本發(fā)明的一種構(gòu)建釀酒酵母乙醇高產(chǎn)菌株的方法，所構(gòu)建的非整倍體釀酒酵母高產(chǎn)菌 株在濃醪發(fā)酵(初糖濃度為300g/L)中，乙醇產(chǎn)量較對(duì)照菌株提高了 5.33%，殘?zhí)墙档土?58.70%，乙醇及高滲透壓抗性是對(duì)照菌株的2.31倍，為燃料乙醇工業(yè)生產(chǎn)提供了優(yōu)良的 菌株。
權(quán)利要求
1.一種構(gòu)建釀酒酵母乙醇高產(chǎn)菌株的方法，其特征是包括如下步驟(1)以Ycplac33為載體，構(gòu)建帶有受半乳糖誘導(dǎo)啟動(dòng)子調(diào)控的HO基因的質(zhì)粒YCplac33-GHK；該質(zhì)粒載有HO基因的開放閱讀框ORF和終止子，HO基因的啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子GAL2，同時(shí)該質(zhì)粒還載有KanMX選擇標(biāo)記；(2)將質(zhì)粒YCplac33-GHK轉(zhuǎn)入釀酒酵母雙倍體菌株MATa/α中，通過(guò)半乳糖誘導(dǎo)后再做PCR驗(yàn)證菌株的交配型即可得到同宗配合的酵母雙倍體細(xì)胞MATa/a和MATα/α，將它們進(jìn)行融合后通過(guò)PCR驗(yàn)證菌株的交配型，其中PCR產(chǎn)物有544bp和404bp兩條帶對(duì)應(yīng)的菌株即釀酒酵母四倍體；(3)用芬苯達(dá)唑處理釀酒酵母四倍體，使之發(fā)生染色體缺失，通過(guò)乙醇發(fā)酵從而得到非整倍體釀酒酵母乙醇高產(chǎn)菌株。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種構(gòu)建釀酒酵母乙醇高產(chǎn)菌株的方法，其特征是所述步驟(2) 為1) 將質(zhì)粒YCplac33-GHK轉(zhuǎn)入釀酒酵母雙倍體菌株M4ra/a中，并將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布在 YPD+G418選擇平板上；于30 。C下培養(yǎng)2d后，從上述YPD+G418平板上任意挑一些菌體 涂在YP+G418+Galacose平板上；于30 。C下誘導(dǎo)20h后，從中任意挑少量的菌體在YPD十 G418平板上劃線；于30 'C下培養(yǎng)2d后，從YPD+G418平板上再任意挑出16個(gè)單菌落，做 菌落PCR驗(yàn)證它們的交配型；驗(yàn)證菌株交配型的引物為5'-AGTCACATCAAGATCGTTTATGG-3'、 5'-GCACGGAATATGGGACTACTTCG-3'和 5'-ACTCCACTTCAAGTAAGAGTTTG-3'，以下不再贅述；將PCR產(chǎn)物跑瓊脂糖凝膠電泳進(jìn) 行驗(yàn)證，構(gòu)建出同宗配合的雙倍體菌株M47Wa和雙倍體M4ra/a;2) 將所述雙倍體菌株M47Va和雙倍體菌株M4ra/a，于30 'C培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)， 分別取10D6oo的菌體于lml的YPD中混合；于30 。C下靜止16h后，任意挑取少量的菌 體在新YPD平板上劃線；于30 'C下培養(yǎng)2 d后，再任意挑23個(gè)單菌落做菌落PCR驗(yàn)證 它們的交配型；將PCR產(chǎn)物跑瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證，構(gòu)建出釀酒酵母四倍體，并命名 為HLH34。 ，
4. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種構(gòu)建釀酒酵母乙醇高產(chǎn)菌株的方法，其特征是所述步驟(3) 為將所述釀酒酵母四倍體接入YPD液體培養(yǎng)基中，于30 'C下振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；測(cè)定細(xì)胞 濃度，當(dāng)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，稀釋細(xì)胞使之濃度為3X 106~6X 106/1111，加入終濃度為50 jig/ml 的芬苯達(dá)唑，放入23'C搖床中，培養(yǎng)24h后；將培養(yǎng)液通過(guò)孔徑為0.45jim的濾膜，利用 抽慮裝置用IO倍體積的YP洗上述細(xì)胞；收集細(xì)胞并分別將其接種到初糖濃度為20%的發(fā) 酵培養(yǎng)基中；培養(yǎng)30d后，收集細(xì)胞分別將其涂布在YPD平板上。于30'C下培養(yǎng)2d, 將長(zhǎng)出的單菌落在初糖濃度為20%發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，發(fā)酵36h，測(cè)殘?zhí)菨舛?，從中篩選 殘?zhí)亲畹偷木?，將該菌株進(jìn)行產(chǎn)孢，發(fā)現(xiàn)不能產(chǎn)孢，由此說(shuō)明四倍體菌株HLH34在MBC 處理后發(fā)生了染色體缺失，即該菌株是非整倍體釀酒酵母乙醇高產(chǎn)菌株，并命名為 HLH34-M。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種構(gòu)建釀酒酵母乙醇高產(chǎn)菌株的方法，步驟為以Ycplac33為載體，構(gòu)建帶有受半乳糖誘導(dǎo)啟動(dòng)子調(diào)控的HO基因的質(zhì)粒Ycplac33-GHK；該質(zhì)粒載有HO基因的開放閱讀框ORF和終止子，HO基因的啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子GAL2，同時(shí)該質(zhì)粒還載有KanMX選擇標(biāo)記；利用質(zhì)粒Ycplac33-GHK構(gòu)建四倍體菌株；用芬苯達(dá)唑處理釀酒酵母四倍體，使之發(fā)生染色體缺失，通過(guò)乙醇發(fā)酵從而得到非整倍體釀酒酵母乙醇高產(chǎn)菌株。本發(fā)明的方法構(gòu)建的菌株，在濃醪發(fā)酵(初糖濃度為300g/L)中，乙醇產(chǎn)量較對(duì)照菌株提高了5.33％，殘?zhí)墙档土?8.70％，乙醇及高滲透壓抗性是對(duì)照菌株的2.31倍。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101215562SQ20071006065
公開日2008年7月9日 申請(qǐng)日期2007年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月28日
發(fā)明者侯麗華, 馬平生 申請(qǐng)人:天津大學(xué)