專利名稱：：一種快速提取植物樣本dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于分子生物學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及模板DNA的制備方法。更具體的說是一種釆用改進(jìn)的快速用于提取植物樣本DNA的方法。技術(shù)背景分子生物學(xué)技術(shù)已經(jīng)滲透到生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、植物學(xué)、遺傳學(xué)和動(dòng)物學(xué)等各個(gè)方面。DNA提取的質(zhì)量和產(chǎn)量是直接影響PCR擴(kuò)增的關(guān)鍵步驟，自1985年P(guān)CR技術(shù)問世以來，這一技術(shù)已被應(yīng)用到生命科學(xué)的各信息領(lǐng)域，因其敏感性高、特異性強(qiáng)、操作簡便、所需時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)已被廣泛用于多種檢測領(lǐng)域。PCR檢測技術(shù)的第一步就是模板DNA的制備，即樣本中DM的提取，這直接影響著PCR反應(yīng)的結(jié)果。長期以來，樣本中DNA的提取和純化一直是耗時(shí)、繁瑣的過程，嚴(yán)重減慢了檢測速度。因此，許多學(xué)者一直在探索各種樣本DNA的快速提取方法。當(dāng)今科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展使很多方法及試劑商品化，大大縮短了提取DNA的時(shí)間，但是相應(yīng)的使價(jià)格成倍的增長。因此，從具體的實(shí)驗(yàn)要求，樣本的大小、實(shí)驗(yàn)室的條件和經(jīng)濟(jì)等方面考慮，尋找簡便、成本較低的方法很有必要。提取DNA的方法主要有傳統(tǒng)法、螯合樹脂法、玻璃粉法、磁珠法、免疫親和法等。每種方法都有其自身的優(yōu)缺點(diǎn)，總結(jié)如下(1)傳統(tǒng)法通過CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)或SDS(十二烷基硫酸鈉)裂解細(xì)胞，酚/氯仿等有機(jī)溶劑抽提蛋白，適用于大多數(shù)標(biāo)本DNA提取、純化，獲得DNA純度高，含量多。但比較費(fèi)時(shí)，需要5小時(shí)甚至更多，流程繁瑣，同時(shí)樣品需要用4-5個(gè)BP管，容易造成混淆和污染，操作復(fù)雜，要通過裂解細(xì)胞、去蛋白、沉淀DM等過程，方法不易掌握及推廣，而且操作過程中使用了大量有機(jī)溶劑，有損實(shí)驗(yàn)人員健康。(2)玻璃粉法靠玻璃粉吸附提取DM，適用于土壤標(biāo)本，提取方法簡便，可用于土壤中細(xì)菌DM的提取，但不能徹底除去PCR抑制劑。(3)磁珠法靠磁珠吸附、磁場分離提取DNA，適用于冰凍、陳舊組織，簡單、快速整個(gè)過程僅需不到2小時(shí)，利用磁場分離可以得到較純的DM，但產(chǎn)量比傳統(tǒng)方法獲得的少，成本較高。(4)免疫親和法通過抗原抗體反應(yīng)來提取DM,適用于樣本含量很少的標(biāo)本，獲得DM純度高，含量多。缺點(diǎn)是設(shè)備要求比較高，而且抗DNA單克隆抗體制備是關(guān)鍵的一步。(5)螯合樹脂法使用Chelex-100樹脂來提取DNA,據(jù)報(bào)道該方法目前用于細(xì)菌、血液及部分病毒核酸提取，操作簡單、快速、且成本不高。同時(shí)避免使用酚氯仿等有機(jī)試劑，對(duì)操作人員沒有損害。Chelex-IOO是一種不溶于、酸、堿溶液、有機(jī)溶劑的高分子化合物，由苯乙晞和苯乙二烯組成。在pH值為4-14的環(huán)境中可保持其自身的穩(wěn)定性。其外型呈白色顆粒狀，無味，由苯乙烯和二乙烯基苯的聚合形成高聚物骨架，官能基成對(duì)的二乙酸亞胺離子連接在骨架上。Walsh最初用Chelex-100作為金屬離子鰲合劑來提取人類DNA,利用人類細(xì)胞在含有5%Chelex-lOO懸液中煮沸時(shí)可使細(xì)胞膜破裂釋放出DNA，同時(shí)與二價(jià)金屬離子鰲合，從而避免樣品中存在的金屬離子在高溫和低離子強(qiáng)度條件下作為催化劑使DNA降解。一步完成提取過程，同時(shí)獲得純度較高的DNA。X.deLamballerie等用Chelex-100螯合柱從培養(yǎng)和臨床標(biāo)本中快速提取細(xì)菌及病毒DNA用于PCR反應(yīng)。對(duì)150例臨床標(biāo)本提取DNA進(jìn)行PCR檢測分枝桿菌，結(jié)果表明用此方法比堿裂解后，傳統(tǒng)的蛋白酶K消化、酚/氯仿抽提法可獲得更多的(5例)陽性樣本。5例標(biāo)本中有3例培養(yǎng)為陽性。目前Chelex-100法在法醫(yī)鑒定中也廣泛應(yīng)用，現(xiàn)已經(jīng)逐漸擴(kuò)展到其他學(xué)科，如腫瘤學(xué)的研究。用此法提取的DM操作簡便，并可以減少提取過程中DNA的損失，常用于從十分微量的樣品中(如毛發(fā)，血液、精斑和上皮脫落細(xì)胞中等)中提取足量的DNA。植物細(xì)胞與動(dòng)物和微生物細(xì)胞相比具有細(xì)胞壁，所以核酸不易釋放出來。本發(fā)明將CTAB裂解細(xì)胞壁的功能和chelex-100結(jié)合，提高了植物樣本DNA提取效率。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服傳統(tǒng)樣本DNA提取步驟多、復(fù)雜、費(fèi)事等缺點(diǎn)，公開一種采用改進(jìn)的快速用于提取植物樣本DNA的方法，本發(fā)明的DNA提取方法具有筒單、易行、污染小、快速、節(jié)約樣品和耗材的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的4支術(shù)方案如下一種采用改進(jìn)的快速用于提取植物樣本DNA的方法，其特征在于它按如下步驟進(jìn)行(1)取待測植物樣本100mg于研缽中加入液氮研磨至粉末，放入滅菌離心管內(nèi)；(2)加入600-800nL十六烷基三曱基溴化銨提取緩沖液，蝸旋混勻，置于65。C水浴鍋中恒溫水浴30-50min,12000r/min,離心5-10min;(3)取上清液分別放于另一離心管中，并加入所得上清液體積的1/10倍體積的3mol/L乙酸鈉溶液和0.8倍體積的異丙醇，顛倒混勻，然后在轉(zhuǎn)數(shù)12000-15000r/min，離心5-10min，棄上清；(4)向沉淀中加入100-200nL,5%-10%Chelex-100溶液，并使沉淀充分溶解在溶液中，12000-15000r/min，離心10-15min，取上清，保存，用于PCR擴(kuò)增。本發(fā)明所述的待測樣本為植物樣品包括轉(zhuǎn)基因植物樣品。本發(fā)明所述的待測樣本也可為植物新鮮組織、愈傷組織、千性粉末及簡單加工產(chǎn)品(例如面粉、大豆粉)。本發(fā)明所述的離心速度為12000r/min;離心時(shí)間5-10min。優(yōu)選的離心速度為12000r/min;離心5-10min;加上10%Chelex-lOO溶液，加入的量為200jiL。為了能更加清楚的說明本發(fā)明的提取方法，下面以轉(zhuǎn)基因作物大豆為樣本實(shí)例，對(duì)本發(fā)明的提取方法與傳統(tǒng)的CTAB法分別加以比較對(duì)照說明。一、材料和方法(1)樣品轉(zhuǎn)基因大豆，本實(shí)驗(yàn)室保存。(2)主要儀器高速冷凍離心機(jī)，凝膠電泳設(shè)備，PCR擴(kuò)增儀，恒溫水浴鍋。(3)主要試劑PCR引物由上海生工公司合成，引物序列見表l。Taq酶和dNTP等試劑購自Promega公司-Chelex-100購自sigma公司。10%Chelex-IOO溶液稱量10gChelex-100，加入90mL去離子水，121r滅菌，用時(shí)混勻。CTAB(十六烷基三曱基溴化銨)提取緩沖液1000mL水中溶解CTAB20g，Tris12.llg，NaCl81.82g，Na2EDTA7.44g，PVP(聚乙烯p比咯烷酮)20g，高壓滅菌；3mol/L乙酸鈉溶液，100mL水中溶解40.8g三水乙酸鈉，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至5.2,高壓滅菌。其他試劑購自上海生工。_表l轉(zhuǎn)基因大豆內(nèi)源基因和外源基因的引物序列_<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>二、轉(zhuǎn)基因大豆DNA的兩種提取方法的比較1、CTAB法提取DNA(1)取轉(zhuǎn)基因大豆約100mg,放入研缽中，加入少量液氮迅速磨碎。液氮反復(fù)加入3~4次，磨碎成粉末為止。(2)加入1.5mL預(yù)熱至65°C的CTAB提取緩沖液，充分混合、懸浮試樣(依試樣不同，可適當(dāng)增加緩沖液的用量)，65'C保育60min，期間不停顛倒混勻；(3)約12000r/min離心10min。轉(zhuǎn)移上清至一新離心管，加入l倍體積的酚氯仿異戊醇(25:24:1),充分混合。約12000r/min離心15min。轉(zhuǎn)移上清至一新離心管中；(4)加入1倍體積的氯仿異戊醇(24:1)，充分混合。約12000r/min離心15min。轉(zhuǎn)移上清至一新離心管中；(5)加入2倍體積CTAB沉淀緩沖液，室溫靜置保育60min;12000r/邁in離心15min，棄上清；加入350pL氯化鈉溶液溶解沉淀；12000r/min離心10min,轉(zhuǎn)移上清至一新離心管。(6)加入0.6倍體積異丙醇，倒置離心管輕柔混合，室溫放置20min。12000r/min離心15min.棄上清。加入500jiL70。/。乙醇溶液，并顛倒離心管數(shù)次。12000r/min離心10min。棄上清。(7)干燥DNA沉淀，加10OjiL水或TE緩沖液溶解DNA。2、本發(fā)明方法提取DNA:(1)取轉(zhuǎn)基因大豆約100邁g于研缽中加入液氮研磨至粉末，放入滅菌離心管內(nèi)。(2)加入800pLCTABDNA提取緩沖液，渦旋混勻，置于65。C水浴鍋中恒溫水浴40min,12000r/min，離心5min。(3)取上清液于一新離心管中，加入所得上清液的體積的1/10倍體積的3mol/L乙酸鈉溶液和0.8倍體積的異丙醇，12000r/min，離心5min,棄上清。(4)沉淀中加入200pL10%Chelex-lOO,并使沉淀充分溶解在溶液中，12000r/min，離心IOmin,取上清，保存，用于PCR擴(kuò)增。二、兩種方法提取DM的PCR擴(kuò)增檢測試驗(yàn)1、PCR反應(yīng)體系組成10xPCR反應(yīng)緩沖液(含Mg")2.5jiL，dNTP溶液(各為lO咖ol/nL)0.5jiL,正反引物(10pmol/pL)各0.5jiL,Taq酶(5U/jiL)0.5jiL,模板5jiL,水補(bǔ)足反應(yīng)體系，使總體積為25^L。2、PCR反應(yīng)程序循環(huán)參數(shù)為94。C預(yù)變性5ndn，再按94。C變性40s、5S。C復(fù)性40s、72°C延伸40s，40個(gè)循環(huán)，最后72。C延伸5min,3、產(chǎn)物鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物加入EB的2.0%瓊脂糖凝膠上電泳，電泳條件，電壓100V;時(shí)間40分鐘紫外燈下觀察，用DL2000做分子量標(biāo)記。4、PCR的擴(kuò)增結(jié)果對(duì)兩種方法提取的DNA，分別進(jìn)行大豆內(nèi)源基因lectin,外源基因CaMV35S、nos和Cp4-印spsPCR的擴(kuò)增，凝膠電泳結(jié)果見附圖，結(jié)果顯示，兩種方法提取的DNA內(nèi)源和外源基因的擴(kuò)增結(jié)果是基本一致的。本發(fā)明與現(xiàn)有^t術(shù)相比所具有的積極效果在于(1)傳統(tǒng)的核酸模板提取方法操作步驟多、復(fù)雜、費(fèi)事。需要經(jīng)過裂解細(xì)胞、去除蛋白、DM沉淀等多個(gè)步驟。而且由于需要在多個(gè)離心管之間相互轉(zhuǎn)移標(biāo)本，增加了對(duì)標(biāo)本間交叉污染的可能性。另外所用的酴氯仿等有機(jī)溶劑對(duì)人體有害。而本發(fā)明的改進(jìn)的DNA提取方法過程簡單，整個(gè)提取過程在兩個(gè)離心管中進(jìn)行。避免使用有毒有機(jī)試劑，所使用的提取溶液無毒無害，對(duì)人體和環(huán)境都不會(huì)造成危害。(2)本方法最大的優(yōu)點(diǎn)在于其過程快速。與常規(guī)的提取過程需要5小時(shí)左右相比。采用本法，60分鐘就可以完成樣本DNA提取的全過程。(3)采用本發(fā)明的侏速提取樣本DNA的方法所得到的DM經(jīng)凝膠電泳實(shí)驗(yàn)、PCR檢測實(shí)驗(yàn)，證實(shí)與傳統(tǒng)方法得到的DNA基本一致，完全可以采用此方法替代復(fù)雜、費(fèi)事的傳統(tǒng)CTAB法。從而大大的節(jié)省了時(shí)間，可廣泛應(yīng)用于實(shí)時(shí)監(jiān)控生產(chǎn)、科研進(jìn)程或臨床化驗(yàn)等過程。圖1為兩種方法提取的DNA凝膠電泳結(jié)果圖。其中M表示DL2000;l是改良Chelex-100法；2表示CTAB法。圖2為CaMV35S、NOS、Cp4-epsps和lectin的PCR擴(kuò)增結(jié)果。其中M表示DL2000;1,3，5,7表示CaMV35S、NOS、Cp4-epsps和lectin的擴(kuò)增產(chǎn)物(CTAB法)；2,4,6,8表示:CaMV35S、NOS、Cp4-epsps和lectin的擴(kuò)增產(chǎn)物(本發(fā)明方法)。圖3為油菜的內(nèi)源基因hmg擴(kuò)增結(jié)果。其中M為DL2000MAROR，l為空白對(duì)照；2，3為本發(fā)明方法提取DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物。圖4為玉米的內(nèi)源基因zSSIIb擴(kuò)增結(jié)果。其中MDL2000MARKER,l空白對(duì)照；2,3本發(fā)明方法提取DM的擴(kuò)增產(chǎn)物。圖5為大豆內(nèi)源lectin擴(kuò)增結(jié)果。其中M為DL2000MARKER,l為空白對(duì)照；2，3為本發(fā)明方法提取DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述。實(shí)施例1以市場銷售的油菜籽為樣本，采用本發(fā)明方法快速提取DM,制備方法如下(1)取油菜籽約100mg于研缽中加入少量液氮迅速磨碎。液氮反復(fù)加入3~4次研磨至粉末，放入滅菌離心管內(nèi)。(2)加入800pLCTABDM提取緩沖液，蝸旋混勻，置于65'C水域鍋中恒溫水浴O.5h,12000r/min離心5min。(3)取上清液于滅菌離心管中，并加入上清液l/10倍體積的3mol/L乙酸鈉溶液和O.8倍體積的異丙醇，12000r/min，離心5min，棄上清。(4)沉淀中加入100jiL10XChelex-lOO,并使沉淀充分溶解在溶液中，12000r/min，離心IOmin，取上清，保存，用于PCR擴(kuò)增。PCR檢驗(yàn)1、對(duì)油菜編碼高移動(dòng)簇蛋白I/Y(highmobilegroupproteinI/Y)基因進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列為hmg-F:5'-TCCTTCCGTTTCCTCGCC-3';hmg-R:5'-TTCCACGCCCTCTCCGCT-3';預(yù)期擴(kuò)增片段大小為206bp。2、反應(yīng)體系:_試劑體積無菌水11.5PL10XPCR緩沖液(含鎂離子)2.5吣dNTPs混合溶液0.5PL10Mmol/L上游引物0.5叱10陶ol/L下游引物0.5PL5U/恥Taq酶0.5ML腿模板5.0ML總體積_25MI3、反應(yīng)程序94'C變性5min;進(jìn)行35次循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)(94'C變性30s，59'C退火30s,72。C延伸40s;72'C延伸7min。4、產(chǎn)物鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物加入EB的2.0%瓊脂糖凝膠上電泳，電泳條件電壓100V;時(shí)間40分鐘。紫外燈下觀察，用DL2000做分子量標(biāo)記。5、結(jié)果油菜籽的hmg擴(kuò)增結(jié)果見圖3。其中，M為DL2000MARKER,1為空白對(duì)照；2，3為本發(fā)明方法提取DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物。實(shí)施例2以本院農(nóng)場的玉米籽粒為樣本，采用本發(fā)明方法快速提取DNA。(1)取玉米約100mg于研缽中，加入液氮研磨至粉末，放入滅菌離心管內(nèi)；(2)加入800nL十六烷基三甲基溴化銨提取緩沖液，蝸旋混勻，置于65。C水浴鍋中恒溫水浴40分鐘，15000rAnin離心8min;(3)取上清液于離心管中，并加入上清液體積的l/10倍體積的3mo1/L乙酸鈉溶液和0.8倍體積的異丙醇，混合均勻，15000r/min離心8min,棄上清；(4)向沉淀中加入200jiL10%Chelex-100溶液，并使沉淀充分溶解在溶液中，12000r/邁in，離心10min,取上清，檢驗(yàn)DNA,保存，用于PCR擴(kuò)增。PCR檢驗(yàn)1、引物序列對(duì)編碼玉米淀粉合酶異構(gòu)體的zSTSn-2基因進(jìn)行擴(kuò)增zSSIIb-F:5'-CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3';zSSIIb-R:5'-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3';預(yù)期擴(kuò)增片段大小為88bp。2、反應(yīng)程序95X:變性5min;進(jìn)4亍35次循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)(94匸變性30s，58n退火30s,721C延伸30s。根據(jù)不同型號(hào)的PCR儀，可將PCR反應(yīng)的退火和延伸時(shí)間適當(dāng)延長)；72'C延伸7min。3、反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>4、產(chǎn)物鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物加入EB的2.0%瓊脂糖凝膠上電泳，電泳條件電壓100V;時(shí)間40分鐘。紫外燈下觀察，用DL2000做分子量標(biāo)記。5結(jié)果玉米的zSSIIb擴(kuò)增結(jié)果見圖4。其中M為DL2000MARKER，l為空白對(duì)照；2,3為本發(fā)明方法提取DM的擴(kuò)增產(chǎn)物。實(shí)施例3以本室收集的大豆愈傷組織為樣本，采用本發(fā)明方法快速提取DNA。(1)取樣品約100mg于研缽中加入液氮研磨至粉末，放入滅菌離心管內(nèi)；(2)加入600pL十六烷基三曱基溴化銨提取緩沖液，蝸旋混勻，置于65。C水浴鍋中恒溫水浴40分鐘，12000r/min，離心IOmin;(3)取上清液放于離心管中，并加入1/10倍體積的3mol/L乙酸鈉溶液和O.8倍體積的異丙醇，混合均勻，12000r/min,離心10min，棄上清；(4)向沉淀中加入100pL,10%Chelex-100溶液，并使沉淀充分溶解在溶液中，15000r/min，離心IOmin，取上清，保存，用于PCR擴(kuò)增。1、PCR反應(yīng)體系組成10xPCR反應(yīng)緩沖液(含Mg")2.5jiL,dNTP溶液(各為10mmol/jiL)0.5pL，正反引物(IOpmoi/VL)各0.5jiL，Taq酶(5U/jiL)0.5pL,模板5pL，水補(bǔ)足反應(yīng)體系，使總體積為25nL。2、循環(huán)參數(shù)為94'C預(yù)變性5min,再按94。C變性40s、55。C復(fù)性40s、72。C延伸40s,40個(gè)循環(huán)，最后72。C延伸5min。3、產(chǎn)物鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物加入EB的2.0%瓊脂糖凝膠上電泳，電泳條件電壓100V;時(shí)間40分鐘。紫外燈下觀察，用DL2000做分子量標(biāo)記4、PCR的擴(kuò)增結(jié)果對(duì)大豆內(nèi)源基因lectin內(nèi)源進(jìn)行擴(kuò)增，凝膠電泳結(jié)果見圖5。其中M為DL2000MARKER，l為空白對(duì)照；2，3為本發(fā)明方法提取DM的擴(kuò)增產(chǎn)物。在詳細(xì)說明的較佳實(shí)施例之后，熟悉該項(xiàng)技術(shù)人士可清楚地了解，在不脫離上述申請(qǐng)專利范圍與精神下可進(jìn)行各種變化與修改，凡依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍。且本發(fā)明亦不受限于說明書中所舉實(shí)例的實(shí)施方式。權(quán)利要求1、一種采用改進(jìn)的快速用于提取植物樣本DNA的方法，其特征在于它按如下步驟進(jìn)行(1)取待測植物樣本100mg于研缽中加入液氮研磨至粉末，放入滅菌離心管內(nèi)；(2)加入600-800μL十六烷基三甲基溴化銨提取緩沖液，蝸旋混勻，置于65℃水浴鍋中恒溫水浴30-50min，12000r/min，離心5-10min；(3)取上清液分別放于另一離心管中，并加入所得上清液體積的1/10倍體積的3mol/L乙酸鈉溶液和0.8倍體積的異丙醇，顛倒混勻，然后在轉(zhuǎn)數(shù)12000-15000r/min，離心5-10min，棄上清；(4)向沉淀中加入100-200μL，5％-10％Chelex-100溶液，并使沉淀充分溶解在溶液中，12000-15000r/min，離心10-15min，取上清，保存，用于PCR擴(kuò)增。2、如權(quán)利要求1所述的提取方法，其中所述的待測樣本為植物樣品包括轉(zhuǎn)基因植物樣品。3、如權(quán)利要求1所迷的提取方法，其中所述的待測樣本為植物新鮮組織、愈傷組織、干性粉末或簡單加工產(chǎn)品。4、如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述的離心速度為12000r/min;離心5-10min;Chelex-lOO溶液濃度為10%,加入量為200pL。全文摘要本發(fā)明公開了一種改進(jìn)的快速用于提取植物樣本DNA的方法，它是將待測植物樣品在液氮中研磨至粉末，然后加入一定量的CTAB提取緩沖液，經(jīng)處理，取上清液放于離心管中，加入上清液1/10倍體積的3mol/L乙酸鈉溶液和0.8倍體積的異丙醇，混合均勻，離心5-10min，棄上清；向沉淀中加入10％Chelex-100溶液，離心，取上清即為樣品DNA，可直接用于PCR擴(kuò)增。本發(fā)明采用的DNA提取方法，60分鐘就可以完成樣本DNA提取的全過程。所提取的DNA質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)滿足了后續(xù)PCR擴(kuò)增的要求，更適合于生產(chǎn)、科研過程中快速提取樣品DNA的目的。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101220390SQ200710060308公開日2008年7月16日申請(qǐng)日期2007年12月18日優(yōu)先權(quán)日2007年12月18日發(fā)明者蘭青闊,張麗華,珠朱,永王,奕程,新趙申請(qǐng)人:天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室