專利名稱：一種角膜緣干細胞無血清培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及干細胞體外培養(yǎng)基領(lǐng)域，具體涉及一種角膜緣干細胞無血清培 養(yǎng)基及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
細胞培養(yǎng)是生產(chǎn)基因工程產(chǎn)品的重要環(huán)節(jié)。由于傳統(tǒng)的含血清的細胞培養(yǎng)會給生產(chǎn)及科研帶來許多不利因素，因此自50年代以來，國外就開始研制無血清 培養(yǎng)基。80年代末90年代初，有商業(yè)應(yīng)用價值的無血清培養(yǎng)基紛紛上市，而無 血清培養(yǎng)基的一個主要特點是適用的細胞系譜窄，對特定的細胞株需自己摸索 新的配方或最優(yōu)條件。角膜緣干細胞是角膜細胞增殖和更新的源泉，研究角膜 緣干細胞的增殖分化規(guī)律不僅為治療角膜疾病開辟新的途徑，而且將為體外構(gòu) 建具有生理功能的人工角膜指明方向。因此，建立角膜緣干細胞無血清培養(yǎng)基 是實現(xiàn)這一目標的關(guān)鍵。然而，長期以來，角膜緣干細胞體外擴增培養(yǎng)是借助 有血清培養(yǎng)基實現(xiàn)的(Kim HS et al. Exp Eye Res， 2004 ,79:41 - 49. Tseng SC et al. Curr Eye Res， 1996,15:973 -984)，且大多需要以成纖維細胞作飼 養(yǎng)層。經(jīng)檢索國外雖有專用于培養(yǎng)正常人表皮角化細胞和角膜上皮細胞的基礎(chǔ) 培養(yǎng)基EpiLife，但EpiLife它適用于已分化的角化細胞的培養(yǎng)，而且EpiLife必須加入角膜細胞培養(yǎng)基補劑才能支持角膜細胞的長期增殖。因此，國內(nèi)外還 沒有適用未分化的角膜緣干細胞長期擴增培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基。發(fā)明內(nèi)容針對現(xiàn)有技術(shù)角膜緣干細胞傳代培養(yǎng)仍需血清或成纖維細胞予以維持其干
細胞狀態(tài)的缺點，本發(fā)明的目的是根據(jù)角膜緣干細胞在體微環(huán)境對角膜緣干細 胞增殖分化的調(diào)控規(guī)律，建立一種不需飼養(yǎng)層細胞、無血清的角膜緣干細胞培 養(yǎng)基。培養(yǎng)的細胞需要多種微量元素才能支持其生長和維持活性，這些元素通常 來自血清，而本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基中，是靠添加下以幾種微量元素來實現(xiàn)的 霍亂毒素可增加上皮細胞CAMP合成，促進上皮細胞快速生長。胰島素能夠刺激葡萄糖和氨基酸的利用及冊A、蛋白和磷脂的合成。轉(zhuǎn)鐵蛋白是一種結(jié)合鐵的糖蛋白，在無血清培養(yǎng)基中是一種重要的生長刺激蛋白還可作用于細胞表面的相 應(yīng)受體，促進鐵的穿膜傳遞，也可以降低氧自由基對細胞產(chǎn)成的細胞毒性。亞 硒酸鈉中的硒作為一種微量元素，是一種谷胱甘肽過氧化物酶的輔因子，具有 抗過氧化物的能力。本發(fā)明突破傳統(tǒng)培養(yǎng)基只添加各種生長因子的局限，添加 了霍亂毒素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和亞硒酸鈉，并摸索出這些因子的適宜比例。本發(fā)明的角膜緣干細胞無血清培養(yǎng)基是由下列質(zhì)量比的原料制成的每100ml無血清培養(yǎng)基中各種成分的含量為DMEM/F (Dulbecco， s Modified Eagle's Medium :F12 Medium 1:1) 60 ml 90 ml、牛血清 白蛋白(BSA) 0. 5g 4g、表皮生長因子(EGF) 1(^g 4Pg、胰島素(insulin) 0. 1mg lmg 、氫化可酸松20ug 100ug、霍亂毒素lug 10ug、轉(zhuǎn)鐵蛋白0. lmg lmg、 亞硒酸鈉O. lug lug、山羊成纖維細胞條件培養(yǎng)基(GCLCM) 10 m1 40 ml，青霉 素和鏈霉素各5X103IU 2X10"IU。制備本發(fā)明角膜緣干細胞無血清培養(yǎng)基的配方優(yōu)選質(zhì)量比范圍是 每100ml無血清培養(yǎng)基中各種成分的含量為DMEM/F12 70 m1 90 ml、 BSA 1 g 3g、 EGF 1Pg 2l^g、 i謂lin 0. 2mg 0. 8mg 、氫化可酸松40ug 60ug、
霍亂毒素lug 5ug、轉(zhuǎn)鐵蛋白0. lmg 0. 5mg、亞硒酸鈉0. 2ug 0. 5ug、GCLCM 10 m1 30 ml、青霉素和鏈霉素各8X1()3IU 1X104IU。本發(fā)明角膜緣干細胞無血清培養(yǎng)基的最佳質(zhì)量百分比是每100ml無血清培養(yǎng)基中各種成分的含量為DMEM/F12 80ml、 BSA 2g、 EGF 2Pg、 insulin 50Qug 、氫化可酸松50ug、霍亂毒素2ug、轉(zhuǎn)鐵蛋白500ug、亞 硒酸鈉500ng、 GCLCM 20ml、青霉素1X104IU 、鏈霉素1 X 104 IU。本發(fā)明采用在培養(yǎng)基添加成纖維細胞條件培養(yǎng)液的辦法，替代用成纖維細 胞共培養(yǎng)的方法。此外，該發(fā)明用激素、細胞因子組合及成纖維細胞條件培養(yǎng) 液和BSA補充了因不添加血清而導致的營養(yǎng)因子的不足，完全滿足角膜緣干細 胞體外長期擴增培養(yǎng)的營養(yǎng)需求，是一種理想的可商品化生產(chǎn)的無血清培養(yǎng)基。


圖1角膜緣干細胞在有血清培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基中的生長曲線圖。 圖2角膜緣干細胞在無血清培養(yǎng)基中克隆生長圖。 圖3無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)角膜緣干細胞Ps3免疫組化染色陽性圖。 圖4無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的角膜緣干細胞具有高核質(zhì)比，細胞器不發(fā)達等干 細胞特性圖。圖5無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的角膜緣干細胞RT-PCR檢測曲線圖。'具體實施方式
結(jié)合附圖和發(fā)明人給出的具體具體實施例、試驗例來進一步說明本發(fā)明培 養(yǎng)基的有益效果。實施例1成纖維細胞條件培養(yǎng)基的制作本發(fā)明的關(guān)鍵是成纖維細胞條件培養(yǎng)基的制作，現(xiàn)以關(guān)中奶山羊角膜緣干 細胞無血清培養(yǎng)基制作為例予以說明。成纖維細胞條件培養(yǎng)基的制備在眼科手術(shù)顯微鏡下，無菌剪取關(guān)中奶山羊角膜上皮組織(深約200 yni)，將角膜上皮組織塊切割成5mmX5mm的小塊， 上皮面朝上貼于皿底，每皿3-4塊，加培養(yǎng)基(DMEM/F12+2腿SA+10ng/ml EGF+10ug/ml insulin+青鏈霉素各100 IU /ml)進行培養(yǎng)。當成纖維細胞鋪滿 平皿后，去組織塊，將成纖維細胞消化傳代以lX105/ml，接種在50mm平皿中， 培養(yǎng)48小時后收集培養(yǎng)基，離心(4000r/分30分鐘)，0. 22um濾膜過濾除菌， 一2(TC保存?zhèn)溆?，標為GCLCM。 實施例2培養(yǎng)基配方，每100ml無血清培養(yǎng)基中各種成分的含量為DMEM/F12 60ml、BSA 0. 5g、 EGF 1Pg、 insulin 100ug 、氫化可酸松20ug、霍亂毒素lug、轉(zhuǎn)鐵蛋白100ug、亞 硒酸鈉100ng、 GCLCM 40ml、青霉素2X104工U 、鏈霉素2X104 IU。實施例3培養(yǎng)基配方每100ml無血清培養(yǎng)基中各種成分的含量為DMEM/F12 70ml、 BSA lg、 EGF Dg、 insulin 300ug 、氫化可酸松40ug、霍亂毒素lug、轉(zhuǎn)鐵蛋白300ug、 亞硒酸鈉300ng、 GCLCM 30ml、青霉素1X10411]、鏈霉素1X104 IU。實施例4培養(yǎng)基配方每100ml無血清培養(yǎng)基中各種成分的含量為DMEM/F12 80ml、 BSA 2g、 EGF 2Pg、 insulin 500ug 、氫化可酸松50ug、霍亂毒素2ug、轉(zhuǎn)鐵蛋白500ug、亞 硒酸鈉500ng、 GCLCM 20ml、青霉素1X10411]、鏈霉素1X104 IU。實施例5培養(yǎng)基配方每100ml無血清培養(yǎng)基中各種成分的含量為DMEM/F12 90ml 、 BSA 4g、 EGF #g、 insulin lmg 、氫化可酸松100ug、霍亂毒素10ug、轉(zhuǎn)鐵蛋白lmg、亞硒 酸鈉lug、 GCLCM 10ml、青霉素5X103111 、鏈霉素5X103 IU。 試驗例1本發(fā)明無血清培養(yǎng)基效果試驗下面部分大寫字母所代表的意思MTT (噻唑蘭)、SDS(十二烷基磺酸鈉)、 細胞OD值(細胞光密度值)、PCM(增殖細胞核抗原)、ABCG2 (the ATP-binding cassette transporter) 、 Cx43(連接因子43)、 CK3 (細胞角蛋白3) 、 CK12 (細胞 角蛋白12)。首先，比較了角膜緣干細胞在有血清培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基中的增殖活性。 將lml原代角膜緣干細胞懸液，以每孔5.0乂103細胞數(shù)接種于96孔培養(yǎng)板，再 分別加入有血清培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基，每組24孔，標準條件下培養(yǎng)并于倒置 相差顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)和生長情況。培養(yǎng)24h后，每天各組取3孔，加 入MTT液(50 mg MTT溶于IO mlPH7. 2的PBS中，過濾除菌)，37。C孵育6 h， 然后吸出100 W液體，再加100 W甲月贊溶解劑十SDS十二烷基磺酸鈉液SDS10 g溶解于100 ml的四蒸水中，用10 mol/L HQ調(diào)至為0. 01 mol/L的HC1 ) 37 。C過夜，在酶標儀(型號Elx800UV)上測OD值(雙波450 nm、 490 nm),持 續(xù)8d，縱坐標為每天所測OD值的平均值，橫坐標為天數(shù)，繪制細胞生長曲線， 對各組OD值進行差異顯著性檢驗。結(jié)果表明，在兩種培養(yǎng)基中所測平均細胞光 密度值無顯著差異(P>0.05)，在兩種培養(yǎng)基中細胞均保持很強的增殖能力， 細胞在兩種培養(yǎng)基中的生長趨勢保持一致(圖1)，在兩種培養(yǎng)基中細胞均保持 很強的增殖能力，細胞在兩種培養(yǎng)基中的增殖能力沒有顯著差異。再者，將角膜緣干細胞接種在無血清條件培養(yǎng)基中，4-5天后角膜緣干細 胞呈鋪路石樣生長，這些細胞體積小，胞體透亮，折光性強，核質(zhì)比高(圖2)。
高核質(zhì)比細胞器不發(fā)達是干細胞的基本特性，在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的角 膜緣干細胞很好地維持了干細胞高核質(zhì)比細胞器不發(fā)達等相關(guān)特性。具有干細 胞的基本特征。這些細胞在鋪有明膠的培養(yǎng)皿中，能夠形成全克隆(圖3)，根據(jù)細胞形成克隆的不均一性將細胞分為三類，①在培養(yǎng)皿中形成面積10 30 mm2 、含有2 5 X104個細胞的細胞團塊的全克隆(holoclone),所含終末分化 細胞〈5 % ，此類細胞體積小，但具極強的增殖、分化潛能；②形成〈5 mm2面積 的細胞克隆的流產(chǎn)克隆(paraclone)，此類克隆面積小，不規(guī)則，幾乎均為終末分 化細胞，這類細胞外形大而扁平，具短暫的增殖、分化潛能，細胞分裂增殖少于15 次，便逐漸喪失增殖能力；③介于全克隆與流產(chǎn)克隆之間的部分克隆 (meroclone)，所含終末分化細胞比例為5 % 100 %;此類克隆形成的面積也介 于全克隆與流產(chǎn)克隆之間，細胞大小不一，具有較強的增殖、分化潛能。全克隆 細胞即為干細胞，而部分克隆細胞又被命名為短暫擴充細胞(BarrandonJC, et al. Proc Vatl Acad Sci USA， 1987， 84:2302-2306)。角膜緣干細胞在無血清 培養(yǎng)基中能夠快速增殖，3天左右即出現(xiàn)多個小的片狀克隆，幾天后克隆逐漸擴 增面積增大，邊緣大致呈圓形，克隆內(nèi)部細胞大小較均一，大部分細胞核質(zhì)比 較高，為Bairandon等定義的全克隆，具有很強增殖潛能。其次，將原代角膜緣干細胞以1X104接種于4孔板，用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)， 細胞生長到80%融合連生時用狄多聚甲醛固定15 min， PBS沖洗，然后按 Histostain PTimP-Plus kits免疫組化染色試劑盒程序分別進行Pe3抗體的染色， DAB顯色，Leica倒置顯微鏡下觀察照相。免疫組化結(jié)果顯示，在這些細胞核中 角膜緣干細胞陽性標記^呈強陽性表達(圖4)， Pe3是目前角膜緣干細胞公認的 特異性標記,對無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的角膜緣干細胞進行P63免疫組織化學染色， 結(jié)果呈強陽性，說明無血清培養(yǎng)基能夠維持角膜緣干細胞處于未分化狀態(tài)。最后，提取無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的角膜緣干細胞RNA并進行RT-PCR?？俁NA 的提取參照裂解液(Sidest印 Lysis and Stabilization Buffer，購自Merck 公司，CatNo. 400901〕的說明書進行，逆轉(zhuǎn)錄采用TaKaRa公司的RNA PCR Kit (Code No.DRR019A)進行。P63、 ABCG2、 PCNA、 CK3、 CK12、 Cx43等引物由上 海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物的序列及產(chǎn)物長度見表1表l引物的序列及產(chǎn)物長度Accession no.Sense primerAntisense primerPCRproductP63NM—003722CAGACTCMTTTAGTGAGAGCTCATGGTOGGGCAC440 bpCK3NM一。57808GGCAGAGATCGAGGGTGTCGTCATCCTTCGCCTGCTGTAG145 bpCK12D78367ACATGAAGAAG亂CACGAGGATGTCTGCTCAGCGATGGTTTCA150 bpABCG2DQ904356TGGAGTCATGMACCTGGCCTCAAAAGGACAGCATTCGCTGTGC474 bpCx43AY074716ATGACAAATCXTTCCCMTCTCGTTCCTCCTCTTTCTTGTTCAGT141 bpPCNAAF416380AGTGGAGMCTTGG嵐TGGAAGAGACAGTGGAGTGGCTTTTGT154 bpP -act inAF481159CACGGTGCCCATCTACGACTTGATGTCACGGACGATTT157 bp結(jié)果顯示，角膜緣干細胞陽性標記P63、 ABCG2、 PCNA等呈強陽性表達， 角膜緣干細胞陰性標記CK3、 CK12、 C^等未表達(圖5):無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的 角膜緣干細胞RT-PCR檢領(lǐng)U。 P63、 ABCG2、 PC織是角膜緣干細胞公認的陽性標記， CK3、 CK12、 Cx43是角膜緣干細胞公認的陰性標記，通過RT-PCR的辦法進行綜 合判定，結(jié)果顯示P63、 ABCG2、 PCNA等陽性標記呈強陽性表達，CK3、 CK12、 Cx43等陰性標記未表達，說明無血清培養(yǎng)基能夠很好地維持角膜緣干細胞處于 未分化狀態(tài)。綜合上述結(jié)果，表明無血清條件培養(yǎng)基能很好地促進角膜緣干細胞的快速 增殖，同時維持角膜緣干細胞處于未分化狀態(tài)。
權(quán)利要求
1. 一種角膜緣干細胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于它是由下述原料制成每100ml無血清培養(yǎng)基中各種成分的含量，其中各原料的比例是DMEM/F 60 ml 90 ml、牛血清白蛋白0. 5 g 4 g、表皮生長因子11^g 4l"ig、胰島素0. lmg lmg 、氫化可酸松20ug 100ug、霍亂毒素lug 10ug、轉(zhuǎn)鐵蛋白0. lmg lmg、 亞硒酸鈉O. lug lug、山羊成纖維細胞條件培養(yǎng)基10ml 40ml，青霉素和鏈 霉素各5X1()3IU 2X104IU。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的角膜緣干細胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于它是由 下述原料制成DMEM/F12 70ml 90ml、牛血清白蛋白1 g 3g、表皮生長因子lPg 2lAg、 胰島素0. 2mg 0. 8mg 、氫化可酸松40ug 60ug、霍亂毒素lug 5ug、轉(zhuǎn)鐵蛋 白0. lmg 0. 5mg、亞硒酸鈉0. 2ug 0. 5ug、山羊成纖維細胞條件培養(yǎng)基10 m1 30 ml、青霉素和鏈霉素各8X1()3IU 1X104IU。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的角膜緣干細胞無血清培養(yǎng)基，其中各原料的比例是每100ml無血清培養(yǎng)基中各種成分的含量為DMEM/F12 80ml、牛血清白蛋白 2g、表皮生長因子2Pg、胰島素500ug 、氫化可酸松50ug、霍亂毒素2ug、轉(zhuǎn) 鐵蛋白500ug、亞硒酸鈉500ng、山羊成纖維細胞條件培養(yǎng)基20ml、青霉素1X 104IU 、鏈霉素1X104 IU。
全文摘要
本發(fā)明公開了角膜緣干細胞無血清培養(yǎng)基，由下述質(zhì)量百分比的原料制成的DMEM/F12 60ml～90ml、BSA 0.5g～4g、EGF 1μg～4μg、insulin 0.1mg～1mg、氫化可酸松20ug～100ug、霍亂毒素1ug～10ug、轉(zhuǎn)鐵蛋白0.1mg～1mg、亞硒酸鈉0.1ug～1ug、GCLCM 10ml～40ml、青霉素和鏈霉素各5×10³IU～2×10⁴IU。本發(fā)明采用在培養(yǎng)基添加成纖維細胞條件培養(yǎng)液的辦法，用激素、細胞因子組合及成纖維細胞條件培養(yǎng)液和BSA補充了營養(yǎng)因子，滿足角膜緣干細胞體外長期擴增培養(yǎng)的營養(yǎng)需求，是一種可商品化生產(chǎn)的無血清培養(yǎng)基。
文檔編號C12N5/06GK101121926SQ200710018160
公開日2008年2月13日 申請日期2007年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月2日
發(fā)明者彌勝利, 竇忠英 申請人:西北農(nóng)林科技大學