專利名稱：一種檢測山羊催乳素基因單核苷酸多態(tài)性的pcr－rflp方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種快速檢測山羊催乳素(PRL)基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)的PCR-RFLP(PCR-限制性片段長度多態(tài)性)方法，該方法利用限制性內(nèi)切酶對包含該單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因序列進(jìn)行酶切，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳對其進(jìn)行片段大小分離，利用凝膠成像系統(tǒng)分析其片段大小，從而確定其SNP。
背景技術(shù)：
所謂單核苷酸多態(tài)性(SNP)就是指基因組DNA序列中由于單個核苷酸(A/T/C/G)的替換而引起的多態(tài)性。因此，通常所說的SNPs包括堿基的插入、缺失以及重復(fù)序列拷貝數(shù)的變化。一個SNP表示在基因組某個位點(diǎn)上有一個核苷酸的變化，主要由單個堿基的轉(zhuǎn)換(以一種嘧啶置換另一種嘧啶或一種嘌呤置換另一種嘌呤)以及顛換(嘌呤與嘧啶互換)所引起。具有轉(zhuǎn)換型變異的SNPs約占2/3，其他幾種SNP在相似的水平上，因?yàn)镃pG二核苷酸的胞嘧啶是基因組中最易發(fā)生突變的位點(diǎn)，其中大多數(shù)是甲基化的，可自發(fā)地脫去氨基而形成胸腺嘧啶。在任何已知或未知的基因內(nèi)或附近都可能找到數(shù)量不等的SNPs，根據(jù)它們在基因組中分布的位置可分為基因編碼區(qū)SNPs(cSNPs)、基因周邊SNPs(pSNPs)和基因間SNPs(iSNPs)等三類?？偟恼f來，cSNP比較少，因?yàn)樵谕怙@子內(nèi)的變異率僅占周圍序列的1/5，但它在遺傳病和育種的研究中卻具重要意義，因此倍受關(guān)注。根據(jù)對遺傳性狀的影響，cSNPs又可分為兩種一種是同義cSNPs，即SNP所致編碼序列的改變并不影響其所翻譯的氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基的“含義”相同；另一種是非同義cSNPs，即指堿基序列的改變將導(dǎo)致編碼氨基酸的改變從而產(chǎn)生蛋白質(zhì)序列的改變，可能最終影響到蛋白質(zhì)的功能。因此，對編碼區(qū)SNPs的非同義突變來說，它們可能對基因功能有直接的重要影響，為此，對個體的表現(xiàn)型具有重要影響。不僅如此，在群體遺傳研究中，這些SNPs作為遺傳標(biāo)記在群體遺傳和生物進(jìn)化的研究中也具有重要意義。
由于SNPs是二等位基因分子標(biāo)記，所以，理論上在一個二倍體生物群體中，SNPs可能是由2個、3個或4個等位基因構(gòu)成，但實(shí)際上3個或4個等位基因的SNPs很罕見，故SNPs通常被簡單地稱為二等位基因分子標(biāo)記。目前，主要采用幾種不同的路線來發(fā)現(xiàn)SNPs即DNA序列測定方法、PCR-SSCP與DNA測序結(jié)合法、AS-PCR方法、引物延伸法和寡核苷酸連接反應(yīng)等。在這些SNP檢測技術(shù)中，其中DNA序列測定法是最為準(zhǔn)確的SNP檢測方法，但是，其檢測費(fèi)用極其昂貴，且需要有DNA測序儀等大型儀器，同時，在測序過程中需要非常熟練的技術(shù)人員和經(jīng)驗(yàn)，所以，DNA序列測定法不是一種應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)際的理想SNP檢測方法；當(dāng)然，利用PCR-SSCP與DNA測序結(jié)合法檢測SNP可以適當(dāng)降低檢測費(fèi)用，但是，PCR-SSCP的實(shí)驗(yàn)過程比較長，操作比較繁瑣，且實(shí)驗(yàn)過程中存在假陰性問題，所以，也并非理想的SNP檢測手段；AS-PCR方法作為一種新型的SNP檢測方法，在未來的應(yīng)用領(lǐng)域中具有非常的前景，但是，該方法需要設(shè)計特別的引物，且只能針對特定的基因位點(diǎn)，同時，檢測過程中還存在誤檢的概率，因此，目前不具有普遍應(yīng)用的特點(diǎn)；而引物延伸法和寡核苷酸連接反應(yīng)技術(shù)檢測SNP位點(diǎn)，需要平板讀數(shù)儀、基因芯片、微球陣列技術(shù)和質(zhì)譜儀等檢測平臺，對于一般的分子實(shí)驗(yàn)室來說可實(shí)施性不強(qiáng)。綜上所述，現(xiàn)有方法不是一種檢測具有限制性酶切位點(diǎn)SNP的理想的遺傳標(biāo)記方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測山羊催乳素(PRL)基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)的PCR-RFLP方法。該方法利用限制性內(nèi)切酶對包含該單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因序列進(jìn)行酶切，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳對其進(jìn)行片段大小分離，利用凝膠成像系統(tǒng)分析其片段大小，從而確定其SNP。
為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取如下的技術(shù)方案一種檢測山羊催乳素(PRL)基因SNP的PCR-RFLP方法，其特征在于，該方法以山羊基因組DNA或包含PRL基因DNA序列的DNA為模板，在Taq DNA聚合酶、Buffer(緩沖環(huán)境)、Mg++、dNTPs存在的情況下，利用一對PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))引物，在PCR條件下進(jìn)行擴(kuò)增，然后利用限制性內(nèi)切酶對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，再通過電泳檢測即可鑒定山羊PRL基因SNP。
所述的1對PCR引物包括上游引物Forward primer5′-ATTCCTGGAGCCAAAGAG-3′；下游引物Reverse primer5′-TGTGGGCTTAGCAGTTGT-3′；所述的PCR擴(kuò)增的條件是25μL反應(yīng)體系包括1U Taq DNA聚合酶(MBI，F(xiàn)ermentas)，10×Buffer 2.5μL(MBI，F(xiàn)ermentas)，25mol/L MgCl21.5μL(MBI，F(xiàn)ermentas)，2.5mmol/L dNTPs 2.5μL，100ng山羊基因組DNA或含PRL基因序列的DNA，10pmol/μL上、下游引物各0.25μL和滅菌超純水15.0μL；PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性4-5min，30-35個循環(huán)(94℃ 30s，58.5℃30s，72℃ 30s)，最后72℃延伸10min，4℃保存。
所述的PRL基因SNP位點(diǎn)為山羊PRL基因第5外顯子的X76049g.576C＞A變異；所述的限制性內(nèi)切酶為Eco24I；25.0-30.0μL Eco24I酶切體系為10-15μL中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，2.5-3.0μL 10×緩沖液(含BSA)，1.0-1.5μL濃度10U/μL的Eco24I限制性內(nèi)切酶，11.5-16.5.0μL滅菌純水(H2O)，酶切消化條件37℃恒溫水浴搖床中消化5-8h左右。
所述的電泳檢測是用2.0-4.0％瓊脂糖凝膠電泳分析限制性內(nèi)切酶Eco24I消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(片段)，C突變表現(xiàn)為196bp，A突變表現(xiàn)為170bp和26bp，相應(yīng)地，CC型表現(xiàn)為170bp，26bp；CA型表現(xiàn)為196bp，170bp，26bp；AA型表現(xiàn)為196bp。
催乳素(PRL)是脊椎動物腺垂體分泌的單鏈多肽類激素，屬于生長激素/催乳素家族，具有促進(jìn)乳腺發(fā)育、啟動泌乳和維持泌乳的功能，是繁殖成功所必需的垂體前葉肽類激素，同時，它還可以直接或間接影響毛皮動物毛的生長、脫落以及替換周期、刺激哺乳動物角質(zhì)化細(xì)胞的生長、增加培養(yǎng)皮膚細(xì)胞的成活率，毛發(fā)生長的季節(jié)性周期中起到重要作用。為此，PRL基因遺傳變異或SNP位點(diǎn)在動物生產(chǎn)實(shí)踐中對泌乳性狀、生長發(fā)育、繁殖和產(chǎn)絨性狀具有重要的作用。關(guān)于動物PRL基因遺傳變異的研究國內(nèi)外多見于雞、牛等動物，而未見山羊PRL基因遺傳變異或SNP研究的報道。由于目前中國山羊PRL基因遺傳變異領(lǐng)域的研究匱乏，使該基因位點(diǎn)的功能研究及該基因遺傳變異與經(jīng)濟(jì)性狀(如泌乳、生長發(fā)育、繁殖和產(chǎn)絨等性狀)關(guān)聯(lián)的研究成為空白。而本發(fā)明所述的方法為檢測中國山羊PRL基因遺傳變異提供了技術(shù)支持；同時，由于本發(fā)明所述方法檢測的中國山羊PRL基因第5外顯子SNP位點(diǎn)為錯義突變(X76049g.576C＞A突變導(dǎo)致第176位氨基酸由Pro變成Thr)，可能影響具有重要生理功能的PRL蛋白的功能，為此，利用本方法檢測的SNP位點(diǎn)為研究PRL功能及PRL SNP與泌乳、生長發(fā)育、繁殖和產(chǎn)絨性狀關(guān)系提供科學(xué)數(shù)據(jù)，為山羊遺傳育種領(lǐng)域標(biāo)記輔助選擇(MAS)在早期泌乳、生長發(fā)育、繁殖和產(chǎn)絨性狀的運(yùn)用提供寶貴資料。
PCR-RFLP方法作為一種檢測SNP的有效技術(shù)，在發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)后利用廉價限制性內(nèi)切酶進(jìn)行切割，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠分析后，就能準(zhǔn)確地鑒別SNP位點(diǎn)。不僅具有DNA測序列法的準(zhǔn)確性，又克服了費(fèi)用昂貴的缺點(diǎn)；不僅具有操作簡單的自身特點(diǎn)，又克服了PCR-SSCP與測序結(jié)合法的繁瑣操作、假陰性缺點(diǎn)；不僅具有AS-PCR方便易行的特點(diǎn)，又克服了特殊性的缺點(diǎn)；不僅具有引物延伸法和寡核苷酸連接反應(yīng)檢測的高通量性的特點(diǎn)，不需要平板讀數(shù)儀、基因芯片、微球陣列技術(shù)和質(zhì)譜儀等檢測平臺，又克服分子實(shí)驗(yàn)室可行性差的缺點(diǎn)。因此，PCR-RFLP方法是一種檢測具有限制性酶切位點(diǎn)SNP的非常理想的遺傳標(biāo)記方法。


圖1為山羊血樣基因組DNA電泳檢測圖；圖2為山羊組織樣品基因組DNA檢測電泳圖；圖3為山羊PRL基因PCR產(chǎn)物電泳；圖4為山羊PRL基因第5外顯子196bp PCR產(chǎn)物的Eco24I酶切電泳分析(2.0-4.0％瓊脂糖凝膠電泳)；其中，泳道1未進(jìn)行酶切消化的PCR產(chǎn)物(196bp)；泳道2CA基因型個體(196bp，170bp，26bp)；泳道3CC基因型個體(170bp，26bp)；MMarker I(600bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp)另外，由于26bp較小，故在瓊脂糖電泳分析中不可見，但196bp和170bp片段能鑒別CC型和CA型。
圖5為山羊PRL基因第5外顯子不同基因型SNP位點(diǎn)測序圖；圖6為Eco24I PCR-RFLP方法檢測山羊PRL基因第5外顯子SNP(X76049g.576C＞A)分析；下面結(jié)合

和發(fā)明人給出的最佳實(shí)施方式對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，以使公眾對發(fā)明內(nèi)容從整體上得到充分的理解，而并非對本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例中所用的主要試劑來源(一)實(shí)驗(yàn)藥品與試劑
1.生化試劑與生物學(xué)試劑①Taq DNA聚合酶(購自Fermantas即MBI公司)；②限制性內(nèi)切酶Eco24I(購自MBI公司)；③蛋白酶K(購自華美生物工程公司)；④PBR322 DNA/MspI和λDNA/EcoRI+HindIII DNA Marker購自上海生工生物工程有限公司和華美生物工程公司；⑤Marker I購自北京天為時代科技有限公司；⑥dNTPs購自北京鼎國生物工程有限公司和上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。
2.普通試劑普通試劑從華美生物工程公司購買，為進(jìn)口分裝產(chǎn)品檸檬酸、檸檬酸鈉、葡萄糖、Tris、EDTA、NaCl、NaOH、KCl、Na2HPO4、KH2PO4、Tris飽和酚、氯仿、異戊醇、無水乙醇、醋酸鈉、十二烷基磺酸鈉(SDS)、溴化乙錠(EB)、溴酚藍(lán)、二甲基苯氰FF、乙酸、蔗糖、硼酸、瓊脂糖等。
3.溶液與緩沖液所有溶液與緩沖液均采用去離子超純水配制。高壓滅菌條件為15bf/in(1.034×105Pa)，25min。試劑配制方法均參考Sambrook等編著的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》。
(1)樣品采樣所用溶液抗凝劑ACD檸檬酸0.48g；檸檬酸鈉1.32g；葡萄糖1.47g。把它們定容于100mL水中，高壓滅菌。每6mL新鮮血液中加入1mL的ACD液。這一抗凝劑優(yōu)于EDTA，在血液貯存過程中能更好地保存高分子的DNA。經(jīng)其抗凝的血液可以在0℃保存數(shù)天或-70℃長期保存。
(2)血樣基因組DNA分離所用溶液①PBS緩沖液NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO41.44g，KH2PO40.24g，加超純水至1000mL，調(diào)pH至7.4，高壓滅菌。
②10％ SDS10g SDS溶解于90mL的超純水中，68℃水浴溶解，用HCl調(diào)pH至7.2，定容至100mL。
③0.5mol/L EDTAEDTA 186.1g，溶于800mL的超純水中，用NaOH調(diào)pH至8.0，定容至1000mL，高壓滅菌，4℃保存。
④1mol/L Tris·Cl121.14g Tris，溶于800mL超純水中，HCl調(diào)節(jié)pH至8.0，定容至1000mL。高壓滅菌，4℃保存。
⑤5mol/L NaClNaCl 292.2g溶于1000mL超純水中。
⑥D(zhuǎn)NA抽提緩沖液取0.5mmol/L EDTA 40mL，1mmol/L Tris·Cl 10mL，⑦5mmol/L NaCl 4mL，10％SDS 10mL定容至100mL。實(shí)際濃度為200mmol/L EDTA，pH8.0100mmol/L Tris·HCl，pH8.0，200mmol/L NaCl，2％ SDS。RNase 20μg/mL。
⑧NaAc緩沖液NaAc·3H2O 20.4g；超純水40mL；稀HAc調(diào)pH至7.4；定容至50mL。
⑨TE緩沖液Tris·Cl緩沖液(pH8.0)10mmol/L，EDTA緩沖液(pH8.0)0.1mmol/L，高壓滅菌，4℃保存。
⑩蛋白酶K用超純水配成20mg/mL，-20℃保存。
(3)提取組織樣DNA所用溶液除了基因組DNA提取時的公用溶液外，還配置以下試劑①2mol/L NaCl11.688g溶于水，定容至100mL，高壓滅菌。
②組織DNA提取液(100mL)1mol/L Tris-Cl(pH8.0)1mL，0.5mol/L EDTA(pH8.0)20mL，2mol/L NaCl 5mL，定容至100mL。
(4)瓊脂糖電泳分析所用溶液①0.5×TBE緩沖液取10×TBE 50mL定容至1000mL。
②上樣緩沖液0.25％溴酚藍(lán)，0.25％二甲苯青FF，40.0％(w/v)蔗糖水溶液。
實(shí)施例1山羊樣本采集及基因組DNA提取、檢測、純化與濃度分析A、實(shí)驗(yàn)動物的采集8個山羊品種(見表1)內(nèi)蒙古白絨山羊(847)、陜西西農(nóng)薩能奶山羊(74)、關(guān)中奶山羊(62)、山東嶗山奶山羊(80)、貴州黑山羊(21)、貴州白山羊(34)、四川板角山羊(25)、湖北馬頭山羊(22)。
表1樣品來源表

B、血樣基因組DNA的分離血樣基因組DNA的分離，具體操作如下(1)冷凍血樣(主要為血細(xì)胞)室溫解凍，轉(zhuǎn)移500μL至1.5mLEppendorf管，加入等體積PBS液，充分混勻，12000r/min離心10min(4℃)，棄去上清液，重復(fù)上述步驟至上清夜透明、沉淀呈淡黃色。
(2)在離心管中加入DNA抽提緩沖液500μL，搖動，使血細(xì)胞沉淀脫離離心管管壁，37℃水浴1h。
(3)加蛋白酶K至30μL(20mg/mL)并混勻，55℃過夜至澄清，尚未澄清者，可補(bǔ)加10μL蛋白酶K混勻繼續(xù)消化直至澄清。
(4)將反應(yīng)液冷卻至室溫，加Tris-飽和酚500μL，溫和搖動離心管20min，使其充分混勻；4℃，12000r/min離心10min，將上清液轉(zhuǎn)入另一1.5mL離心管中，重復(fù)一次。
(5)加氯仿500mL，充分混勻20min，4℃，12000r/min離心10min，將上清液轉(zhuǎn)入另一1.5mL離心管中。
(6)加氯仿、異戊醇混合液(24∶1)500mL，充分混勻20min，4℃，12000r/min離心10min，將上清液轉(zhuǎn)入另一1.5mL離心管中。
(7)加0.1倍體積的NaAc緩沖液及2倍體積的冰冷的無水乙醇，混合轉(zhuǎn)動離心管直至白色的絮狀沉淀析出，-20℃保存30～60min。
(8)4℃，12000r/min離心10min，棄去上清液，用70％冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。
(9)4℃，12000r/min離心10min，棄去上清液，室溫下使乙醇揮發(fā)干凈。
(10)干燥后的DNA溶于80～100μL的TE液，4℃保存直至DNA完全溶解，0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量，-80℃保存。
C、組織樣品DNA的提取與分離(1)取耳組織樣約10mg的組織樣品，放于1.5mL的離心管中，用小剪刀盡量剪碎。
(2)加入600μL組織提取液，10％SDS至終濃度為1％，蛋白酶K至終濃度為100μg/mL，55.0℃消化過夜，最好保證組織樣較均勻地分布在組織提取液中。
(3)將溶液冷卻至室溫，加入等體積的Tris飽和酚，蓋緊管蓋，緩慢地來回顛倒離心管，至少持續(xù)10min以上，12000r/min離心15min。
(4)取上清液，加入等體積的酚∶氯仿(1∶1)，蓋緊管蓋，緩慢地來回顛倒離心管，至少持續(xù)10min以上，12000r/min離心15min。
(5)取上清液，加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，蓋緊管蓋，緩慢地來回顛倒離心管，至少持續(xù)10min以上，12000r/min離心15min。
(6)取上清液，加入2倍體積的冰冷無水乙醇和1/10體積的3mol/L乙酸鈉，蓋緊管蓋，緩慢地來回顛倒離心管，直至液體清亮，出現(xiàn)白色絮DNA。
(7)挑出DNA，放進(jìn)一個1.5mL的離心管中，加入500μL 70％乙醇，蓋緊管蓋，緩慢地來回顛倒離心管，然后12000r/min離心3～5min，小心倒掉乙醇，將管倒置于吸水紙上。
(8)再一次向離心管中加入500μL 70％乙醇，蓋緊管蓋，緩慢地來回顛倒離心管，然后12000r/min離心3～5min，小心倒掉乙醇，將管倒置于吸水紙上。
(9)待干燥后，加入60μL滅菌超純水，為使其完全溶解，4℃保存過夜，待檢測。
D、瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA(1)將凝膠電泳槽洗干凈，用膠帶紙將兩端封住，插上梳子。
(2)稱取0.24g的瓊脂糖，轉(zhuǎn)入三角瓶中，加入1×TAE 30mL使其懸浮，微波爐中火加熱，待沸騰2次拿出。
(3)迅速向另一個三角瓶加入EB溶液至終濃度為0.5μg/mL，然后快速將瓊脂糖溶液導(dǎo)入，輕微搖動，防止出現(xiàn)氣泡。
(4)混勻后(約60℃)，立即將瓊脂糖溶液到入槽內(nèi)。如出現(xiàn)氣泡，立即用移液器移出。
(5)完全冷卻凝固(約25～40min)后，拔掉梳子，去掉兩端膠帶紙，將凝膠移入電泳槽中。
(6)向電泳槽中加入1×TAE緩沖液，使液面高出膠面2～5mm。
(7)取DNA樣品2～4μL，加2μL上樣緩沖液后混勻，統(tǒng)一上樣(注意槍頭的順序應(yīng)前后對應(yīng))，并將DNA Marker加在一邊。
(8)80V電壓電泳2h。
(9)在紫外分析儀上觀察，如果有RNA則需要純化，如果有明顯降解不能用，需重新提取相應(yīng)樣品的DNA。
E、DNA的純化(1)500μL的DNA溶液中加入10％ SDS使其終濃度為0.1％，加入蛋白酶K至終濃度達(dá)到100μg/mL。
(2)5℃保溫10h左右。
(3)等體積苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)和氯仿分別抽提一次。
(4)12000r/min離心5min分相，吸取上層水相至另一離心管中。
(5)加入1/10體積3mol/L醋酸鈉和2倍體積冰冷無水乙醇沉淀DNA。
(6)倒掉液體，70％乙醇洗滌后涼干，加入60μL滅菌超純水溶解，4℃待檢測。
F、分光光度法檢測DNA用紫外光光度計測定DNA樣品在260nm、280nm處的OD值。計算DNA含量和OD260/OD280的比值。如OD260/OD280比值小于1.6，說明樣品中含有較多的蛋白質(zhì)或酚，則應(yīng)進(jìn)行純化；若比值大于1.8，則應(yīng)該考慮去除RNA純化。
DNA濃度(ng)＝50×OD260值×稀釋倍數(shù)DNA檢測完畢后，取出一定的量稀釋至50ng/μL，存于-20℃?zhèn)溆茫溆嗟拇娣庞?80℃。
結(jié)果
山羊血樣基因組DNA、組織樣基因組DNA的檢測結(jié)果分別見圖1和圖2，圖1中1-10為山羊血樣基因組DNA，MλDNA/EcoRI+HindIII，圖2中1-8為不同山羊DNA；MλDNA/EcoRI+HindIII，從圖中表明山羊基因組DNA的質(zhì)量非常高。
實(shí)施例2山羊PRL基因第5外顯子的PCR擴(kuò)增A、山羊PRL基因第5外顯子196bp片段PCR引物的設(shè)計以山羊X76049序列為參考，利用Primer 5.0設(shè)計山羊PRL基因第5外顯子196bp片段的PCR引物，其引物序列如下上游引物(Forward primer5’-ATTCCTGGAGCCAAAGAG-3’)；下游引物(Reverse primer5’-TGTGGGCTTAGCAGTTGT-3’)；該引物擴(kuò)增了山羊PRL基因第5外顯子區(qū)域(以X76049序列為參考，在552-747區(qū)域)B、PCR反應(yīng)條件反應(yīng)體系采用混合加樣法，即根據(jù)每一個反應(yīng)體系所需的各種組分的數(shù)量和1次反應(yīng)所需的PCR反應(yīng)的個數(shù)，算出各種反應(yīng)組分的總量，加入到1個1.5mL離心管中，充分混勻后瞬時離心，再分裝到每個Eppendorf管中，然后加入模板DNA，再瞬時離心后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系見表2表2 PCR反應(yīng)體系

25μL反應(yīng)體系包括1 U Taq DNA聚合酶(MBI，F(xiàn)ermentas)，10×Buffer 2.5μL(MBI，F(xiàn)ermentas)，25mol/L MgCl21.5μL(MBI，F(xiàn)ermentas)，2.5mmol/L dNTPs 2.5μL，100ng山羊基因組DNA或含PRL基因序列的DNA，10pmol/μL上、下游引物各0.25μL；C、PCR反應(yīng)的程序見表3表3 PCR反應(yīng)程序 D、瓊脂糖凝膠電泳檢測及Kada120系統(tǒng)的成像分析(1)制作2.0-4.0％的瓊脂糖凝膠，100V電壓電泳0.5～1h，EB染色。
(2)待分子量不同的DNA片段分離清晰時，在Kodak DC 120凝膠成像系統(tǒng)成像。
(3)根據(jù)圖像判斷基因的PCR效果。
結(jié)果PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖3，圖中泳道1為PCR產(chǎn)物(196bp)；M為MaekerI(600bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp)表明PCR片段的大小為196bp，與理論設(shè)計的大小完全一致。故此，成功擴(kuò)增出山羊PRL基因第5外顯子區(qū)域DNA片段。
實(shí)施例3山羊PRL基因DNA片段的Eco24I PCR-RFLP分析利用實(shí)施例2中的山羊PRL基因第5外顯子的196bp片段的PCR引物和PCR擴(kuò)增條件，對實(shí)施例1中8個山羊品種的1000多份基因組DNA(已經(jīng)DNA檢測、純化和濃度測定分析)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得1000多個體的山羊PRL基因中包含SNP位點(diǎn)的DNA片段，然后利用如下方法進(jìn)行Eco24I的PCR-RFLP分析，具體方法如下
A、Eco24I酶切反應(yīng)的消化體系Eco24I酶切體系(25-30μL)10-15μL PCR產(chǎn)物，10×緩沖液(含BSA)2.5-3.0μL，Eco24I(10U/μL)為1.0-1.5μL，11.5-16.5.0μL滅菌純水(H2O)。
B、酶切消化條件37℃恒溫水浴搖床中消化5-8h。
C、Eco24I消化PCR產(chǎn)物后的圖象分析用Kodak DC 120凝膠成像分析系統(tǒng)照相分析，并人工進(jìn)行判型；D、不同基因型個體PCR產(chǎn)物的測序驗(yàn)證利用ABI 377和ABI 3730測序儀對代表性的不同基因型個體PCR分別進(jìn)行正反雙向測序；同時，進(jìn)行SNP位置進(jìn)行分析。
E、山羊PRL基因SNP位點(diǎn)的頻率統(tǒng)計分析(1)基因和基因型頻率基因型頻率是指一個群體中某一性狀的各種基因型之間的比率。PCR-RFLP、PCR-SSCP及微衛(wèi)星等其檢測結(jié)果是共顯性等位基因，故表型頻率和基因型頻率一致。
PAA＝NAA/N，其中PAA代表某一位點(diǎn)的AA基因型頻率；NAA表示群體中具有AA基因型的個體數(shù)；N為檢測群體的總數(shù)量。
基因頻率是指一個群體中某一基因?qū)ζ涞任换虻南鄬Ρ嚷?。計算的公式可以寫成PA＝(2NAA+NAa1+NAa2+NAa3+NAa4+......+NAan)/2N式中，PA表示等位基因A頻率，NAA表示群體中具有AA基因型的個體數(shù)量，NAai表示群體中具有Aai基因型個體數(shù)量，a1-an為等位基因A的n個互不相同的復(fù)等位基因。
結(jié)論利用2.0％-4.0％瓊脂糖凝膠電泳分析Eco24I限制性內(nèi)切酶消化196bp的PCR擴(kuò)增片段結(jié)果見圖4，圖中泳1為未進(jìn)行酶切消化的PCR產(chǎn)物(196bp)，泳道2為CA基因型個體(196bp，170bp，26bp)，泳道3為CC基因型個體(170bp，26bp)，M為Marker I(600bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp)。由于26bp較小，故在瓊脂糖電泳分析中不可見，但196bp和170bp片段能鑒別CC型和CA型。表明C堿基突變表現(xiàn)170bp和26bp條帶，A突變表現(xiàn)為196bp條帶，相應(yīng)地，CC型表現(xiàn)170bp和26bp條帶；CA型表現(xiàn)196bp，170bp，26bp條帶；AA型表現(xiàn)170bp和26bp條帶。不同基因型個體的DNA正、反雙向DNA測序結(jié)果見圖5，圖中CC基因型表現(xiàn)X76019g.576C突變，CA基因型表現(xiàn)X76019g.576C＞A突變。經(jīng)過分析，發(fā)現(xiàn)Eco24I PCR-RFLP檢測的SNP的位置如圖6所示，X76019g.576C＞A，對應(yīng)于X76049序列的第576位置(即PRL基因CDS區(qū)第526位核苷酸位置)，導(dǎo)致第176位氨基酸密碼子由CCC＞ACC，從而形成錯義突變176Pro＞176Thr，同時，該位點(diǎn)能形成Eco24I(GRGCYC)多態(tài)，是Eco24I PCR-RFLP方法能檢測該SNP的分子機(jī)理。等位基因在不同山羊品種PRL基因SNP的C等位基因頻率變化幅度為在78.60-93.50％，A等位基因頻率變化幅度在6.5-21.4％之間(見表4)。由于SNP位點(diǎn)的等位基因要求大于1.0％，因此，本實(shí)施例中利用Eco24I PCR-RFLP檢測PRL基因第5外顯子的SNP位點(diǎn)(X76019g.576C＞A)。
表4 山羊PRL基因SNP位點(diǎn)的Eco24I PCR-RFLP的頻率分布表

權(quán)利要求
1.一種檢測山羊催乳素基因單核苷酸多態(tài)性的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性方法，其特征在于，以山羊基因組DNA或包含PRL基因的DNA序列為模板，在Taq DNA聚合酶、緩沖環(huán)境、Mg++、dNTPs存在的情況下，利用一對聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物，在PCR條件下進(jìn)行擴(kuò)增，然后利用限制性內(nèi)切酶對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，再通過電泳檢測即可鑒定山羊催乳素基因單核苷酸多態(tài)性；所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物包括上游引物Forward primer5′-ATTCCTGGAGCCAAAGAG-3′；下游引物Reverse primer5′-TGTGGGCTTAGCAGTTGT-3′。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的PCR擴(kuò)增的條件是25μL反應(yīng)體系，包括1U Taq DNA聚合酶，10×Buffer 2.5μL，25mol/LMgCl2 1.5μL，2.5mmol/L dNTPs 2.5μL，100ng山羊基因組DNA或含催乳素基因序列的DNA，10pmol/μL，上、下游引物各0.25μL，滅菌超純水15.0μL；PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性5min，94℃30s，58.5℃30s，72℃30s共30～35個循環(huán)，最后72℃延伸10min，4℃保存。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的催乳素基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)為山羊催乳素基因第5外顯子的X76049g.576C＞A變異位點(diǎn)。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的限制性內(nèi)切酶為Eco24I；
25-30μL Eco24I酶切體系為10-15μL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，2.5-3.0μL10×緩沖液，其中含BSA，1.0-1.5μL的濃度10U/μL的Eco24I限制性內(nèi)切酶，11.5-16.5μL滅菌純水H2O，酶切消化條件37℃恒溫水浴搖床中消化5-8h。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的限制性內(nèi)切酶為能切割該位點(diǎn)的相應(yīng)的限制型內(nèi)切酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的電泳檢測是用2.0-4.0％瓊脂糖凝膠電泳分析限制性內(nèi)切酶Eco24I消化PCR擴(kuò)增片段，C突變表現(xiàn)為196bp，A突變表現(xiàn)為170bp和26bp，相應(yīng)地，CC型表現(xiàn)為170bp，26bp；CA型表現(xiàn)為196bp，170bp，26bp；AA型表現(xiàn)為196bp。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速檢測山羊催乳素(PRL)基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)的PCR－RFLP(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)－限制性片段長度多態(tài)性)方法，該方法是以山羊基因組DNA或包含PRL基因的DNA序列為模板，在Taq DNA聚合酶、Buffer(緩沖環(huán)境)、Mg
文檔編號C12Q1/68GK101063169SQ20071001797
公開日2007年10月31日 申請日期2007年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月4日
發(fā)明者藍(lán)賢勇, 陳宏 , 潘傳英 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)