專利名稱：：用于預(yù)測(cè)急性髓系白血病病人對(duì)抗癌藥物應(yīng)答的標(biāo)記物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用于預(yù)測(cè)急性髓系白血病(AML)病人對(duì)抗癌藥物應(yīng)答的標(biāo)記物。更具體地，本發(fā)明涉及一種用于預(yù)測(cè)AML病人對(duì)抗癌藥物應(yīng)答的試劑盒，該試劑盒包含用于測(cè)定所述標(biāo)記物的表達(dá)水平的試劑，并且本發(fā)明還涉及一種以該標(biāo)記物的表達(dá)的程度為基礎(chǔ)，預(yù)測(cè)AML病人對(duì)抗癌藥物應(yīng)答的方法。
背景技術(shù)：
：根據(jù)白血病的進(jìn)展速度，白血病可以被劃分為急性和慢性形式。根據(jù)疾病類型和受侵入的細(xì)胞的特性，白血病的臨床狀況是不同的。當(dāng)白血病侵入淋巴細(xì)胞時(shí)，它被稱為淋巴細(xì)胞白血病。當(dāng)髓細(xì)胞被侵入時(shí)，該疾病被稱為髓系白血病。當(dāng)處于成熟期的細(xì)胞發(fā)生突變時(shí)，慢性髓系白血病就會(huì)發(fā)作。急性髓系白血病(AML)是血癌的一種，其表現(xiàn)為細(xì)胞分化的特定階段中母細(xì)胞的無(wú)限生長(zhǎng)和抑制母細(xì)胞的分化。AML顯示已知的各種基因突變與對(duì)抗癌治療的應(yīng)答和其預(yù)后都密切相關(guān)。因?yàn)檫@些原因，細(xì)胞遺傳學(xué)方法被廣泛地用來(lái)做染色體突變分析并對(duì)AML進(jìn)行分類。例如，已經(jīng)觀察到具有t(8;21)(在第8和第21之間的染色體轉(zhuǎn)運(yùn))，t(15;17)(在第15和第17之間的染色體轉(zhuǎn)運(yùn))或inv(16)(第16染色體的倒位)的AML病人對(duì)抗癌藥物顯示出良好的應(yīng)答和所希望的預(yù)后(Lowenbergetal.，N.Engl.J.Med.1999，341:1051-1062;Slovaketal.,Blood2000,96:4075-4083;Byrdetal.，Blood2002，100:4325-4336;Grimwadeetal.,Blood1998，92:2322-2333;Grinwadeetal.，Blood2001,98:1312-1320)。除細(xì)胞遺傳學(xué)方法之外，分子分析方法也用于檢查基因突變，或表達(dá)的改變，和預(yù)后之間的關(guān)系。具有FLT3(FMS樣酪氨激酶3)基因內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)突變或EV1(熱帶病毒整合位點(diǎn)1)基因的增加的表達(dá)水平的病人已知具有不良的預(yù)后。相反，具有CEBPA(CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白a)基因突變的病人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有良好的預(yù)后(Kiyoetal.,Blood1999,93:3074-3080;GillilandandGriffinBlood2002,100:1532-1542;Barjestehetal.，Blood2003，101:837-845;Barjestehetal,,Hematol.J.4:31-40;Preudhortimeetal.,Blood2002，100:2717-2723)。已經(jīng)努力來(lái)揭示基因表達(dá)信息或特異性蛋白的表達(dá)水平對(duì)抗癌藥物應(yīng)答的關(guān)系(Broxte醒netal.,Leukemia2000，14:1018-1024;Kandaetal.，Cancer2000，88:2529-2533;Ugrandetal"Blood2000，96:870-877;Christiansenetal.，J.Clin.Oncol.2001，19:1405-1413;Okutsuetal.,Mol.Cancer.Ther.2002，1:1035-1042)。隨著DNA芯片分析技術(shù)的發(fā)展，在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中分析成千上萬(wàn)的基因的表達(dá)水平已經(jīng)成為可能。在這種背景下，使用DNA芯片，在分子水平上來(lái)分析AML病人的基因(Virtanevaetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2001,98:1124-1129;Armstrongetal.，Nat.Genet.2002,30:41-47;Yeohetal.,CancerCell.2002,1:133-143;Schochetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2002,99:10008-10013;Kohlmannetal.，GenesChromosomesCancer2003'37:396-405;Yagietal.,Blood2003102:1849-1856)。但是目前還沒(méi)有提供用于預(yù)測(cè)AML病人對(duì)抗癌治療應(yīng)答的技術(shù)。特別是，沒(méi)有方法來(lái)預(yù)測(cè)既沒(méi)有染色體異常也沒(méi)有上述基因突變的AML病人是如何對(duì)抗癌治療作出應(yīng)答的。白血病的治療是非常復(fù)雜的，并且要根據(jù)白血病的類型進(jìn)行治療。臨床上，對(duì)治療表現(xiàn)抗性的白血病病人具有十分短的存活時(shí)間。因此，從例如放療，手術(shù)治療，化療等多種治療中形成一套適合的治療方案，并且考慮到減少昂貴的藥費(fèi)和精神和身體痛苦將它應(yīng)用于病人是非常重要的。診斷為相同癌癥疾病的病人中，一些可能對(duì)藥物積極地作出應(yīng)答，而另一些可能對(duì)相同的藥物沒(méi)有應(yīng)答。另外，即使對(duì)相同藥物的積極應(yīng)答，可能從一個(gè)病人到另一個(gè)病人在程度上不同。從而，病人對(duì)藥物應(yīng)答的預(yù)測(cè)賦予醫(yī)生放棄不必要的治療能力，因此，增加了所使用的治療的效率和效果。對(duì)于本發(fā)明，本發(fā)明人對(duì)AML病人的某些基因的表達(dá)行為進(jìn)行了透徹和徹底的研究，從而發(fā)現(xiàn)了67種標(biāo)記基因與抗癌藥物的應(yīng)答有關(guān)并且該標(biāo)記基因的表達(dá)水平可預(yù)示該應(yīng)答。
發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問(wèn)題因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于預(yù)測(cè)AML病人對(duì)抗癌藥物應(yīng)答的試劑盒，該試劑盒含有一種試劑，該試劑能夠預(yù)測(cè)使用抗癌藥物進(jìn)行治療的應(yīng)答。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種方法，該方法用于預(yù)測(cè)AML病人對(duì)使用抗癌藥物進(jìn)行治療而產(chǎn)生的應(yīng)答。圖1是顯示P值的圖表，它是在檢查低危人群和高危人群之間復(fù)發(fā)顯著性差異的時(shí)序檢驗(yàn)中獲得的，低危人群和高危人群根據(jù)AML病人的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分進(jìn)行劃分。圖2是顯示圖1的兩組人群中復(fù)發(fā)頻率的Kaplan-Meier曲線圖，其中全部55例AML病人中的33個(gè)病人處于低危人群。具體實(shí)施例一方面，本發(fā)明涉及一種用于預(yù)測(cè)AML病人對(duì)抗癌藥物應(yīng)答的標(biāo)記物。另一方面，本發(fā)明涉及一種用于預(yù)測(cè)AML病人對(duì)抗癌藥物應(yīng)答的試劑盒，該試劑盒含有一種試劑，該試劑用于測(cè)定能預(yù)測(cè)AML病人對(duì)抗癌藥物進(jìn)行應(yīng)答的標(biāo)記基因的表達(dá)。很難在任意時(shí)間對(duì)抗癌藥物的應(yīng)答進(jìn)行分類。例如，一個(gè)病人從開始就顯示對(duì)抗癌治療的抵抗，而另一個(gè)病人起先達(dá)到幾乎完全緩解階段，但是幾個(gè)月后癌癥復(fù)發(fā)。因此，在預(yù)定的臨床時(shí)間，選擇具有不同表達(dá)水平的基因作為將病人劃分為完全和非完全緩解階段的方法可能導(dǎo)致誤差。在本發(fā)明中，cDNA由來(lái)自AML病人骨髓的RNA合成，并將其雜交到16k人類cDNA芯片上，來(lái)檢測(cè)與正常人群表達(dá)水平不同的基因。隨后，記錄病人對(duì)抗癌治療顯示出抵抗的時(shí)間，并且為了應(yīng)用截尾數(shù)據(jù)(censoreddata)(這種情況是只監(jiān)控了病人的該疾病，或始終沒(méi)有復(fù)發(fā)發(fā)生)通過(guò)Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型的方式選擇了下列67種基因，發(fā)現(xiàn)這67種基因與對(duì)抗癌藥物的應(yīng)答有顯著關(guān)系(p=0.001),(CoxD.R.J.RoyalStat.Soc.B.197234:187-202):GENX-3414，SPINK2,PECAM1,AQP5，LAPTM5,DDX48,F2RL3,SLC3A2，GPR51,ZC3HDC8.WASF1,PSCD4，CDKN1A，AIF1，ADFP,CD164,RAB8A,ID2,ITGB2,MGC3047，MYST3'MT3，MGAT1,BC002942，EVI2B,CPVL'MX1，LGALS1,MX2,KRT1，MICA，GABBR1，TINF2，MPV17，RXRA，JARID1D'C2orf22，DPT，NDUFS2,CCIN，MADH3,NAG,E2F5,SMC6L1,CASP1，LILRB1,TCF4,TNP03，DNCI1,TIE，ADM，SMUG1,PPP1CA,SALL3,IRF2，KIAA1223,NC0A3,CKS2，ZNF226，CTBS，MetRS,MGC5395,FLJ10349，CD4，EHD4，ARL4A，和DNAJCIO。在獨(dú)立探針試驗(yàn)中再次選擇它們之中的四個(gè)基因PECAM1,LAPTM5，AIF1,和ITGB2。這支持了這些基因不是偶然被選擇的，而是它們的表達(dá)與對(duì)抗癌藥物的應(yīng)答有關(guān)的主張。通過(guò)留一法交叉驗(yàn)證，還發(fā)現(xiàn)在給藥之前這些被選擇的標(biāo)記基因可用于預(yù)測(cè)抗癌藥物治療AML病人的可行性。因此，根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，本發(fā)明涉及一種用于預(yù)測(cè)AML病人對(duì)抗癌藥物應(yīng)答的試劑盒，其包含一種試劑，該試劑能夠分析對(duì)抗癌治療具有預(yù)測(cè)性的標(biāo)記基因的表達(dá)，該標(biāo)記基因是從上述標(biāo)記基因中選出的。在此使用的術(shù)語(yǔ)'AML(急性髓系白血病)，指惡性血液疾病，特征為髓系前體白細(xì)胞的癌細(xì)胞增殖，它們?cè)谄鞴僦蟹e聚并干擾正常血細(xì)胞的生長(zhǎng)，此時(shí)骨髓中的平衡被破壞，從而侵入外周血液或其它器官。在此使用的該術(shù)語(yǔ)'用于預(yù)測(cè)對(duì)抗癌藥物應(yīng)答的標(biāo)記物，是指一種通過(guò)測(cè)定表達(dá)水平，確定在給藥之前抗癌藥物在癌癥治療中是否有用的材料，以該表達(dá)水平為基礎(chǔ)，對(duì)抗癌藥物的應(yīng)答是可預(yù)測(cè)的。該標(biāo)記物可以包括例如核酸，多肽，蛋白質(zhì)，類脂，和糖類的有機(jī)生物分子。對(duì)于本發(fā)明的該目的，用于預(yù)測(cè)對(duì)抗癌藥物治療應(yīng)答的標(biāo)記物選自于核酸和多肽，它們對(duì)AML病人對(duì)抗癌藥物的應(yīng)答是可預(yù)測(cè)的。該標(biāo)記物的表達(dá)水平可以通過(guò)定量測(cè)定其mRNA或蛋白質(zhì)確定，優(yōu)選測(cè)定其mRNA。在本發(fā)明中用于確定mRNA的表達(dá)水平的技術(shù)的例子包括，但不限于，DNA芯片，RT-PCR,竟?fàn)幮訰T-PCR,實(shí)時(shí)RT-PCR，RPA(RNA酶保護(hù)試驗(yàn))，和Northern印跡技術(shù)。優(yōu)選地，DNA芯片用于測(cè)定mRNA的表達(dá)水平，其中標(biāo)記基因或其片段以高密度附著在例如玻璃的基底上。該DNA芯片需要核苷酸，在它的端位點(diǎn)或中間位點(diǎn)用如熒光成分進(jìn)行標(biāo)記，用于雜交。優(yōu)選地，該核苷酸可以是由來(lái)自目標(biāo)樣本制備的mRNA合成的cDNA。在DNA芯片上雜交cDNA后，表達(dá)水平可以被容易地讀取。作為選擇，RT-PCR可以用于檢測(cè)mRNA的表達(dá)水平。RT-PCR是一種技術(shù)，其中由目標(biāo)樣本制備的mRNA"逆"轉(zhuǎn)錄為cDNA,隨后使用聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增(PCR)擴(kuò)增所得到的DNA。在該擴(kuò)增步驟中，使用對(duì)該標(biāo)記基因有特異性的一對(duì)引物。在對(duì)由此獲得的RT-PCR產(chǎn)物電泳后，看到的帶型和厚度給出該標(biāo)記基因表達(dá)水平的信息。從蛋白質(zhì)水平，可以測(cè)定該標(biāo)記基因的表達(dá)。在這種情況下，該基因的蛋白質(zhì)可以使用特異性結(jié)合在該蛋白質(zhì)上的抗體被定量地分析。使用抗體分析技術(shù)的例子包括蛋白質(zhì)印跡法，ELISA(酶聯(lián)免疫吸附劑法)，RIA(放射性免疫測(cè)量)，it射免疫擴(kuò)散，火箭免疫電泳，免疫組織化學(xué)染色，免疫沉淀測(cè)定法，補(bǔ)體結(jié)合測(cè)定法，F(xiàn)ACS,蛋白質(zhì)陣列等，但不限于此。根據(jù)本發(fā)明，用于測(cè)定所述標(biāo)記基因的表達(dá)的試劑盒可以包括適合所使用的分析技試劑盒可以包括目標(biāo)基因或其cDNA附著在其上的基底，用于熒光標(biāo)記的試劑，和酶。RT-PCR試劑盒可以包括對(duì)該基因有特異性的一對(duì)引物。每一個(gè)引物是對(duì)該標(biāo)記基因有特異性的，長(zhǎng)度7至50bp的核苷酸序列。該RT-PCR試劑盒可以包括容器，反應(yīng)緩沖器，脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs),taq聚合酶，反轉(zhuǎn)錄酶，DNAse，或RNAse抑制劑。根據(jù)本發(fā)明的該試劑盒可以用于對(duì)在AML治療中使用的抗癌藥物上。另外，使用本發(fā)明的試劑盒，，可以預(yù)先分析天然產(chǎn)生的材料和由此制備的純化學(xué)制品以及在化療中通用的合成有機(jī)化學(xué)制品對(duì)治療的應(yīng)答。該抗癌藥物可以聯(lián)合給藥。例如，伊達(dá)比星(IDA)可以與4N-聯(lián)己基(bihenoyl)-1-P-D-阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶(BHAC)聯(lián)合，柔紅霉素與BHAC聯(lián)合，阿糖胞苷與從阿霉素，柔紅霉素，米托蒽醌(mitoxanthrone)和硫鳥噪呤之中選擇的一種聯(lián)合，巰基噪呤與氨甲葉酸聯(lián)合，米托蒽醌與依托泊戒聯(lián)合，天門冬酰胺酶與長(zhǎng)春新堿，柔紅霉素和強(qiáng)的松聯(lián)合，環(huán)磷酰胺與長(zhǎng)春新堿，阿糖胞苷和強(qiáng)的松聯(lián)合，環(huán)磷酰胺與長(zhǎng)春新堿和硫鳥噪呤聯(lián)合，柔紅霉素與阿糖胞脊和硫鳥嘌呤聯(lián)合，以及柔紅霉素與長(zhǎng)春新堿和強(qiáng)的松聯(lián)合給藥。優(yōu)選的是伊達(dá)比星與BHAC的聯(lián)合或柔紅霉素與BHAC的聯(lián)合。根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種用于預(yù)測(cè)AML病人對(duì)抗癌藥物應(yīng)答的方法，其包括如下步驟1)在AML病人的生物樣本中，確定用于預(yù)測(cè)對(duì)抗癌藥物應(yīng)答的標(biāo)記基因的表達(dá)水平，該標(biāo)記基因選自包括GENX-3414,SPINK2，PEC扁，AQP5，LAPTM5，DDX48,F2RL3,SLC3A2，GPR51,ZC3HDC8.WASF1，PSCD4，CDKN1A,AIF1'ADFP'CD164,醒8A,ID2,ITGB2,MGC3047,MYST3,MT3，MGAT1，BC002942，EVI2B,CPVL，MX1，LGALS1,MX2,KRT1,MICA，GABBR1,TINF2，MPV17,RXRA,JARID1D,C2orf22,DPT，NDUFS2，CCIN,MADH3,NAG，E2F5,SMC6L1，CASP1,LILRB1，TCF4，TNP03，DNCIl，TIE,ADM,SMUG1,PPP1CA,SALL3,IRF2，KIAA1223,NC0A3,CKS2,ZNF226,CTBS，MetRS,MGC5395,FLJ10349,CD4，EHD4,ARL4A和DNAJCIO的組，和2)統(tǒng)計(jì)分析該基因的表達(dá)水平，來(lái)評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分R。在步驟1)中，對(duì)測(cè)定用于預(yù)測(cè)對(duì)抗癌藥物應(yīng)答的該標(biāo)記基因的表達(dá)水平有用的生物樣本可以以骨髓，淋巴節(jié)，脾，血液和淋巴液作為例子，優(yōu)選地是骨髓。可選擇地，該方法還可以包括參考已累積的AML病人風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分R的數(shù)據(jù)庫(kù)，校正所述風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分R的步驟。可以使用得自Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型的HR(風(fēng)險(xiǎn)比)或e系數(shù)計(jì)算該風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分R。在此使用的術(shù)語(yǔ)"HR"指當(dāng)系數(shù)增加1時(shí)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分R增加，并與e^相對(duì)應(yīng)。顯著性pi.001時(shí)所選擇的67種基因的冊(cè)值在下面表l中給出。病人的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分R可以使用下面的數(shù)學(xué)公式1進(jìn)行計(jì)算，該公式表示每個(gè)病人的各個(gè)產(chǎn)品的每個(gè)基因表達(dá)程度和p系數(shù)的總和。數(shù)學(xué)公式I其中R表示風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，Pi表示基因i的e系數(shù)，并且Gi表示基因i的表達(dá)程度。在表1中總結(jié)了由Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型獲得的用于預(yù)測(cè)對(duì)抗癌藥物應(yīng)答的標(biāo)記基因的服(風(fēng)險(xiǎn)比)值。[表l]用于預(yù)測(cè)對(duì)抗癌藥物應(yīng)答的標(biāo)記基因<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>a:重復(fù)選擇的4個(gè)基因被重復(fù)表示。b:風(fēng)險(xiǎn)比，當(dāng)基因表達(dá)雙倍增加時(shí)，風(fēng)險(xiǎn)增加。朋是2指當(dāng)基因表達(dá)雙倍增加時(shí)，該風(fēng)險(xiǎn)水平加倍。c:基因表達(dá)的平均偏差。d:GenBank登錄號(hào)。e:UniGene蔟ID。AML病人的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分(R)數(shù)據(jù)庫(kù)在下面的表4中給出。在根據(jù)本發(fā)明的用于預(yù)測(cè)對(duì)抗癌藥物應(yīng)答的方法中，可以使用上面描述的用于測(cè)定標(biāo)記基因的表達(dá)率的方法和抗癌藥物。對(duì)本發(fā)明的更好的理解可以根據(jù)出于說(shuō)明的下面的實(shí)施例獲得，該實(shí)施例不是為了限制本發(fā)明。本發(fā)明的實(shí)施例實(shí)施例1:使用DNA芯片測(cè)定AML病人的骨髓樣本中的基因表達(dá)〈l-l〉從骨髓細(xì)胞中分離RNARNA從55例AML病人的骨髓樣本中分離出來(lái)。第一，將lmL的骨髓樣本與5mL的TriZol試劑(InVitrogen，Cat.No.15596-018)混合，隨后使用組織均質(zhì)器破碎細(xì)胞。根據(jù)TriZol試劑廠商提供的說(shuō)明書進(jìn)行隨后的RNA分離步驟。由此獲得的該RNA隨后使用RNeasy試劑盒(Qiagen，Cat.No.74106),根據(jù)其廠商提供的說(shuō)明書進(jìn)一步純化?！磍-2〉被分離的RNA的定量分析該RNA通過(guò)使用分光光度計(jì)測(cè)定260nm的吸光率定量。<1-3〉參考RNA的制備與從骨髓細(xì)胞中分離的RNA—起，參考RNA同樣用于在DNA芯片上雜交。該參考RNA從基于血細(xì)胞的細(xì)胞系中分離出來(lái)。具體地，以與實(shí)施例<1-1〉中相同方式用7個(gè)細(xì)胞系HL-60，K-562,CCRF-CEM，CCRF-HSB-2,CEM-CM3，Molt-4,和THP-1制備RNA。在如實(shí)施例〈1-2〉一樣被定量后，被分離的RNA片段以等量混合就獲得參考RNA。<1-4〉DNA芯片在該實(shí)驗(yàn)中使用的該DNA芯片是包括15,972cDNA探針(Digitalgenomics,Korea)的16K人類cDNA芯片。該DNA芯片的制備如下。第一，攜帶該cDNA的質(zhì)粒從很多細(xì)菌中分離出來(lái)，并且使用PCR對(duì)探針序列從該質(zhì)粒中擴(kuò)增。由此獲得的該cDNA用PCR純化試劑盒純化并在濃度為100至200ng/u1的包含50%DMSO的點(diǎn)樣液中溶解。在該cDNA溶液在GAPSII玻片(Corning,Cat.No.40006)上被點(diǎn)樣后，使用適合劑量的UV光照射，將cDNA固定在其上?！?-5〉DNA芯片實(shí)驗(yàn)和基因表達(dá)的定量測(cè)定在氨基烯丙基(aminoallyl)-dUTP的存在下，從10ug的骨髓樣本中分離的RNA和參考RNA被逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并且隨后該cDNA通過(guò)分別與單酯-Cy5和單酯-Cy3的反應(yīng)用Cy5和Cy3標(biāo)記。被標(biāo)記的樣本使用PCT純化試劑盒純化并在DNA芯片上雜交16小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間。隨后，該DNA芯片用SSC洗滌溶液沖洗，以除去非特異性雜交體。被沖洗后的DNA芯片用共聚焦激光掃描儀(PerkinElmer,ScanarrayLite)掃描，從每個(gè)點(diǎn)樣中收集熒光數(shù)據(jù)。該數(shù)據(jù)作為TIFF文件儲(chǔ)存，使用GenePix3.0(AxonInstruments)對(duì)其進(jìn)行定量分析。使用GenePix3.0定量的在每個(gè)點(diǎn)樣的該熒光值根據(jù)Yang方法(NucleicAcidsRes2002,30:el5)在S-plus統(tǒng)計(jì)軟件包(Insightful)中'lowess，功能的幫助下校正。將具有該校正值的該基因表達(dá)水平應(yīng)用于Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型計(jì)算出HR,選擇出67種能預(yù)測(cè)AML病人對(duì)抗癌藥物應(yīng)答的標(biāo)記基因。該結(jié)果在表l中給出。實(shí)施例2:關(guān)于AML病人基因表達(dá)和對(duì)抗癌藥物應(yīng)答的數(shù)據(jù)<2-1>被測(cè)試病人的基因表達(dá)結(jié)果骨髓樣本從55例AML病人中獲取并對(duì)以與實(shí)施例1中的相同方式使用DNA芯片測(cè)定表1中列出的67種標(biāo)記基因的表達(dá)水平。<2-2〉待測(cè)病人的臨床信息對(duì)于誘導(dǎo)緩解化療，55例AML病人中的一些用朋AC給藥7或10天，并用伊達(dá)比星給藥3或5天。另一些誘導(dǎo)緩解化療的病人用BHAC給藥3或5天，并用柔紅霉素給藥3或5天。病人的重要臨床信息總結(jié)在下面的表2中。[表2]病人的臨床信息<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>療到復(fù)發(fā)之間的期間以月份表示。d:根據(jù)French-American-British分類的AML亞型。〈2-3〉病人的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的計(jì)算從55例AML病人荻取的骨髓樣本用于測(cè)定每種標(biāo)記基因的表達(dá)水平，所述標(biāo)記基因用于預(yù)測(cè)對(duì)抗癌藥物的應(yīng)答。55例AML病人的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分R使用從Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型獲得的風(fēng)險(xiǎn)比或e系數(shù)來(lái)計(jì)算。術(shù)語(yǔ)"風(fēng)險(xiǎn)比"與ee具有相同的值并且指當(dāng)變量增加1時(shí)，增加的風(fēng)險(xiǎn)比例。病人的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分R根據(jù)下面的數(shù)學(xué)公式I計(jì)算，病人的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分R使用下面的數(shù)學(xué)公式1進(jìn)行計(jì)算，表示各個(gè)產(chǎn)品的每個(gè)基因表達(dá)程度和e系數(shù)的總和。數(shù)學(xué)公式I其中R表示風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，h表示基因i的e系數(shù)，并且Gi表示基因i的表達(dá)程度。計(jì)算出的55例AML病人的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分在表3中給出。在表3中，發(fā)現(xiàn)55例AML病人的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分為-23.29,正如使用用于預(yù)測(cè)抗癌藥物應(yīng)答的67種標(biāo)記基因所計(jì)算的。由55例AML病人獲得的67種標(biāo)記基因的表達(dá)水平來(lái)看，計(jì)算了風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，并且其結(jié)果在表3中列出。[表3]<table>tableseeoriginaldocumentpage133</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>887867-O.0414794921.731478538-0.07182085-17.16BV2293588-0.2004224162.345165541-0.470023744-17.631553995-0.0660132631.532124809-0.101140557-17.731871440-0.3932542891.16720508-0.459008404-18.19BV744940-O.2989334752.118061113-0.633159369-18.82BV4350360.30580477-0.913793852-0.279442519-19.10BV7312730.439940423-1.845160246-0.81176058-19.91BV343867-l.2623940231.289232648-1.62751959-21.54BV812994「1.0642274821.47132461-1.565824085-23.10707667-0.1136369761.676535656-0.190516441-23.29實(shí)施例3:使用標(biāo)記基因的表達(dá)預(yù)測(cè)對(duì)抗癌藥物應(yīng)答的實(shí)驗(yàn)<3-1〉在抗癌治療應(yīng)答的預(yù)測(cè)中的顯著性實(shí)驗(yàn)使用根據(jù)實(shí)施例2中描述的方法選擇的標(biāo)記基因的表達(dá)，進(jìn)行預(yù)測(cè)AML病人對(duì)抗癌藥物的應(yīng)答的留一法交叉驗(yàn)證，并進(jìn)行對(duì)該預(yù)測(cè)的評(píng)估。留一法交叉驗(yàn)證是一種統(tǒng)計(jì)方法，既把一個(gè)病人的數(shù)據(jù)從全部數(shù)據(jù)庫(kù)中排除在外并選擇標(biāo)記基因后，該病人對(duì)抗癌藥物的應(yīng)答可以使用在該病人中的標(biāo)記基因的表達(dá)進(jìn)行預(yù)測(cè)。這個(gè)程序重復(fù)很多次，直到病人的總數(shù)允許對(duì)于每一個(gè)病人都可以做出獨(dú)立的預(yù)測(cè)時(shí)。使用由該獨(dú)立預(yù)測(cè)獲得的該風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，比較高危病人群和低位病人群之間的存活曲線，以使每個(gè)病人對(duì)抗癌藥物應(yīng)答的預(yù)測(cè)的顯著性可以被確定。<3-2〉使用在p=0.001選擇的標(biāo)記基因?qū)拱┧幬飸?yīng)答的預(yù)測(cè)為了檢測(cè)AML病人對(duì)抗癌藥物的應(yīng)答是否可以用與實(shí)施例2中相同的方式在p=0.001進(jìn)行顯著性預(yù)測(cè)，進(jìn)行"留一法"交叉驗(yàn)證。全部55例病人樣本中，將一個(gè)樣本作為有效數(shù)據(jù)，而其它樣本作為基因選擇的訓(xùn)練數(shù)據(jù)。基因選擇被重復(fù)55次，以使每個(gè)病人的樣本作為有效數(shù)據(jù)被使用一次。使用被選擇基因的表達(dá)，計(jì)算一個(gè)被排除的病人的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分?jǐn)?shù)據(jù)和截尾數(shù)據(jù)在下面的表4中給出。[表4]獨(dú)立計(jì)算的每個(gè)病人的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分病人ID風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分截尾月病人ID風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分截尾月<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>使用所計(jì)算的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，將這些病人分為高危人群和低危人群。然而，單獨(dú)使用風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分作為標(biāo)準(zhǔn)可能是有些不合理的。為了確定如何用最佳的顯著性將這兩組人群進(jìn)行劃分，當(dāng)按照風(fēng)險(xiǎn)增加的順序低危人群中成員的數(shù)量增加1時(shí)制作了Kaplan-Meier曲線，該曲線提供這兩組人群的復(fù)發(fā)曲線。進(jìn)行時(shí)間等級(jí)檢驗(yàn)，來(lái)檢查在這兩組人群中的復(fù)發(fā)曲線之間是否存在顯著性差異。圖1是顯示在時(shí)間等級(jí)檢驗(yàn)中獲得的p值的圖表。根據(jù)這種分析，當(dāng)33例病人處在低危人群中，而剩下的22例病人處在高危人群中時(shí)，這兩組人群的Kaplan-Meier圖表顯示最大的顯著性差異(p=0.0002)。這時(shí)得到的Kaplan-Meier圖表在圖2中顯示。這些結(jié)果證明，當(dāng)根據(jù)基于標(biāo)記基因的表達(dá)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分把病人劃分成危險(xiǎn)人群時(shí)，該高危人群和該低危人群可顯著性預(yù)測(cè)(P=0.0002)。<3-3〉根據(jù)基因選擇的顯著性對(duì)抗癌藥物應(yīng)答的預(yù)測(cè)結(jié)果在實(shí)施例3-2中，使用p=0.001的被選擇的基因預(yù)測(cè)對(duì)抗癌藥物的應(yīng)答。當(dāng)選擇不同的p值(即，該顯著性改變)時(shí)，被選擇的基因的數(shù)量改變。如果p值減少，選擇較少數(shù)量的基因。較高的p值導(dǎo)致選擇較多數(shù)量的基因。為了確定多少種基因適合于預(yù)測(cè)對(duì)抗癌治療的應(yīng)答，在p二O.Ol，0.0005,0.0001和0.00001下進(jìn)行對(duì)抗癌治療應(yīng)答的有效預(yù)測(cè)的實(shí)驗(yàn)。該結(jié)果在下面的表5中總結(jié)。[表5]對(duì)于選擇的基因，在不同p值下對(duì)抗癌治療應(yīng)答的預(yù)測(cè)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>如表5中所示，一旦進(jìn)行基因選擇降低p值時(shí)，也就是說(shuō)，當(dāng)基因在較高顯著性被選擇時(shí)，K鄰lan-Meier曲線顯示這兩組危險(xiǎn)人群之間具有較大的差異。也就是，雖然在p=0.001下選擇的所有基因可以用于預(yù)測(cè)對(duì)抗癌治療的應(yīng)答，但是這種預(yù)測(cè)可能僅對(duì)它們中的一部分可行。工業(yè)實(shí)用性根據(jù)本發(fā)明可以選擇在預(yù)測(cè)AML病人對(duì)抗癌藥物的應(yīng)答中有用的標(biāo)記基因。因此，當(dāng)將取自AML病人的生物樣本應(yīng)用于試劑盒時(shí)，其中所述的試劑盒含有測(cè)定能預(yù)測(cè)AML病人對(duì)抗癌藥物應(yīng)答的標(biāo)記基因表達(dá)的試劑，可以分析該基因的表達(dá)圖鐠，以預(yù)測(cè)AML病人對(duì)抗癌藥物的應(yīng)答。因此，本發(fā)明提供了用于AML病人的適當(dāng)?shù)幕熜畔?，從而提高所使用的抗癌藥物的治療效果并減輕病人的痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。權(quán)利要求1.一種用于預(yù)測(cè)急性髓系白血病病人對(duì)抗癌藥物應(yīng)答的標(biāo)記物，所述的標(biāo)記物選自包括GENX-3414，SPINK2，PECAMl，AQP5，LAPTM5，DDX48，F(xiàn)2RL3，SLC3A2，GPR51，ZC3HDC8.WASFl，PSCD4，CDKNlA，AIFl，ADFP，CD164，RAB8A，ID2，ITGB2，MGC3047，MYST3，MT3，MGATl，BC002942，EVI2B，CPVL，MXl，LGALSl，MX2，KRTl，MICA，GABBRl，TINF2，MPV17，RXRA，JARIDlD，C2orf22，DPT，NDUFS2，CCIN，MADH3，NAG，E2F5，SMC6L1，CASPl，LILRBl，TCF4，TNPO3，DNCIl，TIE，ADM，SMUGl，PPPlCA，SALL3，IRF2，KIAA1223，NCOA3，CKS2，ZNF226，CTBS，MetRS，MGC5395，F(xiàn)LJ10349，CD4，EHD4，ARL4A和DNAJClO的組。2.—種用于預(yù)測(cè)急性髓系白血病病人對(duì)抗癌藥物應(yīng)答的試劑盒，該試劑盒包括用于檢測(cè)基因的工具，所述基因選自包括GENX-3414,SPINK2，PECAM1，AQP5,LAPTM5，DDX48,F2RL3，SLC3A2,GPR51,ZC3HDC8，WASF1，PSCD4，CDKN1A,AIF1,ADFP,CD164,RAB8A,ID2'ITGB2，MGC3047,MYST3,MT3,MGAT1,BC002942，EVI2B，CPVL,MX1，LGALS1,MX2,KRT1，MICA,GABBR1，TINF2,MPV17,RXRA,JARID1D，C2orf22,DPT,NDUFS2，CCIN，MADH3,NAG,E2F5，SMC6L1,CASP1,LILRB1，TCF4，TNP03，DNCIl，TIE,ADM，SMUG1，PPP1CA，SALL3,IRF2,KIAA1223，NC0A3，CKS2，ZNF226，CTBS,MetRS，MGC5395，F(xiàn)LJ10349，CD4,EHD4，ARL4A和DNAJC10的組。3.根據(jù)權(quán)利要求2所迷的試劑盒，其特征在于，所述;f企測(cè)工具是所述基因的特異性探針或引物。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述抗癌藥物選自包括伊達(dá)比星，4N-聯(lián)己基-i-e-D-阿拉伯呋喃糖基胞嘧咬，柔紅霉素和它們的組合物的組。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒是DNA芯片形式。6.根據(jù)權(quán)利要求2所迷的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒使用RT-PCR方法。7.—種用于預(yù)測(cè)急性髓系白血病病人對(duì)抗癌藥物治療應(yīng)答的方法，包括以下步驟1)在急性髓系白血病病人的生物樣本中，確定用于預(yù)測(cè)對(duì)抗癌藥物治療應(yīng)答的標(biāo)記基因的表達(dá)水平，所述標(biāo)記基因選自包括GENX-3414,SPINK2,PECAMl,AQP5,LAPTM5,DDX48,F2RL3,SLC3A2,GPR51，ZC3HDC8.沐ASF1，PSCD4，CDKN1A,AIF1,ADFP,CD164，RAB8A，ID2,ITGB2，MGC3047，MYST3,MT3，MGAT1,BC002942,EVI2B,CPVL,MX1,LGALS1,MX2，KRT1，MICA,GABBR1,TINF2'MPV17,RXRA，JARID1D，C2orf22,DPT,N叫FS2'CCIN，MADH3，NAG,E2F5,SMC6L1,CASP1，LILRB1，TCF4，TNP03,DNCIl，TIE,ADM,SMUG1，PPP1CA，SALL3,IRF2，KIAA1223,NC0A3，CKS2'ZNF226,CTBS，MetRS，MGC5395,因的表達(dá)水平來(lái)評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分R。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述統(tǒng)計(jì)分析方法是Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型。9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，所述方法還包括參考包含急性髓系白血病病人的不同風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分R的數(shù)據(jù)庫(kù)校正所述風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分R的步驟。10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述抗癌藥物選自包括伊達(dá)比星，4N-聯(lián)己基-1-e-D-阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶，柔紅霉素和它們組合物的組。11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，使用DNA芯片確定所述標(biāo)記基因的表達(dá)水平。12.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，使用RT-PCR方法確定所述標(biāo)記基因的表達(dá)水平。13.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述生物樣本選自包括骨髓，淋巴節(jié)，脾，血液，和淋巴液的組。全文摘要本發(fā)明公開了一種標(biāo)記物，所述的標(biāo)記物能預(yù)測(cè)AML(急性髓系白血病)病人對(duì)抗癌治療的應(yīng)答。本發(fā)明還提供了一種試劑盒，所述的試劑盒具有用于測(cè)定標(biāo)記基因的表達(dá)水平的工具，所述的標(biāo)記基因能預(yù)測(cè)應(yīng)答，從而用于預(yù)測(cè)AML病人對(duì)抗癌藥物的應(yīng)答。另外，以該標(biāo)記基因的表達(dá)程度為基礎(chǔ)，本發(fā)明提供了一種用于預(yù)測(cè)AML病人對(duì)抗癌藥物應(yīng)答的方法。通過(guò)將取自AML病人的生物樣本應(yīng)用于該試劑盒，來(lái)分析所述基因的表達(dá)譜圖，可以預(yù)測(cè)AML病人對(duì)抗癌藥物的應(yīng)答。該方法提供了對(duì)AML病人適合的化療信息，從而提高所使用的抗癌藥物的治療效果并減輕病人的痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101326290SQ200680044375公開日2008年12月17日申請(qǐng)日期2006年9月26日優(yōu)先權(quán)日2005年9月27日發(fā)明者宋榮華,尹正浩,樸棟潤(rùn),李鳳龍,李瀚鏞,申仁京,金世云,金東旭,金成韓,金永準(zhǔn)申請(qǐng)人:數(shù)字基因組學(xué)株式會(huì)社;大熊株式會(huì)社