專利名稱：：新穎的倍半萜合酶和它們的應用方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及新穎的萜合酶。本發(fā)明還涉及編碼萜合酶的核酸，制備多種碎合酶的方法，以及表達本發(fā)明多肽的宿主生物體。本發(fā)明還包含生成碎合酶的方法和生成碎類化合物的方法。
背景技術：
：辟類化合物或碎代表了在多數(shù)生物體(細菌、真菌、動物、植物)中發(fā)現(xiàn)的天然產(chǎn)物家族。辟類化合物由稱為異戊二烯單元的五碳單元組成。它們可由其結構中存在的異戊二烯單元的數(shù)目來分類單辟(CIO),倍半辟(C15)，二辟(C20),三碎(C30),四萜(C40)和聚碎(Cn,n"5)。植物界含有最為豐富的單薛和倍半辟。單辟和倍半碎是最多結構變化的類異戊二烯。通常它們?yōu)閾]發(fā)性化合物并且大多發(fā)現(xiàn)于植物中，它們在防御病原體和草食動物襲擊，授粉吸引和植物對植物通訊中起作用。一些被稱為芳香植物或香精油植物的植物在其葉子、根或莖中積聚大量的單萜和倍半萜。這類植物的典型的實例是來自于唇形科、蕓香科、茄科和禾本科植物等的成員。單薛和倍半辟積聚植物由于其風味和香味特性和其化妝品、藥的和抗菌的效果千百年來受到人們的關注。所述積聚于植物中的薛可通過如蒸氣蒸鎦等不同的方法進行抽提，該蒸餾的產(chǎn)物即為所謂的含有濃縮薛的精油。所述天然的植物提取物為調(diào)味料和香料工業(yè)重要的成分。多種倍半辟化合物在香料業(yè)中被使用。例如從巖蘭草的根中提取出來的巖蘭油已知含有大量有氣味的倍半路，其中最為典型的是a-巖蘭酮、P-巖蘭酮和巖蘭酸(zizanoicacid)。目前巖蘭草在留尼旺島、菲律賓、科摩羅群島、日本、西非和南美洲都有種植。通常，植物天然提取物如巖蘭油的價格和可獲量依賴于植物的豐度、精油的產(chǎn)量和地理來源。某些年份商業(yè)可用的天然提取物的可獲量降低，同時它們的質(zhì)量相應變差。在這種情況下，在高質(zhì)量香料產(chǎn)品中不可能再應用這樣的成分。因此，提供一種在可獲量和質(zhì)量方面波動較少的倍半萜的來源是有利的。化學合成似乎成為制備倍半萜的顯然的選擇，然而，這些化合物通常具有高度復雜的結構并且到目前為止沒有開發(fā)出經(jīng)濟的制備倍半萜的合成方法。由此，本發(fā)明的目的是提供一種以經(jīng)濟和可靠的方式生產(chǎn)高質(zhì)量的倍半萜的方法。植物中的碎的生物合成已經(jīng)被廣泛的研究，在此不另外詳述，但可參考DewickP的Ato./Vod7e;"2002，19,181-222,其回顧了路生物合成路徑的現(xiàn)有技術的狀況。倍半辟合酶將FPP轉(zhuǎn)化成為不同的倍半辟骨架。超過300種倍半碎烴和3000種倍半碎化合物已經(jīng)被鑒別出來(Joulain,D.和K6nig,W.A.的TheAtlasofSpectralDataofSesquiterpeneHydrocarbons,EBVerlag，Hamburg,1998;Connolly,J.D.和HillR.A.的DictionaryofTerpenoids,Vol1,ChapmanandHall(publisher),1991),并且每年許多種新的結構被鑒定出來。事實上在植物界中存在大量的倍半萜合酶，它們所有都使用相同的底物但生成不同的產(chǎn)物輪廓。Bohlmann,J,Crock,J.,Jetter,R.和CroteauR.(1998)的Terpenoid-baseddefensesinconifers:cDANcloning,characterization,andfunctionalexpressionofwound-inducible閣-a-bisabolenesynthasefromgrandfir(JWesgrawcfo).尸rac.A^/.爿cfld95,6756-6761報道了編碼反式-a-紅沒藥烯合酶的cDNA。但是，所述酶催化了一個環(huán)化步驟并且生成了幾乎唯一的紅沒藥烯倍半薛。認lnerT等的(2004)Theplantcell16(5),1115-1131公開了大量的從玉米中分離出來的推定的萜合酶基因，它們中的大多數(shù)不編碼有功能的酶。功能合酶DNA序列Tps4-B73和Tps5-1delprim的檢索號為AY518310和AY518313。由編碼的酶產(chǎn)生的香檸檬烯〗又為次要產(chǎn)物，其量占產(chǎn)生的總倍半萜量的最多2.6wt.%。盡管對薛環(huán)化進行了廣泛的化學研究，由于它們的低豐度、通常短暫的表達方式和在其表達組織中從樹脂和酚類化合物的混合物中純化它們的復雜性的原因，所述酶特別是在植物中的分離仍然^艮困難?？紤]到以上的原因，本發(fā)明的目的是提供一種新的薛合酶。另一目的是從巖蘭草植物中分離出薛合酶。本發(fā)明的又一目的是提供能夠用于合成萜的萜合酶，用于合成目前沒有報道的酶。特別地，目的是提供能夠合成足夠量的具有檀香碎或香檸檬烯的碳骨架的倍半薛的酶。沒有基于檀香萜合酶遺傳基礎的報道，而香檸檬烯僅能由已知萜合酶以痕量合成出來。同樣地，目的是提供如上所述的以經(jīng)濟的方式生成辟類化合物的方法。因此，本發(fā)明的目的是生產(chǎn)倍半萜而有極少的浪費、節(jié)約能源和資源的方法并且同時降低對于化石燃料的依靠。另一目的是提供能夠合成用于香料和/或芳香成分的萜類化合物的酶。
發(fā)明內(nèi)容不同尋常地，本發(fā)明人克隆了編碼巖蘭草根部的新穎倍半萜的cDNA。令人驚奇的是所述新穎的倍半碎合酶能夠合成倍半裕，"i亥倍半辟^口J不J古玉巴茨錄(cyclocopacamphene)、(+)隱epi-(3-才亶香碎,反式-a-香檸檬烯，順式-a-香檸檬烯，(3-紅沒藥烯，和/或反式-y-紅沒藥烯，到目前為止這些倍半萜還未從巖蘭草中分離出來。因此本發(fā)明提供了第一種克隆的倍半萜合酶，其能夠催化FPP向紅沒藥基陽離子(bisabolylcation)的環(huán)化，以及隨后的向香檸檬烷和檀香烷骨架的環(huán)化。第一次報道了萜環(huán)化酶，其能夠合成足夠量的紅沒藥基陽離子的二環(huán)衍生物。因此，第一方面本發(fā)明提供了選自以下的一種分離的核酸(a)含有與SEQIDN0:2有至少82.4%同一性的核苷酸序列的核酸；(b)含有編碼與SEQIDNO:5有至少76.8%的序列同一'性的多肽的核苷酸序列的核酸；(c)含有在中度嚴謹條件下與核苦酸序列SEQIDNO:2雜交的核苷酸序列的核酸；(d)含有編碼能夠合成具有C3-C7鍵的二環(huán)倍半辟和/或三環(huán)倍半辟的多肽的核苷酸序列的核酸；和/或(e)含有編碼能夠合成至少一種香檸檬烯和非強制性選擇的其它倍半萜的多肽的核苷酸序列的核酸，其特征在于香檸檬烯占由所述多肽合成的全部倍半萜產(chǎn)物的至少10wt.%;其中由任一(a)(e)的所述核酸編碼的多肽具有碎合酶活性。另一方面，本發(fā)明提供了選自以下的分離的核酸(a)含有與SEQIDNO:1有至少59%的序列同一性的核苷酸序列的核酸；(b)含有編碼與SEQIDNO:4有至少50%的氨基酸序列同一性的多肽的核苦酸序列的核酸；(c)在中度嚴謹條件下與SEQIDNO:1雜交的核酸；(d)含有編碼能夠合成環(huán)玷圯莰烯的多肽的核苷酸序列的核酸；其中，由所述核酸編碼的多肽具有辟合酶活性。又一方面，本發(fā)明提供了選自以下的分離的多肽(a)含有與SEQIDNO:5有至少76.8%氨基酸序列同一性的氨基酸序列的多肽；(b)能夠合成具有C3-C7鍵的二環(huán)倍半萜和/或三環(huán)倍半萜的多肽；(c)能夠合成至少一種香檸檬烯和非強制性選擇的其它倍半辟的多肽，其特征在于香檸檬烯占由所述多肽合成的全部倍半萜產(chǎn)物的至少10wt.%。又一方面，本發(fā)明提供了選自以下的多肽(a)含有與SEQIDNO:5有76.8%氨基酸序列同一性的氨基酸序列的多肽；(b)能夠合成具有C3-C7鍵的二環(huán)倍半萜和/或三環(huán)倍半萜的多肽；(c)能夠合成至少一種香檸檬烯和非強制性選擇的其它倍半萜的多肽，其特征在于所述香檸檬烯占由所述多肽合成的全部倍半萜產(chǎn)物的至少5wt.%。本發(fā)明還涉及制備如權利要求書和具體實施方式中給出的具有萜合酶活性的多肽變體的方法。另一方面，本發(fā)明提供了含有任意本發(fā)明的核酸的載體和宿主生物體或細』包。又一方面，本發(fā)明提供了權利要求書和具體實施方式中列出的生成辟合酶的不同的方法，另外，和生成辟類化合物如倍半辟的方法。圖1顯示了由本發(fā)明的辟合酶合成的倍半辟化合物的結構，從正文中討論的巖蘭油和其它倍半辟化合物中分離的倍半辟化合物，具體為(l)順式-a-香檸檬烯，(2)反式-a-香檸檬烯，(3)epi-(3-檀香萜，(4)3-紅沒藥烯，(5)反式1-紅沒藥烯，(6)環(huán)灑剔烯和(7)環(huán)玷圯莰烯，來自巖蘭油的曾報道過的倍半碎化合物為(8)巖蘭酸，(9)a-巖蘭酮，(10)(3-巖蘭酮，(ll)異紅沒藥烯，(12)p-紅沒藥醇，(13)脫氬姜黃烯，(14)(Z)-反式-a-香檸檬醇,(15)(Z)-(+)-epi-p-檀香醇。圖2顯示了源自由RT-PCR獲得的編碼倍半萜合酶的cDNA片段的氨基酸序列(SEQIDNO:8-14)的比對。圖3顯示了本發(fā)明的SEQIDNO:4,SEQIDNO:5和SEQIDNO:6的全長氨基酸序列的比較。相同的氨基酸以黑色背景顯示，具有相同離子電荷的氨基酸以灰色背景顯示，并且不相關的氨基酸以白色背景顯示。圖4A中顯示了由酶法測定得到的倍半辟的氣相色譜(GC),在該測定中FFP被暴露于具有完全如SEQIDNO:4所示氨基酸序列的多肽中。圖4B顯示了圖4A的主峰(10.81)的質(zhì)譜(MS)，將其與相應的標準環(huán)灑剔烯的譜圖比較，由此顯示出在酶法測定中獲得的倍半萜的性質(zhì)。圖5顯示了由酶法測定獲得的倍半辟的氣相色譜，在該測定中FFP被暴露于具有完全如SEQIDNO:5所示氨基酸序列的多肽中。該蛋白重組體得到了由至少7種不同的倍半萜烴形成的混合物，通過GC-MS鑒定出其中的5種，用編號1~5表示(化合物名稱見圖1)。圖6顯示了由本發(fā)明的多肽催化的倍半薛合成的推定生物合成機制，其中反應由FPP(16)起始并且經(jīng)過紅沒藥基陽離子(17)中間體。具體地，該反應由具有完全如SEQIDNO:5所示氨基酸序列的多肽及其變體催化。圖6進一步顯示了前體(FPP)和該倍半碎產(chǎn)物的化學結構。使用的縮寫bp堿基對DNA脫氧核糖核酸cDNA互補DNADTT二硫蘇糖醇FPP法呢基焦磷酸酯NPP焦磷酸橙花叔酯IPTG異丙基-D-硫代半乳糖-吡喃糖苷PCR聚合酶鏈式反應RT-PCR反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應3，-/5，-RACE3，-和5，-cDNA末端快速擴增RNA核糖核酸mRNA信使核糖核酸nt核苷酸RNase核4唐核酸酶SDS-PAGESDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳具體實施例方式本發(fā)明提供了編碼能夠合成單環(huán)倍半萜，二環(huán)倍半萜和/或三環(huán)倍半辟的新穎倍半薛合酶的分離的核酸。具有CVC7鍵的二環(huán)或三環(huán)倍半碎被定義為具有檀香辟碳骨架的倍半辟，而那些具有C2-C7鍵的被定義為具有香檸檬烯骨架的倍半萜。"萜"為脂肪族或環(huán)狀的基于異戊二烯單元(C5H8)的烴。"萜"包4舌<旦不限定為環(huán)灑剔烯、環(huán)3古^巴莰烯(cyclocopacamphene),環(huán)J古記莰烯醇(cyclocopacamphenol)差向異構體，環(huán)坫記莰烯搭(cyclocopacamphenal)差向異才勾體,環(huán)3古3巴莰烯酸(cyclocopacamphenicacid)差向異構體，順式-a-香檸檬烯，反式-a-香檸檬烯，(+)-epi_p-檀香辟，(3-紅沒藥烯，和反式-"紅沒藥烯。此處使用的"辟"，和"辟類化合物"包括辟和萜的衍生物，包括經(jīng)過一步或多步的如羥基化，異構化，氧化還原，二曱基化或?；裙倌芑幕衔铩Ｔ诖耸褂玫?倍半萜"為基于C15結構的萜并且包括經(jīng)過一個或多個官能化步驟的化合物的倍半萜和倍半薛衍生物。在此使用的"衍生物"為任何從已知的或假定化合物獲得并含有親體結構基本單元的任意的化合物。在此使用的"碎合酶"為催化碎合成的任意的酶。"倍半碎合酶"為催化倍半格合成的任意的酶。如在術語"同一性"或"同一的"中使用的序列同一性可簡單地由標準對齊算法(standardalignmentalgorithms)計算得到。優(yōu)選地，為了評定本發(fā)明序列與其它序列(例如來自現(xiàn)有技術的序列)之間的序歹'J同一性，使用J.D.Thompson，D.J.Higgins,T.J.Gibson(1994)CLUSTALW:improvingthesensitivityofprogressivemultiplesequencealignmentthroughsequenceweighting,position-specificgappenaltiesandweightmatrixchoice.NucleicAcidsRes22(22)，4673-4680中公開的CLUSTALW.方法。選擇標準的參數(shù)用于評估序列的同一性。序列的比專交可在網(wǎng)上進4亍，ft口在http:〃www.ebi.ac.uk/clustalw/或另夕卜可4吏用下載的|欠件，jo可《尋自http:〃www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html的生物編輯軟件。一方面，本發(fā)明提供了與本發(fā)明任意核酸雜交的分離的核酸，例如在低度嚴謹條件下與SEQIDNO:1、SEQIDN0:2或SEQIDNO:3雜交的那些核酸。優(yōu)選地，定義的條件為中度嚴謹條件，更優(yōu)選高度嚴謹條件。令人驚奇的是，在SEQIDNO:6的N末端的序列不同于其它已知的辟合酶序列之處在于，其含有不同的基序(motif)PAAAASSQQQQ(SEQIDNO:7),該序列不類似于任何已知的信號序列。本發(fā)明還涉及到該特殊的序列和編碼該基序的任何核苷酸序列，如SEQIDNO:3。在具體實施方式中，本發(fā)明涉及包括那些完全沒有污染內(nèi)源物質(zhì)的特定的分離的核苷酸序列。術語"核酸"或"核酸分子"包括單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核酸或核糖核酸聚合物(DNA和/或RNA)。"核苷酸序列"還指分離片段形式的多核苷酸分子或寡核苷酸分子，或較大核酸的一部分。在實施方式中，本發(fā)明提供了選自以下的核酸(a)選自由SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3組成的組中的任一核酸，(b)選自由編碼完全如SEQIDNO:4、SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示任一多肽的核酸組成的組中的任一核酸，(c)在低度嚴謹條件下與(a)或(b)的核酸雜交的核酸，其中由所述核酸編碼的多肽具有倍半碎合酶活性。在具體實施方式中，該核酸含有核苷酸序列，該核苷酸序列與SEQIDNO:1有至少59%,優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%和最優(yōu)選至少70%的同一性。例如，本發(fā)明的核酸序列與SEQIDNO:1有至少75%、80%、85%、90%、95%或98%的同一性。在實施方式中，核酸包含核苷酸序列，該核苷酸序列與SEQIDN0:2有至少82.4%,優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少90%，并且最優(yōu)選至少95%的同一性。例如，本發(fā)明所述核酸序列與SEQIDNO:2有至少95%、97%或98%的同一性。在實施方式中，該核苷酸包含核苷酸序列，該核香酸序列與SEQIDNO:3有至少49%,優(yōu)選至少50%,更優(yōu)選至少55%和最優(yōu)選至少60%的同一性。例如，本發(fā)明的所述核酸序列與SEQIDNO:3有至少650/。、70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%的同一性。優(yōu)選地，步驟(c)的核酸在中度嚴謹條件下，優(yōu)選在高度嚴謹條件下與以上的(a)或(b)的核酸雜交，但是優(yōu)選與序列SEQIDNO:l,SEQIDNO:2或SEQIDNO:3雜交。例如，(c)的核酸與SEQIDNO:l雜交。根據(jù)另一實施例，在上述條件下將其與SEQIDNO:3雜交。優(yōu)選地，本發(fā)明的核酸與SEQIDNO:l的核酸雜交并且不與檢索號為AP003911的編碼發(fā)現(xiàn)于稻(Oo;zfl^"'va)的推定倍半萜合酶的核酸雜交。根據(jù)實施方式，本發(fā)明的核酸與SEQIDNO:2的核酸雜交并不與選自具有檢索號AY518310或AY518313的編碼玉米的倍半辟合酶的那些核酸雜交。優(yōu)選地，本發(fā)明的核酸不另外與任何選自那些具有檢索號AY518311、AY518312和AY518314的核酸雜交。后面的這些序列未被報道過編碼活性倍半碎合酶。優(yōu)選地，本發(fā)明的核酸與SEQIDNO:3的核酸雜交并且不與檢索號為AAG37841的編碼發(fā)現(xiàn)于玉米中的推定倍半萜合酶的核酸雜交。優(yōu)選地，分離的核酸在嚴謹條件特別地與SEQIDNO:3的核酸雜交，在該嚴謹條件下不與檢索號為AF296122的推定編碼萜合酶的存在于玉米中的核酸雜交。優(yōu)選地，本發(fā)明的核酸序列含有SEQIDNO:l,SEQIDNO:2和/或SEQIDNO:3。更優(yōu)選，其主要由SEQIDNO:l,SEQIDNO:2和/或SEQIDNO:3組成。在另一實施方式中，該核酸含有SEQIDNO:l,SEQIDNO:2和/或SEQIDNO:3的至少20、100、200、300、400、500或750個核苷酸的連續(xù)片段。優(yōu)選地，本發(fā)明的核酸在低度，中度和高度嚴謹條件下與具有上述長度的片段雜交。優(yōu)選地，本發(fā)明的核酸分別含有SEQIDNO:l,SEQIDNO:2和/或SEQIDNO:3的從約第900個核苷到第1647、1641和1791個核苦的片段。這些片段包括本發(fā)明的多肽的活性位點。優(yōu)選地，本發(fā)明的核酸和/或多肽是從巖蘭草(K"veW"z/zflwo/^"中被分離出來的。在實施方式中，所述核酸是從巖蘭草的根中被分離出來。在此使用的術語"雜交或在一定條件下雜交"被如下所示定義。所述條件為，具有至少約70%,例如至少約80%,并且例如至少約85~90%同一性的序列仍然保持彼此結合。本領域技術人員可以根據(jù)Ausubel等的(1995),CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons一書第2、4和6章中例舉的最小限度試驗(minimalexperimentation)選擇合適的雜交條件。另夕卜，還有Sambrook等(1989)第7、9和11章中描述的嚴謹條件。在此使用的定義的"低度嚴謹"條件如下所述。將含有DNA的濾膜40。C下在含下列物質(zhì)的溶液中預處理6小時35%甲酰胺，5xSSC,50mMTris-HCI(pH7.5),5mMEDTA，0.1%PVP,0.1%Ficoll,1%BSA,和500|ig/ml變性的鮭魚精子DNA。雜交在相同溶液中進4亍，除下歹寸改動夕卜0.02%PVP，0.02%Ficoll，0.2%BSA，100pg/ml鮭魚精子DNA,10。/0(wt/vol)葡聚糖硫酸酯，使用5-20x10632-標記探針。將濾膜在雜交混合液中40。C下孵育18-20小時，然后55。C下用含有2xSSC,25mMTris-HCI(pH7.4),5mMEDTA和0.1%SDS的溶液洗滌1.5小時。用新鮮溶液取代洗滌溶液，60"C下再孵育1.5小時。濾膜進行印跡干燥并進行放射自顯影。在此使用的定義的"中度"嚴謹條件不同于"低度"嚴謹條件，差別在于將含有DNA的濾膜50。C下在以上給出的相應溶液中預處理7小時(中度)和65。C下在以上給出的相應溶液中預處理8小時(高度)。在相同的溶液中進行與"低度嚴謹"相同的雜交，除了分別在50"C下處理30小時，然后在55'C下在上述的洗滌溶液中洗滌1.5小時(中度)。用新鮮溶液取代洗滌溶液并另外在60"C下孵育1.5小時。"高度"嚴謹條件在上述的溶液中在65。C下預雜交8小時，除了用6xSSC，lnMEDTA,0.02%PVP,0.02%Ficoll,0.02%BSA和500g/ml的變性鮭魚精子DNA替代。將濾膜在65。C下在含100pg/ml變性鮭魚精子DNA和5-20x106cpm32-標記探針的預雜交混合液中雜交48小時。將濾膜在37。C下用含有2xSSC,0.01%PVP,0.0P/。Ficoll和0.01%BSA的溶液洗滌1小時。然后再用O.lxSSC在5(TC下洗滌45分鐘。如果上面給出的條件不合適，還可以選用本領域已知的其他低度、中度和高度嚴謹條件(例如，用于種間雜交的條件)。本法明還包括"各種核苷酸序列"，如由任一的SEQIDNO:l,SEQIDNO:2和SEQIDNO:3突變獲得的序列。該突變可為任一類型的本發(fā)明序列的突變，例如點突變，缺失突變，插入突變和/或移碼突變。為了使一個序列適應特定的表達系統(tǒng)，可以制備各種不同的核苷酸序列。例如，當氨基酸以優(yōu)選的密碼子編碼時，公知細菌的表達系統(tǒng)可比較有效地表達多肽。由于遺傳密碼子的簡并性，其中多于一個的密碼子可以編碼相同的氨基酸，多個DNA序列可以編碼相同的多肽，該多肽包括在本發(fā)明的核酸或核苷酸序列中。另外，本發(fā)明還包括編碼完全不同于在此報道過的氨基酸序列的多肽的各種核苷酸序列，但是該序列可通過變異如誘變或另外使用本發(fā)明核苷酸序列來獲得。優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽能夠合成單環(huán)倍半薛和二環(huán)倍半搭。優(yōu)選地，其能夠合成二環(huán)倍半碎或三環(huán)倍半碎。最優(yōu)選其能夠合成單環(huán)倍半碎、二環(huán)倍半辟和三環(huán)倍半碎。優(yōu)選地，本發(fā)明的分離的多肽能夠從FPP形成紅沒藥基陽離子并且能夠進一步生成FPP的C3和C碳原子之間的鍵以生成具有C3-C7鍵的二環(huán)倍半萜或三環(huán)倍半萜。同樣地，本發(fā)明的多肽能夠從FPP形成紅沒藥基陽離子并且能夠進一步生成FPP的(32和C7碳原子之間的鍵以生成具有C2-C7鍵的二環(huán)倍半碎或三環(huán)倍半萜。術語"能夠合成"化合物，例如特定的倍半萜和術語"碎合酶活性"，優(yōu)選"倍半碎合酶活性"指的是本發(fā)明的多肽以及編碼這些多肽的核酸，從至少一種起始化合物能夠合成在此提到的辟，優(yōu)選倍半碎和最優(yōu)選的倍半薛化合物，該起始化合物優(yōu)選脂肪族的焦磷酸酯碎前體。優(yōu)選地，合成的能力由實施例5給出的酶法評估(enzymeessay)來確定。當特定產(chǎn)物通過這種測定被發(fā)現(xiàn)時，所述"能夠合成"或"合酶活性"被賦予產(chǎn)物。優(yōu)選地，脂肪族萜前體為FPP,其以倍半辟碳骨架的標準編號法在下面化學式(I)中給出。OPP指的是焦磷酸酯。優(yōu)選地，分離的多肽能夠合成至少一種倍半萜，更優(yōu)選至少一種具有檀香萜或香檸檬烯碳骨架的倍半萜。在優(yōu)選實施方式中，所述多肽能夠從FPP形成紅沒藥基陽離子，并且能夠進一步生成FPP的Cs和(37或C2和C7間的鍵以生成一種或幾種二環(huán)倍半萜和/或三環(huán)倍半薛。術語"鍵"指的是單一的共價鍵。本發(fā)明涉及編碼多肽的核酸，以及所述多肽本身，該多肽能夠合成具有C3-C7鍵的至少一種二環(huán)倍半萜和/或三環(huán)倍半萜。優(yōu)選地，具有C3-C7鍵的倍半萜占由多肽合成的倍半萜產(chǎn)物的至少5wt.%。更優(yōu)選至少10wt%,甚至更優(yōu)選至少15wt%，并且最優(yōu)選至少20wt。/。的由所述多肽產(chǎn)生的倍半碎由具有CVC7鍵的倍半碎組成。對于本發(fā)明來說，倍半辟合酶的倍半辟產(chǎn)物分布的量優(yōu)選通過應用實施例5中詳述的步驟來確定(酶法測定，產(chǎn)物的提取和GC)。因此，本發(fā)明涉及能夠形成具有C3-C7鍵的以下化學式(II)和/或化學式(III)的化合物的分離的多肽，其中R2、R3、R4相互獨立地為q~C2G的直鏈或支鏈烷基或鏈烯基，和其中Ri和R2和/或R3和R4可形成雙鍵而取代兩個單獨的單鍵。優(yōu)選地，R!、R2、R3、R4相互獨立地為C!ds的直鏈或支鏈烷基或鏈烯基，更優(yōu)選C!do，最優(yōu)選C!C8。具體地，本發(fā)明的多肽能夠形成以下化學式(IV)，化學式(v)和/或化學式(VI)的化合物，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>其中R!、R2、R3、R4如上定義。優(yōu)選地，在化學式(IV)和化學式(VI)中，R!和R2中的一個為C廣C5的烷基，另一個為C2-C8的鏈烯基。另外化學式(VI)中的R3優(yōu)選為CrC5,更優(yōu)選為C!-C3烷基。優(yōu)選地，在化學式(V)中，R3和R4與以上化學式(IV)中&和R2的定義相同。本發(fā)明涉及編碼多肽的核酸，和多肽本身，該多肽能夠形成至少一種具有CVC7鍵的倍半辟。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，具有C2-C7鍵的倍半萜占由所述多肽合成的倍半碎產(chǎn)物的至少5wt.%。更優(yōu)選至少10wt%,甚至更優(yōu)選至少15wt%，和最優(yōu)選至少20wt。/。的由所述多肽產(chǎn)生的倍半萜由具有C2-C7鍵的倍半碎組成。優(yōu)選地，該倍半萜為香檸檬烯和/或其異構體(優(yōu)選為立體異構體)中的一種。根據(jù)本發(fā)明的實施方式，本發(fā)明涉及能夠形成以下化學式(VII)和/或化學式(VIII)的具有C2-C7鍵的化合物的分離的多肽，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>其中R5和R6與以上R！和R2的定義相同。優(yōu)選地，R5為曱基和R6為C2-do鏈烯基，反之亦然。優(yōu)選地，可能存在于上述Ri、R2、R3、R4、Rs或R6殘基之一的至少一種鏈烯基為4-曱基-3-戊烯基，而另一連接到相同碳原子上的殘基為曱基。能夠合成以上化學式(II),化學式(III)，化學式(IV),化學式(V)，化學式(VI),化學式(VII)和/或(VIII)的化合物的多肽優(yōu)選為具有氨基酸序列SEQIDNO:5的多肽或其多肽變異體。具有C3-C7鍵的倍半萜為檀香碎和其立體異構體，具體例如(+)-epi-(3-檀香萜，(-)-P-檀香萜，(+)-(3-檀香萜(三者都為二環(huán))，和(+)-a-檀香萜，和(-)-a-檀香萜(兩者都為三環(huán))。具有C2-C7鍵的倍半碎為包括其立體異構體的香檸檬烯，具體例如順式-a-香檸檬烯，反式-a-香檸檬烯，反式-(3-香杵檬烯和順式-P-香檸檬烯。最優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽能夠合成重現(xiàn)于附圖中的化合物。另一方面，本發(fā)明提供了能夠合成檀香烯，香檸檬烯和/或紅沒藥烯的分離的多肽。在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明提供了能夠合成(+)-epi-(3-檀香萜，反式-a-香檸檬烯，順式-a-香檸檬烯，p-紅沒藥烯和/或反式-"紅沒藥烯的分離的多肽。優(yōu)選地，所述多肽能夠合成(+)-epi-(3-檀香碎，反式-a-香檸檬烯，順式-a-香擰檬烯，(3-紅沒藥烯和/或反式-y-紅沒藥烯中的任一種或全部。更優(yōu)選，該多肽能夠合成它們中的至少一種，最優(yōu)選該多肽能夠合成(+)-epi-p-檀香薛，反式-a-香檸檬烯和Z或順式-a-香檸檬烯。在此使用的術語"多肽"指的是一類多肽或肽片段，其中含有本申請鑒定出的氨基酸序列，以及更小的片段。"多肽變體"這里指的是完全與天然多肽同源的多肽，但是其氨基酸序列因為一處或多處缺失、插入或取代而不同于本發(fā)明任一核酸所編碼的多肽。本發(fā)明的所述多肽和多肽變體優(yōu)選具有萜合酶活性。更優(yōu)選它們具有倍半辟合酶活性。變體可以包括保守取代序列，即一特定氨基酸殘基被一具有類似理化特性的殘基所取代。保守取代的實例包括用一個脂肪族殘基取代另一個脂肪族殘基，例如，Ile、Val、Leu或Ala之間相互取代，或者用一個極性殘基取代另一個極性殘基，例如在Lys和Arg;Glu和Asp;或Gin和Asn之間相互取^。參見，Zubay,Biochemistry,Addison-WesleyPub.Co.,(1983)。這類取代的效果可以用取代打分矩陣(substitutionscorematrices)來計算，如Altschul,(J.Mol.Biol.219:555-65,1991)中所述的PAM-120、PAM-200和PAM-250。其他這類保守取代，例如具有近似疏水特性的完整區(qū)域的取代，已為本領域熟知。天然生成的肽變體也包含在本發(fā)明范圍之內(nèi)。這種變體的實例是由于可變mRNA剪接事件或者本申請所述多肽的蛋白水解切割而得到的蛋白質(zhì)。蛋白水解引起的變化包括，例如，在不同類型宿主細胞中表達時，由本發(fā)明序列編碼的多肽由于蛋白水解除去了一個或多個末端氨基酸而導致N-或C-末端的差異。本發(fā)明倍半萜合酶的變體可以用于實現(xiàn)酶促活性的增強或減弱，區(qū)域化學(regiochemistry)或立體化學的變化，或者底物利用或者產(chǎn)物分配的改變。此外變體可被制備使其具有至少一種經(jīng)改變的特性，例如對于底物的親和力，一種或多種想得到化合物的產(chǎn)量的改進的特異性，不同的產(chǎn)物分布，不同的酶促活性，酶反應速率的增加，在特定環(huán)境(pH、溫度、溶劑等等)中的更高活性或穩(wěn)定性，或者在想要的表達系統(tǒng)中的改進的表達水平。變體或位點直接突變體可以通過現(xiàn)有技術已知的任何方法來生成。如上所述，本發(fā)明提供了例如來自巖蘭草植物中的重組的和非重組的，分離的并純化的多肽。天然多肽的變體和衍生物能夠通過分離其序列)來獲得，或者通過對編碼天然萜合酶的核苷酸序列進行人工規(guī)劃突變獲得。天然氨基酸序列的改變可通過多種傳統(tǒng)方法中的任一種完成。在本發(fā)明的多肽的氨基和羧基末端由另外的肽序列的融合產(chǎn)生的多肽變體可被用于增強多肽的表達，在期望的環(huán)境或表達系統(tǒng)中利于蛋白的純化或改進多肽的酶促活性。這種另外的肽序列例如可為單一的肽。因此，本發(fā)明包含本發(fā)明的多肽的變體，例如通過與其它寡肽或多肽和/或連接到信號肽上的多肽融合獲得的那些變體。因此，在實施方式中，本發(fā)明提供了制備具有期望的碎合酶活性的多肽變體的方法，該方法包含以下步驟(a)/人由SEQIDNO:1,SEQIDNO:2或SEQIDNO:3組成的組中的核酸或者含有上述核苷酸序列的核酸中選擇任一種核酸；(b)修飾所選擇的核酸以獲得至少一種突變核酸；(c)用突變核酸序列轉(zhuǎn)化宿主細胞以表達由突變核酸序列編碼的多肽；(d)篩選多肽以獲得具有至少一種經(jīng)改變的特性的功能多肽；和(e)非強制性選擇地，當多肽不具有期望的變體碎合酶活性時，重復(a)(d)的步驟直至得到具有期望的變體薛合酶活性的多肽為止(=DNA改組)。提供多肽變體的該方法適合于從由突變核酸池編碼的多肽中篩選具有期望特性，如活性參數(shù)的功能化多肽。在步驟(a)中，可以選擇任何本發(fā)明的核酸。隨后，在步驟(b)中，可生成大量的突變核酸序列，例如通過隨機誘變，位點特異性誘變或DNA改組方法?；蚋慕M的詳細的步驟可在Stemmer,W.P.(1994)DNAshufflingbyrandomfragmentationandreassembly:invitrorecombinationformolecularevolution.ProcNatlAcadSciUSA.91(22):10747-1075中發(fā)現(xiàn)。總之，DNA改組指的是在體外已知序列的隨機重組的方法，其包括選擇至少兩種核酸用于重組。例如突變能夠通過合成含有突變序列的寡核苷酸被引入特定座位，與能夠連接到天然序列片段的限制性位點側(cè)面相連。連接之后，得到的重建的序列編碼具有期望的氨基酸插入、置換或缺失的相似體。另外，可使用寡核苷酸直接位點特異性誘變步驟提供改變的基因，其中預先確定的密碼子可通過置換、缺失或插入來改變。因此，SEQIDNO:1，SEQIDNO:2或SEQIDNO:3中的任一種可與選自SEQIDNO:1,SEQIDNO:2或SEQIDNO:3中任一種的不同序列進行重組，并/或與例如從不同于巖蘭草的生物體中分離出來的其它編碼核酸的碎合酶進行重組。因此，突變核酸可被獲得和分離，其可根據(jù)例如本實施例公開的標準步驟被用于轉(zhuǎn)化宿主細胞。在步驟(d)中，在步驟(e)中獲得的多肽被篩選用于得到經(jīng)改變的特性，例如期望改變的酶促活性。期望的酶促活性(為該活性而篩選表達的多肽)的實例包括增強或減弱的酶促活性，其由KM或V腦x值度量，例如改變的區(qū)域化學或立體化學，改變的底物利用或產(chǎn)物分布。酶促活性的篩選可根據(jù)本領域的技術人員熟知的步驟以及在本實施例中公開的步驟來實施。步驟(e)提供了步驟(a)(d)方法的循環(huán)，優(yōu)選其平行進行。因此，通過生成顯著量的突變核酸，可同時用不同的突變核酸將許多的宿主細胞轉(zhuǎn)化，使較多數(shù)量的多肽進行隨后的篩選。因此獲得期望的多肽變體的機會隨技術人員意愿增加。在實施方式中，本發(fā)明提供了制備編碼具有辟合酶活性的多肽變體的核酸的方法，該方法包括上述的步驟(a)(e)并且還包含以下步驟(f)當具有期望變體碎活性的多肽被鑒定出來時，獲得在步驟(c)中得到的突變核酸，其被用于轉(zhuǎn)化宿主細胞以表達步驟(c)和步驟(d)之后的變體路合酶。多肽變體同樣包括具有與含有SEQIDNO:4,SEQIDNO:5和/或SEQIDNO:6的氨基酸序列的任一多肽有特定最小序列同一性的多肽。在實施方式中，分離的多肽含有與SEQIDNO:4有至少50%的氨基酸序列同一性并且具有萜合酶活性的氨基酸序列。優(yōu)選地，分離的多肽含有與SEQIDNO:4有至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、90%并且最優(yōu)選95%的序列同一性的氨基酸序列。在實施方式中，分離的多肽包含與SEQIDNO:5有至少76.8%的氨基酸序列同一性并且具有萜合酶活性的氨基酸序列。優(yōu)選地，分離的多肽含有與SEQIDNO:5有至少78%、79%、80%、85%、90%、95%和最優(yōu)選97%的序列同一性的氨基酸序列。在實施方式中，分離的多肽含有與SEQIDNO:6有至少49%的氨基酸序列同一性并且具有萜合酶活性的氨基酸序列。優(yōu)選地，分離的多肽含有與SEQIDNO:6有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%并且最優(yōu)選97%的序列同一性的氨基酸序列。優(yōu)選地，所述多肽主要由SEQIDNO:4，SEQIDNO:5或SEQIDNO:6的氨基酸序列組成。另一方面，本發(fā)明提供了含有本發(fā)明核酸的載體。"載體"在這里包括任何重組載體，包括但不限定為病毒載體、噬菌體和質(zhì)粒。技術人員能夠根據(jù)表達系統(tǒng)選擇合適的載體。在實施方式中，所述表達載體包括編碼可操作地連接到調(diào)節(jié)序列、mRNA核糖體結合位點、以及調(diào)控轉(zhuǎn)錄和翻譯起始和終止的合適的序列等的多肽的cDNA序列，該調(diào)節(jié)序列例如為轉(zhuǎn)錄啟動子、操縱基因或增強子。當調(diào)控序列與本發(fā)明的cDNA序列功能性相連時，那么核苷酸序列就是"可操作地連接"。本發(fā)明的載體可被應用于制備遺傳修飾的宿主生物體和/或細胞的方法，應用于包含本發(fā)明核酸的宿主生物體和/或細胞，以及應用于生產(chǎn)或生成裕合酶的方法，以下將進一步給出。一方面，本發(fā)明提供了生成碎合酶的方法，該方法包括在有利于所述薛合酶生產(chǎn)的條件下對經(jīng)修飾以含有至少一種核酸序列的宿主生物體和/或細胞進行培養(yǎng)，其中所述至少一種核酸為本發(fā)明的核酸。例如，生產(chǎn)碎合酶的方法包括步驟(a)選擇不表達本發(fā)明的核酸的宿主生物體和/或細胞；(b)轉(zhuǎn)化所述生物體使其表達本發(fā)明的核酸；(c)在有利于由所述核酸編碼的萜合酶生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)該生物體。本發(fā)明同樣提供了生產(chǎn)萜合酶的方法，該方法包括步驟(a)選擇不表達任何本發(fā)明的核酸的宿主生物體和/或細胞；(b)轉(zhuǎn)化所述生物體使其以較高的量表達本發(fā)明權利要求1~3或12的任一的核酸；(c)在有利于由所述核酸編碼的萜合酶生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)該生物體。因此，另一方面，本發(fā)明提供了經(jīng)轉(zhuǎn)化以含有本發(fā)明核酸的重組宿主生物體和/或細胞。宿主生物體可以是單細胞或多細胞生物體，但為非人類生物體。宿主例如可為多細胞生物體的細胞。優(yōu)選地，宿主生物體為細菌，例如大腸桿菌(五.co//.)。優(yōu)選地，宿主生物體可以異源地包含本發(fā)明的核酸。另一優(yōu)選的宿主生物體包括真菌類，優(yōu)選酵母，最優(yōu)選釀酒酵母(Sflc/z『owjFcescereWs/ae入用于本發(fā)明多肽的表達的合適的宿主生物體包括較高級的真核細胞，優(yōu)選植物。優(yōu)選地，植物為屬于茄科或唇形科，更優(yōu)選煙草類。例如，合適的宿主細胞為植物細胞。一方面，本發(fā)明提供了表達本發(fā)明多肽的重組宿主生物體或細胞。優(yōu)選地，該宿主生物體經(jīng)轉(zhuǎn)化以比未經(jīng)如此轉(zhuǎn)化的相同生物體高的量表達多肽。術語"經(jīng)轉(zhuǎn)化"指的是將宿主進行遺傳工程改造使其含有一個、兩個或多個本發(fā)明任意的核酸的拷貝。優(yōu)選地，術語"經(jīng)轉(zhuǎn)化"涉及異源表達本發(fā)明多肽和/或由本發(fā)明核酸編碼的多肽的宿主。因此，在實施方式中，本發(fā)明提供了經(jīng)轉(zhuǎn)化的生物體，其中本發(fā)明的多肽以比未經(jīng)如此轉(zhuǎn)化的相同生物體高的量被表達。現(xiàn)有技術中公知幾種方法用于生成轉(zhuǎn)基因重組宿主生物體或細胞，如植物、酵母、細菌或高級真核生物體的細胞培養(yǎng)物。例如，適用于細菌、真菌、酵母和哺乳動物細"包宿主的克隆和表達載體的描述參見,例如，Pouwels等的CloningVectors:ALaboratoryManual,Elsevier,NewYork，(1985)和前面歹。舉的Sambrook等的文獻。具體的高級植物和/或植物細胞的克隆和表達載體是技術人員可以得到的，見例如Schardl等的(1987)Gene61:1-11。轉(zhuǎn)化宿主生物體的方法，例如生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物，修飾宿主生物體或細胞使其包含轉(zhuǎn)基因核酸(例如本發(fā)明的核酸)，為技術人員所熟知。對于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物，如通用的方法包括植物原生質(zhì)體的電穿孔、脂質(zhì)體介導的轉(zhuǎn)化、土壤桿菌介導的轉(zhuǎn)化、聚乙二醇介導的轉(zhuǎn)化、粒子轟擊、植物細胞的顯微注射和應用病毒的轉(zhuǎn)化。在實施方式中，轉(zhuǎn)化的DNA被整合到非人類宿主生物體和/或細胞的染色體中，從而得到穩(wěn)定的重組體系統(tǒng)?，F(xiàn)有技術中任何已知的染色體整合方法可以應用于本發(fā)明的實踐中，包括但不限定為重組酶介導的盒式交換(RMCE),病毒位點特異性染色體插入，1|_病毒法和前核注射。另一方面，本發(fā)明提供了生成辟類化合物的步驟和/或方法。因此本發(fā)明提供了生成至少一種辟類化合物的方法，該方法包含(a)將至少一種脂肪族的焦磷酸酯碎前體與至少一種本發(fā)明的多肽或由任一本發(fā)明的核酸編碼的多肽接觸，和(b)非強制性選擇地，分離步驟(a)中產(chǎn)生的至少一種萜類化合物。此外，本發(fā)明提供了一種生成至少一種萜類化合物的方法，該方法包括物體經(jīng)轉(zhuǎn)化以表達或遞增表達由權利要求1~3中任一項的核酸編碼的多肽或權利要求4的多肽；和-非強制性選擇地，從該非人類生物體中分離至少一種薛類化合物。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，該方法還包括步驟在有利于辟類化合物生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)所述生物體的步驟之前，用重組核酸轉(zhuǎn)化非人類生物體以表達或遞增表達由權利要求1~3中任一項的核酸編碼的多肽或權利要求4的多肽。優(yōu)選地，該至少一種辟類化合物為本發(fā)明說明書中公開的碎類化合物。更優(yōu)選地，所述方法適合于生成化學式(I)~(VII)的至少一種環(huán)狀的路。生成至少一種碎類化合物的方法包含將至少一種脂肪族的焦磷酸酯辟前體與至少一種本發(fā)明的多肽接觸的步驟。例如，以上用于生成辟合酶方法中獲得的多肽可被使用。根據(jù)標準蛋白或酶的提取技術，所述多肽從表達本發(fā)明核酸的宿主生物體中被提取出來。當宿主生物體是向培養(yǎng)基中釋放本發(fā)明多肽的單細胞生物體或細胞時，可簡單地從培養(yǎng)基中收集所述多肽，例如通過離心法，非強制性選擇地通過洗滌步驟和懸浮于合適的緩沖溶液中。當宿主生物體是在細胞中積聚本發(fā)明多肽的植物或單細胞生物體或細胞時，可通過細胞的破裂或溶解獲得所述多肽并且從細胞的溶解產(chǎn)物中提取所述多肽。然后在最佳的pH和溫度下將分離的多肽懸浮于緩沖溶液中。如果合適的話，為了優(yōu)化酶促活性可添加鹽、BSA和其它種類的酶的輔因子。碎前體可被添加到多肽的懸浮液或溶液中，接下來在最佳的溫度如3(TC下孵育。孵育后，所述碎類化合物可從孵育溶液中通過標準分離步驟如溶劑萃取和蒸餾而被分離出來，優(yōu)選在從溶液中除去多肽后進行。在生成至少一種碎類化合物的方法的一個步驟中，在有利于萜類化合物生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)宿主生物體或細胞。因此，當所述宿主為轉(zhuǎn)基因植物時，提供了最佳的生長條件，例如最佳的光照、水和營養(yǎng)條件等。當宿主為單細胞生物體時，有利于辟類化合物生產(chǎn)的條件可包含向宿主的培養(yǎng)基中添加合適的輔因子。另外可選擇被證明對綜類化合物合成最優(yōu)的培養(yǎng)基。外部條件例如最佳的pH和溫度通常在給定的表達系統(tǒng)中也是有利于辟類化合物生產(chǎn)的。本申請中提及的所有的文獻都被并入作為公開和描述與文獻列舉的方法和/或材料相關的參考文獻。以下的實施例目的是舉例說明本發(fā)明而不限定其范圍。實施例實施例1巖蘭草根材料，mRNA的分離和cDNA的合成巖蘭草才直物/人才直物苗圃('LaCompagniedesPlantesAustrales,,LesAvirons,TheR6unionIsland,France)中獲得。該植物在LullierAgronomyresearchStation(瑞士)的溫室的罐子中培養(yǎng)并且通過劃分6個月到1年大小進行生長繁育。在溫室條件下，1-3周后移植的巖蘭草切口開始發(fā)芽并且培養(yǎng)一年后根的體積通常增至三倍或四倍。為了收獲根部，將所述植物從罐子中挖出并且用自來水沖洗。根部的倍半萜含量如下計算將根切成小塊或用研缽和碾槌在液氮中碾碎并且用二乙醚或戊烷抽提；濃縮后，提取物用GC和GC-MS分析。在不同的生長階段收獲從母體植抹裂口移植之后獲得的植物從具有活躍的消耗的根系統(tǒng)的植物(移植后4~6個月)到具有良好發(fā)達的密集根系統(tǒng)的植物(移植后1~2年)。巖蘭油的倍半辟特性在所有的被分析的根中被發(fā)現(xiàn)并且?guī)r蘭酸是主要成分。對于克隆試驗，使用移植后大約6個月獲得的幼嫩的植物。該根從葉子上切下并在液氮中冷凍。首先使用Wadng攪切器將它們在液氮中粗略的切碎，然后使用研缽和碾槌將其碾成細的粉末。根據(jù)以下廠商的指示使用Invitrogen的ConcertTM植物RNA試劑提取總RNA。RNA的濃度從260nm的OD值估算出來并且RNA的完整性通過在瓊脂糖凝膠上檢驗核糖體RNA帶的完整性進行評估。通過oligodT-纖維素親和色譜法根據(jù)制造商的指示使用FastTrack2.0mRNA分離試劑盒(Invitrogen)將mRNA從總RNA中純化出來。mRNA的濃度從260nm的OD值估算出來并且一部分置于瓊脂糖凝膠上檢驗mRNA池的分布規(guī)模。根據(jù)制造商的指示從1的mRNA中應用MarathoncDNA擴增試劑盒(Clontech)制備接頭連接的雙鏈cDNA。部分cDNA庫被置于瓊脂糖凝膠上評估質(zhì)量和規(guī)模分布。實施例2來自于巖蘭草根的編碼倍半薛合酶的cDNA的片段的分離使用特定植物的倍半萜合酶核苷酸序列的簡并引物擴增編碼倍半辟合酶的cDNA的片段。倍半薛合酶特定的核普酸序列已經(jīng)從植物倍半辟合酶氨基酸序列的比對(WO04/031376)中預先被設計好。從植物倍半辟合酶氨基酸序列中的三個保守區(qū)域設計六條引物(四條正向的和兩條反向的)。分另'J為TpsVFl、TpsVF2、TpsCFl、TpsCF2、TpsVR3和TpsCR3(WO04/031376)。另外，對巖蘭草的倍半碎合酶核苷酸序列設計一系列寡核苦酸使其具有改良的特異性。從不同植物中分離出來的倍半萜合酶的序列比較顯示了在種系發(fā)源關系上高的序列同源性。從分類學關聯(lián)物種的碎合酶中這些序列同源性很高并且不涉及功能的特化合酶的序列的比對，我們設計新的倍半碎合酶特定引物。巖蘭草是禾本科植物并且屬于單子葉植物綱(Liliopsida)。來自單子葉植物(檢索序號為AAC31570的來自油椰子o/ez/era),檢索序號為BAC99549、BAC99543、AAR01759、BAD03024、NP—908798、BAC20102、AAR87368的來自于稻(Oo;zasa"va)和檢索序號為AAG37841、AAS88575、AAS88574、AAS88573、AAS88572、AAS88571的來自于玉米(Zeama"))的倍半碎合酶的氨基酸序列使用ClustalW[Thompson,J.D.,Higgins,D.GandGibson,T丄(1994)CLUSTALW:improvingthesensitivityofprogressivemultiplesequencealignmentthroughsequenceweighting,position,specificgappenaltiesandweightmatrixchoice.NucleicAcidsRes.22,4673-4680]進行比對并且選擇所有序列中的保守區(qū)域。從這些區(qū)域中，4吏用在萬維網(wǎng)[http:〃blocks.fhcrc.org/blocks/make一blocks.html和http://blocks.fhcrc.org/blocks/codehop.html]上可得的計算機程序?qū)崿F(xiàn)的CODEHOPstrategy[RoseT.M.,SchultzE.R.,HenikoffJ.GPietrokovskiS.McCallumC.MandNenikoffS.(1998)Consensus-degeneratedhybridoligo-nucleotideprimersforamplificationofdistantlyrelatedsequences.NucleicAcidsResearch26(7),1628-1635]來設計引物。設置該程序的參數(shù)以使設計引物具有11~13個堿基的簡并核心，256的最大的簡并性(由每一種引物表示的不同序列的數(shù)目)和約60。C的退火溫度。使用單子葉植物玉米的密碼子的用法。使用該方法，從五個保守區(qū)域中設計出四條正向引物和兩條反向引物(表1)。表l:單子葉植物倍半辟合酶特定引物<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>對于表1中的每一種引物，給出了其核苦酸序列并且在序列比對中顯示了相應的氨基酸序列。核普酸序列的簡并性使用IUPAC的單字母編碼的方式表示。這些引物應用在從巖蘭草根中提取的總RNA的RT-PCR試驗中。在所有試驗中，反轉(zhuǎn)錄在60。C下按照制造商所述使用巖蘭草根總RNA、oligo(dT)2。引物和ThermoscriptTM(Invitrogen)反轉(zhuǎn)錄酶進行。PCR條件適合于兩套引物。使用PlatinumTaqDNA聚合酶(Invitrogen),植物倍半碎合酶特定引物進行PCR反應。-使用正向引物TpsVFl、TpsVF2、TpsCFl和TpsCF2與反向引物TpsVR3、TpsCR3和dTadaptor引物(表2)的不同的可能組合進行第一輪PCR,所述PCR混合物含有5(iL10XPCR反應緩沖溶液(invitrogen)、1.5mMMgCl2、0.2mMdNTPs、200nM正向引物、200nM反向引物、0.4pL(2單位)PlatinumTaqDNA聚合酶、2pL的來自上述反轉(zhuǎn)錄的cDNA并加蒸餾水至最終體積50pL。該反應在EppendorfMastercycler梯度熱循環(huán)4義和以下的循環(huán)條件下進行95°〇下2分鐘；35個循環(huán)的94°。下45秒，42。C下45秒，72。C下2分30秒；72°C下最終延伸10分鐘。第二輪PCR以與第一輪PCR相同的條件進行，使用5的第一輪PCR混合物為模板和相同的引物或嵌套引物。PCR產(chǎn)物的大小在1%的瓊脂糖凝膠上測定。在幾種RT-PCR中，兩種產(chǎn)生了期望片段TpsCFl+dTadaptor的第一次PCR,接下來進行TpsCF2+TpsCR3的第二次PCR,和TpsCF2+dTadaptor的第一次PCR,接下來進行TpsCF2+TpsCR3的第二次PCR。將條帶從凝膠中切離，使用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen)進行純化并在pCR2.1-TOPO載體中使用TOPOTA克隆試劑盒(Invitrogen)克隆。插入的cDNA進行DNA測序并且序列在GenBank的非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫(NCBI)用BLASTX算法(Altschul,S.F.,Gish,W.，Miller,W"Myers,E.W"andLipman,D.J.(1990)Basiclocalalignmentsearchtool.JA/o/.5/o/.215,403-410)進行比較。比較在http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/網(wǎng)站在線進行。序列分析顯示了與倍半萜合酶的同源性，并且序列的比較顯示出我們得到具有顯著序列區(qū)別的4個不同的cDNA片段CA711,CA717,CA782和CA783(圖2)。用單子葉植物的倍半萜合酶特定引物，使用Clontech的Advantage2聚合酶混合液進行PCR步驟。每種PCR混合物含有5jiLAdvantage2的PCR緩沖溶液、200|iMdNTPs、200nM每種寡核苷酸引物、2的來自上述的反轉(zhuǎn)錄的cDNA、1的Advantage2聚合酶混合液和蒸餾水至最終體積50fiL。下述條件被用于擴增94。C變性3分鐘；15個循環(huán)的94。C變性1分鐘，第一個循環(huán)65°C退火1分鐘和以后每個循環(huán)減少一度，和72。C延伸2分鐘；20個循環(huán)的94。C變性1分鐘，58。C退火1分鐘和72。C延伸2分鐘；最后72。C延伸10分鐘。不同的PCR采用單子葉植物倍半辟合酶特定正向引物和反向引物可能的組合。第二輪PCR使用5pL的第一次PCR混合物作為模板，以與上述第一輪PCR相同的條件和相同的引物來進行。正向引物和反向引物的組合為TpsmonocotF3+TpsMonocotRl、TpsmonocotF3+TpsMonocotR2、TpsmonocotF4+TpsMonocotRl和TpsmonocotF4+TpsMonocotR2,產(chǎn)生期望大小的擴增子。序列分析和比較顯示我們得到了編碼三種不同和新的倍半辟合酶的部分cDNA:CA725,CA731和CA733(圖2)。實施例3通過快速擴增cDNA末端(RACE)方法對編碼倍半萜合酶的全長cDNA的擴增從這些新的cDNA片段(表2)來設計前端特定引物。如下進行3'RACE。首先在60。C使用oligo(dT)20引物，1.5微克的總RNA和ThermoscriptTM逆轉(zhuǎn)錄酶在與上述RT-PCR相同的條件進行反轉(zhuǎn)錄。使用dTadaptor引物和正向cDNA特定引物進行第一次PCR。最終體積為50(iL的PCR混合物中含有0.4|iMcDNA特定引物，0.4(iM的dTadaptor引物(表2),每種dNTP各300^M，5pL的10XHotStartTaqDNA聚合酶緩沖溶液(Qiagen)，2pL的cDNA,0.5pL的HotStartTaqDNA聚合酶。循環(huán)條件為95。C下15分鐘；35個循環(huán)的94°C45秒，48°C45秒和72°C2分30秒；和72。C下10分鐘。嵌套式PCR使用與以上組成相同的PCR混合物進行，除了以下的修改使用嵌套式cDNA特定引物和adaptorP引物(表2),5mL的第一次PCR用作模板，以及退火溫度增至60°C。將擴增產(chǎn)物進行測定，亞克隆，并且如上分析它們的序列。3，RACE成功獲得CA717和CA733(圖3),而不是其它的cDNA。用Thermoscript和引物CA711—Fl和CA711—F2(表2)和嵌套式PCR的低至48。C代替60。C的退火溫度的3'RACE試驗，允許新的倍半辟合酶cDNA，即CA775的3'末端的非特定擴增。表2:用于3'RACE和5'RACE的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>基于3'RACE后獲得的這三種半全長序列，我們設計了特定的反向引物用于5'RACE。應用Invitrogen的5'RACE系統(tǒng)。對于這一步驟，每種cDNA應用三條引物(一條用于反轉(zhuǎn)錄，和兩條嵌套引物用于第一和第二次PCR)。反轉(zhuǎn)錄部分的步驟如制造商所述適用于高GC含量的轉(zhuǎn)錄。使用PlatinumT叫DNA聚合酶(Invitrogen)進行PCR。對于第一次PCR,模板為5pL的dC-結尾的cDNA，并使用cDNA特定引物(表2)和精簡的錨定引物(Invitrogen)。循環(huán)條件為94°C2分鐘；35個循環(huán)的94。C下0.5分鐘，55°CT0.5分鐘和72t:下2分鐘；和72t下10分鐘。對于第二次PCR,模板為5|iL的100倍稀釋的第一次PCR產(chǎn)物和嵌套式cDNA特定引物(表2)和通用擴增引物(Invitrogen)。第二次PCR的循環(huán)條件為94。C下2分鐘；12個循環(huán)的94°C下0.5分鐘，第一個循環(huán)時68。C下0.5分鐘和每后一循環(huán)減少rC，和72。C下2分鐘；25個循環(huán)的94。C下0.5分鐘，6(TC下0.5分鐘和72"C下2分鐘；和72'C下IO分鐘；72"下IO分鐘。對擴增產(chǎn)物進行檢測、亞克隆并對它們的序列作如上述的分析。5，末端的擴增成功獲得CA717和CA733，并且對于這兩個克隆，全長的核苷酸序列可被重建(Vet717:SEQIDNO:1;Vet733:SEQIDNO:2)。對于CA775,使用相同方法的第一5'RACE得到了820bp片段的擴增。該序列的分析顯示出與CA775的3'RACE產(chǎn)物的60bp的重疊，^旦顯示了5，RACE并不完全以及仍然缺少5，末端的部分?；讷@得的5'RACE序列(進一步接近5'末端)設計一套新的引物并且以相同的條件重復5'RACE。這些允許獲得額外的100bp但翻譯起始密碼子仍然缺失。應用MarathoncDNA合成試劑盒(Clontech)獲得的cDNA來設計第三套引物。如制造商所述在EppendorfMastercycler梯度熱循環(huán)儀上用Advantage2聚合酶混合液進行擴增。第三次5'RACE獲得了最終含有起始密碼子的額外的lOObp的序列并獲得了全長的核苷酸序列(Vet775，SEQIDNO:3)。由全長倍半碎合酶編碼cDNA(即Vet717、Vet733和Vet775,分別相應于SEQIDNO:4、SEQIDNO:5和SEQIDNO:6)推導出來的氨基酸序列的比較顯示出相對低的同源性(圖3)(同一性范圍從31%~40%)。在公共序列數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)的最接近的匹配為推定的稻和玉米的倍半辟合酶序列。對于Vet717和Vet775,最接近的序列分別為47%和50%的同一性。Vet733具有與檢索序號為AY518310到AY518314(Kminer等(2004)ThePlantcell16(5),1115-1131)的核香酸序列編碼的玉米的倍半辟合酶序列相對高的序列同源性(76.8%的同一性)。在Vet755的N-末端的序列不同于其它兩者并且區(qū)別于其它已知的倍半碎合酶N末端延伸出50個氨基酸并且含有與眾不同的基序PAAAASSQQQQ(SEQIDNO:7)。該N-末端的額外的序列是與眾不同的并且與任何已知的肽信號序列都不相似。實施例4細菌中來自巖蘭草的倍半萜合酶的異源表達從MarathoncDNA庫中使用從RACE獲得的序列信息設計的引物CA717—Nde和CA717_Kpn(表3)擴增Vet717的全長的cDNA。使用Pfu聚合酶(Promega)、含有5(il的尸/wDNA聚合酶10X緩沖液、每種dNTP各200pM、每種正向引物和反向引物各0.4jiM,2.9單位的尸/wDNA聚合酶和5(il的100倍稀釋的cDNA(使用MarathoncDNA擴增試劑盒(Clontech)如上所述制備)以50jlU的最終體積進行PCR。熱循環(huán)的條件如下95"下2分鐘；30個循環(huán)的95。C下30秒、55。C下30秒和72。C下4分鐘；和72。C下10分鐘。使用QIAquicl^凝膠提取試劑盒(Qiagen)在瓊脂糖凝膠上純化和洗提PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物由含有Ndel位點(包括轉(zhuǎn)錄起始密碼子)和在緊接終止密碼子之后的《;wl位點的全長Vet717cDNA組成。該PCR產(chǎn)物用Wel和《戶"I消化并連接到用相同的酶消化的pETDuet-l質(zhì)粒(Novagen)上。插入片段的測序顯示出與RACE產(chǎn)物沒有序列差異。表3:用于表達質(zhì)粒構建的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>然后將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)細胞(Novagen)中。轉(zhuǎn)化細胞的單一菌落被接種到5mlLB培養(yǎng)基上。37。C孵育5~6小時后，培養(yǎng)物冷卻至2CTC并且用0.5mMIPTG誘導蛋白的表達。過夜孵育后，通過離心法收集該細胞，懸浮于0.5ml的抽提緩沖液中(50mMMOPSOpH7，5mMDTT,10%甘油)并且超聲波降解樣本3次每次20秒。細胞碎片通過30分鐘18,000g離心并且回收含有可溶性蛋白的上清液。通過SDS-PAGE分析的分析結果顯示具有期望分子量的蛋白重組體的生成。以相同的方式，從MarathoncDNA庫中^f吏用引物733—Nco和733—Eco(表3)擴增Vet733cDNA并以A^/el-五coiI片段連接到pETDuet-l表達質(zhì)粒上。通過測序檢驗其構造。使用這些質(zhì)粒在BL21(DE3)中的異源表達生成了由SDS-PAGE清晰可見的蛋白重組體。對于Vet775到pETDuet-l表達質(zhì)粒中的連接，因為cDNA已經(jīng)含有兩個〃&1和一個限制性位點(分別在位置603,1483和1020),為了在末端引入iVcoI和位點和除^卓內(nèi)部的限制性位點，以兩階段進行擴增，使用重疊延伸PCR方法(Horton,R.M.,Hunt,H.D.,Do,S.N.,Pullen,J.K.肌dPease,L.R.(1989)Engineeringhybridgeneswithouttheuseofrestrictionenzymes:genesplicingbyoverlapextension.Gene77,61-68)。首先進4亍兩個分別的PCR反應一個用引物Vet775—Nco(在起始密碼子之前引入Wcol位點)和775_mut—F2;第二個使用引物775—mut—R2和775_fus—Eco(在終止密碼子之后緊引入￡coRIJ立點)。775_mut—F2*775—mut_R2引4勿為*，32個核苷酸重疊區(qū)域的正向和反向誘變的引物并且允許在cDNA中的位置1020上TVcol識別位點的抑制而不改變蛋白序列(將Ala340的密碼子從GCC改變?yōu)镚CA)(表3)。將來自這兩種PCR的產(chǎn)物純化、組合并用作最終PCR的模板，在該最終PCR中用引物Vet775_Nco和775—fus—Eco擴增全長的突變的Vet775cDNA。然后該PCR產(chǎn)物連接在pETDuet-1質(zhì)粒中TVcoI和五co7I限制性位點之間。另外，為了檢測不尋常的Vet775的N-末端序列對大腸桿菌中表達的影響和對酶促活性的影響，我們制造了兩個構造，包括除去Vet775的N-末端部分，并用源自Vet717的等價部分將它們替代。由此得到兩個經(jīng)修飾的cDNA,即Vet775—fusl和Vet775—fus2。在第一個構造中，起始的68個密碼子凈皮除去，并用Vet717的24個N-末端密碼子替代。在第二構造中，起始的91個密碼子被除去，并用Vet717的42個N-末端密碼子替代。這些構造通過重疊延伸PCR來生成。對于Vet775—fusl,第一次PCR使用引物775_fus_Nco和775_fusl-r并以pETDuet-l中的Vet717的cDNA為模板進行。第二次PCR使用引物775—fusl-f和775—fus—Eco并以MarathoncDNA庫為模板進行。引物775_fusl-f和775一fusl-r含有29個核苦酸(表3)的重疊區(qū)域。來自兩次擴增的PCR產(chǎn)物被純化并用作以775—fus—Nco和775_fus—Eco為引物另一PCR的模板。該PCR產(chǎn)物用TOPOTA克隆試劑盒(Invitrogen)被連接到pCR2.1-TOPO載體上，該PCR產(chǎn)物由204個5'-末端堿基對被Vet717的72個5，-末端堿基對替代并且與Ncol和EcorlP艮制性位點側(cè)面相連的Vet775的開放式閱讀框組成。來自三個分別克隆的插入物進行全長測序以確定沒有序列的變異。然后將質(zhì)粒用作重疊延伸PCR的位點定向突變模板以除去在核苷酸序列中位置72和888的兩個TVcoI位點。如上所述進4亍最后的^f'務飾，^使用i秀變的引物對775—mut—Fl和775一mut—Rl(改變Pro24的密碼子4吏其/人CCA變到CCT)(表3)以及775—mut_F2和775—mut—R2(如上所述)生成三個重疊片段。PCR產(chǎn)物最終被連接到pETDuet-l質(zhì)粒的TVcoI和五co7I卩艮制位點之間。編碼Vet775—fus2的cDNA的構建以相同的方式進行，在第一次PCR中使用引物775—fus2-f和775_fus2-r(表3)以生產(chǎn)由融合到Vet775的核普酸274~1521上的Vet717的核普酸1~126組成的cDNA。所有的這些用于全長或修飾的Vet775的cDNA擴增的PCR都如上所述用PfuDNA聚合酶進行。在co//BL21(DE3)中進行異源表達，之后通過SDS-PAGE分析，顯示出產(chǎn)生了構造Vet775—fusl和Vet775—fus2的蛋白重組體，但是沒有見到全長非修飾Vet775的蛋白重組體。實施例5倍半路合酶重組體的酶促活性的特征描述獲得的蛋白重組體使用FPP作為底物對倍半辟合酶活性進行檢驗。在特氟隆密封的玻璃管中使用50~100pl的粗大腸桿菌蛋白的提取物進行酶法測定，該提取物根據(jù)實施例3中給出的步驟(根據(jù)表3),在補以15mMMgCl2和100-250|iM純化的FPP的最終體積1mL的抽提緩沖液中獲得。培養(yǎng)基用1ml的戊烷覆蓋并且在30。C下將該管孵育12~18小時。產(chǎn)生的倍半萜用戊烷抽提兩次并且通過前述的GC和GC/MS(WO04/031376,實施例6)進行分析。用含有Vet775全長cDNA或兩個Vet775的融和蛋白的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的培養(yǎng)物獲得的蛋白提取物進行的酶法測定，沒有發(fā)現(xiàn)任何倍半萜合酶活性。這種明顯的失活的原因仍然不確定。Vet717蛋白重組體(SEQIDNO:4)產(chǎn)生了主要的倍半薛烴和幾種次要產(chǎn)物(圖4)。主要產(chǎn)物的質(zhì)譜與環(huán)灑剔烯(圖1中的(6))相符并且主要產(chǎn)物的保持時間與環(huán)灑剔烯標準的保持時間以非極性的；f主(SPB陽l,Supelco)和才及性4主(InnoWax，Hewlett-packard)方式呈列排布。環(huán)灑剔烯或其衍生物從未在巖蘭草油中被鑒定出來。在其它被鑒定出來的倍半萜中，氧化的環(huán)枯圯莰烷(cyclocopacamphane)倍半辟(圖l)結構上最接近于環(huán)灑剔烯。環(huán)J古圯莰烯(7)是環(huán)灑剔烯的立體異構體(KidoF等(1969)T^ra/zet/raw/e"en37,3169-3172),有趣的是環(huán)玷記莰烯的氧化衍生物以相對較多的量存在，在巖蘭油中達4%(Homa等(1970)Tetrahedronletters3,231-234;Weyerstahl等(2000)FlavourFrag.J.15,61-83;Weyerstahl等(2000)FlavourFrag.J.15,153-173;Weyerstahl等(2000)FlavourFrag.J.15,395-412)。為了將Vet717的產(chǎn)物與環(huán)灑剔烯區(qū)分開，用了手性GC色譜4義4吏用Megadex-5(MEGAs.n.c.,Legnano,Italy)毛細；f主(12m,0.25mm,0.25jim),起始的爐的溫度設置為6(TC保持2分鐘。隨后以5°C/min的等變率升至150。C和第二次以20°C/min等變率升至270°C。這些條件下，環(huán)灑剔烯具有5.60分鐘的保持時間并明顯地從具有5.75分鐘保持時間的Vet717產(chǎn)物中分離出來。Vet717酶還產(chǎn)生了幾種次要產(chǎn)物，基于MS,其具有相關結構如蓽澄茄烷或胡椒烷的骨架。Vet733蛋白重組體(SEQIDNO:5)不產(chǎn)生主要產(chǎn)物但卻有至少7種不同的倍半辟烴的混合物(圖5)?；贛S光譜和公開數(shù)據(jù)的保持力指標的比較，下述化合物可被鑒定出來(l)順式-a-香檸檬烯，(2)反式-a-香檸檬烯，(3)epi-P-檀香辟，(4)(3-紅沒藥烯,和(5)反式-紅沒藥烯。它們通過與含有P-紅沒藥烯、反式-Y-紅沒藥烯、反式-a-香檸檬烯和順式-a-香杵檬烯的企業(yè)標準(housestandard)比較被進一步確認。Epi-P-檀香辟的結構通過與紅沒藥提取物的GC-MS分析比較而確認。由Vet733產(chǎn)生的倍半碎烴或這些倍半辟的衍生物未曾從巖蘭油中分離出來?？赡苁荲et733在巖蘭草的根中以較低的量表達并且由這種酶產(chǎn)生的倍半萜以低于能被檢測的水平存在。某些Vet733、(Z)-(+)-epi-卩-檀香醇和(Z)-a-反式-香檸檬醇(圖l)的產(chǎn)物的醇衍生物已經(jīng)被描述作為檀香油的香味的重要的貢獻者(DE3205320;Frater,G.,Bajgrowicz,J.A和Kraft,P.(1998)FragranceChemistry.Tetrahedron456,7633-7703.)。巖蘭草的香味是非常復雜的，除此之外，與檀香相似的氣味已經(jīng)用來描述這種油。因此檀香方面特征可能與Vet733產(chǎn)物的痕量氧化衍生物存在有關。Vet733產(chǎn)生的倍半薛的形成機制流程圖解釋了形成的多種產(chǎn)物的關系(圖6)。每一輪循環(huán)從FPP(圖6的(16))的異構化開始至橙花醇-焦磷酸酯(NPP)(C2-C3鍵的旋轉(zhuǎn))，接下來環(huán)化得到紅沒藥基陽離子(17)。環(huán)化作用可以通過幾種機制進行。)3-紅沒藥烯和反式-Y-紅沒藥烯可通過分別使C6或C!4發(fā)生去質(zhì)子作用而形成。去質(zhì)子作用之后的C2-C7關閉生成順式-a-香檸檬烯和反式-a-香檸檬烯。在C15的Wagner-Meerwein重排和去質(zhì)子作用之后的C3-C7關閉生成了epi-P-檀香烯。Vet733倍半碎合酶是第一個被克隆的倍半辟合酶，其能夠催化FPP到紅沒藥基陽離子的環(huán)化和隨后的到香檸檬烷和檀香烷骨架的環(huán)化。權利要求1.分離的核酸，選自(a)含有與SEQIDNO2有至少82.4％同一性的核苷酸序列的核酸；(b)含有編碼與SEQIDNO5有至少76.8％的序列同一性的多肽的核苷酸序列的核酸；(c)含有在中度嚴謹條件下與核苷酸序列SEQIDNO2雜交的核苷酸序列的核酸；(d)含有編碼能夠合成具有C3-C7鍵的至少一種二環(huán)倍半萜和/或三環(huán)倍半萜的多肽的核苷酸序列的核酸；和/或(e)含有編碼能夠合成至少一種香檸檬烯和非強制性選擇的其它倍半萜的多肽的核苷酸序列的核酸，其特征在于香檸檬烯占由所述多肽合成的全部倍半萜產(chǎn)物的至少5wt.％；其中由任一(a)～(e)的所述核酸編碼的多肽具有萜合酶活性。2.根據(jù)權利要求1的分離的核酸，該核酸與SEQIDNO:2的核酸雜交并不與選自具有檢索號AY518310或AY518313的編碼玉米的倍半薛合酶的那些核酸序列雜交。3.根據(jù)權利要求1或2的分離的核酸，該核酸編碼能夠合成選自以下組中一種或多種二環(huán)倍半萜或三環(huán)倍半萜的多肽(+)-epi-p-檀香辟，反式-a-香檸檬烯，順式-a-香檸檬烯，(3-紅沒藥烯，反式-"紅沒藥烯和/或前述的兩種或多種的組合。4.分離的多肽，選自(a)含有與SEQIDNO:5有至少76.8%氨基酸序列同一性的氨基酸序列的多肽；(b)能夠合成具有C3-C7鍵的二環(huán)倍半萜和/或三環(huán)倍半萜的多肽；(C)能夠合成至少一種香檸檬烯和非強制性選擇的其它倍半萜的多肽，其特征在于香檸檬烯占由所述多肽合成的全部倍半萜產(chǎn)物的至少5wt.%。5.經(jīng)轉(zhuǎn)化以包含權利要求1~3中任一項的核酸的重組宿主生物體和/或細胞。6.生成至少一種萜類化合物的方法，該方法包含(a)將至少一種脂肪族焦磷酸酯碎前體與至少一種權利要求4的多肽或由權利要求1~3中任一項的核酸編碼的多肽接觸，和(b)非強制性選擇地，分離步驟(a)中產(chǎn)生的至少一種辟類化合物。7.生成至少一種萜類化合物的方法，該方法包含物體經(jīng)轉(zhuǎn)化以表達或遞增表達由權利要求1~3中任一項的核酸編碼的多肽或權利要求4的多肽；和-非強制性選擇地，從該非人類生物體中分離至少一種辟類化合物。8.權利要求7的方法，該方法包含步驟-在有利于萜類化合物生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)所述生物體的步驟之前，用重組核酸轉(zhuǎn)化非人類生物體以表達或遞增表達由權利要求1~3中任一項的核酸編碼的多肽或;f又利要求4的多肽。9.生成萜合酶的方法，包含在有利于所述萜合酶生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)經(jīng)修飾以含有至少一種核酸序列的宿主生物體或細胞，其中所述至少一種核酸為權利要求1~3中任一項的核酸。10.制備具有期望路合酶活性的多肽變體的方法，該方法包含以下步驟(a)選擇包含與SEQIDNO:2有至少82.4%同一性的核苷酸序列的核酸；(b)修飾所選擇的核酸以獲得至少一種突變核酸；(c)用該突變核酸序列轉(zhuǎn)化宿主細胞以表達由該突變核酸序列編碼的多肽；(d)篩選多肽以獲得具有至少一種經(jīng)改變的特性的功能多肽；和,(e)非強制性選擇地，當所述多肽不具有期望的變體辟合酶活性時，重復步驟(a)(d)的過程直至獲得具有期望的變體辟合酶活性的多肽為止。11.制備編碼具有期望的碎合酶活性的多肽變體的核酸的方法，該方法包含權利要求10的步驟并且還包含以下步驟(f)當具有期望變體萜活性的多肽被鑒定出來時，獲得在步驟(c)中得到的突變核酸，其被用于轉(zhuǎn)化宿主細胞以表達步驟(c)和步驟(d)之后的變體辟合酶。12.分離的核酸，選自(a)含有與SEQIDNO:l有至少59%的序列同一性的核苷酸序列的核酸；(b)含有編碼與SEQIDNO:4有至少50%的氨基酸序列同一性的多肽的核苷酸序列的核酸；(c)在中度嚴謹條件下與SEQIDNO:1雜交的核酸；(d)含有編碼能夠合成環(huán)玷圯莰烯的多肽的核普酸序列的核酸；其中，由所述核酸編碼的多肽具有薛合酶活性。13.分離的多肽，選自(a)與SEQIDNO:4有至少50%的氨基酸序列同一性的多肽；(b)能夠合成環(huán)j古圯莰烯的多肽。M.重組宿主生物體和/或細胞，經(jīng)轉(zhuǎn)化以含有權利要求12的核酸，和/或經(jīng)轉(zhuǎn)化以表達或遞增表達權利要求13的多肽。全文摘要本發(fā)明涉及一種新穎的倍半萜合酶和它們的應用方法。該萜合酶能夠合成具有C₂-C₇鍵或C₃-C₇鍵并且起始于脂肪族的焦磷酸酯萜前體(法呢基焦磷酸酯)的單環(huán)倍半萜、二環(huán)倍半萜和/或三環(huán)倍半萜。因此，第一次公開了催化能得到檀香萜和香檸檬烯碳骨架的環(huán)化的倍半萜合酶。本發(fā)明還涉及編碼倍半萜合酶的核酸序列和生成萜類化合物的方法。文檔編號C12N9/00GK101194013SQ200680020334公開日2008年6月4日申請日期2006年6月8日優(yōu)先權日2005年6月17日發(fā)明者米歇爾·沙爾克申請人:弗門尼舍有限公司