專利名稱：：用于基于瘤細胞及受刺激的白細胞內mRNA表達譜而預測對腫瘤疾病的免疫應答的方法用于基于瘤細胞及受刺激的白細胞內mRNA表達譜而預測對腫瘤疾病的免疫應答的方法
背景技術：
：相關申請本申請要求美國臨時申請?zhí)?0/688,744(2005年7月8日提交)和60/735,508(2005年11月11日提交)的優(yōu)先權。發(fā)明領域本發(fā)明涉及用于預測哺乳動物內對腫瘤疾病的免疫應答的方法，其中該方法基于瘤組織內腫瘤壞死因子受體(TNF-R)超家族mRNA的表達譜(profile)和循環(huán)白細胞內肺瘤壞死因子(TNF)超家族mRNA的表達譜。在該方法中，獲得瘤組織的樣品并評估表達于這些組織內的TNF-R超家族亞型mRNA。另外，哺乳動物的全血接受活化血液內T-細胞的刺激物處理并且鑒定應答該刺激物在表達水平上表現(xiàn)顯著改變的TNF超家族亞型mRNA。確定這樣的個體對其疾病可能具有較低嚴重性的預后，其中所述個體顯示與表達于它們的腫瘤組織內的TNF-R超家族亞型相關的TNF超家族亞型的表達水平改變。相關技術的描述不同方式的癌癥療法可以比喻為社會中各種類型力量的用途?；燁愃朴谠诔鞘写蠓秶厥褂密娛铝α浚幌嚓P武器極大的威力可附帶造成平民損害。相反，在循環(huán)外周血內作為人體內癌細胞主要殺手的白細胞類似于處理街頭犯罪的城市街道巡邏警察。類似地，當白細胞遭遇身體內癌細胞時，這些細胞是對癌靶的最初應答者?；谛螒B(tài)學分析和細胞表面標記的表征，使用流式細胞術或免疫組織化學染色^t支術，白細胞分類為眾多的類和亞類。這些類和亞類類似于通過制服和身份徽章(budge)確定警官。每mmS外周血的白細胞數(shù)目對應于城市內警察的數(shù)目。當警察遭遇街頭罪犯時，他首先必須用手頭擁有的武器對付罪犯。但是警察不總是攜帶適宜的武器。類似地，不總是給細胞毒性T-細胞提供適用于對付特定癌細胞的抗腫瘤因子。當癌細胞被IgG包被時，細胞毒性T-細胞經(jīng)IgGFc受體(FcRy)識別癌細胞。該過程稱為抗體依賴細胞介導的細胞毒性(ADCC)。實際上，用抗人IgG染色而在癌邊緣周圍經(jīng)常識別出IgG(參見例如，RichmanAV，Immunofluorescencestudiesofbenignandmalignanthumanmammarytissue,J.Natl.CancerInst.1976;57:263-7和KonevalT等,Demonstrationofimmunoglobulinintumorandmarginaltissuesofsquamouscellcarcinomasoftheheadandneck,J.Natl.CancerInst.1977;59:1089-97)。很多情況下也可以發(fā)現(xiàn)單核白細胞浸潤至癌損害內。在細胞毒性T-細胞表面上的FcRy類似于警察攜帶的備有多種武器的口袋。不同類型的FcRy如CD16、CD32和CD64對應于不同類型的口袋。棍棒(cudgel)是最初的武器并且待用于任何時候的攻擊。在細胞毒性T-細胞內，棍才奉對應于預先合成及貯藏在細胞毒性T-細胞細胞液內并且一旦FcRy活化則立即釋放的穿孔素(參見Nakanishi等，Performexpressioninlymphocytesinfiltratedtohumancolorectalcancer,Br.J.Cancer1991;64:239-42)。其它即刻可用的預先合成"棍棒"包括顆粒酶、與消化酶胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶相關的蛋白酶，可以起到在靶細胞內觸發(fā)凋亡的作用。警官還攜帶威力更大的槍支，可以對應于細胞毒性T-細胞內的腫瘤壞死因子(TNF)。通常，"子彈，，在細胞環(huán)境下(TNF亞型)不裝填在槍支內并且僅在Fc受體活化時才得到合成并從細胞毒性T-細胞中釋放。TNF能夠通過與靶細胞表面上存在的特定TNF受體相互作用而誘導凋亡。為了維持抗廣譜靶細胞的殺傷活性，存在不同類型的TNP配體(作為TNF超家族的部分，縮寫成TNFSF)。才艮據(jù)GenBank和UniGene信息(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov),人TNF超家族包含總共17個人類成員的多達18個TNF超家族，其中某些編號(16和17)缺失并且相同編號內具有多種序列(13A和13B)。對于相應TNF受體(TNF-R超家族縮寫成TNFRSF),人TNF-R超家族包含多達21個TNF-R超家族亞型。雖然TNF/TNF-R超家族亞型的相互作用不是嚴格特異性的，然而每種配體通常與特定的受體反應，如表l內所示，并且存在超過300個不同的TNF超家族亞型TNF-R超家族組合。表1.TNFRSFmRNA和TNFSFmRNA的GenBankUniGene條目列表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>承:GeneBank登錄號(未找到UniGene條目)當從浸潤的細胞毒性T-細胞中釋放適宜的TNF超家族亞型時，癌的徹底消滅可以發(fā)生。癌癥奇跡幸存者的稀有病例可能是其中TNF超家族亞型TNF-R超家族亞型完美組合的那些病例。抗體依賴細胞介導的細胞毒性(ADCC)是涉及結合抗體的白細胞細胞毒功能的另一種才幾制(見Perussia等,Assaysforantibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity(ADCC)andreverseADCC(redirectedcytotoxicity)inhumannaturalkillercells.MethodsMolBiol.2000;121:179-92)。一旦IgG的Fab部分與靶細胞結合，則IgG的Fc部分活化在白細胞上的Fc受體，則隨即活化這些白細胞以攻擊輩巴細胞。雖然已經(jīng)研究ADCC多年，但是在涉及ADCC的體外(v/的)實-瞼中的條件耳又決于純細胞系統(tǒng)中混懸在人工溶液內的效應細胞毒性T-細胞與耙細胞間的比率。此外，因為細胞溶解通常通過同位素(鉻-51)從靶細胞內的釋放進行定量，不知道所觀察的細胞溶解是否因穿孔素或TNF發(fā)生。也不知道哪種TNF超家族亞型參與ADCC。最后，白細胞對付癌的又一個重要機制是釋放趨化因子以召集更多白細胞至發(fā)病部位。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)此類眾多細胞因子。雖然沒有建立特定趨化因子與所召集的特定白細群體間的關系，然而趨化因子釋放與白細胞召集現(xiàn)象在對付癌癥中是重要的。這里可以類比為遭遇一伙罪犯的警察用無線電發(fā)回總部請求更多增援?？傊m然需要復雜的細胞機制以培育能夠識別特定癌標記的適宜白細胞亞群，并且應當釋放適宜的趨化因子以吸引這些成熟的白細胞至損害處，實際的癌殺傷以兩種不同方式發(fā)生。立即癌殺傷因穿孔素從這些白細胞中的釋放而發(fā)生，隨后通過合成和釋放TNF而緩慢及持續(xù)地誘導凋亡(見Vujanovic,RoleofTNFfamilyligandsinantitumoractivityofnaturalkillercells,Int.Rev.Immunol.2001Jun;20(3-4):415-37)。TNF通過與靶細胞表面上的特定受體結合而誘導凋亡。這意味白細胞必須釋放與存在于癌細胞上的受體相對應的特定TNF配體。雖然已經(jīng)考慮利用TNF/TNF受體的比作為疾病結果的預測(參見McDermott,TNFandTNFRbiologyinhealthanddisease.Cell.Mol.Biol.(Noisy-le-grand).2001Jun;47(4):619-35)，然而4艮少了解癌細胞內的TNF受體譜及白細胞內配體的誘導語，也很少知道如何召集適宜的白細胞群體。發(fā)明筒述若病理學標本顯示IgG沉積在癌邊緣，這意味患者至少能夠產生識別癌的IgG。若單核白細胞浸潤出現(xiàn)在癌塊邊緣，這意味患者的白細胞某種程度上被吸引至癌損害處，可能原因是在結合癌的IgG活化補體期間釋放了趨化因子(C3a、C5a、C567)(見Becker,Therelationshipofthechemotacticbehaviorofthecomplement-derivedfactors,C3a,C5a,andC567,andabacterialchemotacticfactortotheirabilitytoactivatetheproesterase1ofrabbitpolymorphonuclearleukocytes,J.Exp.Med.1972;135:376-87)。在癌細胞表面上表達的TNF-R超家族亞型的類型可以通過例如免疫染色(若抗體可獲得)、原位(/"wh)雜交或原位PCR(可從GenBank獲得序列)進行鑒定。對表達于浸潤性單核細胞內TNF超家族亞型的鑒定難以解釋，因為FcRy可以未被活化。由于外周血內的白細胞類似于后備警察，在外周血內供應適宜且充分裝備的細胞毒性T-細胞是抗癌戰(zhàn)斗的首要關^;步驟。因此，本方法有可能通過定量外周血白細胞內適宜TNF超家族亞型的誘導性來預測每名患者內的抗癌免疫力。因此，本發(fā)明的實施方式提供測定哺乳動物內腫瘤疾病預后的可能嚴重性的方法，該方法包括測定來自哺乳動物的全血第一樣品內的多種腫瘤壞死因子(TNF)超家族亞型的表達水平；使哺乳動物的全血第二樣品暴露于活化全血內T-細胞的刺激物；測定第二樣品內的多種胂瘤壞死因子(TNF)超家族亞型的表達水平；鑒定在所述第一樣品和第二樣品之間顯示在所述全血內表達水平顯著改變的亞型；并且當已鑒定的TNF超家族亞型與在哺乳動物瘤細胞內表達的特定腫瘤壞死因子受體(TNF-R)超家族亞型相對應時，確定預后可能較低的嚴重性。在另外方面，瘤組織內表達的TNF-R超家族亞型選自由TNF-R超家族亞型1A、3、12A和14所組成的組中。在另一方面，瘤組織內表達的TNF-R超家族亞型得到鑒定。在又一個方面，瘤組織內表達的TNF-R超家族亞型采用選自由下列所組成的組中的方法鑒定免疫染色、原位雜交、原位聚合酶鏈式反應和體外聚合酶鏈式反應。在另外方面，暴露全血包括添加肝素。在另一方面，刺激物選自由熱聚集性人IgG和抗人a/pT-細胞受體單克隆IgG所組成的組中。在另外方面，由發(fā)病細胞表達的腫瘤壞死因子受體超家族亞型選自由下列所組成的組中TNF-R超家族亞型1A、1B、3、4、5、6、7、8、9、IOA、IOB、IOC、IOD、IIA、IIB、12A、14、17、18和25。在另一方面，在所述已被暴露的全血內表達的腫瘤壞死因子超家族mRNA亞型選自由下列所組成的組中TNF超家族亞型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、13B、14、15和18。在另一方面，本方法還包括測定來自哺乳動物的全血第三樣品內多種趨化因子的表達水平；使哺乳動物的全血第四樣品暴露于活化全血內T-細胞的刺激物；測定第四樣品內多種趨化因子的表達水平；以及當鑒定在所述的第三樣品和第四樣品之間顯示在全血內表達水平顯著改變的趨化因子時，確定預后可能較低的嚴重性。在又一個方面，趨化因子選自由下列所組成的組中CCL1、C(X2、CCU、CCL4、CCX5、CCX6、CCL7、CCX8、CCX9、C(XIO、CCU1、CCU2、CCU3、CCX14、CCL15、CCU6、CCL17、CCX18、CCU9、CCX20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、C(X26、CCL27、C(X28、CXCL1、CXCX2、CXCU、CXCL4、CXCX5、CXCL6、CXCL7、CXCX9、CXQLIO、CXCLll、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL16、IL1B、IL5、IL6、IL8、IL12A、IL12B、IL15和IL16。本發(fā)明的又一個實施例提供測定飲食成分用于治療哺乳動物內腫瘤疾病的可能效用的方法，該方法包括獲得哺乳動物的全血第一樣品；使哺乳動物的全血第二樣品暴露于飲食成分；使哺乳動物的全血第一樣品和第二樣品暴露于活化全血內T-細胞的刺激物；測定來自哺乳動物的全血第一樣品和第二樣品內的多種肺瘤壞死因子(TNF)超家族亞型的表達水平；鑒定在所述的第一樣品和第二樣品之間顯示在所述全血內表達水平顯著改變的亞型；以及當已鑒定的TNF超家族亞型對應于表達在哺乳動物瘤細胞內的特定TNF-R超家族亞型時，確定所述飲食成分可能具有用于治療腫瘤疾病的功用。在另外方面，使第一樣品暴露于活化全血內T-細胞的刺激物之前暴露于對照刺激物。在另一方面，瘤組織內表達的TNF-R超家族亞型選自TNF-R超家族亞型1A、3、12A和14。在另外方面，瘤組織內表達的TNF-R超家族亞型得到鑒定。在另一個方面，瘤組織內表達的TNF-R超家族亞型采用選自由下列所組成的組中的方法鑒定免疫染色、原位雜交、原位聚合酶鏈式反應和體外聚合酶鏈式反應。附圖簡述圖1A顯示在全血暴露于熱聚集性IgG(HAG)后，外周血白細胞內所誘導的TNF超家族mRNA的分析結果；圖1B顯示圖1A重復分析的結果；圖2顯示取自各種腺癌和鱗狀細胞癌的組織樣品內表達的TNF-R超家族mRNA的分析結果；圖3顯示在全血暴露于抗人T-細胞受體(TCR)單克隆抗體后，外周血白細胞內所誘導的TNF超家族mRNA的分析結果；圖4A顯示當使外周血白細胞暴露于抗TCR抗體并定量TNF超家族亞型2mRNA表達時，劑量反應和動力學的分析結果；圖4B顯示當使外周血白細胞暴露于抗TCR抗體并定量TNF超家族亞型2mRNA表達時，動力學的分析結果；圖5A顯示當使外周血白細胞暴露于HAG并定量TNF超家族亞型15mRNA表達時，劑量反應和動力學的分析結果；圖5B顯示當使外周血白細胞暴露于HAG并定量TNF超家族亞型15mRNA表達時，動力學的分析結果；圖6顯示關于圖5數(shù)種TNF超家族亞型mRNA及對照mRNA方面的重復分析結果；圖7顯示在全血暴露于HAG后，外周血白細胞內所誘導的TNF超家族mRNA的分析結果；圖8顯示實施例4內所用的趨化因子引物序列；圖9顯示在全血暴露于HAG后，外周血白細胞內誘導的趨化因子mRNA的分析結果；圖10顯示在事先用飲食補充物或對照刺激物刺激的全血等分試樣暴露于HAG后，外周血白細胞內誘導的TNF超家族亞型3mRNA的分析結果。優(yōu)選實施方式的詳述mRNA的定量本發(fā)明的發(fā)明人開發(fā)了名為Hem(A)+系統(tǒng)的能夠定量全血白細胞內基因表達細微變化的獨特技術。該技術在美國專利申請?zhí)?0/796，298和國際專利申請系列號PCT/US2004/036309內詳細描述，兩篇文獻均在本文引用作為參考(還見Mitsuhashi,AbsolutequantitationofrnRNAinhumanbloodleukocytesasamodelforphenotypicgeneexpression-baseddiagnostics,ClinChem,52:4(2006))。在定量技術中，將全血施加至96孔濾板以捕獲白細胞。將含有合成性外來對照RNA和特異性反向引物的裂解緩沖液添加到濾板，并轉移細胞裂解物至用于雜交的寡UT)固定化微量培養(yǎng)板。隨后在寡(dT)固定化微量培養(yǎng)板內從所述引物位點合成cDNA。將含有特異性反向引物所引發(fā)的cDNA的溶液用于實時PCR。可以貯藏含有寡(dT)所引發(fā)的固定化cDNA的平板作為cDNA庫(bank)。更詳細地，該測定方法由3個主要步驟組成(a)在濾板上分離并裂解白細胞；(b)在寡(dT)固定化微量培養(yǎng)板內進行mRNA分離、反向引物雜交和cDNA合成；以及(c)實時定量的PCR。制造定制的96孔濾板，可以通過裝酉己白纟田萬包還原月莫(leukocytereductionmembrane)(Leukosorb;Pall)通過例如由Whatman或Pall。這些濾板安放在收集平板上，并施加150的5mmol/LTris(pH7.4)以潤濕濾膜。在4。C于120g離心1分鐘以從膜上移走Tris溶液后，施加50jiL充分混合的全血樣品至每個孔內并立即在4。C于120g離心2分鐘?？纂S后用300)iL磷酸鹽緩沖鹽水洗滌一次。在4。C于2000g離心5分鐘以除去鹽溶液，添加以1mL/L2-巰基乙醇(Bio-Rad)、0.5g/L蛋白酶K(Pierce)、0.1g/L鮭精DNA(5PrimeEppendorf/Brinkman)、0.1g/L大腸桿菌(^c/2eWc//flco//)tRNA(Sigma)、5nmol/L每種特異性反向引物和109個分子/L的合成RNA34(作為外來對照)補充的60(iL貯藏裂解緩沖液[5g/LN-月桂?；“彼猁}、4x標準檸檬酸鹽水、10mmol/LTris-HCHpH7.4)、1mmol/LEDTA、1mL/LIGEPALCA-630(NP-40的替代物)、1.79mol/L異硫氰酸胍(均來自Sigma)]至濾板的各孔內。隨后該平板在37。C溫育10分鐘，安放在寡(dT)固定化微量培養(yǎng)板(GenePlate;RNAture)上并在4°C于2000g離心5分鐘。在4。C下貯藏過夜后，微量培養(yǎng)板在4。C用100pL空白裂解緩沖液(plainlysisbuffer)洗滌3次并隨后用150(xL洗滌緩沖液洗滌3次?？梢酝ㄟ^添加30fiL含有1x逆轉錄緩沖液[50mMKC1、10mMTris-HCL(pH8.3)、5.5mMMgCl2、1mL/LTween20]緩沖液、每種三磷酸脫氧核苷1.25mM、4單位rRNA酶抑制劑(rRNAsin)和80U的MMLV逆轉錄酶(Promega;無引物)并在37。C溫育2小時，于每孔內直接合成cDNA。將每30pL反應物(reaction)、4pLcDNA直接轉移至384孔PCR平板內，并添加5(iL的TaqMan通用主'混合4勿(universalmastermixture)(AppliedBiosystems)和1|iL寡4亥香酸混合物(正向引物和反向引物每種5|LiM和1-2piMTaqMan探針)。PCR可以在PRISM7900HT(AppliedBiosystems)內進行，在95°C下10分鐘1個循環(huán)，隨后是45個循環(huán)95。C下30秒；55°〇下30秒和60。C下1分鐘。每種基因在獨立的孔內擴增。用分析軟件(SDS;AppliedBiosystems)測定循環(huán)閾值(Ct)，即產生一定量PCR產物(基于熒光)的循環(huán)。為構建用于定量的校正曲線，合成用于每種靶的含有正向引物及反向引物以及TaqMan探針的序列的合成長DNA寡核苷酸。用于對照RNA34的TaqMan探針例如是CCAAGGCCCAGCCCTCACACA?？蛇x地，可以利用SYBRGreenPCR。每種寡核苷酸可以通過HPLC純化至〉95。/。的純度。每個PCR含有10-106個分子/孔的這些模板核苷酸?？梢允褂脤τ谟蒁NA寡核苷酸所產生的對照RNA34的校正曲線來將樣品的Ct值轉換成分子/PCR孔(4的cDNA)，隨后乘以7.5(30除以4)以獲得分子/樣品(30|_iL的cDNA)。RNA34的回收百分數(shù)通過將這些值除以60iaL原始裂解緩沖液內RNA34的量而獲得(6x105=107/mLx60jiL)。對于天然mRNA，分子/PCR孔如以上所述用相應校正曲線加以確定，并且隨后通過乘以7.5(30除以4)，除以每一個樣品內的RNA34回收百分數(shù)并除以添加到濾板每孔內血液的體積(通常50(iL)而將這些值轉換成分子/每微升血液。平均數(shù)(SD)從全血的三份等分試樣中計算并可以使用Studentt-檢驗來統(tǒng)計分析。在實施方式中，使用以上所述的mRNA定量系統(tǒng)(Hem(A)+)在各種癌標本中表征TNF受體超家族(TNFRSF)mRNA的表達譜。隨后，TNF超家族(TNFSF)mRNA的誘導性通過使用分別作為細胞毒性T-細胞介導反應和抗體依賴細胞介導的細胞毒性(ADCC)的離體模型的小鼠抗人T細胞受體單克隆抗體或熱聚集性IgG對肝素化全血刺激加以定量。使用本領域內眾所周知的統(tǒng)計方法計算表達水平的顯著誘導或減少；使用0.05或更小的p值。所疫療法的基礎。實施例1使用以上所述的mRNA定量方法來定量在施加或不施加由熱聚集性IgG(HAG)所引起的離體刺激下的全部類型的TNF超家族mRNA,其中使用所述的熱聚集性IgG作為免疫復合物刺激模型(見Ostreiko等，Productionandcharacterizationofheat-aggregatedIgGcomplexeswithpredeterminedmolecularmasses:light-scatteringstudy,ImmunolLett1987;15:311-6)。當與革巴細J包結合的IgG分子以高親和力結合至白細胞上的Fc受體時，免疫復合物形成，導致Fc受體交聯(lián)及白細胞活化信號產生。三份等分試樣的每份50jiL的肝素化全血與200嗎/mLHAG在37。C溫育2小時。隨后如上所述，將血液樣品施加至96孔濾板以捕獲白細胞，并轉移細胞裂解物至96孔寡(dT)固定化的微量培養(yǎng)板以分離poly(A)+mRNA。cDNA在微量培養(yǎng)板上合成并通過監(jiān)視SYBR綠色熒光而用于384孔平板內的實時聚合酶《連式反應(PCR)(見Morrison等,Quantificationoflow-copytranscriptsbycontinuousSYBRGreenImonitoringduringamplification,Biotechniques1998;24:954-8,960，96)。簡而言之，如此實施SYBRGreenPCR，即通過在水中稀釋cDNA3-4倍，并直接轉移4^cDNA溶液至384孔PCR平板內，向384孔PCR平板內施力口5jil主混合物(BioRad,Hercules,CA)和1pi寡核苷酸混合物(每種正向引物和反向引物15[iM),并在PRISM7900HT(ABI)內實施PCR，在95。C下10分鐘1個循環(huán)，隨后是45個循環(huán)95。C下30秒和、60。C下1分鐘。每種基因在獨立的孔內擴增。Ct用分析軟件(SDS,ABI)測定。仔細優(yōu)化PCR條件，以至在解鏈曲線分析上檢測到單個適宜的峰，無任何引物二聚體。為—驗^正分析條件，合成RNA34添加至裂解緩沖液內，并且這種RNA34也通過實時PCR定量。引物的序列特異性通過blast分析證實(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)。設定Ct等同于產生一定量PCR產物的PCR循環(huán)，并且△Ct(ACt)還通過從受刺激樣品的Ct值中扣除未刺激樣品的Ct值加以計算。由于Ct是對數(shù)標度，1ACt意指2倍或1.5倍量，并且負ACt指示表達增加。結果示于圖1A和圖1B。在所述附圖中，通過SYBRGreen實時PCR定量TNFSFmRNA(1-18)和所添加的RNA34對照。ACt值3、2、1、0、-1、-2和-3分別表示1/8、1/4、1/2、0、2、4、8倍增加。在圖1A中，每個符號是來自每一個體的平均值。o符號表示顯著增加(p<0.05)，而A符號表示顯著減少(p<0.05)并且X表示沒有變化。圖1B顯示在連續(xù)2日內使用相同的個體，重復分析2次的結果。符號是來自每一個體的平均數(shù)±標準差。分別為^TNFSF-2(TNFa)，▲:TNFSF-8，:TNFSF-15。實線是其中兩個數(shù)據(jù)集合相同的線。虛線表示土0.5ACt。該技術能夠檢測在血液白細胞內TNP超家族mRNA的全部成員的基礎水平。如圖1A中所示，鑒定當全血暴露于HAG時顯著誘導TNF超家族mRNA。雖然存在巨大的個體對個體變異，優(yōu)勢的TNF超家族mRNA是TNF超家族亞型2(TNFa)、8和15。這些mRNA分別在80%(12/15)、73%(11/15)和60%(9/15)的受測試個體內表現(xiàn)HAG誘導性應答。TNF超家族亞型1、3、4、6(即FasL)、7、9、10(即TRAIL)、14和18mRNA在至少一個受測試個體內表現(xiàn)HAG誘導性應答。TNF超家族亞型5、11、12、13和13BmRNA在任何受測試個體內均不表現(xiàn)HAG誘導性應答。TNF超家族亞型2、8和15中的至少一種在每名受測試個體內因暴露于HAG而誘導。例如，不表現(xiàn)HAG誘導性TNF超家族亞型2應答的3名個體均表現(xiàn)亞型15應答，而不表現(xiàn)HAG誘導性TNF超家族亞型15應答的6名個體均表現(xiàn)亞型2應答。其中TNF超家族亞型8不表現(xiàn)HAG誘導性應答的4名個體的確表現(xiàn)亞型2應答或亞型15應答。如圖1A中所示，所添加RNA34對照的ACt完全在士0.5內。為了進一步驗證這些實驗，血液樣品在連續(xù)2日內從相同個體中釆耳又兩次。如圖1B中所示，對于TNF超家族亞型2、8、15和RNA34的值以±0.5標準差內可重復。三份全血等分試樣內的變異也小于0.5ACt(圖1B，每種符號內的X-Y軸(bar))。本方法可以按如下方式在實施例內應用。分析從接受手術摘除或活組織檢查的哺乳動物患者中所取出癌標本的IgG沉積、單核白細胞浸潤和在癌細胞上表達的TNF-R超家族亞型的類型。隨后從相同個體中獲得血液樣品并對其分析以確定哪種類型的TNF超家族mRNA由HAG刺激而誘導并到達何種程度。將個體分成其中誘導的TNF超家族和表達的TNF-R相匹配的組以及其中它們不相匹配的組。在這兩組中臨床結果的比較結果表明匹配的組表現(xiàn)預后的較低嚴重性。如果癌塊小，如早期的不可見轉移性損害，適宜的TNF超家族介導性免疫系統(tǒng)攻擊可能足以防止癌復發(fā)。所比較的臨床結果因此應當包括緩解的時間長度和復發(fā)(轉移)的頻率。實施例2TNF-R超家族mRNA和TNF超家族mRNA的DNA序列從GenBank下載，如表1內所示，并且在下文表2內所示的引物序列通過PrimerExpress(AppliedBiosystems)和HYBsimulator(RNAture)i殳計。在多種轉錄物之間的共有區(qū)域內設計這些序列，如果此類變體存在。在無cDNA下，無擴增發(fā)生(無引物二聚體)并且在解鏈曲線分析中檢測到單峰。表2:所用的引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>每種mRNA的量通過以上所述的方法在^L如下調整時加以測定。簡而言之，大約125mg冰凍的癌標本與以1%2-巰基乙醇(BioRad)、0.5mg/mL蛋白酶K(Pierce)、0.1mg/mL鮭精DNA(5PrimeEppendorf/Brink腿n)、0.1mg/mL大腸桿菌tRNA(Sigma)、10mM每種TNF-R超家族亞型特異性反向引物和作為外來對照的10個分子/mL合成RNA34補充的1mL裂解緩沖液混合，并通過Polytron(Brinlanann)進行勻漿。施加70|iL這些裂解物至用于mRNA純化的寡(dT)固定化微量培養(yǎng)板(GenePlate，RNAture)。在4。C溫育過夜后，微量培養(yǎng)板在4。C用100^iL空白裂解緩沖液洗滌3次并隨后用150洗滌緩沖液(0.5mol/LNaCl、10mmol/LTris、pH7.4、1mmol/LEDTA)洗滌3次。通過添加30)iL含有1xRT-緩沖液(50mMKC1、10mMTris-HCL、pH8.3、5.5mmol/LMgCl2,無二碌^蘇糖醇)緩沖液、每種三磷酸脫氧核苷1.25mM、4單位rRNA酶抑制劑和80U的MMLV逆轉錄酶(Promega;無引物)并在37。C溫育2小時直接在每孔內合成cDNA。將100pL水添加至30^L這些cDNA內并將4cDNA轉移至384孔PCR平板內，其中向所述PCR平板施加5pLTaqSYBR主混合物(BioRad)和1jiL引物的混合物(每種正向引物和反向引物10拜ol/L)，并且在PRISM7900HT(AppliedBiosystems)內實施PCR，在95。C下IO分鐘1個循環(huán)，隨后是45個循環(huán)95。C下30秒和60。C下1分鐘。每種基因在獨立孔內擴增。用分析軟件(SDS;AppliedBiosystems)測定循環(huán)閾值(Ct),即產生一定量的PCR產物(熒光)的循環(huán)。在無cDNA下，證實無擴增(無引物二聚體)并且在解鏈曲線分析中檢測到單峰。為了在20個不同mRNA間比較多個樣品，對每個Ct扣減來自相同樣品的TNFRSF1A的Ct(ACt，Y-軸)。正Ct意指比TNFRSF1A更低的表達，并且1ACt意指1.5倍表達。每種符號代表來自單個標本的平均值。圖2中每一列的左側(。)顯示來自包括結腸、肝臟、胃、子宮的腺癌樣品及3個乳腺癌病例(O樣品以及黑素瘤樣品的結果。右側(A)顯示來自鱗狀細胞癌的結果，包括肺癌、咽癌、舌癌和頸癌(cervicalcancer)樣品。對于分析由抗人T細胞受體(TCR)單克隆抗體在肝素化全血內誘導的TNF超家族mRNA,分析結杲示于圖3內，60|iL全血在37。C用5嗎/mL抗TCRa/卩或對照IgG僅刺激2小時，重復三份。如上所述，施加50(iL血液樣品至濾板內以捕獲白細胞，隨后通過添加裂解緩沖液在膜內進行裂解。如上所述實施poly(A)+mRNA的純化、cDNA合成和實時PCR。通過從抗TCRa/卩的Ct中扣減對照IgG的Ct值計算ACt。每種符號代表來自單一個體三次重復的血液等分試樣的平均ACt。還定量作為外來對照而添加至裂解緩沖液內的合成RNA34以驗證每個分析。使用分析軟件(SDS，AppliedBiosystems)確定循環(huán)閾值(Ct),即產生一定量的PCR產物(焚光)的PCR循環(huán)。雖然DNA芯片技術(見Schena等，QuantitativemonitoringofgeneexpressionpatternswithacomplementaryDNAmicroarray，Science1995;270:467-70)能夠同時分析眾多基因，但是該技術缺少精確定量的能力，并通常需要多于3倍的增加作為有意義的結果。相反，以上所述的DNA定量技術通過考慮每一樣品內的RNA回收效率和cDNA合成效率而提供更精確的定量，并且可以檢測到統(tǒng)計顯著的微小如150%(1.5倍)一樣的變化。因此，如上所述，通過SYBRGreen實時PCR(見Morrison等，Quantificationoflow-copytranscriptsbycontinuousSYBRGreenImonitoringduringamplification,Biotechniques1998;24:954-8,960,96)分析由本方法所制備的每種cDNA中的每種mRNA。圖2顯示在各種癌(結腸癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、子宮癌、黑素瘤、肺癌、咽癌、舌癌和子宮頸癌)內TNF-R超家族mRNA表達的結果。為了在20個不同mRNA間比較多個樣品，從每個觀察到的Ct(ACt,Y-軸)中扣減來自相同樣品TNF-R超家族亞型1A的Ct。正Ct意指比TNFR超家族亞型1A更低的表達水平，并且1ACt意指1.5倍表達水平。如圖2中所示，幾乎全部癌組織表達高水平的TNF-R超家族亞型1A、3、12A和14。這表示如果癌浸潤性白細胞能夠在浸潤部位產生TNF超家族亞型1(即淋巴毒素)(對應于TNF-R超家族亞型3)、TNF超家族亞型2(即TNFa)(對應于TNF-R超家族亞型1A和IB)、TNF超家族亞型12(對應于TNF-R超家族亞型12A)、TNF超家族亞型14(對應于TNF-R超家族亞型14)或這些配體的組合，則可能#~除任意這些類型的癌。雖然在評估的樣品內TNF-R超家族亞型4、5、8、9、11A和11B及17的表達水平非常低(圖2)，不能排除其它樣品可以表達這些受體亞型的可能性。因此，白細胞內TNF超家族亞型4(對應于TKF-R超家族亞型4)、TNF超家族亞型5(即CD40配體)(對應于TNF-R超家族亞型5)、TNF超家族亞型8(即CD30配體)(用于TNF-R超家族亞型8)和TNF超家族亞型13和13B(對應于TNF-R超家族亞型17)的誘導性也可能對癌癥免疫療法是重要的。雖然存在巨大的個體對個體變異，白細胞內TNF超家族亞型6(即Fas配體)(對應于TNF-R超家族亞型6)、TNF超家族亞型7(即CD27配體)(對應于TNF-R超家族亞型7)、TNF超家族亞型11(對應于TNF-R超家族亞型11A和11B)、TNF超家族亞型18(對應于TNF-R超家族亞型18)和TNF超家族亞型15(即DR3的配體)(對應于TNF-R超家族亞型25)的誘導性可能對其中相應受體表達水平高的癌是重要的。盡管在癌內的TNF-R超家族亞型1OAmRNA表現(xiàn)高表達，然而誘何受體TNF-R超家族亞型10B的m認A表達(見Sheridan等，ControlofTRAIL-inducedapoptosisbyafamilyofsignalinganddecoyreceptors.Science1997Aug8;277(5327):818-21和Pan等,Anantagonistdecoyreceptorandadeathdomain-containingreceptorforTRAIL,Science1997Aug8;277(5327):815-8)比TNF-R超家族亞型10A更高。然而，TNF-R超家族亞型10(即TRAIL)仍可能是用于治療某些癌的有用靶。在腺癌/黑素瘤(示于圖2內各列左側)和鱗狀細胞癌(示于圖2內各列右側)之間不存在明顯差異。T-細胞受體(TCR)是識別特定外來的非己分子的細胞毒性T細胞的細胞表面分子。TCR在抗原呈遞的初始步驟以及癌殺傷中的作用是眾所周知的(見例j口Mami-Chouaib，AntitumorcytotoxicT-lymphocyteresponseinhumanlungcarcinoma:identificationofatumor-associatedantigen,ImmunolRev.2002Oct;188:114-21)。雖然細胞免疫學中常見的實驗采用純細胞系統(tǒng)，該系統(tǒng)利用混懸于人工溶液內的分離的細胞，本發(fā)明實施例內所用的mRNA分析法允許鑒定在離體刺激全血后各種mRNA水平的變化。因所述的mRNA分析法比前面的純細胞系統(tǒng)更接近生理狀態(tài)，故本實施例使用在全血內TCR與靶分子相互作用的刺激，其中存在細胞對細胞以及細胞對血漿的相互作用。由于全血含有細胞毒性T細胞和其它類型的白細胞，故TCR特異性地由抗人a/卩TCR小鼠單克隆gGlA("抗TCR，，可從BioLegend獲得)刺激。作為對照，還使用相同濃度純化的小鼠IgGl(也從BioLegend獲得)。60(iL全血在37。C下用5昭/mL抗TCR或或對照IgG僅刺激2小時，重復三份。劑量和溫育時間通過抗TCR對外周血白細胞內TNFSFmRNA表達影響的初步分析加以確定，其中所述初步分析的結果示于圖4A和4B內。就劑量反應和動力學而言，如圖4A中所示，三^^等分試樣的每^分60(iL的肝素化全血與PBS(o)、10)ig/mL(■)或1())ng/mL小鼠抗人a/卩TCRIgGlk混合，或與10(□)嗎/mL或1()嗎/mL純化的小鼠IgGlk混合，并在37。C下溫育0-7小時。隨后如上所述定量TNFSF-2mRNA。就動力學而言，如圖4B中所示，TNFSF-2()、TNFSF-5()、TNFSF-6(△)、TNFSF畫9(□)和TNFSF-14(▲)的ACt通過從各自的Ct值中扣減對照IgG的Ct值進行計算。每個數(shù)據(jù)是來自全血的三份等分試樣的平均數(shù)士標準差。ACt通過從使用抗TCR所獲得的Ct值中扣減使用對照IgG所獲得的Ct值進行計算。如圖3中所示，抗TCR刺激特異性地誘導TNF超家族亞型2、5、6、9、10和14。TNF超家族亞型2和14的結果是特別有意義的，因為這些受體的mRNA表達水平在全部類型的癌中都高(見圖2)。同時類似于耳關合化療，活化多重TNF/TNF-R超家族亞型相關的級聯(lián)可以防止癌細胞的抵抗機制。用添加至裂解緩沖液內的合成RNA34對照獲得的結果顯示出極小變化，小于±0.3△Ct(圖3中的RNA34),表明該測定系統(tǒng)是可靠的。更重要地，TCR應答表現(xiàn)巨大的個體對個體變異，并且分別地，9名個體中的6名(66%)沒有顯示TNF超家族亞型2的抗TCR介導性誘導，以及9名個體中的5名(56%)沒有顯示TNF超家族亞型14的抗TCR介導性誘導。另外，顯示陰性TNF超家族亞型2應答的個體也顯示陰性TNF超家族亞型14應答。然而，這些個體的確顯示其它的陽性TKF超家族配體。實施例3在本實施例中，如實施例1中那樣，利用作為ADCC內所發(fā)現(xiàn)的免疫復合物的模型而廣泛使用的熱聚集性人IgG(HAG)來刺激全血內白細胞的Fc受體。簡而言之，將人IgG(Sigma)以20mg/mL混懸于PBS內并在63。C下加熱20分鐘。將重復三份的60(iL全血在37。C下用200|ig/mLHAG或對照磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)刺激僅2-4小時。HAG的劑量和溫育時間通過初步分析確定，如圖5和圖6中所示。圖5A顯示劑量反應分析的結果。三份等分試樣的每份60的肝素化全血與各種濃度的人IgG(o)或HAG()混合并在37。C下溫育2小時。圖5B顯示動力學的分析結果。三份等分試樣的每份60)iL的肝素化全血與PBS(o)或200mg/mLHAG()混合并在37。C溫育0-12小時。隨后定量TNFSF-I5mRNA。每個數(shù)據(jù)是來自全血的三份等分試樣的平均數(shù)±標準差。圖6顯示重復性分析的結果。血液在1-3日內從相同個體中抽取并定量HAG-誘導的TNFSFmRNA和對照RNA34。符號分別表示o:RNA34,:TNFSF-2，:TNFSF-8和A:TNFSF-15。每個數(shù)據(jù)是來自全血的三份等分試樣的平均數(shù)±標準差。實線是其中兩個數(shù)據(jù)集合相同的線。虛線表示±0.5ACt。如圖7中所示，HAG主要誘導TNF超家族亞型2、8、14、15和18的表達。TNF超家族亞型15的誘導比用抗TCR刺激所獲得的TNF超家族亞型的誘導更高(圖3)。此外，HAG應答表現(xiàn)重大的個體對個體變異。一些個體僅表達TNF超家族亞型15，并且其它個體表達TNF超家族亞型2和8而無TNF超家族亞型15應答。有意義的是全部個體均顯示至少1種TKF超家族應答。添加至裂解緩沖液的對照RNA34的結果顯示小于±0.6ACt的極小變化(圖3中的RNA34)，表明該測定系統(tǒng)是可靠的。為了驗證分析法的重復性，血液在1-3日內從相同個體中抽取二次。不過，結果非常相似，ACt差異小于0.5(圖6)。在使用HAG和抗TCR刺激獨立地檢驗血液的9名個體中，由HAG刺激所誘導的TNF超家族亞型15表達應答與由抗TCR刺激所誘導的TNF超家族亞型2和14表達應答不相關。實施例4在本實施例中，來自數(shù)名個體的全血接受HAG刺激，并且趨化因子組的mRNA水平的變化用如實施例1內所述的相同方式進行評估。使用RNA34和CD4mRNA作為對照。用于待分析趨化因子mRNA的正向引物序列和反向引物序列示于圖8。分析結果示于圖9內。在該圖中，圓圈表示其中特定趨化因子mRNA的水平由HAG刺激顯著誘導的個體。三角形表示在刺激后mRNA水平顯著減少，而X符號表示沒有顯著改變。如可以從圖9中看出，應答在個體間不同，雖然存在共同點例如，全部受測試個體均表現(xiàn)CCL-3和CCL-20;CXCL畫1、CCL-2和CCL-3;以及IL-8和IL-1B的顯著誘導。這些結果表示有可能確定癌癥患者能夠召集更多白細胞至發(fā)病部位的可能性，并且如果在特定趨化因子與特定白細胞群間建立聯(lián)系，則可能使用圖9內所示數(shù)據(jù)，基于所召集白細胞群體與腫瘤細胞之間的TNF/TNF-R匹配分析來評估召集能夠有效對付腫瘤的白細胞群體的可能性。實施例5在本實施例中，評估各種飲食成分如補充物對TNF超家族亞型3mRNA水平的HAG-誘導性變化的影響。"飲食成分"指可由哺乳動物攝取的任何化合物或物質而"飲食補充物"表示用來補充哺乳動物飲食的那些有益飲食成分，如維生素和天然提取物以及其它化學化合物如藥物。因此，"飲食成分"含義更廣泛并包括"飲食補充物"。所用的飲食成分是維生素A(10nM,終濃度)、染料木黃酮(大豆(soy))(100nM)、姜黃色素(辛料姜黃(spiceturmeric))(100nM)和櫟精(植物色素類黃酮)(100nM)。據(jù)報道全部這些飲食成分對免疫系統(tǒng)或癌或同時對二者有影響。已知維生素A可以刺激免疫系統(tǒng)。在某些研究中發(fā)現(xiàn)染料木黃酮具有抗癌活性；其可能的作用機制包括上調凋亡、抑制血管發(fā)生、抑制DNA拓樸異構酶II并抑制蛋白酪氨酸激酶。姜黃色素在癌細胞內具有促凋亡效應(proapoptoticeffects)并干擾在癌細胞內經(jīng)常高度過量表達的轉錄因子NF-kB的活性。已經(jīng)證實櫟精促進大鼠內天然殺傷細胞的活性并抑制肥大細胞、嗜堿性粒細胞和中性粒細胞的脫顆粒。在本實施例中，使用磷酸鹽緩沖鹽水作為對照。肝素化全血與各種飲食補充物在37。C下預溫育1小時(在如上所述的血液濃度上)，隨后用1.2(^L的熱聚集性IgG刺激4小時。血液隨后在37。C溫育2小時，隨后使用實施例1內所述的方法評估TNF超家族亞型3mRNA的水平。引物序列在上文表2內給出。TNF超家族亞型3又稱作淋巴毒素-a(LTa)、腫瘤壞死因子-P(TNF-卩)和淋巴毒素-P(LT(3)。分泌的LTa組裝成可溶性同三聚體LTa3。分泌的LTa還與膜結合的LT(3復合以產生兩個類型的異三聚體LTa1/(3和LTa2/卩1。亞型3由活化的天然CD4細胞、非極化的分泌IL-2的效應細胞和Thl效應細胞表達，并且亞型3特異性受體由某些腫瘤細胞表達。結果示于圖10內。在圖10中，空心圓圈表用PBS對照所獲得的TNF超家族亞型3值。而實心圓圈表示使用HAG刺激物時所獲得的亞型3值。亞型3mRNA的基礎水平不因飲食補充物的預處理而變化(空心圓圏)。然而，該結果顯示HAG導致顯箸誘導暴露于櫟精的血液內的TNF超家族亞型3表達(p=0.03)。如果該個體也具有表達適宜TNF-R亞型(亞型3)的腫瘤細胞，則該基因表達的增加可以增加腫瘤細胞凋亡，因此，櫟精將是包含在具有抗癌特性的用于該個體的飲食內的優(yōu)良候選者。圖10內的Y-軸值表示循環(huán)閾值(Ct)。每個數(shù)據(jù)是來自50mL肝素化的全血的三份等分試樣的平均數(shù)士標準差。本領域技術人員將認識到還有可能篩選藥物和其它化學性化合物以類似地影響特定TNF超家族亞型或趨化因子的表達，因此本實施例的系統(tǒng)可以廣泛用于篩選用于在特定個體內發(fā)動抗癌免疫應答的物質。通過病理學檢驗經(jīng)常在手術切除的組織標本內觀察到癌浸潤性白細胞。然而，這些發(fā)現(xiàn)對患者而言并不總是毫無疑問的良好征兆有時候癌癥進展甚至在白細胞浸潤存在時發(fā)生。當該現(xiàn)象發(fā)生時，病理學家往往疑惑不解。本發(fā)明的實施方式還提供對此項技術的進一步改良在癌細胞內的TNF-R超家族亞型與在浸潤性白細胞內的TNF超家族亞型的匹配可能是良好的預后征兆，尤其當趨化因子誘導也得到證實時。浸潤性白細胞的病理學分析難以解釋，因為我們不知道每種白細胞是否遭遇癌細胞并且TNF超家族級聯(lián)是否被活化。定量的基線TNF超家族mRNA水平也難以解釋。相反，本發(fā)明的實施方式使用在抗TCR或HAG刺激后，對TNF超家族mRNA亞型表達的功能性變化的分析。由于浸潤性白細胞來自血流，本發(fā)明實施方式的離體功能性分析將成為有用工具用于在癌癥患者及在患有如自身免疫疾病、炎癥、移植等的其它疾病的患者內，就診斷監(jiān)視、治療監(jiān)視、預后標記和對有效免疫調節(jié)藥物、基于單克隆抗體的藥物、基因療法及疫苗鑒定方面分析免疫功能。該分析法筒單且接近生理條件(2-4小時溫育不分離白細胞的全血)、有統(tǒng)計分析意義地精確(全血的三份等分試樣作為原材料)和敏感(60)LiL全血足以用于全部17種TNF超家族亞型mRNA定量)。由于全血的三份等分試樣之間的mRNA數(shù)據(jù)變異極小，因此該分析法允許鑒定在很多情況下如0.5-1.0ACt那樣小的基因表達的顯著改變，這遠優(yōu)于基于DNA芯片的方法學或常規(guī)的實時PCR。NK細胞或細胞毒性T-細胞的數(shù)目可以通過流式細胞分析或免疫組織化學染色定量，其中每一細胞群體通過特定的細胞表面標記鑒定。然而，不清楚這些標記陽性細胞是否在分析時具有預期的功能。雖然本實施例的方法不鑒定具有每種TNF超家族亞型mRNA的刺激應答的特定細胞群體，該方法顯示整體的功能，這對理解單個的人有用。所獲得1-3日內顯示良好的重復性(圖6)，該應答也可以經(jīng)過長時間并因施飲食補充物和鍛煉而變化，這表明涉及到非遺傳因素。因此本實施例的方法代表未來個性化癌癥免疫療法的前進方向。這類個性化癌癥免疫療法將基于增加血液白細胞內適宜TNF超家族亞型的表達以及通過適宜的趨化因子信號作用召集亞型特異性白細胞。以上所述的實施例的系統(tǒng)和方法將用于藥物篩選、驗證和臨床試驗。此外，相同系統(tǒng)可以可應用于自身免疫疾病，其中抑制適宜的TNF超家族是用藥目的。城市中大量提供適度裝備的警察僅在這些警察派往犯罪現(xiàn)場時才有意義的。如果警官遭遇一伙罪犯，他或她的主要任務是呼喚幫助以引導更多同事至現(xiàn)場，而不是盡量只身逮捕罪犯。對于細胞毒性T-細胞而言，這種行為可能相當于釋放趨化因子如CCL和CXCL趨化因子和白細胞介素(IL)(序列可從GenBank和UniGene獲得)。因此，監(jiān)視外周血白細胞內CCL、CXCL和IL也是重要。類似于警察調度員，腫瘤學家能夠通過監(jiān)視外周血內每個患者自身免疫細胞的供應而組織患者自身的免疫細胞。權利要求1.測定哺乳動物內腫瘤疾病預后的可能嚴重性的方法，該方法包括測定來自哺乳動物的全血第一樣品內多種腫瘤壞死因子(TNF)超家族亞型的表達水平；使哺乳動物的全血第二樣品暴露于活化全血內T-細胞的刺激物；測定第二樣品內的多種腫瘤壞死因子(TNF)超家族亞型的表達水平；鑒定在所述的第一樣品和第二樣品之間顯示在所述全血內表達水平顯著改變的亞型；并且當已鑒定的TNF超家族亞型與哺乳動物瘤細胞內表達的特定腫瘤壞死因子受體(TNF-R)超家族亞型相對應時，確定預后可能較低的嚴重性。2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，瘤組織內表達的TNF-R超家族亞型選自由TNF-R超家族亞型1A、3、12A和14所組成的組中。3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，瘤組織內表達的TNF-R超家族亞型得到鑒定。4.根據(jù)權利要求3所述的方法，其中，瘤組織內表達的TNF-R超家族亞型采用選自由下列所組成的組中的方法鑒定免疫染色、原位雜交、原位聚合酶鏈式反應和體外聚合酶鏈式反應。5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，暴露全血包括添加肝素。6.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述刺激物選自由熱聚集性人IgG和抗人a/pT-細胞受體單克隆IgG所組成的組中。7.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，由發(fā)病細胞表達的腫瘤壞死因子受體超家族亞型選自由下列所組成的組中TNF-R超家族亞型1A、1B、3、4、5、6、7、8、9、IOA、IOB、IOC、IOD、IIA、IIB、12A、14、17、18和25。8.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述表達于所述已被暴露的全血內的肺瘤壞死因子超家族mRNA亞型選自由下列所組成的組中TNF超家族亞型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、13B、14、15和18。9.根據(jù)權利要求1所述的方法，該方法還包括測定來自哺乳動物的全血第三樣品內多種趨化因子的表達水平；使哺乳動物的全血第四樣品暴露于活化全血內T-細胞的刺激物；測定第四樣品內多種趨化因子的表達水平；當鑒定在所述的第三樣品和第四樣品之間顯示在所述全血內表達水平顯著改變的趨化因子時，確定預后可能較低的嚴重性。10.根據(jù)權利要求9所述的方法，其中，所述的趨化因子選自由下列所組成的組中CCX1、CCL2、CCX3、CCX4、CCL5、CCX6、CCX7、CCL8、CCL9、CCU0、CCXll、CCL12、CCL13、CCU4、CCL15、CCU6、CCU7、CCL18、CCL19、CCX20、CCX21、CCX22、CCX23、CCL24、C(X25、C(X26、CCX27、CCL28、CXCU、CXCL2、CX(X3、CXCL4、CXCL5、CXCX6、CXCU7、CXCL9、CXCUO、CXCLll、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL16、IL1B、IL5、IL6、IL8、IL12A、IL12B、IL15和IL16。11.測定飲食成分用于治療哺乳動物內腫瘤疾病的可能效用的方法，該方法包括獲得哺乳動物的全血第一樣品；使哺乳動物的全血第二樣品暴露于飲食成分；使哺乳動物的全血第一樣品和第二樣品暴露于活化全血內T-細胞的刺激物；測定來自哺乳動物的全血第一樣品和第二樣品內多種腫瘤壞死因子(TNF)超家族亞型的表達水平；鑒定在所述的第一樣品和第二樣品之間顯示在所述全血內表達水平顯著改變的亞型；以及當已鑒定的TNF超家族亞型對應于表達在哺乳動物瘤細胞內的特定TNF-R超家族亞型時，確定所述飲食成分可能具有用于治療腫瘤疾病的功用。12.根據(jù)權利要求11所述的方法，其中，使第一樣品在暴露于活化全血內T-細胞的刺激物之前暴露于對照刺激物。13.根據(jù)權利要求11所述的方法，其中，瘤組織內表達的TNF-R超家族亞型選自由TNF-R超家族亞型1A、3、12A和14所組成的組中。14.根據(jù)權利要求11所述的方法，其中，瘤組織內表達的TNF-R超家族亞型得到鑒定。15.根據(jù)權利要求14所述的方法，其中，瘤組織內表達的TNF-R超家族亞型采用選自由下列所組成的組中的方法鑒定免疫染色、原位雜交、原位聚合酶鏈式反應和體外聚合酶鏈式反應。全文摘要腫瘤壞死因子(TNF)能夠通過與癌細胞表面上的特異性TNF受體相互作用而誘導凋亡。因為TNF配體和受體的多種成員存在于每個超家族內，故存在超過300種不同的配體-受體組合?；罨难喊准毎a生TNF作為抗癌免疫應答的部分，并產生趨化因子以吸引其它白細胞至癌癥部位。本發(fā)明公開了使全血暴露于熱聚集性人IgG或抗T-細胞受體抗體而作為免疫系統(tǒng)相互作用的模型時，檢測血液白細胞內多種TNF超家族亞型和趨化因子mRNA的顯著誘導作用的方法。觀察到在誘導的TNF亞型和趨化因子方面?zhèn)€體之間的重大差異。因為外周血液白細胞是抗癌免疫細胞的來源，定量血液內適宜TNF配體和趨化因子的離體誘導性將用于個體化癌癥免疫治療中。如果癌塊小，如早期不可見的轉移性損害，適宜的TNF攻擊可以足以防止復發(fā)。文檔編號C12Q1/70GK101194027SQ200680020298公開日2008年6月4日申請日期2006年6月8日優(yōu)先權日2005年6月8日發(fā)明者三橋將人申請人:日立化成研究中心公司;日立化成工業(yè)株式會社