專利名稱：皂草苷分解酶及其基因以及大豆皂草精醇b的大量生產(chǎn)系統(tǒng)的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及新型的皂草苷分解酶及其基因以及使用它們生產(chǎn)大豆皂草精醇B的新方法。
背景技術：
大豆皂草精醇B(12-齊墩果烷-3，22，24-三醇)是豆科植物中含有的皂草苷類的糖苷配基之一，一直以來報道了它的各種生理活性。例如，報道了血小板凝集抑制作用、抗補體活性、預防和治療胃炎、風濕病、全身性紅斑狼瘡等免疫疾病、自身免疫疾病或血栓病的作用(Chem.Pharm.Bull.24，121-129，1976、Chem.Pharm.Bull.30，2294-2297，1982、化學和生物21224-232，1983、特開昭61-37749號)。還報道了對來自人結腸癌和人卵巢癌細胞增殖的抑制作用(特開昭61-37749號、特開平10-234396號)。
作為生產(chǎn)大豆皂草精醇B的方法，例如有將大豆種子中以苷狀態(tài)含有的皂草苷類(大豆皂草苷I-V)的糖鏈進行化學水解的方法。但是這種方法因酸解的條件而產(chǎn)生很多副產(chǎn)物，效率不高。另外，已知大豆種子還含有以大豆皂草精醇A(大豆皂草苷A1-A6)和大豆皂草精醇E作為糖苷配基的皂草苷類。因此從大豆中獲得大豆皂草精醇B時，容易夾雜大豆皂草精醇A和大豆皂草精醇E，從其中只純化大豆皂草精醇B是很困難的。另外，大豆種子中含有的皂草苷的比例通常約為0.2％(藥學雜志104，162-168，1984)，由于太少，因此需要更有效的生產(chǎn)方法。
作為使用微生物生產(chǎn)大豆皂草精醇B的方法，例如已知使用鏈霉菌屬(Streptomyces)(Chem.Pharm.Bull.32，1287-1293，1984)和青霉屬(Penicillium)(特開平10-234396號)的方法。但是使用這些微生物時，大豆皂草精醇B的生產(chǎn)性低、并不具實際應用性。
有報道指出在使用曲霉屬(Aspergillus)微生物產(chǎn)生的酶(葡糖醛酸糖苷酶)或含有該酶的培養(yǎng)物水解葡糖苷酸皂草苷類，生產(chǎn)以葡糖醛酸作為還原末端的酸性寡糖的方法中，作為副產(chǎn)物，可獲得大豆皂草精醇B(特公平7-32714號)。但是，該方法是酸性寡糖的生產(chǎn)方法，該報道中只是定性地確定了大豆皂草精醇B。該報道中雖然明確了具有目標活性的酶的分子量，但并未闡明其氨基酸序列。
另一方面，本發(fā)明人調(diào)查了可有選擇地水解以大豆皂草精醇B為糖苷配基的苷，高效生產(chǎn)大豆皂草精醇B的微生物，結果發(fā)現(xiàn)了屬于新赤殼屬(Neocosmospora)或正青霉屬(Eupenicillium)的絲狀菌。發(fā)現(xiàn)將屬于新赤殼屬或正青霉屬的絲狀菌在含有皂草苷類(以大豆皂草精醇B為糖苷配基的苷)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，大豆皂草精醇B在培養(yǎng)物中被高濃度生產(chǎn)、蓄積(參照國際公開WO01/81612號)。
這樣的絲狀真菌例如有新赤殼屬的侵菅新赤殼侵菅變種PF1225菌株(Neocosmospora vasinfecta var.vasinfecta PF1225)、正青霉屬的Eupenicillium brefeldianum PF1226菌株(參照國際公開WO01/81612號)。
通過直接利用這些菌類，可以與培養(yǎng)基中添加的皂草苷類的量呈相關性地生產(chǎn)目標物質(zhì)大豆皂草精醇B，但由于皂草苷類具表面活性作用，容易起泡，因此可添加到培養(yǎng)基中的皂草苷類的量受到限制。另外，可以預見添加了皂草苷類的培養(yǎng)物由于其表面活性作用而粘性增高。因此由該培養(yǎng)物生產(chǎn)目標物質(zhì)時，為了提高回收率，需要多次重復提取操作。通常采用大豆提取物作為可有效地提供皂草苷類的天然資源，但該大豆提取物中除了皂草苷類以外，通常還含有例如油脂、蛋白質(zhì)和多糖類等成分。因此，可添加到培養(yǎng)基中的皂草苷類的量最終與大豆提取物的純度相關，高效的生產(chǎn)未必是件容易的事情。
作為不象傳統(tǒng)的方法依賴大豆提取物中的皂草苷含量，卻可有效地生成大豆皂草精醇B并保持高回收率的方法，需采取用皂草苷分解酶進行酶反應的大量生產(chǎn)大豆皂草精醇B的方法。
發(fā)明概要本發(fā)明人成功地從具有皂草苷分解活性的微生物中分離純化出具有皂草苷分解活性的蛋白質(zhì)(以下稱為“皂草苷分解酶”)，并鑒別了編碼該蛋白質(zhì)的基因。本發(fā)明人還使用得到的基因，使其在不同的宿主中表達，獲得了高活性的皂草苷分解酶。并進一步使用該獲得的皂草苷分解酶進行酶反應，高效地生產(chǎn)了大豆皂草精醇B。本發(fā)明基于上述認識而完成。
本發(fā)明的目的在于提供具有皂草苷分解活性的蛋白質(zhì)，具體地說，是可分解以大豆皂草精醇B為糖苷配基的苷而生產(chǎn)大豆皂草精醇B的蛋白質(zhì)；編碼這樣的蛋白質(zhì)的多核苷酸；以及可使用它們大量生產(chǎn)大豆皂草精醇B的方法。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)選自下述各項(a)含有選自SEQ ID NO.2、4和6所示氨基酸序列的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(b)含有與包含上述(a)的氨基酸序列的蛋白質(zhì)具有至少50％同源性的氨基酸序列，且具皂草苷分解活性的蛋白質(zhì)；或(c)含有上述(a)的氨基酸序列中缺失、置換、插入或添加1個或多個氨基酸殘基的氨基酸序列，且具皂草苷分解活性的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的多核苷酸選自下述各項(i)由選自SEQ ID NO.1、3和5所示堿基序列的堿基序列構成的多核苷酸；(ii)由與上述(i)的堿基序列構成的多核苷酸具有至少70％同源性的堿基序列構成，且編碼具皂草苷分解活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；(iii)由上述(i)的堿基序列中缺失、置換、插入或添加1個或多個堿基的堿基序列構成，且編碼具皂草苷分解活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；和
(iv)與上述(i)的堿基序列構成的多核苷酸在嚴格條件下雜交，且編碼具皂草苷分解活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
本發(fā)明的重組載體中包含本發(fā)明的多核苷酸。
本發(fā)明的宿主是由上述重組載體轉(zhuǎn)化的宿主。
本發(fā)明的目標蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法包括培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化宿主，從得到的培養(yǎng)物中收集具皂草苷分解活性的蛋白質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明，可獲得高活性的皂草苷分解酶。另外，使用該酶可以大量且高效地從皂草苷獲得大豆皂草精醇B。根據(jù)該方法，可以不依賴于例如大豆提取物中的皂草苷含量而獲得大豆皂草精醇B。
附圖簡述

圖1表示質(zhì)粒pCB-SBe的結構和限制性酶切圖。
圖2表示實施例5的重組皂草苷分解酶的最適pH結果。圖中，野生型SDN是指來自侵菅新赤殼侵菅變種PF1225菌株的皂草苷分解酶，重組型SDN是指重組皂草苷分解酶。
圖3表示實施例5的重組皂草苷分解酶的最適溫度的結果。圖中，野生型SDN是指來自侵菅新赤殼侵菅變種PF1225菌株的皂草苷分解酶，重組型SDN是指重組皂草苷分解酶。
圖4表示質(zhì)粒pCB-SDAe的結構和限制性酶切圖。
圖5表示實施例8的重組皂草苷分解酶的最適pH的結果。圖中，野生型SDA是指來自曲霉屬種名待定PF1224菌株(Aspergillus sp.PF1224)的皂草苷分解酶，重組型SDA是指重組皂草苷分解酶。
圖6表示實施例8的重組皂草苷分解酶的最適溫度的結果。圖中，野生型SDA是指來自曲霉屬種名待定PF1224菌株的皂草苷分解酶，重組型SDA是指重組皂草苷分解酶。
圖7表示質(zhì)粒pCB-SDEs的結構和限制性酶切圖。
圖8表示實施例12的重組皂草苷分解酶的最適pH的結果。圖中，野生型SDE是指來自Eupenicillium brefeldianum PF1226的皂草苷分解酶，重組型SDE是指重組皂草苷分解酶。
圖9表示實施例12的重組皂草苷分解酶的最適溫度的結果。圖中，野生型SDE是指來自Eupenicillium brefeldianum PF1226的皂草苷分解酶，重組型SDE是指重組皂草苷分解酶。
圖10表示比較SDN、SDA和SDE的同源性的結果。
發(fā)明詳述微生物保藏侵菅新赤殼侵菅變種PF1225菌株于2000年3月13日(原保藏日)保藏在獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術綜合研究所特許生物寄托中心(305-5466日本國茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6)。保藏號為FERMBP-7475。
Eupenicillium brefeldianum PF1226于2000年3月13日(原保藏日)保藏在獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術綜合研究所特許生物寄托中心(305-5466日本國茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6)。保藏號為FERMBP-7476。
曲霉屬種名待定PF1224菌株于2001年5月24日保藏在獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術綜合研究所特許生物寄托中心(305-5466日本國茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6)。保藏號為FERM BP-8004。
綠色木霉MC300-1菌株(Trichoderma viride MC300-1)于1996年9月9日(原保藏日)保藏在獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術綜合研究所特許生物寄托中心(305-5466日本國茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6)。
保藏號為FERM BP-6047。
具皂草苷分解活性的蛋白質(zhì)從侵菅新赤殼侵菅變種PF1225菌株(FERM BP-7475)中分離、純化的皂草苷分解酶與迄今已知的任何一種皂草苷分解酶都不具有同源性，與來自分解葡糖苷酸皂草苷類的曲霉屬微生物產(chǎn)生的葡糖醛酸糖苷酶(由特公平7-32714號記載的分子量35,000和45,000的亞基構成的約158,000的糖蛋白)的亞基結構和分子量不同，因而可確認其為新型的酶系。
進一步對本發(fā)明的蛋白質(zhì)和上述公報公開的葡糖醛酸糖苷酶的同一性和相似性進行了研究。由于難以獲得該公報記載的曲霉屬微生物，使用其他曲霉屬微生物進行了研究。通過下述微生物學性狀鑒定所使用的曲霉屬種名待定PF1224菌株為半知菌綱曲霉屬(DeuteromycetesAspergillus)的絲狀菌。
(1)菌落特性在Czapek酵母提取物瓊脂培養(yǎng)基上生長良好，在25℃下培養(yǎng)7天，菌落直徑達到80mm。呈黃色～黃綠色、羊毛狀菌落，大量形成分生孢子、菌核。背面呈淡褐色。在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上生長良好，在25℃下培養(yǎng)7天，菌落直徑達到80mm。呈黃色～黃綠色、羊毛狀菌落，大量形成分生孢子、菌核。背面呈土黃色。在37℃下培養(yǎng)時，其生長在兩種培養(yǎng)基上都稍受抑制。
(2)形態(tài)學特性分生孢子頭呈黃色～黃綠色、放射狀～近圓柱形狀。分生孢子梗表面粗糙、無色，泡囊為棒形～近球形，幾乎全部形成曲霉。曲霉為單列、雙列混雜，通常為雙列。梗基8～12×4～5μm，瓶梗為8～12×3～4μm。分生孢子呈球形～近球形、表面光滑，為4～6μm。
使用曲霉屬種名待定PF1224菌株鑒定被稱為葡糖醛酸糖苷酶的酶時，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)從曲霉屬種名待定PF1224菌株分離、純化的皂草苷分解酶的分子量為90kDa、最適pH5-6、最適溫度為45-50℃(參照參考例)。
還鑒定了從Eupenicillium brefeldianum PF1226分離、純化的皂草苷分解酶的分子量為90kDa、最適pH5-6、最適溫度為45-50℃。
上述公報中未公開葡糖醛酸糖苷酶的氨基酸序列等信息，無法比較氨基酸序列的同源性，因此，由蛋白質(zhì)的分子量和亞基結構進行了比較判斷。結果表明本發(fā)明的蛋白質(zhì)是與上述公報記載的葡糖醛酸糖苷酶不同的蛋白質(zhì)。
如上所述，根據(jù)本發(fā)明，可提供選自下述的蛋白質(zhì)。
(a)含有選自SEQ ID NO.2、4和6所示氨基酸序列的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(b)含有與包含上述(a)的氨基酸序列的蛋白質(zhì)具有至少50％同源性的氨基酸序列，且具皂草苷分解活性的蛋白質(zhì)；或(c)含有上述(a)的氨基酸序列中缺失、置換、插入或添加1個或多個氨基酸殘基的氨基酸序列，且具皂草苷分解活性的蛋白質(zhì)。
即，本發(fā)明的蛋白質(zhì)是含有與SEQ ID NO.2、4或6所示氨基酸序列同一或?qū)嵸|(zhì)上同一的氨基酸序列而構成的蛋白質(zhì)。
這里，與SEQ ID NO.2、4或6所示氨基酸序列實質(zhì)上同一的氨基酸序列是指與這些SEQ ID NO.所示的任一種氨基酸序列的同源性典型地為50％以上，優(yōu)選70％以上，更優(yōu)選80％以上，進一步優(yōu)選90％以上，更進一步優(yōu)選95％以上，最優(yōu)選98％以上的氨基酸序列。
本說明書中所示的這些同源性的數(shù)值均是采用本領域技術人員公知的同源性搜索程序計算的數(shù)值，例如在FASTA、BLAST等中，通過使用缺省值(初始設定)的參數(shù)可以容易地計算。
例如同源性搜索程序Genetyx(Genetyx公司出品)中，使用缺省值的參數(shù)計算的同源性的數(shù)值分別為SDN和SDA之間的同源性為51％，SDA和SDE之間的同源性為52％，SDE和SDN之間的同源性為51％。
含有與SEQ ID NO.2、4或6所示氨基酸序列實質(zhì)上同一的氨基酸序列而構成的蛋白質(zhì)是指包含在任何這些氨基酸序列中缺失、置換、插入或添加1個或多個氨基酸殘基的氨基酸序列、且具有皂草苷分解活性的蛋白質(zhì)。
這里，可缺失、置換、插入或添加的氨基酸殘基的數(shù)量優(yōu)選為1-50個、更優(yōu)選1-30個、進一步優(yōu)選1-10個、更進一步優(yōu)選1-5個、最優(yōu)選1-2個。
本發(fā)明的一個更優(yōu)選的實施方案中，上述(b)的蛋白質(zhì)是由在上述氨基酸序列(a)中的1個或多個氨基酸殘基被保守性置換的氨基酸序列構成、且具有皂草苷分解活性的蛋白質(zhì)。
這里的“保守性置換”是指不實質(zhì)性地改變蛋白質(zhì)的活性，將1個或多個氨基酸殘基用其它的化學性質(zhì)相似的氨基酸殘基置換。例如有某個疏水性殘基被其它疏水性殘基置換的情況、某個極性殘基被具有相同電荷的其它極性殘基置換的情況等?？梢赃M行這種保守性置換的功能相似的各種氨基酸都是本領域公知的。例舉具體的例子，非極性(疏水性)氨基酸有丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸等。極性(中性)氨基酸有甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等。帶正電荷(堿性)的氨基酸有精氨酸、組氨酸、賴氨酸等。另外，帶負電荷(酸性)的氨基酸有天冬氨酸、谷氨酸等。
本發(fā)明中，“具有皂草苷分解活性的蛋白質(zhì)”是指可分解皂草苷的活性得到本領域人員證實的蛋白質(zhì)，例如是指在與實施例5同樣的條件下測定時，其皂草苷分解活性得到證實的蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)可從后述的“具皂草苷分解活性的生物”中分離、純化。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)例如可如下獲得。
培養(yǎng)具有皂草苷分解活性的生物，以皂草苷分解活性為指標，從該培養(yǎng)液中分離、純化具有皂草苷分解活性的蛋白質(zhì)。對得到的純化蛋白質(zhì)的氨基酸序列進行分析，合成編碼該氨基酸序列的寡核苷酸，以該生物的DNA為模板進行PCR(聚合酶鏈反應)，合成長鏈探針。使用該探針，通過反向PCR或RACE(cDNA末端快速擴增)法分析皂草苷分解酶基因的翻譯區(qū)的DNA序列。將這樣得到的皂草苷分解酶的翻譯區(qū)連接到在用于表達的宿主內(nèi)發(fā)揮功能的調(diào)節(jié)序列上，獲得表達載體。使用該表達載體轉(zhuǎn)化該宿主，通過培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化體，可獲得皂草苷分解酶。
這里，“具有皂草苷分解活性的生物”只要是具有皂草苷分解活性的生物即可，并無特別限定，包括微生物、植物等。這樣的微生物例如包括新赤殼屬、曲霉屬或正青霉屬的絲狀菌。已知這些微生物在醬和醬油的釀造中使用，具有皂草苷分解活性。放線菌和桿菌等中也存在具皂草苷分解活性的微生物，因此可以認為所述微生物中也包括這樣的生物。作為所述植物，例如預測豆科植物的皂草苷類的糖轉(zhuǎn)移酶中存在催化可逆反應的物質(zhì)，因此也包括這樣的植物體、植物細胞、來源于這樣的植物的愈傷組織或培養(yǎng)細胞。
根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多核苷酸來自微生物，更優(yōu)選來自絲狀菌微生物。這樣的絲狀菌微生物優(yōu)選為屬于新赤殼屬、曲霉屬或正青霉屬的絲狀菌。
這里，新赤殼屬的絲狀菌例如有侵菅新赤殼侵菅變種PF1225菌株(保藏號FERM BP-7475)或其突變菌株。曲霉屬的絲狀菌例如有曲霉屬種名待定PF1224菌株(保藏號FERM BP-8004)或其突變菌株。正青霉屬的絲狀菌例如有Eupenicillium brefeldianum PF1226(保藏號FERMBP-7476)或其突變菌株。
多核苷酸根據(jù)本發(fā)明，提供編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的多核苷酸。
本發(fā)明的典型的多核苷酸選自上述(i)～(iv)。
即，根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，多核苷酸由選自SEQ ID NO.1、3和5所示堿基序列的堿基序列構成。
根據(jù)本發(fā)明的另一實施方案，多核苷酸由與SEQ ID NO.1、3或5所示堿基序列構成的多核苷酸具有至少70％同源性的堿基序列構成、且編碼具有皂草苷分解活性的蛋白質(zhì)。與由SEQ ID NO.1、3或5所示堿基序列構成的多核苷酸的同源性優(yōu)選80％以上，更優(yōu)選90％以上，進一步優(yōu)選95％以上，最優(yōu)選98％以上。
本說明書中所示的同源性的數(shù)值均可采用本領域技術人員公知的同源性搜索程序計算的數(shù)值，例如在FASTA、BLAST等中，通過使用缺省值(初始設定)的參數(shù)可以容易地計算。
根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，多核苷酸由SEQ ID NO.1、3或5所示堿基序列中缺失、置換、插入或添加1個或多個堿基的堿基序列構成，且編碼具有皂草苷分解活性的蛋白質(zhì)。
這里，可缺失、置換、插入或添加的堿基數(shù)量優(yōu)選為1-50個、更優(yōu)選1-30個、進一步優(yōu)選1-10個、更進一步優(yōu)選1-5個、最優(yōu)選1-2個。
根據(jù)本發(fā)明又一個實施方案，多核苷酸與由SEQ ID NO.1、3或5所示堿基序列構成的多核苷酸在嚴格條件下雜交，且編碼具有皂草苷分解活性的蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，多核苷酸中也包括與上述編碼具皂草苷分解活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸互補的多核苷酸。
這里，“嚴格條件”是指控制為下述條件使包含編碼部分或全部本發(fā)明蛋白質(zhì)的氨基酸序列的堿基序列而構成的探針與編碼同源體的基因雜交，另一方面，使所述探針不與具有特公平7-32714號記載的分子量的葡糖醛酸糖苷酶雜交。具體地說，例如有下述條件使用編碼標記的SEQ ID NO.1、3或5所示氨基酸序列的全長多核苷酸作為探針，按照ECL直接DNA/RNA標記檢測系統(tǒng)(Amersham)的方法，首先進行1小時的預雜交(42℃)，然后摻入上述探針，進行15小時的雜交(42℃)，接著使用添加了0.4％SDS和6M尿素的0.5倍濃度SSC(SSC；15mM檸檬酸三鈉、150mM氯化鈉)，在42℃下洗滌20分鐘，重復2次，再用5倍濃度SSC在室溫(約25℃)洗滌10分鐘，洗滌2次。
重組載體根據(jù)本發(fā)明，提供含有上述多核苷酸的重組載體。
本發(fā)明的重組載體的構建順序和方法可以采用基因工程領域常用的手段。
本發(fā)明中可使用的表達載體有整合到宿主染色體DNA的表達載體、使具有可自我復制的自主復制序列的載體以質(zhì)粒狀態(tài)在宿主細胞內(nèi)存在的表達載體。例如pUC系列(pUC18或pUC118等)、pBluescript系列(pBluescriptII KS+等)和pBR322等質(zhì)粒。存在于宿主細胞內(nèi)的基因的拷貝數(shù)可以是1個或多個。
對于重組載體的調(diào)節(jié)序列，只要是在宿主中發(fā)揮功能的調(diào)節(jié)序列即可，沒有特別限定，例如可以使用啟動子和終止子等。這樣的調(diào)節(jié)序列可以與編碼具皂草苷分解活性的蛋白質(zhì)的基因連接，并使基因表達。
與調(diào)節(jié)序列的連接例如可以按照常規(guī)方法，通過將編碼目標蛋白質(zhì)的基因(目標基因)的翻譯區(qū)順時方向插入啟動子的下游來進行。此時，可以使目標基因與編碼其它蛋白質(zhì)的翻譯區(qū)的外源基因連接，作為融合蛋白質(zhì)表達。
表達的具皂草苷分解活性的蛋白質(zhì)或具該活性的融合蛋白可以在用于表達的宿主細胞內(nèi)產(chǎn)生，也可以使其分泌到培養(yǎng)基中。
例如，由DNA序列分析和N末端氨基酸序列分析可知來自侵菅新赤殼侵菅變種PF1225菌株(FERM BP-7475)的皂草苷分解酶的N末端側(cè)具有26個氨基酸殘基的信號肽序列(參照實施例)。同樣方法確定了來自曲霉屬種名待定PF1224菌株的皂草苷分解酶和來自Eupenicillium brefeldianum PF1226的皂草苷分解酶的N末端側(cè)分別具有28個氨基酸殘基和17個氨基酸殘基的信號肽序列。
因此，例如使用木霉屬(Trichoderma)和曲霉屬等的絲狀菌作為宿主時，可以直接利用該序列中含有的信號序列，使其分泌到培養(yǎng)基中。
另外，由推定氨基酸組成得出的預測分子量68kDa以及在大腸桿菌(Escherichia coli)和綠色木霉(Trichoderma viride)菌株中表達的蛋白質(zhì)的分子量約68kDa，可以推測分子量約77kDa的來自侵菅新赤殼侵菅變種PF1225菌株的皂草苷分解酶為糖蛋白。同樣，由推定氨基酸組成得出的預測分子量68kDa，可以推測分子量約90kDa的來自曲霉屬種名待定PF1224菌株的皂草苷分解酶和分子量約80kDa的在綠色木霉菌株中表達的蛋白質(zhì)為糖蛋白。另外，由推定氨基酸組成得出的預測分子量65kDa，可以推測分子量約90kDa的來自Eupenicillium brefeldianumPF1226的皂草苷分解酶為糖蛋白。
預計這些糖鏈不會對活性表達產(chǎn)生大的影響，但有望在耐熱性、最適pH的改變、保存穩(wěn)定性等方面產(chǎn)生效果，也可以進行翻譯后的修飾例如添加各種糖鏈等。
本發(fā)明的重組載體還可以連接抗藥性基因和/或營養(yǎng)需求型互補基因等選擇性標記基因來構建。
基因標志可以根據(jù)選擇轉(zhuǎn)化體的方法來適當選擇。例如可使用編碼抗藥性的基因或與營養(yǎng)需求型互補的基因。抗藥性基因例如有抗越霉素、苯菌靈、寡霉素、潮霉素、G418、滿霉素、雙丙氨膦(bialaphos)、沙稻瘟菌素S、腐草霉素、膦絲菌素、氨芐青霉素、鏈霉素、卡那霉素等藥物的基因。與營養(yǎng)需求型互補的基因例如有amdS、pyrG、argBtrpC、niaD、TRP1、LEU2、URA3等基因。另外也可合有用于各種氨基酸合成系統(tǒng)、維生素合成系統(tǒng)、核酸合成系統(tǒng)等表達的宿主原有的營養(yǎng)需求型互補基因標志，或經(jīng)各種突變處理使其具有營養(yǎng)需求型、與該營養(yǎng)需求型互補的基因標志。
轉(zhuǎn)化體和目標蛋白質(zhì)的生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明，提供由上述重組載體轉(zhuǎn)化的宿主。
可在本發(fā)明中使用的宿主只要是可正確地轉(zhuǎn)錄和翻譯編碼具皂草苷分解活性的蛋白質(zhì)的基因的生物即可，并沒有特別限定，例如有大腸桿菌和芽孢桿菌屬(Bacillus spp.)等的細菌、放線菌、酵母、木霉屬等的絲狀菌或上述微生物的突變菌株。
用于基因表達的重組載體向宿主的導入可以按照常規(guī)方法進行。導入方法例如有電穿孔法、聚乙二醇法、農(nóng)桿菌法、鋰法或氯化鈣法等，可選擇對于宿主細胞來說效率較高的方法。
轉(zhuǎn)化體(轉(zhuǎn)化的宿主細胞)的培養(yǎng)可以按照常規(guī)方法，適當選擇培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件等來進行。
作為培養(yǎng)基的常用成分，例如碳源可以使用葡萄糖、蔗糖、纖維素、飴糖、糊精、淀粉、甘油、糖蜜、動植物油等。氮源可以使用大豆粉、麥胚、玉米漿、棉籽餅、肉浸汁、蛋白胨、酵母提取物、硫酸銨、硝酸鉀、尿素等。其它可根據(jù)需要添加有效生成鈉、鉀、鈣、鎂、鈷、氯、磷酸、硫酸和其它離子的無機鹽類，例如氯化鉀、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硫酸鋅、硫酸錳、硫酸銅等。另外還可根據(jù)需要添加各種維生素、氨基酸、核苷酸等微量營養(yǎng)元素、抗生素等選擇性藥物。還可以適當添加幫助轉(zhuǎn)化體生長、促進導入基因的表達的有機物和無機物。
培養(yǎng)可以在選擇性地含有上述成分的培養(yǎng)基上進行。
作為培養(yǎng)方法，例如采用液體培養(yǎng)基時，有好氣條件下的培養(yǎng)方法、振蕩培養(yǎng)法、通氣攪拌培養(yǎng)法或深層培養(yǎng)法。培養(yǎng)基的pH例如為pH 5-pH 8左右。通常條件下，培養(yǎng)溫度例如為14℃-40℃，優(yōu)選26℃-37℃。培養(yǎng)天數(shù)可在1天-25天左右的條件下進行。
本發(fā)明的目標蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法中，可從轉(zhuǎn)化細胞的培養(yǎng)物中獲得目標基因表達產(chǎn)物—具皂草苷分解活性的蛋白質(zhì)?？梢园凑粘Ｒ?guī)方法從培養(yǎng)物中獲得目標蛋白質(zhì)，例如將從培養(yǎng)物中提取(研磨處理、加壓破碎等)、回收(過濾、離心等)和/或純化(鹽析法、溶劑沉淀法等)等方法適當組合來進行。另外，在這些過程中，可以根據(jù)需要添加苯甲基磺酰氟(PMSF)、苯脒或亮抑蛋白酶肽等蛋白酶抑制劑。
根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，可通過使編碼具皂草苷分解活性的蛋白質(zhì)的基因在生成皂草苷類的植物體例如大豆、四季豆、豇豆、豌豆、花生、蠶豆或苜蓿等中表達，形成含大豆皂草精醇B的植物體，由此直接獲得大豆皂草精醇B。這種情況下，也可以使用肌動蛋白、遍在蛋白質(zhì)、花椰菜花葉病毒35S啟動子等或在種子等部位特異性表達的基因的調(diào)節(jié)序列。
將編碼具皂草苷分解活性的蛋白質(zhì)的基因正確地連接到上述調(diào)節(jié)序列上，再根據(jù)需要將雙丙氨膦、卡那霉素或沙稻瘟菌素S等抗藥性標志基因與其連接。可以通過基因槍法、PEG法、電穿孔法或微量注射法等直接導入方法或通過農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒載體的間接導入法等將其導入植物細胞，制備轉(zhuǎn)化植物細胞。向植物細胞或植物導入基因的方法例如可以按照Vaeck M.等人的方法(Nature328，33-37，1987)實施。
可以通過本領域技術人員熟知的方法使上述轉(zhuǎn)化的植物細胞進行再分化，獲得具完整植物體的轉(zhuǎn)化植物。還可以栽培該轉(zhuǎn)化植物，收獲該植物體和/或使編碼具皂草苷分解活性的蛋白質(zhì)的基因表達的器官例如種子等，采用適合其性狀的方法例如溶劑提取法等，由其中獲得大豆皂草精醇B。
大豆皂草精醇B的生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，提供大豆皂草精醇B的生產(chǎn)方法，所述方法使用含有可由上述轉(zhuǎn)化宿主得到的具皂草苷分解活性的蛋白質(zhì)的培養(yǎng)物，分解以大豆皂草精醇B為糖苷配基的苷。
根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，還提供大豆皂草精醇B的生產(chǎn)方法，所述方法使用選自上述蛋白質(zhì)和可由上述轉(zhuǎn)化宿主得到的蛋白質(zhì)的至少一種蛋白質(zhì)，分解以大豆皂草精醇B為糖苷配基的苷。
這里，“以大豆皂草精醇B為糖苷配基的苷”主要在豆科植物中含有，例如大豆皂草苷I、II、IV、V；小豆皂草苷II、V(azukisaponinII、V)、黃芪苷VIII、槐黃苷I(sophoaraflavoside I)等。
另外，作為含有以大豆皂草精醇B為糖苷配基的苷的物質(zhì)，例如有用熱水、醇或含水醇從大豆或脫脂大豆(豆餅)中提取的物質(zhì)，更優(yōu)選按照常規(guī)方法除去蛋白質(zhì)、糖、脂糖等雜質(zhì)的物質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明，使含有具皂草苷分解活性的蛋白質(zhì)的培養(yǎng)物、本發(fā)明的蛋白質(zhì)或可由本發(fā)明的宿主獲得的蛋白質(zhì)與上述含有以大豆皂草精醇B為糖苷配基的苷的物質(zhì)和/或所述苷作用，可獲得大豆皂草精醇B。
作為具體例子，例如將皂草苷(小城制藥)按照約1％-10％重量的比例溶解于水或緩沖液例如乙酸緩沖液或磷酸緩沖液等中，向其中添加皂草苷分解酶。使其在適當溫度例如20℃-50℃下反應，將該反應液用乙酸乙酯等有機溶劑萃取，可獲得大豆皂草精醇B。
實施例以下通過實施例詳述本發(fā)明，但本發(fā)明并不限定于此。
參考例1曲霉屬皂草苷分解酶的確認將約1cm2曲霉屬種名待定PF1224菌株(FERM BP-8004)的PDA斜面培養(yǎng)物接種于裝有100ml TS培養(yǎng)基(2.0％可溶淀粉、1.0％葡萄糖、0.5％聚胨、0.6％麥胚、0.3％酵母提取液、0.2％豆餅和0.2％碳酸鈣(滅菌前為pH 7.0))的500ml容量三角燒瓶中，在25℃振蕩培養(yǎng)3天。將4ml所得培養(yǎng)物接種于加入了100ml MY培養(yǎng)基(4.0％麥芽汁、2.0％酵母提取物、0.2％磷酸二氫鉀、0.2％硫酸銨、0.03％硫酸鎂七水合物、0.03％氯化鈣二水合物(pH7.0))和4.0％大豆皂草苷(小城制藥)的500ml容量三角燒瓶中，振蕩培養(yǎng)3天。
在以下的來自曲霉屬的皂草苷分解酶的純化中，以試驗例1所示的皂草苷分解活性為指標。
取約800ml上述培養(yǎng)液，用玻璃濾器(G3)過濾后進行離心(8,000rpm、30分鐘)，除去菌體碎片。向約570ml該培養(yǎng)上清中加入294g硫酸銨，通過離心(8,000rpm、30分鐘)回收產(chǎn)生的沉淀。將該沉淀溶解于約120ml緩沖液A(0.1M乙酸鈉緩沖液、1M硫酸銨(pH 5.8))，進行ButylToyopearl 650S(26mm i.d.×330mm)(Tosoh Co.)的疏水層析。用從緩沖液B(0.1M磷酸鈉緩沖液、1M硫酸銨(pH 5.8))到0.1M磷酸鈉緩沖液(pH 5.8)的濃度梯度進行洗脫，回收未吸附流分和1M至0.5M濃度硫酸銨洗脫的流分。
用Pellicon XL(截留分子量10,000)(Millipore)濃縮回收的流分，然后向其中加入1M Tris-鹽酸緩沖液和硫酸銨，使其濃度與緩沖液C(50mM Tris-鹽酸緩沖液、1M硫酸銨(pH 7.5))濃度相同，進行6mlResource PHE(Amersham Biosciences)的疏水層析。用從緩沖液C到50mM Tris-鹽酸緩沖液(pH 7.5)的濃度梯度進行洗脫，回收未吸附流分。
用Ultrafree 15(截留分子量5,000)(Millipore)濃縮所得流分，進行Superdex 200pg(16mm i.d.×600mm)(Amersham Biosciences)的凝膠過濾層析。用緩沖液D(25mM磷酸鈉緩沖液、0.15M氯化鈉(pH 5.8))進行洗脫，回收截留分子量約為90kDa的流分。
對該流分進行SDS-PAGE，結果觀察到在分子量約為90kDa處的單一條帶。
試驗例1皂草苷分解活性的測定用PD-10柱(Amersham Biosciences)對含有目標酶的酶液進行脫鹽，使其與等量的2％皂草苷溶液混合，在37℃下反應約16小時。將其用等量的乙酸乙酯萃取，將該萃取液通過TLC展開(所用溶劑系統(tǒng)為氯仿∶甲醇＝95∶5)。利用香草醛-硫酸顯色反應檢測Rf值為0.35的大豆皂草精醇B，從而測定目標酶液的酶活性。
試驗例2皂草苷分解活性的定量分析向50μl 2％皂草苷溶液中加入稀釋的酶，定容為100μl，使其反應30分鐘，接著用等量的乙酸乙酯萃取反應液，將其中的50μl用450μl流動相稀釋。取其中的10μl進行下述條件的高效液相色譜，測定保留時間約為7.5分鐘的峰的高度。將其與大豆皂草精醇B的可信樣品的峰高比較，定量評價所述酶的皂草苷分解活性。
柱Inertsil ODS-2、5μm(4.6 i.d.×250mm)
柱溫40℃流動相乙腈∶甲醇∶水＝50∶35∶15流動相流速0.8ml/min實施例1來自新赤殼屬的皂草苷分解酶(SDN)的分離純化將約1cm2侵菅新赤殼侵菅變種PF1225菌株(FERM BP-7475)的PDA斜面培養(yǎng)物接種于裝有100ml TS培養(yǎng)基的500ml容量三角燒瓶中，在25℃振蕩培養(yǎng)3天。將4ml上述培養(yǎng)物接種于裝有100ml MY培養(yǎng)基和4.0％大豆皂草苷(小城制藥)的500ml容量三角燒瓶中，振蕩培養(yǎng)3天。
在以下的來自新赤殼屬的皂草苷分解酶的純化中，以試驗例1所示的皂草苷分解活性為指標。
將約800ml上述培養(yǎng)液用約2倍的水稀釋，通過離心(8,000rpm、30分鐘)除去菌體。向其中加入171g硫酸銨，離心(8,000rpm、30分鐘)除去產(chǎn)生的沉淀。再向該上清中加入573g硫酸銨，離心(8,000rpm、30分鐘)回收沉淀，將該沉淀溶解于70ml緩沖液C中。進行ButylToyopearl650S(26mm i.d.×110mm)(Tosoh Co.)的疏水層析。用從緩沖液C到50mM Tris-鹽酸緩沖液(pH 7.5)的濃度梯度進行洗脫，回收未吸附流分。
向約500ml上述流分中加入約239g硫酸銨，離心回收得到的沉淀。接著將回收的沉淀溶解于4ml緩沖液B中，進行苯基瓊脂糖FF(PhenylSepharose FF)(16mm i.d.×100mm)(Amersham Biosciences)的疏水層析。用從緩沖液B到0.1M磷酸鈉緩沖液(pH 5.8)的濃度梯度進行洗脫，回收約0.4M濃度硫酸銨洗脫的流分。
接著將回收的流分進行Superdex 200pg(16mm i.d.×600mm)(Amersham Biosciences)的凝膠過濾層析。用緩沖液E(50mM Tris-鹽酸緩沖液、0.15M氯化鈉(pH 7.5))進行洗脫，回收截留分子量約為76,000的流分。
對該流分進行SDS-PAGE，結果觀察到在分子量約為77kDa處的單一條帶。
實施例2皂草苷分解酶(SDN)的氨基酸序列分析2a)N末端側(cè)的氨基酸序列將如實施例1制備的流分進行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)印至PVDF膜(Immobilon-PSQ)(Millipore)，然后水洗風干。將其用蛋白質(zhì)測序儀492型(Applied Biosystem)進行氨基酸序列分析。
分析得到的氨基酸序列如下所示。
N末端氨基酸序列ASPPASVPNNPSSEEITLQ(SEQ ID NO.7)2b)內(nèi)部氨基酸序列的分析(肽作圖)將實施例1中制備的流分進行SDS-PAGE，使用考馬斯亮藍R250進行蛋白質(zhì)染色。將其中分子量約為77kDa染色的單一條帶切下，用在50％乙腈中配制的0.2M碳酸氫銨緩沖液(pH 8.0)進行脫色，在室溫下風干約2小時。
接著，將該凝膠條用含0.02％吐溫20的0.2M碳酸氫銨緩沖液(pH8.0)浸泡，然后加入胰蛋白酶(Promega)，在37℃下反應2天。回收反應后的上清，再用60％乙腈和0.1％三氟乙酸將凝膠條洗滌3次。將該洗滌液與反應上清合并，濃縮，通過Model 172μ制備HPLC系統(tǒng)(AppliedBiosystems)(RP-300 Aquiapore C18、220×2.1mm、由0.1％三氟乙酸、35％乙腈到0.085％三氟乙酸、35％乙腈的濃度梯度)，分離如下所示的5種肽。
Trp26.8LVFNPSPKSEQ ID NO.8Trp27.59WNVAADGSGPSGEIRSEQ ID NO.9Trp32.07VTILHNPEGVAPITAK SEQ ID NO.10Trp39.43EHSDTIPWGVPYVPGSQ SEQ ID NO.11Trp41.3LTDYSFDWYSDIR SEQ ID NO.12
實施例3皂草苷分解酶(SDN)的克隆和序列分析3a)PCR制備長鏈探針由侵菅新赤殼侵菅變種PF1225菌株(FERM BP-7475)培養(yǎng)菌體中制備基因組DNA，用其作為PCR模板。
基因組DNA的分離按照Horiuchi等人的方法(J.Bacteriol.170，272-278，1988)進行。首先，通過離心(7,500rpm、10分鐘)回收在TS培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌體。將得到的菌體冷凍干燥，然后懸浮于TE(10mMTris-鹽酸緩沖液、1mM EDTA(pH 8.0))中，在3％SDS溶液中、在60℃下處理30分鐘。接著用TE飽和苯酚萃取，由此除去菌體碎片。
將萃取液用乙醇沉淀后，用核糖核酸酶A(Nippon Gene)和蛋白酶K(和光純藥)處理，再用12％的聚乙二醇6000使核酸沉淀。將沉淀用TE飽和苯酚萃取，用乙醇沉淀，將該沉淀物溶解于TE，以此作為基因組DNA。
根據(jù)實施例2中得到的肽序列，合成編碼上述肽序列的如下所示的寡核苷酸，用其作為PCR引物。
引物N1CCIGCITCNGTNCCNAASEQ ID NO.13引物N2CCIGCIAGYGTNCCNAASEQ ID NO.14引物2ACCRTCIGCNGCNACRTTSEQ ID NO.15引物3ACCCCAIGGDATNGTRTCSEQ ID NO.16引物4AACICCYTCNGGRTTRTGSEQ ID NO.17使用TaKara Taq(寶酒造)進行PCR，在94℃下進行1分鐘的熱變性處理，然后將94℃ 30秒、45℃ 30秒和55℃ 3分鐘的一系列步驟進行10個循環(huán)，接著將94℃ 30秒、47℃ 30秒和60℃ 3分鐘的一系列步驟進行20個循環(huán)，擴增片段。結果，在引物N1和引物4A的組合中，特異性擴增了約0.8kb的片段。使用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen)將其克隆進入pCR2.1-TOPO中(pCR2.1-2)。
使用dRhodamine Terminator cycle sequencing ready reaction(Applied Biosystems)和ABI PRISM 310基因分析儀(Applied Biosystems)進行DNA序列分析，解碼克隆進入pCR2.1-2中的PCR產(chǎn)物，確定了SEQ ID NO.1所示序列中位置88至位置812的區(qū)得到擴增。
3b)DNA印跡分析和使用反向PCR進行的序列解碼DNA印跡分析中，對由EcoRI消化的基因組DNA進行瓊脂糖凝膠電泳，轉(zhuǎn)印到Hibond N+(Amersham Biosciences)。使用ECF隨機引物標記和檢測系統(tǒng)(Amersham Biosciences)進行雜交，使用分子成象儀FX(Biorad)檢測條帶。
使用實施例3的3a)中得到的PCR產(chǎn)物作為探針，檢測出約2kb的條帶。
接著，用EcoRI消化基因組DNA，回收約2kb的片段，使用DNA連接試劑盒ver.2(寶酒造)進行環(huán)化。以其作為模板，使用如下所示的反向PCR引物，通過LA Taq(寶酒造)，在94℃進行1分鐘熱變性處理后，將94℃ 30秒、50℃ 30秒和72℃ 4分 30秒的一系列步驟重復25個循環(huán)，擴增片段。使用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen)克隆這里被擴增的約2kb的片段，并通過引物分析其序列。
反向PCP引物1TGACGCTGATACCAACGGCGSEQ ID NO.18反向PCR引物2CTAGTGGCAGTATTGGACAGSEQ ID NO.193c)使用3’RACE法和5’RACE法確定翻譯區(qū)以cDNA為模板，使用3’RACE法和5’RACE法進行翻譯區(qū)的確定。cDNA的制備如下進行。
與實施例1同樣，將在TS培養(yǎng)基中培養(yǎng)的1ml侵菅新赤殼侵菅變種PF1225菌株(FERM BP-7475)的培養(yǎng)液接種于裝有100ml含1％大豆皂草苷的MY培養(yǎng)基的500ml容量三角燒瓶中。將其在25℃下振蕩培養(yǎng)32小時，然后用尼龍篩(50μm)過濾菌體，用液氮將過濾的菌體冷凍。使用研缽和研杵研磨冷凍菌體，由研磨的菌體中提取總RNA。使用ISOGEN(Nippon Gene)，按照所附的方案進行總RNA的提取。使用Oligotex-dT30<Super>(Roche Diagnostics)，按照所附的方案，由總RNA中純化mRNA。
對于該mRNA，使用5’/3’RACE試劑盒(Roche Diagnostics)，按照所附的方案進行5’RACE和3’RACE，擴增3’和5’區(qū)。此時，在3’RACE方法中，使用AmpriTaq Gold(Applied Biosystem)進行第一次PCR，使用PCR supermix high fideliy(Lifetech oriental Co.，Ltd)進行第二次PCR。在5’RACE方法中，均使用PCR supermix high fidelity(Lifetechoriental Co.，Ltd)進行第一次PCR和第二次PCR。
3’RACE和5’RACE的特異性引物序列如下所示。
用于第一次PCR的3’RACE特異性引物CCCAGGCCTTTAAGGATGGC SEQ ID NO.20用于第二次PCR的3’RACE特異性引物CTAGTGGCAGTATTGGACAG SEQ ID NO.19用于cDNA合成的5’RACE特異性引物TGACGCTGATACCAACGGCG SEQ ID NO.18用于第一次PCR的5’RACE特異性引物CTGCTTGAGGGTAATGGGCTCSEQ ID NO.21用于第二次PCR的5’RACE特異性引物ACAGACGCCGGAGGAGAAGCGSEQ ID NO.22如上所述，確定了SEQ ID NO.1所示SDN基因的翻譯區(qū)。這里，由實施例2a)的結果可知從翻譯起始位點的Met數(shù)起，SDN氨基酸序列的成熟蛋白質(zhì)的N末端位于位置27。
通過比較基因組DNA和cDNA的堿基序列來確定翻譯區(qū)中是否存在內(nèi)含子。證實該翻譯區(qū)中不存在內(nèi)含子。
實施例4皂草苷分解酶(SDN)在大腸桿菌中的表達以實施例3中得到的cDNA為模板，使用如下所示的用于在大腸桿菌中表達的引物進行PCR。
使用PCR supermix high fidelity(Lifetech oriental Co.，Ltd)，在94℃進行1分鐘的熱變性處理后，將94℃ 30秒、50℃ 30秒和72℃ 2分鐘的一系列步驟進行25個循環(huán)，擴增SDN基因的翻譯區(qū)。使用DNA連接試劑盒ver.2(寶酒造)使由限制酶NdeI和BamHI消化上述擴增產(chǎn)物的片段和用同樣的限制酶消化的質(zhì)粒pET15b(Novagen)連接。按照常規(guī)方法，用其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)菌株，得到具有氨芐青霉素抗性的菌落。
用于在大腸桿菌中表達的N末端引物GGGCATATGGCTTCTCCTCCTGCTTCTG SEQ ID NO.23用于在大腸桿菌中表達的C末端引物GGGGGATCCTTAAGTGCCGCTCTGAGGACTACG SEQ ID NO.24將得到的菌落用于以下的試驗。
將由菌落中收集的菌體在裝有50ml含有50μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基的250ml容量三角燒瓶中、在37℃下振蕩培養(yǎng)過夜，再取其中的2ml接種于裝有50ml含有50μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基的250ml容量三角燒瓶中，在37℃下振蕩培養(yǎng)3小時。向其中加入異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷，使終濃度為0.4mM，再誘導培養(yǎng)3小時。
通過離心收集獲得的培養(yǎng)菌體，使菌體在緩沖液F(50mM Tris-鹽酸緩沖液、2mM EDTA(pH 8.0))中懸浮，然后再次通過離心回收菌體。將該菌體在-80℃冷凍，然后懸浮于5ml緩沖液F中，向其中添加溶菌酶和Triton X 100，使終濃度分別為100μg/ml和0.1％，將其在室溫下靜置20分鐘。使用Sonifier 450(BRANSON)，在冰冷卻下，以50％的占空度(duty cycle)進行30秒的超聲波處理，重復2次，使細胞破碎，通過離心除去菌體碎片。
將這樣得到的菌體提取液作為粗酶液，按照試驗例1進行皂草苷分解活性的測定。
結果，在TLC中，從皂草苷分解酶的翻譯區(qū)被克隆的菌體提取液中只觀察到分解產(chǎn)物大豆皂草精醇B的斑點。
實施例5皂草苷分解酶(SDN)在綠色木霉中的表達5a)用于轉(zhuǎn)化的載體的構建以實施例3得到的cDNA為模板，使用如下所示的用于在木霉屬中表達的引物，與實施例4同樣地進行PCR。
使用DNA連接試劑盒ver.2(寶酒造)使由限制酶SmaI和PstI消化所得PCR產(chǎn)物的片段和用StuI和PstI消化的質(zhì)粒pCB1-M2(參照國際公開第WO98/11239號的實施例5)連接。將其用XbaI消化、脫磷酸，然后使其與來自粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)pyr4基因的XbaI盒連接，構建質(zhì)粒pCB-SBe(圖1)。
用于在木霉屬中表達的N末端引物GGGCCCGGGGCGCATCATGCACTTCTTTGACAAAGCGAC SEQ ID NO.25用于在木霉屬中表達的C末端引物GGGCTGCAGTTAAGTGCCGCTCTGAGGACTSEQ ID NO.26Pyr4基因的XbaI盒的構建方法如下所示。
首先，用BglII消化pFB6(Biochem.Biophys.Res.Commun.112，284-289，1983)，然后用HindIII進行部分消化，回收約1.9kb的片段。將其連接到用BglII和HindIII消化的pLITMUS28(New EnglandBiolabs)。接著，將其用BglII消化，然后用DNA鈍化試劑盒(寶酒造)產(chǎn)生平端，與磷酸化接頭pXbaI(寶酒造)連接，構建了pyr4基因的XbaI盒。
5b)來自綠色木霉的尿嘧啶需求型菌株的獲得將2支UV燈在30cm高度照射，一邊將約1.0×109CFU/ml的綠色木霉MC300-1菌株孢子懸浮液緩慢混合，一邊對該懸浮液照射UV。將其涂于選擇性培養(yǎng)基上，在28℃培養(yǎng)7天，然后篩選生長菌株。
使用在基本培養(yǎng)基(0.2％磷酸二氫鉀、0.4％硫酸銨、0.03％尿素、0.03％硫酸鎂七水合物、0.03％氯化鈣、0.5％葡萄糖、2.5％瓊脂、0.01％痕量元素(5mg硫酸鐵七水合物、1.56mg硫酸錳七水合物、1.4mg硫酸鋅七水合物、2.0mg氯化鈷溶解于1L水中形成))中添加了10μg/ml尿苷和1.0mg/ml 5-氟乳清酸的培養(yǎng)基作為選擇性培養(yǎng)基。
5c)對綠色木霉的轉(zhuǎn)化和對各重組體的皂草苷分解活性的檢測將實施例5的5b)中得到的尿嘧啶需求型綠色木霉菌株接種于裝有50ml菌體形成培養(yǎng)基(1.0％酵母提取物、1.0％麥芽汁、2.0％聚胨、2.5％葡萄糖、0.1％磷酸氫二鉀、0.05％硫酸鎂七水合物(滅菌前pH 7.0))的200ml容量三角燒瓶中，在28℃下振蕩培養(yǎng)2天。通過離心從得到的培養(yǎng)液中回收菌絲體。接著由該菌絲體制備原生質(zhì)體，然后加入質(zhì)粒pCB-SBe的DNA溶液，進行轉(zhuǎn)化(參照國際公開第WO98/11239號的實施例7)。
轉(zhuǎn)化體再生時，使用在基本培養(yǎng)基中添加了0.5M蔗糖的培養(yǎng)基。再將生長的菌落移種于基本培養(yǎng)基上，將在此生長的菌落作為轉(zhuǎn)化體。
將質(zhì)粒pCB-SBe導入尿嘧啶需求型綠色木霉菌株，結果每1μgpCB-SBe獲得了3個轉(zhuǎn)化體。培養(yǎng)25株該轉(zhuǎn)化體(參照國際公開第WO98/11239號的實施例1)，將培養(yǎng)上清進行SDS-PAGE，只在轉(zhuǎn)化體中觀察到了顯示分子量約為68kDa的條帶。
使用該培養(yǎng)上清按照實施例1測定皂草苷的分解活性時，在TLC中觀察到了分解產(chǎn)物大豆皂草精醇B的斑點。而在親本菌株—尿嘧啶需求型綠色木霉菌株中未觀察到該斑點。
5d)重組皂草苷分解酶(重組型SDN)的純化、以及與來自侵菅新赤殼侵菅變種PF1225菌株的皂草苷分解酶(野生型SDN)的活性比較將實施例5的5c)中得到的約700ml培養(yǎng)液離心(8,000rpm、30分鐘)，除去菌體碎片。向約560ml該培養(yǎng)上清中加入64g硫酸銨，離心(8,000rpm、30分鐘)除去沉淀。再向約600ml該上清中加入74g硫酸銨，離心回收沉淀。向得到的沉淀中加入100ml 0.05M Tris-鹽酸緩沖液(pH 7.5)和16g硫酸銨，進行Butyl Toyopearl 650S(26mm i.d.×330mm)(Tosoh Co.)的疏水層析。用從緩沖液C到50mM Tris-鹽酸緩沖液(pH 7.5)的濃度梯度進行洗脫，回收未吸附流分和由1M至0.6M濃度硫酸銨洗脫的流分。
用Millipore公司制造的Pellicon XL(截留分子量10,000)濃縮所得流分。然后向約8ml該濃縮液中加入1.3g硫酸銨和2ml 0.5M磷酸鈉緩沖液(pH 5.8)，進行6ml Resource PHE(Amersham Biosciences)的疏水層析。用從緩沖液B到0.1M磷酸鈉緩沖液(pH 5.8)的濃度梯度進行洗脫，回收未吸附流分。
用Millipore公司制造的Ultrafree 15(截留分子量5,000)濃縮所得流分，將該濃縮液進行Superdex 200pg(16mm i.d.×600mm)(AmershamBiosciences)的凝膠過濾層析。用緩沖液G(50mM磷酸鈉緩沖液、0.15M氯化鈉(pH 7.0))進行洗脫，回收截留分子量約為68,000的流分。
對該流分進行SDS-PAGE，結果在分子量約68kDa處觀察到單一條帶。
如上所示，按照試驗例2，對純化的重組皂草苷分解酶(以下稱為“重組型SDN”)和實施例1中純化得到的皂草苷分解酶(以下稱為“野生型SDN”)測定其最適pH和最適溫度。
最適pH的測定中，首先向50μl 2％皂草苷溶液中加入20μl 0.5M各緩沖液(乙酸鈉(pH4.5、pH5.0、pH5.8)、磷酸鈉(pH5.0、pH5.8、pH7.0)、Tris-鹽酸(pH7.0、pH8.0、pH9.0))和稀釋的酶液，配制100μl的溶液。將其在37℃反應30分鐘，然后定量生成的大豆皂草精醇B的量。
結果如圖2所示。
最適溫度的測定中，首先向50μl 2％皂草苷溶液中加入20μl 0.5M磷酸鈉緩沖液(pH 5.8)和稀釋的酶液，配制100μl的溶液。將其在規(guī)定的各溫度下反應30分鐘，然后定量純化的大豆皂草精醇B的量。
結果如圖3所示。
由這些結果可知通過SDS-PAGE確認了分子量的差異，但在活性上未見有大的差異。
實施例6來自曲霉屬種名待定PF1224菌株的皂草苷分解酶(SDA)的氨基酸序列分析與實施例2的2b)同樣，切下從曲霉屬種名待定PF1224菌株(保藏號FERM BP-8004)中純化的皂草苷分解酶(SDA)(參考例1)的約90kDa的條帶，進行片段化。將其與實施例2的2b)同樣地進行HPLC，分離如下所示的4種肽。
Trp23.67LYNPDSPQPISAKSEQ ID NO.27Trp24.0LQFNPAPK SEQ ID NO.28Trp38.05VDWFSDLTSTGQVTGSKSEQ ID NO.29Trp24.5GEVSGSASVSIIHDSEQ ID NO.30實施例7SDA基因的克隆和序列分析7a)使用PCR制備長鏈探針與實施例3同樣，從如參考例1中培養(yǎng)的菌體中分離基因組DNA。根據(jù)實施例6中得到的肽序列，合成編碼該肽序列的如下所示的寡核苷酸，作為PCR引物。
引物23.67s1TAYAAYCCIGAYTCNCC SEQ ID NO.31引物23.67s2TAYARYCCNGAYAGYCC SEQ ID NO.32引物24.0sCARTTYAAYCCIGCNCCSEQ ID NO.33引物24.0aGGIGCNGGRTTRAAYTGSEQ ID NO.34引物38.05a1AARTCNGARAACCARTC SEQ ID NO.35引物38.05a2AARTCRCTRAACCARTC SEQ ID NO.36與實施例3的3a)的方法同樣地進行PCR。
結果，在上述引物中，引物24.0s和引物38.05a1的組合中，特異性地擴增了約1kb的片段，使用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen)將其克隆進入pCR2.1-TOPO中(pSDAPCR1)。
序列分析的結果表明克隆進入pSDAPCR1中的片段是SEQ IDNO.3所示序列中位置709到位置1748的區(qū)被擴增的片段。
7b)使用DNA印跡分析和大腸桿菌菌落文庫進行篩選DNA印跡分析中，將BamHI、EcoRI、HindIII消化的基因組DNA在瓊脂糖凝膠中進行電泳，將其轉(zhuǎn)印到Hibond N+(AmershamBiosciences)。使用ECF隨機引物標記和檢測系統(tǒng)(Amersham Biosciences)進行雜交，使用分子成象儀FX(Biorad)檢測條帶。
使用上述7a)得到的PCR產(chǎn)物作為探針時，檢測到約10kb的BamHI、約20kb的EcoRI、約5kb的HindIII片段的條帶。
接著，用HindIII消化基因組DNA，回收約4kb-6kb的片段。將其連接到HindIII消化和脫磷酸處理的pUC18，使其轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株。使該大腸桿菌在添加了氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基中形成菌落，將得到的約1,000個菌落轉(zhuǎn)印到Hibond N+(AmershamBiosciences)。這里，以上述7a)得到的PCR產(chǎn)物作為探針，用DIG Hi-prim DNA標記和檢測試劑盒(Roche Diagnostics)，獲得了1種陽性克隆(pSDAHind5/18)。該克隆含有約5kb的HindIII片段。
7c)使用3’RACE法和5’RACE法確定翻譯區(qū)與實施例3的3c)同樣，從參考例1中制備的曲霉屬種名待定PF1224菌株(保藏號FERM BP-8004)的培養(yǎng)菌體中提取總RNA，再使用mRNA快速預純化試劑盒(QuickPrep mRNA Purification kit)(AmershamBiosciences)，按照所附方案分離mRNA。
對于該mRNA，使用5’/3’RACE試劑盒(Roche Diagnostics)，進行3’和5’區(qū)的擴增。另外，使用LA Taq(寶酒造)進行各個PCR。
3’RACE法和5’RACE特異性引物的序列如下所示。
用于第一次PCR的3’RACE特異性引物CCTCGATACCCGAGGGACCG SEQ ID NO.37用于第二次PCR的3’RACE特異性引物GATGGGTTGCATGTTATCGC SEQ ID NO.38用于cDNA合成的5’RACE特異性引物GCGATAACATGCAACCCATCSEQ ID NO.39用于第一次PCR的5’RACE特異性引物GACCACCTGGTTCAGTGGTG SEQ ID NO.40用于第二次PCR的5’RACE特異性引物GGGTTATAGAGTCTGGTAACG SEQ ID NO.41如上所述，確定了SEQ ID NO.3所示的SDA基因的翻譯區(qū)。這里，與實施例2a)同樣，對如參考例1純化的SDA蛋白質(zhì)分析其成熟N末端的氨基酸序列，結果表明從翻譯起始位點的Met數(shù)起，SDA氨基酸序列的成熟蛋白質(zhì)的N末端位于位置29。
通過比較基因組DNA和cDNA的堿基序列來確定翻譯區(qū)中是否存在內(nèi)含子。證實該翻譯區(qū)中不含有內(nèi)含子。
實施例8來自曲霉屬種名待定PF1224菌株的皂草苷分解酶(SDA)在綠色大霉中的表達8a)用于轉(zhuǎn)化的載體的構建首先，以實施例7b中得到的pSDAHind5/18為模板，使用如下所示的在木霉屬中表達的引物，與實施例4同樣地進行PCR。
用DNA連接試劑盒ver.2(寶酒造)使由限制酶StuI和XhoI消化所得PCR產(chǎn)物的片段和預先用StuI和XhoI消化的質(zhì)粒pCB1-M2(參照國際公開第WO98/11239號的實施例5)連接，構建pCB-SDAe(圖4)。
用于在木霉屬中表達SDA的N末端引物GGGAGGCCTGCGCATCATGCATGTTGTCGCAAGTACCACSEQ ID NO.42用于在木霉屬中表達SDA的C末端引物GGGCTCGAGTACCTCAAGTCCCATTTGCCGGCTGCSEQ ID NO.438b)綠色木霉的轉(zhuǎn)化和各重組體的皂草苷分解活性的檢測以實施例5的5b)中得到的尿嘧啶需求型綠色木霉為宿主，與實施例5的5c)同樣，用共轉(zhuǎn)化的方法使pCB-SDAe和pyr4盒連接到pLITMUS28構建的載體pPYR4(參照實施例5的5a))轉(zhuǎn)化。結果每1μgDNA獲得了約12株的轉(zhuǎn)化體。
培養(yǎng)上述獲得的轉(zhuǎn)化體(參照國際公開第WO98/11239號的實施例1)后，將其培養(yǎng)上清進行SDS-PAGE，只在轉(zhuǎn)化體中觀察到顯示分子量約80kDa的條帶。
使用該培養(yǎng)上清，按照實施例1測定其皂草苷的分解活性時，在TLC中觀察到分解產(chǎn)物大豆皂草精醇B的斑點。
8c)來自重組曲霉屬種名待定PF1224菌株的皂草苷分解酶(重組型SDA)的純化、以及與來自野生型曲霉屬種名待定PF1224菌株的皂草苷分解酶(野生型SDA)的活性比較將約600ml上述8b)所得培養(yǎng)液離心(8,000rpm、30分鐘)除去其菌體碎片。向得到的約500ml上清中加入57g硫酸銨，離心除去不溶解的殘渣。再向該上清中依次加入64g(40％飽和級分)和70g(60％飽和級分)硫酸銨，將得到的沉淀溶解于0.1M磷酸鈉緩沖液(pH 5.8)中。向其中得到的60％飽和級分中加入硫酸銨，使?jié)舛葹?M，進行ButylToyopearl 650S(26mm i.d.×250mm)(Tosoh Co.)的疏水層析。用從緩沖液A到0.1M磷酸鈉緩沖液(pH 5.8)的濃度梯度進行洗脫，回收從0.9M到0.2M濃度硫酸銨洗脫的流分。
用Millipore公司制造的Pellicon XL(截留分子量10,000)和Ultrafree15(截留分子量10,000)濃縮所得流分，用PD-10柱(AmershamBiosciences)脫鹽，進行6ml Resource Q(Amersham Biosciences)的離子交換層析。用50mM Tris-鹽酸緩沖液(pH7.5)到50mM Tris-鹽酸緩沖液、0.5M氯化鈉(pH7.5)的濃度梯度進行洗脫，回收未吸附流分和由0.08M鹽濃度洗脫的流分。
用Ultrafree15(截留分子量10,000)(Millipore)濃縮所得流分，進行Superdex 200pg(16mm i.d.×600mm)(Amersham Biosciences)的凝膠過濾層析。用緩沖液G進行洗脫，回收截留分子量約50kDa的流分。
對該流分進行SDS-PAGE，結果在分子量約80kDa處觀察到單一條帶。另外，凝膠過濾的截留分子量與SDS-PAGE的分子量不同，這是由于該蛋白質(zhì)與載體非特異性吸附的緣故。
按照試驗例2的方法，對于如上純化的重組型SDA和參考例1中純化的皂草苷分解酶(野生型SDA)測定其最適pH和最適溫度。
最適pH和最適溫度的測定與實施例5的5d)同樣進行。
結果分別如圖5和圖6所示。
結果表明重組型SDA在pH 7的磷酸鈉緩沖液中的比活性比野生型SDA低，但在Tris-鹽酸緩沖液中的比活性有提高。
實施例9來自Eupenicillium brefeldianum PF1226的皂草苷分解酶(SDE)的分離純化將約1cm2Eupenicillium brefeldianum PF1226(保藏號FERM BP-7476)的PDA斜面培養(yǎng)物接種于裝有100ml TS培養(yǎng)基的500ml容量三角燒瓶中，在25℃振蕩培養(yǎng)3天。將4ml上述培養(yǎng)物接種于裝有100mlMY培養(yǎng)基和1.0％大豆皂草苷(小城制藥)的500ml容量三角燒瓶中，振蕩培養(yǎng)7天。
將約1,000ml該培養(yǎng)液用玻璃濾器(G3)過濾，除去菌體碎片。向約640ml該培養(yǎng)上清中加入73g硫酸銨，離心(8,000rpm、30分鐘)除去生成的沉淀。再向約670ml該上清中加入256g硫酸銨，離心回收生成的沉淀。使該沉淀溶解于約50ml 0.1M乙酸鈉緩沖液(pH 5.8)，加入13.2g硫酸銨，加入水，使最終濃度為1M硫酸銨、0.1M磷酸鈉緩沖液。
離心分離該溶液后，進行Butyl Toyopearl 650S(26mm i.d.×330mm)(Tosoh Co.)的疏水層析。用從緩沖液C到50mM Tris-鹽酸緩沖液的濃度梯度進行洗脫，回收由0.7M至0.5M濃度硫酸銨洗脫的流分。
用Pellicon XL(截留分子量10,000)(Millipore)濃縮所得流分，然后加入磷酸鈉緩沖液和硫酸銨，使其構成緩沖液A的組成，進行6mlResource PHE(Amersham Biosciences)的疏水層析。用從緩沖液A到0.1M磷酸鈉緩沖液(pH 5.8)的濃度梯度進行洗脫，回收從1M到0.3M濃度硫酸銨洗脫的流分。
用Ultrafree15(截留分子量10,000)(Millipore)濃縮所得流分，用PD-10柱(Amersham Biosciences)脫鹽后，進行6ml Resource Q(Amersham Biosciences)的離子交換層析。用20mM磷酸鈉緩沖液(pH 7.0)到20mM磷酸鈉緩沖液、1M氯化鈉(pH 7.0)的濃度梯度進行洗脫，回收未吸附流分。
用Ultrafree15(截留分子量10,000)(Millipore)濃縮該流分，進行Superdex 200pg(16mm i.d.×600mm)(Amersham Biosciences)的凝膠過濾層析。用緩沖液G進行洗脫，回收截留分子量約90kDa的流分。
對該流分進行SDS-PAGE，結果在分子量約90kDa處觀察到單一條帶。
實施例10SDE的氨基酸序列分析10a)N末端側(cè)氨基酸序列與實施例2的2a)同樣，對實施例9中制備的流分進行N末端側(cè)的氨基酸序列分析。結果得到所示的氨基酸序列。
N末端氨基酸序列STTPAPPQPEPI(SEQ ID NO.44)10b)肽作圖與實施例2的2b)同樣，切下實施例9中純化的SDE的約90kDa的條帶，進行片段化。與實施例2的2b)同樣地，將其進行HPLC，分離到如下所示的3種肽。
Trp20.73ADPAFSPDGTR SEQ ID NO.45Trp34.21LHPDDTHMGWSSF SEQ ID NO.46Trp36.26GFSGAGDEILYIGSTRSEQ ID NO.47實施例11SDE基因的克隆和序列分析11a)使用PCR制備長鏈探針與實施例3同樣，從實施例9培養(yǎng)的菌體中分離基因組DNA。
根據(jù)實施例10中獲得的肽的序列，合成編碼這些肽序列的如下所示的寡核苷酸，作為PCR引物。
引物NsCCICARCCNGARCCNAT SEQ ID NO.48引物20.37aCTRAAIGCNGGRTCNGC SEQ ID NO.49引物34.21aCCANCCCATRTGNGTRTCSEQ ID NO.50
與實施例3的3a)同樣地進行PCR。
結果，在上述引物中，引物Ns和引物20.73a的組合中，特異性地擴增了約1kb的片段，使用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen)將其克隆到pCR2.1-TOPO中(pSDEPCR5)。
序列分析的結果表明克隆到pSDEPCR5中的片段是SEQ ID NO.5所示序列中位置70到位置1247的區(qū)被擴增的片段。
11b)使用DNA印跡分析和噬菌體文庫進行篩選DNA印跡分析中，對PstI、SphI、XhoI消化的基因組DNA在瓊脂糖凝膠中進行電泳，轉(zhuǎn)印到Hibond N+(Amersham Biosciences)。使用ECF隨機引物標記和檢測系統(tǒng)(Amersham Biosciences)進行雜交，使用分子成象儀FX(Biorad)檢測條帶。
使用上述11a)中得到的PCR產(chǎn)物作為探針，檢測出約3kbPstI、約4kbSphI、約6kbXhoI片段的條帶。
接著，用Sau3A1部分消化基因組DNA。使其與λEMBL3/BamHI載體(Stratagene)連接，使用MaxPlax包裝提取試劑盒(EPICENTRETECHNOLOGIES)進行包裝。將約5×104PFU的該噬菌體文庫轉(zhuǎn)印到Hibond N+(Amersham Biosciences)，以克隆進入pSDEPCR5中的PCR片段作為探針，通過DIG Hi-prime DNA標記和檢測試劑盒(RocheDiagnostics)獲得了5種陽性克隆。從其中含有6kb XhoI片段的噬菌體DNA中回收該XhoI片段，克隆進入pBluescriptII KS+(pSDEXho/IIKS+1)。
以pSDEXho/IIKS+1為模板，通過轉(zhuǎn)座子法確定SDE翻譯區(qū)的DNA序列如SEQ ID NO.5所示。
這里，實施例10a)的結果表明從翻譯起始位點的Met數(shù)起，SDE氨基酸序列的成熟蛋白質(zhì)的N末端位于位置18。
通過比較基因組和cDNA的DNA序列來確認翻譯區(qū)中是否存在內(nèi)含子。證實該翻譯區(qū)中不存在內(nèi)含子。
實施例12來自Eupenicillium brefeldianum PF1226的皂草苷分解酶(SDE)在綠色木霉中的表達12a)用于轉(zhuǎn)化的載體構建以實施例11中獲得的pSDEXho/IIKS+1為模板，使用如下所示的用于木霉屬分泌的引物，與實施例4同樣地進行PCR。
用DNA連接試劑盒ver.2(寶酒造)使由限制酶SmaI和XhoI消化所得PCR產(chǎn)物得到的片段和預先由SmaI和XhoI消化的質(zhì)粒pCB1-M2(參照國際公開第WO98/11239號的實施例5)連接，構建pCB-SDEs(圖7)。
用于在木霉屬中分泌SDE的N末端引物GGGCCCGGGCTCAGACTACCCCGGCACCTCCTCAGCCSEQ ID NO.51用于在木霉屬中分泌SDE的C末端引物GGGCTCGAGTACCTCATGCACCATTGAGCGGCTGGTGG SEQ ID NO.5212b)綠色木霉的轉(zhuǎn)化和各重組體的皂草苷分解活性的檢測以實施例5的5b)中得到的尿嘧啶需求型綠色木霉為宿主，與實施例5的5c)同樣，用共轉(zhuǎn)化的方法使pCB-SDEs和pyr4盒連接到pLITMUS28構建的載體pPYR4(參照上述5a))進行轉(zhuǎn)化。結果每1μg的DNA獲得了約28株的轉(zhuǎn)化體。
培養(yǎng)上述獲得的轉(zhuǎn)化體(參照國際公開第WO98/11239號的實施例1)后，將該培養(yǎng)上清進行SDS-PAGE，只在轉(zhuǎn)化體中觀察到顯示分子量約67kDa的條帶。
按照試驗例1，使用該培養(yǎng)上清測定皂草苷的分解活性時，在TLC中觀察到分解產(chǎn)物大豆皂草精醇B的斑點。
12c)來自重組Eupenicillium brefeldianum PF1226的皂草苷分解酶(重組型SDE)的純化、以及與來自野生型Eupenicillium brefeldianumPF1226的皂草苷分解酶(野生型SDE)的活性比較將約900ml實施例12的12b)所得培養(yǎng)液離心(8,000rpm、30分鐘)除去菌體碎片。向得到的約690ml上清中加入78.7g硫酸銨，離心除去不溶解的殘渣。再向該上清中加入88.6g(40％飽和級分)硫酸銨，將得到的沉淀溶解于120ml 1M硫酸銨、0.1M磷酸鈉緩沖液(pH 5.8)中。取其中的20ml進行Butyl Toyopearl 650S(26mm i.d.×330mm)(TosohCo.)的疏水層析。用從緩沖液A到0.1M磷酸鈉緩沖液的濃度梯度進行洗脫，回收從0.2M到0M硫酸銨濃度洗脫的流分。
用Millipore公司制造的Pellicon XL(截留分子量10,000)和Ultrafree15(截留分子量5,000)濃縮該流分，用PD-10柱(Amersham Biosciences)脫鹽，進行6ml Resource Q(Amersham Biosciences)的離子交換層析。用50mM Tris-鹽酸緩沖液(pH 7.5)到50mM Tris-鹽酸緩沖液、0.5M氯化鈉(pH 7.5)的濃度梯度進行洗脫，回收由0M到0.1M鹽濃度洗脫的流分。
用Ultrafree15(截留分子量5,000)(Millipore)濃縮該流分，進行Superdex 200pg(16mm i.d.×600mm)(Amersham Biosciences)的凝膠過濾層析。用緩沖液G進行洗脫，回收截留分子量約50kDa的流分。
對該流分進行SDS-PAGE，結果在分子量約67kDa處觀察到單一條帶。另外，凝膠過濾的截留分子量與SDS-PAGE的分子量不同，這是由于該蛋白質(zhì)與載體非特異性吸附的緣故。
按照試驗例2的方法，對于如上純化的重組型SDE和實施例9中純化的皂草苷分解酶(野生型SDE)測定其最適pH和最適溫度。
最適pH和最適溫度的測定與實施例5的5d)同樣進行。
結果分別如圖8和圖9所示。
結果表明重組型SDE在Tris-鹽酸緩沖液中的活性比野生型SDE高，在高pH下的活性也得到提高。
序列表<110>明治制果株式會社(MEIJI SEIKA KAISHA，LTD.)<120>皂草苷分解酶及其基因以及大豆皂草精醇B的大量生產(chǎn)系統(tǒng)<130>M0713-PCT，M0713-AR，TW(136515px)<140>
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<150>JP 2001/171604<151>2001-6-6<160>54<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1917<212>DNA<213>侵菅新赤殼侵菅變種PF1225菌株(Neocosmospora vasinfecta variety vasinfectaP1225)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1914)<220>
<221>mat_peptide<222>(79)..(1914)<300>
<400>1atg cac ttc ttt gac aaa gcg act gtc tac gct ata ctc tgc ggt agc 48Met His Phe Phe Asp Lys Ala Thr Val Tyr Ala Ile Leu Cys Gly Ser-25 -20 -15
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Tyr Val Gly Ser Asn Ile Glu Ser Cys Asn Asn Asp Val Phe Ala Val280 285 290His Leu Gln Thr Gly Val Val Arg Arg Leu Thr Asn His Pro Glu Tyr295 300 305 310Pro Asp Pro Leu Ala Phe Ser Pro Asp Asn Lys Trp Met Ala Val Met315 320 325Asp Thr Arg Gly Ser Gly Arg Asn Met Phe Ile Ala Gly Met Arg Gly330 335 340Ile Pro Pro Leu Val Asp Ile Val Gly Gly Ile Leu Pro Ala Ser Ser345 350 355Arg Asn Asn Gly Leu Arg Arg Phe Phe Gln Pro Tyr Leu Leu Asp Phe360 365 370Tyr Gly Asp Arg Gly Asp Tyr Tyr Gly Gln Lys Ile Asn Gly Asp Asn375 380 385 390Asn Gly Val Pro Gly Ser Gly Ala Ile Asn Asp Pro Glu Trp Asn Gly395 400 405Met Ala Asp Pro Arg Trp Ser Pro Asp Ser Arg Gln Leu Val Phe Trp410 415 420Gln Thr His Thr Val Ser Pro Ser Cys Gly Gly Ala Asn Pro Leu Pro425 430 435Cys Tyr Pro Ser Lys Glu Gln Gly Gly Arg Asn Tyr Arg Met Tyr Ile440 445 450Ala Thr Phe Thr Ser Arg Ser Pro Ser Pro Pro Ala Pro Val Lys Glu455 460 465 470His Ser Asp Thr Ile Pro Trp Gly Val Pro Tyr Val Pro Gly Ser Gln
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Gly Gly Arg Val Thr Arg Leu Met Leu Ala His Leu Thr Ser Arg Glu440 445 450Pro Leu Asp Leu Glu Pro Val Ala Pro Val Ser Asp Glu Val Pro Trp455 460 465Gly Val Pro Tyr Val Pro Glu Ser Ala Leu Pro Asp Arg Pro Phe Pro470 475 480Ala Glu Gly Asn Tyr Thr Leu Lys Gly Glu Val Ser Gly Ser Ala Ser485 490 495 500Val Ser Ile Ile His Asp Lys Thr Ile Pro Ala Ala Ile Lys Thr Ile505 510 515Ala Val Thr Tyr Arg Asn Tyr Ser Asp Asp Gly Leu His Val Ile Ala520 525 530Gly Ser Glu Arg Phe Thr Asn Thr Val Ala Ser Met Thr Ile Asn Lys535 540 545Val Asp Trp Phe Ser Asp Leu Thr Ser Thr Gly Gln Val Thr Gly Ser550 555 560Lys Lys Thr Ser Pro Gly Gly Phe His Leu Glu Ile Asp Ala Met Thr565 570 575 580Asn Ile Phe Met Ala Asn Gly Thr Leu Thr Thr Thr Ile Asp Gly Lys585 590 595Val Trp Lys Gln Pro Ala Asn Gly Thr600 605<210>5<211>1857
<212>DNA<213>Eupenicillium brefeldianum PF1226<220>
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Ile Tyr Ser Gly Glu His Ile Ile Leu Val Lys Ala Asp Gly Thr Thr80 85 90 95ttc acc aat ggc gat gca tgg aaa tgc tta agc tgc ggt gtt cct tcc384Phe Thr Asn Gly Asp Ala Trp Lys Cys Leu Ser Cys Gly Val Pro Ser100 105 110aaa aat gcc ctt agc ctc gac ccg cag aga gac tat cca cat gtg gct432Lys Asn Ala Leu Ser Leu Asp Pro Gln Arg Asp Tyr Pro His Val Ala115 120 125aga aat tct cga caa gcc ctt tgg gga cac aat atc ctg gat tgc agt480Arg Asn Ser Arg Gln Ala Leu Trp Gly His Asn Ile Leu Asp Cys Ser130 135 140ggc att cct ctg gtc agc gat gag tgc acg cca aac aag acg cat atc528Gly Ile Pro Leu Val Ser Asp Glu Cys Thr Pro Asn Lys Thr His Ile145 150 155tat cca atc tac tgg ccc acc ggc acg aac agc tcg ggc agc act cgg576Tyr Pro Ile Tyr Trp Pro Thr Gly Thr Asn Ser Ser Gly Ser Thr Arg160 165 170 175gaa atg cgt ctg cat cct gac gat acg cac atg ggc tgg agc tca ttc624Glu Met Arg Leu His Pro Asp Asp Thr His Met Gly Trp Ser Ser Phe180 185 190acc agt ggt ggt caa ttc gca tac ttt ggt cga ctg cag ttc cgt caa672Thr Ser Gly Gly Gln Phe Ala Tyr Phe Gly Arg Leu Gln Phe Arg Gln195 200 205aat cca acc gac ggg aca ctt cgt gtt cca aga tat gat ctc gtc gat720Asn Pro Thr Asp Gly Thr Leu Arg Val Pro Arg Tyr Asp Leu Val Asp210 215 220gtc aat ctg ctc gtc cag ccc aat ggt act gcg cct atc atg gcc cag768Val Asn Leu Leu Val Gln Pro Asn Gly Thr Ala Pro Ile Met Ala Gln
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agt gtc aac gac ccg aat tgg aat ggc aga gca gac cca gcc ttc tct1248Ser Val Asn Asp Pro Asn Trp Asn Gly Arg Ala Asp Pro Ala Phe Ser385 390 395ccc gat gga act cgt atc gtc tat tgg cag gcc ttg gtg att cca cct1296Pro Asp Gly Thr Arg Ile Val Tyr Trp Gln Ala Leu Val Ile Pro Pro400 405 410 415gcc tgc ggt ggt gca aat cca ctc ccc tgc cca gtg tca act gcc caa1344Ala Cys Gly Gly Ala Asn Pro Leu Pro Cys Pro Val Ser Thr Ala Gln420 425 430gga ggt cga aca tac cga gtg atg ctg gca cgt ctt tca gat cgc aaa1392Gly Gly Arg Thr Tyr Arg Val Met Leu Ala Arg Leu Ser Asp Arg Lys435 440 445cac acg gac cca gcc cct gtt ttt gct gcg cca gat tat att tct tgg1440His Thr Asp Pro Ala Pro Val Phe Ala Ala Pro Asp Tyr Ile Ser Trp450 455 460gcg act ccg ttc cca cca ggt gca ggt ctt cct acg tct tat acc ctg1488Ala Thr Pro Phe Pro Pro Gly Ala Gly Leu Pro Thr Ser Tyr Thr Leu465 470 475cct gcg ggt aac tac act ctc tac ggc aag gct act ggg ctt gca aat1536Pro Ala Gly Asn Tyr Thr Leu Tyr Gly Lys Ala Thr Gly Leu Ala Asn480 485 490 495gcc acc ctg acc agg gac cca ctt ttc ggc agc ttt aag act gta tcc1584Ala Thr Leu Thr Arg Asp Pro Leu Phe Gly Ser Phe Lys Thr Val Ser500 505 510gtc aac tac acg aat ttc tca gat gat ggc cag cac ttt atc aat ggc1632Val Asn Tyr Thr Asn Phe Ser Asp Asp Gly Gln His Phe Ile Asn Gly515 520 525
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<221>mat_peptide<222>(79)..(1914)<400>53atg cac ttc ttt gac aaa gcg act gtc tac gct ata ctc tgc ggt agc48Met His Phe Phe Asp Lys Ala Thr Val Tyr Ala Ile Leu Cys Gly Ser-25 -20 -15gtg gcc cag act gtt cae act gca ccc tcc gct tct cct cct gct tct96Val Ala Gln Thr Val His Thr Ala Pro Ser Ala Ser Pro Pro Ala Ser-10 -5 -1 1 5gtt cca aac cct cct tct cct gag ccc att acc ctc aag cag cta cct144Val Pro Asn Pro Pro Ser Pro Glu Pro Ile Thr Leu Lys Gln Leu Pro10 15 20ctt cct ccc atc tcc cct agc gac gac gtc ggt gct tgc acg aag cag192Leu Pro Pro Ile Ser Pro Ser Asp Asp Val Gly Ala Cys Thr Lys Gln25 30 35atc aac tct cgt gga acg gga tgt ctc gcc aac ggc gtt ttt gaa acg240
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權利要求
1.蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)選自下述各項(a)由SEQ ID NO.6所示氨基酸序列構成的蛋白質(zhì)；和(b)由上述(a)所述序列中缺失、置換、插入或添加一個或幾個氨基酸殘基的氨基酸序列構成，且具皂草苷分解活性的蛋白質(zhì)。
2.多核苷酸，該多核苷酸編碼權利要求1所述的蛋白質(zhì)。
3.多核苷酸，該多核苷酸選自下述各項(i)由SEQ ID NO.5所示DNA序列構成的多核苷酸；(ii)由上述(i)的序列中缺失、置換、插入或添加一個或幾個堿基的修飾DNA序列構成，且編碼具皂草苷分解活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；和(iii)與具有包含上述(i)所述DNA序列的多核苷酸的DNA序列在嚴格條件下雜交，且編碼具皂草苷分解活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸，其中所述嚴格條件包括于0.5％SSC、0.4％SDS和6M尿素中在42℃下洗滌。
4.權利要求2或3所述的多核苷酸，所述多核苷酸來自絲狀菌。
5.權利要求4所述的多核苷酸，其中所述絲狀菌屬于正青霉屬(Eupenicillium)。
6.權利要求5所述的多核苷酸，其中屬于正青霉屬的絲狀菌為Eupenicillium brefeldianum PF1226(保藏號FERM BP-7476)。
7.重組載體，該重組載體含有權利要求2-6中任一項記載的多核苷酸。
8.宿主，該宿主是由權利要求7記載的重組載體轉(zhuǎn)化的。
9.權利要求8所述的宿主，該宿主是微生物。
10.權利要求9所述的宿主，該宿主是絲狀菌。
11.權利要求10所述的宿主，其中絲狀菌屬于木霉屬(Trichoderma)。
12.權利要求11所述的宿主，其中該宿主是綠色木霉MC300-1(Trichoderma viride MC300-1)(保藏號FERM BP-6047)。
13.權利要求8-12中任一項所述的宿主，該宿主表達皂草苷分解酶。
14.目標蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法，該方法包括培養(yǎng)權利要求8-13中任一項所述的宿主，從獲得的培養(yǎng)物中收集具皂草苷分解活性的蛋白質(zhì)。
15.大豆皂草精醇B的生產(chǎn)方法，該方法包括使用含有可由權利要求8-13中任一項所述的宿主獲得的具皂草苷分解活性的蛋白質(zhì)的培養(yǎng)物，分解以大豆皂草精醇B為糖苷配基的糖苷。
16.大豆皂草精醇B的生產(chǎn)方法，該方法包括使用至少一種選自以下的蛋白質(zhì)權利要求1所述的蛋白質(zhì)和可由權利要求8-13中任一項所述的宿主獲得的蛋白質(zhì)，分解以大豆皂草精醇B為糖苷配基的糖苷。
全文摘要
本發(fā)明提供具皂草苷分解活性的蛋白質(zhì)，具體地說是可分解以大豆皂草精醇B為糖苷配基的苷、生產(chǎn)大豆皂草精醇B的蛋白質(zhì)；編碼該蛋白質(zhì)的多核苷酸；以及可使用它們大量生產(chǎn)大豆皂草精醇B的方法。本發(fā)明的蛋白質(zhì)涉及下述(a)、(b)或(c)(a)含有選自SEQ IDNO.2、4和6所示氨基酸序列的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(b)含有與包含上述(a)的氨基酸序列的蛋白質(zhì)具有至少50％同源性的氨基酸序列，且具皂草苷分解活性的蛋白質(zhì)；或(c)含有上述(a)的氨基酸序列中缺失、置換、插入或添加1個或多個氨基酸殘基的氨基酸序列，且具皂草苷分解活性的蛋白質(zhì)。
文檔編號C12N1/15GK101037680SQ20061012566
公開日2007年9月19日 申請日期2002年6月6日 優(yōu)先權日2001年6月6日
發(fā)明者渡邊學, 御堂直樹, 田村隆由, 隅田奈緒美, 矢口貴志 申請人:明治制果株式會社