專利名稱：用于生物合成7α,15α-二羥基雄烯醇酮的發(fā)酵培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物留體轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基，具體涉及一種用于生物合成 7a，15a-二羥基雄烯醇酮的微生物發(fā)酵培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
甾體類中間體往往可用于生產(chǎn)臨床上各種藥物。7a，15a-二羥基雄烯醇 酮(其結(jié)構(gòu)如下式I )<formula>formula see original document page 3</formula>I
是一種重要的甾體中間體，可用于合成內(nèi)酯類醛固酮受體拮抗劑、利尿劑 和婦科藥物等多種藥物。例如，I是合成口服避孕藥Yasmin活性成分屈 螺酮的重要中間體。
微生物轉(zhuǎn)化在甾體藥物的合成中具有重要地位，幾種重要的甾體微生 物轉(zhuǎn)化反應(yīng)如羥化、脫氫和邊鏈降解己成為工業(yè)上生產(chǎn)甾體激素及其類似 物的重要方法。化合物I的制備很難用化學(xué)的方法合成，目前主要由微生 物轉(zhuǎn)化合成。
i可以由去氫表雄酮(其結(jié)構(gòu)如下式n)經(jīng)微生物轉(zhuǎn)化合成。
Kieslich(German Patent No. DE 2746298 1979-04-19)描述了以辣椒刺盤孢 (Co〃e驗(yàn)/c/2謂—moz'cfes ifo 5257)為菌種將II轉(zhuǎn)化為I的方法；而 Petzoldt等(Angew. Chem. 95(5)， 413—414， 1983; U. S. Patent No. 4435327 1984-03-06)則描述了以亞麻剌盤孢(Co〃e敏/c/z"w cbs 112.21)為菌 種將II轉(zhuǎn)化為I的方法。但是兩種方法底物的投料濃度很低，只有l(wèi)g/L，
所以轉(zhuǎn)化效率很低，工業(yè)生產(chǎn)的成本很高。尚珂等(中國(guó)醫(yī)學(xué)生物技術(shù)應(yīng)
用雜志.2， 30 34，2004)報(bào)道亞麻刺盤孢(CW/e齢/c/z謂//"/AS 3.4486) 可將II轉(zhuǎn)化為I ，但是底物投料濃度很低只有2g/L,收率低只有58.8%, 轉(zhuǎn)化率也較低，約為70%。可見已有的轉(zhuǎn)工藝不能高效的合成I ，急需更 為有效的轉(zhuǎn)化工藝，以提高底物的投料濃度和轉(zhuǎn)化率，以降低生產(chǎn)成本。
<formula>formula see original document page 4</formula>

發(fā)明內(nèi)容
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種以亞麻刺盤孢 (Co〃etoWc/2畫//m'AS 3.4486，保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心， 編號(hào)AS 3.4486)為菌種，生物合成7a，15ct-二羥基雄烯醇酮的發(fā)酵培養(yǎng)基， 包含有機(jī)氮源、碳源、無機(jī)鹽和金屬離子，其特征在于，所述的有機(jī)氮源 為蛋白胨、酵母提取物、牛肉膏、酵母膏。
所述的有機(jī)氮源的含量為6g/L 30g/L，優(yōu)選10g/L 15g/L，更優(yōu)選 12g/L。
優(yōu)選地，所述的有機(jī)氮源為酵母提取物。 所述的碳源為多糖類碳源。
所述多糖類碳源為糊精、麥芽糊精、淀粉、可溶性淀粉、玉米粉等， 優(yōu)選為麥芽糊精和可溶性淀粉，更優(yōu)選麥芽糊精；其含量為20g/L 50g/L， 優(yōu)選為35g/L。
本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基還可以含有天然油脂。
所述天然油脂可以為豆油、菜籽油、玉米胚胎油、葵花籽油和棉籽油 等植物油，豬油、羊油、牛油和魚油等動(dòng)物油脂，以及卵磷脂、磷脂酰甘 油、磷脂酸等磷脂，其含量為0.5g/L 10g/L，較優(yōu)為2g/L 5g/L，最優(yōu)為 3g/L。
培養(yǎng)基中還需加入鉀鹽、磷酸鹽、銨鹽和硝酸鹽等無機(jī)鹽和鎂等金屬 離子。
不同有機(jī)氮源對(duì)轉(zhuǎn)化的影響是很大的，實(shí)驗(yàn)考察了花生餅粉、豆餅粉、 棉籽粉、豆粕、蛋白胨、酵母提取物、牛肉膏和酵母膏九種常用有機(jī)氮源，
添加的濃度均為10g/L，底物的投料濃度相同，轉(zhuǎn)化結(jié)束后HPLC檢測(cè)各 有機(jī)氮源發(fā)酵液中產(chǎn)物的濃度(見附圖1)。從圖可以看出有機(jī)氮源采用 蛋白胨、酵母提取物、牛肉膏、酵母膏是產(chǎn)物的含量高，其中又以酵母提 取物最高。
不同碳源對(duì)轉(zhuǎn)化也具有明顯的影響，實(shí)驗(yàn)考察了糊精、麥芽糊精、淀 粉、可溶性淀粉、玉米粉、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖和果糖等碳源，添加的 濃度均為30g/L，底物的投料濃度相同，轉(zhuǎn)化結(jié)束后HPLC檢測(cè)各碳源發(fā) 酵液中產(chǎn)物的濃度(見附圖2)。從圖可以看出糊精、麥芽糊精、淀粉、 可溶性淀粉和玉米粉等多糖類碳源作為碳源時(shí)菌種轉(zhuǎn)化能力較強(qiáng)，而以蔗 糖和麥芽糖等二糖，或葡萄糖和果糖等單糖碳源作為碳源時(shí)轉(zhuǎn)化能力則較 低。
在培養(yǎng)基中加入少量的天然油脂可以促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)，同時(shí)更好的促 進(jìn)底物在發(fā)酵液中的轉(zhuǎn)化，實(shí)驗(yàn)選取了豆油、菜籽油、玉米胚胎油、葵花 籽油、豬油、魚油、卵磷脂和磷脂酰甘油等多種天然油脂分別加入培養(yǎng)基， 加入量度為3g/L，以沒有加入天然油脂的培養(yǎng)基作為對(duì)照，底物的投料濃 度相同，轉(zhuǎn)化結(jié)束后HPLC檢測(cè)各培養(yǎng)基中產(chǎn)物的濃度(見附圖3)。從 圖可以看出加入各類天然油脂后，轉(zhuǎn)化率都有明顯的提高。
采用本發(fā)明發(fā)酵培養(yǎng)基合成產(chǎn)物I時(shí)，底物投料濃度可以達(dá)到8g/L
(底物重量/發(fā)酵液體積)，轉(zhuǎn)化率可以到達(dá)85%。而采用現(xiàn)有技術(shù)的發(fā)酵 培養(yǎng)基合成產(chǎn)物I時(shí)，底物投料濃度只有2g/L，轉(zhuǎn)化率約為70%左右。 因此，通過本發(fā)明經(jīng)過組分優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基來進(jìn)行I的轉(zhuǎn)化合成可以很 好地解決現(xiàn)有技術(shù)底物投料濃度低和轉(zhuǎn)化率不高的缺點(diǎn)，從而降低I的工 業(yè)生產(chǎn)成本。


圖1表示不同有機(jī)氮源對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響；
圖2表示不同碳源對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響；
圖3表示加了天然油脂的培養(yǎng)基對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的促進(jìn)作用。
具體實(shí)施例方式
以下通過具體的實(shí)施例來進(jìn)一步闡明本發(fā)明，但這些實(shí)施例不構(gòu)成對(duì) 本發(fā)明的限制。其中，酵母提取物為湖北安琪酵母股份有限公司生產(chǎn)，蛋 白胨為上海東海制藥廠生產(chǎn)，牛肉膏為成都市華西生化制品廠生產(chǎn)，酵母 膏、糊精、淀粉、可溶性淀粉、卵磷脂為中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司 生產(chǎn)，花生餅粉為北京康明威培養(yǎng)基技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，麥芽糊精為 海鹽六和淀粉化工有限公司生產(chǎn)，玉米粉為諸城裕豐制粉有限公司生產(chǎn)， 葵花籽油為青島嘉里植物油有限公司生產(chǎn)，豆油為上海嘉里糧油工業(yè)有限 公司生產(chǎn)。
實(shí)施例1
i肯養(yǎng)基
斜面培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基(200g土豆煮汁1000ml，葡萄糖20g，瓊 脂20g) ， 12rC滅菌20min。
種子培養(yǎng)基花生餅粉10g/L;糊精30g/L;KCl 1 g/L; (NH4)2HP04 lg/L; K2HP04 lg/L; MgS04.6H20 lg/L。 pH5.5， 121。C滅菌20min。
發(fā)酵培養(yǎng)基酵母提取物10g/L;麥芽糊精35g/L;葵花籽油5g/L; KC1
lg/L; (NH4)2HP04 lg/L; K2HP04lg/L; MgS04.6H20 lg/L。 pH5.5， 121 。C滅菌20min。
轉(zhuǎn)化過程將接種菌種的斜面置于28'C恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)6天，得 到成熟的孢子，然后成熟的孢子接種于裝有30ml種子培養(yǎng)基的250ml搖 瓶中，在3(TC、 230rpm搖床上培養(yǎng)3天，得到成熟的種子，得到的種子 以10%的接種量接入裝有100ml發(fā)酵培養(yǎng)基的750ml搖瓶中，置于30°C 、 230r/min搖床繼續(xù)培養(yǎng)20小時(shí)，以每升發(fā)酵液8g底物的量加入底物，置 于28°C 、 240r/min搖床繼續(xù)轉(zhuǎn)化至48小時(shí)時(shí)放瓶，取發(fā)酵液2ml加入8ml 甲醇浸泡過夜，離心取上清用HPLC進(jìn)行分析，采用外標(biāo)法對(duì)樣品進(jìn)行定 量，計(jì)算轉(zhuǎn)化率為86.5。％。 HPLC條件為色譜儀Waters510型高效液相色
譜儀；色譜柱C18柱；檢測(cè)器Waters 996 Photodiode Array Detector; 流動(dòng)相甲醇:水二50:50;流速0.8ml/min;進(jìn)樣量5^1;柱溫室溫。
實(shí)施例2
斜面培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基同實(shí)施例1。
發(fā)酵培養(yǎng)基蛋白胨20g/L;麥芽糊精30g/L;豬油5g/L; KCllg/L;
(NH4)2HP04 lg/L; K2HP04lg/L; MgS04.6H20 lg/L。 pH5.5， 121。C滅菌 20min。
轉(zhuǎn)化過程同實(shí)施例l，最后的轉(zhuǎn)化率為85.1%。 實(shí)施例3
斜面培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基同實(shí)施例1。
發(fā)酵培養(yǎng)基牛肉膏30g/L;糊精20g/L;卵磷脂lg/L; KC1 lg/L;
(NH4)2HP04 lg/L; K2HP04 lg/L; MgS04.6H20 lg/L。 pH5.5， 121。C滅菌 20min。
轉(zhuǎn)化過程同實(shí)施例1，最后的轉(zhuǎn)化率為85.3%。
斜面培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基同實(shí)施例1。
發(fā)酵培養(yǎng)基酵母提取物6g/L;玉米粉50g/L;卵磷脂2g/L; KC1 lg/L;
(NH4)2HP04 lg/L; K2HP04 lg/L; MgS04'6H20 lg/L。 pH5.5， 121。C滅菌 20min。
轉(zhuǎn)化過程同實(shí)施例1，最后的轉(zhuǎn)化率為84.3。％。
實(shí)施例5
斜面培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基同實(shí)施例1。
發(fā)酵培養(yǎng)基酵母提取物12g/L;麥芽糊精35g/L;豆油0.5g/L; KC1 lg/L; (NH4)2HP04 lg/L; K2HP04 lg/L; MgS04,6H20 lg/L。 pH5.5， 121 。C滅菌20min。
轉(zhuǎn)化過程同實(shí)施例l，最后的轉(zhuǎn)化率為84.1%。
實(shí)施例6
斜面培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基同實(shí)施例1。
發(fā)酵培養(yǎng)基酵母提取物12g/L;可溶性淀粉35g/L;豆油5g/L; KC1 lg/L; (NH4)2HP04 lg/L; K2HP04lg/L; MgS04.6H20 lg/L。 pH5.5， 121 。C滅菌20min。
轉(zhuǎn)化過程同實(shí)施例l，最后的轉(zhuǎn)化率為86.1%。
實(shí)施例7
斜面培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基同實(shí)施例1。
發(fā)酵培養(yǎng)基酵母提取物12g/L;麥芽糊精35g/L;豆油10g/L; KC1 lg/L; (NH4)2HP04 lg/L; K2HP04 lg/L; MgS04.6H20 lg/L。 pH5.5， 121 。C滅菌20min。
轉(zhuǎn)化過程同實(shí)施例l，最后的轉(zhuǎn)化率為87.1%。
實(shí)施例8
7.5L發(fā)酵罐轉(zhuǎn)化合成I 各培養(yǎng)基同實(shí)施例4
轉(zhuǎn)化過程將接種菌種的斜面置于28t:恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)6天，得 到成熟的孢子，然后成熟的孢子接種于裝有100ml種子培養(yǎng)基的750ml搖 瓶中，在30。C、 230rpm搖床上培養(yǎng)3天，得到成熟的種子，得到的種子 以10X的接種量接入4.5L的發(fā)酵培養(yǎng)基中(裝于7.5L發(fā)酵罐中)，溫度 30°C，通氣量0.4VVM，轉(zhuǎn)速180rpm進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)20小時(shí)后，以每升發(fā) 酵液8g底物的量加入底物，然后溫度調(diào)至28"C開始轉(zhuǎn)化，在轉(zhuǎn)化過程中 通過增加轉(zhuǎn)速和通氣量控制溶氧在20%飽和度以上。轉(zhuǎn)化過程中用薄層層 析法確定轉(zhuǎn)化程度，分析方法取少量轉(zhuǎn)化液于離心管中，加入等體積乙 酸乙酯，經(jīng)超聲波細(xì)胞破碎后于4000r/min、 25。C離心6min，取少量上清 點(diǎn)板，展開劑為三氯甲烷:無水乙醇二10: 1(V/V),以10%硫酸溶液噴灑 后加熱顯色，觀察斑點(diǎn)情況，確定轉(zhuǎn)化程度。到48小時(shí)時(shí)產(chǎn)物停止積累， 結(jié)束轉(zhuǎn)化放罐，HPLC分析轉(zhuǎn)化率為85.4%。
權(quán)利要求
1.一種以亞麻刺盤孢(Colletotrichum lini AS 3.4486)為菌種，生物合成7α，15α-二羥基雄烯醇酮的發(fā)酵培養(yǎng)基，包含有機(jī)氮源、碳源、無機(jī)鹽和金屬離子，其特征在于，所述的有機(jī)氮源為蛋白胨、酵母提取物、牛肉膏、酵母膏。
2. 如權(quán)利要求1所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，所述的有機(jī)氮源的 含量為6g/L 30g/L。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，所述的有機(jī)氮源 為酵母提取物，其含量為10g/L 15g/L。
4. 如權(quán)利要求1所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，所述的碳源為多糖 類碳源。
5. 如權(quán)利要求4所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，所述多糖類碳源為 糊精、麥芽糊精、淀粉、可溶性淀粉、玉米粉；其含量為20g/L 50g/L。
6. 如權(quán)利要求5所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，所述多糖類碳源為 為麥芽糊精或可溶性淀粉，其含量為35g/L。
7. 如權(quán)利要求1所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基還含有 天然油脂。
8. 如權(quán)利要求7所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，所述天然油脂為植 物油、動(dòng)物油脂或磷脂。
9. 如權(quán)利要求8所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，所述植物油為豆油、 菜籽油、玉米胚胎油、葵花籽油、棉籽油；所述動(dòng)物油脂為豬油、羊油、 牛油、魚油；所述磷脂為卵磷脂、磷脂酰甘油、磷脂酸。
10. 如權(quán)利要求7所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，所述天然油脂的含 量為0.5g/L 10g/L。
11. 如權(quán)利要求10所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，所述天然油脂的 含量為2g/L 5g/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種以亞麻刺盤孢(Colletotrichum lini AS 3.4486)為菌種，生物合成7α，15α-二羥基雄烯醇酮的發(fā)酵培養(yǎng)基，包含有機(jī)氮源、碳源、無機(jī)鹽和金屬離子，其特征在于，所述的有機(jī)氮源為蛋白胨、酵母提取物、牛肉膏、酵母膏。采用本發(fā)明發(fā)酵培養(yǎng)基合成產(chǎn)物I時(shí)，底物投料濃度可以達(dá)到8g/L(底物重量/發(fā)酵液體積)，轉(zhuǎn)化率可以到達(dá)85％。因此，可以很好地解決現(xiàn)有技術(shù)底物投料濃度低和轉(zhuǎn)化率不高的缺點(diǎn)，從而降低I的工業(yè)生產(chǎn)成本。
文檔編號(hào)C12P33/06GK101191141SQ200610118510
公開日2008年6月4日 申請(qǐng)日期2006年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月20日
發(fā)明者琴 張, 胡海峰, 陶榮盛 申請(qǐng)人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院