專利名稱：與甘藍(lán)未熟抽薹基因相連鎖的分子標(biāo)記及其建立方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子標(biāo)記的建立方法，尤其涉及與甘藍(lán)未熟抽薹基因相連 鎖的分子標(biāo)記的建立方法。
背景技術(shù)：
甘藍(lán)(Bmw/ca O/eracea L. Var. Ojp/tota L.)是十字花科蕓薹屬的二年生 蔬菜作物，在我國分布相當(dāng)廣泛。近年來，春甘藍(lán)種植面積增加較快，但 由于種植的一些春甘藍(lán)品種耐未熟抽薹性較差，再加上春季經(jīng)常出現(xiàn)倒春 寒現(xiàn)象和長期陰天寡照天氣，使得栽培的春甘藍(lán)品種經(jīng)常發(fā)生未熟抽薹現(xiàn) 象，從而嚴(yán)重地影響了甘藍(lán)的品質(zhì)和產(chǎn)量。據(jù)調(diào)査，1998 2005年間南方地 區(qū)春甘藍(lán)未熟抽薹率總在15%~50%之間，有些農(nóng)戶有時達(dá)100%。
當(dāng)前，國內(nèi)應(yīng)用的耐未熟抽薹甘藍(lán)品種主要是以"中甘11號"、"8398" 為代表的春甘藍(lán)品種， 一般適合我國北方地區(qū)氣候條件及栽培方式，引種 到黃河以南及長江中下游地區(qū)，大都表現(xiàn)不耐寒、易未熟抽薹， 一般在1 月份采用保護(hù)地育苗，在5月份上市，效益不高；而以"爭春"、"春豐" 為代表的適合露地越冬的耐未熟抽薹春甘藍(lán)品種，又存在著熟性偏遲，中 心柱偏長，葉球不夠緊實等問題，在3-4月份上市的春甘藍(lán)品種尚是空缺。 因此，盡快選育出耐未熟抽薹、早熟、品質(zhì)優(yōu)良的春甘藍(lán)新品種已成為甘 藍(lán)生產(chǎn)中迫切需要解決的一大課題。
但是，目前耐未熟抽薹甘藍(lán)新品種的選育都是依靠傳統(tǒng)的育種方法， 需要跨年度進(jìn)行耐未熟抽薹性狀的選擇鑒定，周期長，工作量大。另外，
耐未熟抽薹性狀受遺傳背景及環(huán)境因素影響較大，給依靠表型選擇造成了 困難。近幾年發(fā)展起來的分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)，為植物育種學(xué)家提供了 一條新的途徑。該技術(shù)是將分子標(biāo)記技術(shù)與傳統(tǒng)育種學(xué)相結(jié)合，用穩(wěn)定、
可靠的DNA分子標(biāo)記代替易受環(huán)境影響的表型標(biāo)記，對育種材料進(jìn)行篩 選。利用分子標(biāo)記輔助育種的關(guān)鍵是篩選到與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo) 記，因此，開發(fā)研究一種與甘藍(lán)未熟抽薹基因相連鎖的分子標(biāo)記的建立方 法，以滿足有關(guān)方面的需要，將具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是公開一種與甘藍(lán)未熟抽薹基因相連鎖的 分子標(biāo)記及其建立方法，以滿足有關(guān)方面的需要。
本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思是這樣的
本發(fā)明根據(jù)"群體分離分組法(bilked segregant analysis, BSA)"的原
理，利用甘藍(lán)易未熟抽薹材料與耐未熟抽薹材料的雜交分離群體，通過 RAPD技術(shù)開展甘藍(lán)未熟抽薹性狀分子標(biāo)記研究，尋找與甘藍(lán)未熟抽薹基 因連鎖的RAPD標(biāo)記，以用于甘藍(lán)未熟抽薹的早期鑒定和針對該特性的分 子標(biāo)記輔助育種。
本發(fā)明所說的與甘藍(lán)未熟抽薹基因相連鎖的分子標(biāo)記，其特征在于， 所述的分子標(biāo)記S97靴和U16446，是用下述方法得到的
(1)、按照王小佳主編的《蔬菜育種學(xué)》(中國農(nóng)業(yè)出版社2000年出版) 所敘述的甘藍(lán)雜交和自交方法，將上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所甘藍(lán)課題 組選育的甘藍(lán)易未熟抽薹親本2002-45和耐未熟抽薹親本2002-90進(jìn)行雜 交，得到F1代，再經(jīng)過自交獲得F2分離群體。
(2) 、用SDS方法(在本文的具體實施方式
中有詳細(xì)描述)提取F2代 單株的DNA，并選取10株典型的發(fā)生未熟抽薹的單株DNA等量混合為未 熟抽薹池(F池)，選取10株正常生理發(fā)育而包球成熟的單株DNA混合為耐 未熟抽薹池(R池)；
(3) 、利用兩個基因池篩選引物，再利用獲得的候選引物對F2代單株進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，驗證多態(tài)片段的穩(wěn)定性；
(4) 、篩選出的分子標(biāo)記S97股和U16446，經(jīng)過連鎖性鑒定，與甘藍(lán)未 熟抽薹基因相連鎖。
經(jīng)上海生工生物工程有限公司測序分析，S97392的DNA序列為:
GTCGT
經(jīng)上海生工生物工程有限公司測序分析，U16446的DNA序列為:
2、與甘藍(lán)未熟抽薹基因相連鎖的分子標(biāo)記是采用RAPD分子標(biāo)記進(jìn)行 篩選的，具體的方法是
(1) 、基因池間DNA多態(tài)性分析
采用上海生工生物工程有限公司合成的lObp寡核苷酸作為隨機(jī)引物， 在Mastercycler 5333型PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為20 pl， 其中25 mmol/L MgCl22.0nl， 10 X PCR Buffer 2.0 pl， 10 mmol/L dNTP 0.5 pl， 5U/pLTaqE0.5 ^， 20ng/>1 Primer 2.0 pl， 1 Ong/pl模板DNA 3 pl ，滅菌 雙蒸水10pl，加蓋一滴礦物油進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序為94"C預(yù)變性5 min; 94。C變性lmin， 37""C退火1 min， 72。C延伸1.5 min， 40個循環(huán);72。C延伸 10 min后15。C保存。RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析采用濃度為15 g/L的瓊脂糖 凝膠(含0.15 ng/L EB)，電泳緩沖液為lxTAE，保持90 V恒壓(4 5 V/cm) 電泳1.5 2h，凝膠成像儀成像分析。
(2) 、分子標(biāo)記的連鎖性鑒定
在同一條件下鑒定F2代分離群體的未熟抽薹發(fā)生情況。用 Mapmaker/3.0軟件對分離群體單株的未熟抽薹性和分子標(biāo)記的分離數(shù)據(jù)進(jìn) 行連鎖分析，利用Kosambi函數(shù)將重組率轉(zhuǎn)化為遺傳圖距cM(centimorgan)。 所說的Mapmaker/3.0軟件在生物谷網(wǎng)站(http:〃www.bioon.com/Soft)可以下尊。
本發(fā)明的與甘藍(lán)未熟抽薹基因相連鎖的分子標(biāo)記，可用于甘藍(lán)未熟抽 薹的早期鑒定和針對該特性的分子標(biāo)記輔助育種。 有益效果
本發(fā)明利用分子標(biāo)記方法得到兩個與甘藍(lán)未熟抽薹基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，可以用于甘藍(lán)未熟抽薹的早期鑒定和針對該特性的分子標(biāo)記輔助 育種，有效地克服了常規(guī)鑒定方法所需時間周期長的缺點。同時也可利用 這兩個標(biāo)記進(jìn)一步克隆未熟抽薹基因、并對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能分析，這對 于進(jìn)一步了解甘藍(lán)未熟抽薹的分子遺傳學(xué)機(jī)理有積極意義。因此，本研究 結(jié)果在甘藍(lán)育種實踐及抽薹理論研究上都很有價值。


圖l:候選引物部分F2單株驗證結(jié)果。
圖中A、 B、 C、 D分別為引物S20、 S86、 S97、 U16對部分單株擴(kuò)增 的結(jié)果，泳道1~20為未熟抽薹植株，泳道21 29為正常植株。
具體實施例方式
、
本發(fā)明的具體實施程序是利用甘藍(lán)易未熟抽薹親本2002-45與耐未熟 抽薹親本2002-90進(jìn)行雜交得到Fl代，再經(jīng)過自交獲得F2分離群體。提 取F2分離群體單株數(shù)共計117株，其中未熟抽薹單株90株，正常包球的 耐未熟抽薹單株27株。
1、提取DNA
按如下程序提取甘藍(lán)單株材料的基因組DNA:
取新鮮組織2g，在液氮中研磨成粉，置于50ml離心管，加入8ml提 取液(100mMTrispH8.0， 50mMEDTA， 500mMNaCl， 1.5%SDS)， 65°C 情況下30分鐘，不時顛倒混勻，加2.5ml5M乙酸鉀冰浴10分鐘，加5 ml 氯仿，顛倒混勻，10000rmp離心8分鐘，取上清移入新管，加2 / 3體積預(yù) 冷異丙醇，顛倒混勻，-20°。置1-2小時，挑出絮狀白色DNA， 70%乙醇洗 1-2次，吹干，溶于100ul(或適量)TE中，并在1%瓊脂糖凝膠上電泳，用
標(biāo)準(zhǔn)XDNA作對照，估算甘藍(lán)DNA樣品的濃度，獲得高純度甘藍(lán)DNA。 從提取的樣品中選取10株典型的發(fā)生未熟抽薹的單株DNA等量混合為未 熟抽薹池(F池)，選取10株正常生理發(fā)育而包球成熟的單株DNA混合為耐 未熟抽薹池(R池)。
2、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)分析
(1) 、 PCR擴(kuò)增
RAPD引物購自上海生工生物工程公司，共計260個。
反應(yīng)體系為20 pl，其中25 mmol/LMgCl22.0^il， 10XPCR Buffer 2.0 pl，
10 mmol/L dNTP 0.5 pl， 5 U/ Taq E 0.5 pi, 20ng / pi Primer 2.0 (il， 10ng/ pi
模板DNA 3^1，滅菌雙蒸水lO(il，加蓋一滴礦物油，在Mastercycler 5333
型PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。
反應(yīng)程序為94""C預(yù)變性5 min; 94。C變性1 min， 37。C退火1 min， 72
。C延伸1.5 min， 40個循環(huán)；72"延伸10 min后15。C保存。
(2) 、電泳檢測
RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測采用濃度為15 g/L的瓊脂糖凝膠(含0.15 ng/L EB)，電泳緩沖液為lxTAE，保持90 V恒壓(4 5 V/cm)電泳1.5 2h，凝膠 成像儀成像分析。
(3) 、引物篩選結(jié)果
根據(jù)"群體分離分組法(bilked segregant analysis, BSA)"原理，先利 用F、 R兩基因池對260個引物進(jìn)行篩選，其中l(wèi)l個引物對基因池?zé)o擴(kuò)增 產(chǎn)物，16個引物擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶數(shù)少于4條，其它233個引物在兩池間能 擴(kuò)增產(chǎn)生豐富、清晰的條帶，即有效引物比例為89.6%。 233個有效引物擴(kuò) 增產(chǎn)生條帶約1200條，平均每個引物擴(kuò)增出條帶5.2條。
233個有效引物中有217個引物對基因池擴(kuò)增譜帶完全一致，16個引 物能擴(kuò)增產(chǎn)生多態(tài)性，經(jīng)反復(fù)驗證，只有4個引物即S20、 S86、 S97、 U16 (S20: GGACCCTTAC; S86: GTGCCTAACC; S97: ACGACCGACA;賜: CTGCGCTGGA)表現(xiàn)出穩(wěn)定的多態(tài)性，且差異條帶都出現(xiàn)在F池擴(kuò)增產(chǎn)物 中，引物S20、 S86、 S97均產(chǎn)生1條差異條帶，片段大小約為600bp、 500bp、 400bp，引物U16擴(kuò)增產(chǎn)生2條差異條帶，大小約為450bp、 550bp，因此 將S20、 S86、 S97、 U16確定為甘藍(lán)未熟抽薹基因RAPD標(biāo)記候選引物。 3、候選引物單株驗證
利用分離群體中的單株DNA對候選引物進(jìn)一步驗證，結(jié)果見附圖1， 圖中A、 B、 C、 D分別為引物S20、 S86、 S97、 U16對部分單株擴(kuò)增的結(jié) 果，泳道1~20為未熟抽薹植株，泳道21 29為正常植株。由圖可見，4引 物在多數(shù)單株上能擴(kuò)增產(chǎn)生與基因池間一致的多態(tài)性，可見擴(kuò)增產(chǎn)生的特 征片段與甘藍(lán)未熟抽薹基因存在連鎖關(guān)系，可確定其為甘藍(lán)未熟抽薹基因 的RAPD標(biāo)記。但各標(biāo)記在分離群體中并非表現(xiàn)為全有和全無的差別，有 少數(shù)發(fā)生未熟抽薹的單株上未能擴(kuò)增出差異條帶，同樣也有少數(shù)正常植株 擴(kuò)增產(chǎn)生差異條帶，即存在一定的交換率，且各標(biāo)記的交換率不同，說明 各標(biāo)記與甘藍(lán)未熟抽薹基因連鎖程度不同。
對5個連鎖標(biāo)記在所有單株中出現(xiàn)情況進(jìn)行分析，統(tǒng)計未熟抽薹植株 有標(biāo)記、未熟抽薹植株無標(biāo)記、正常植株有標(biāo)記、正常植株無標(biāo)記的單株 數(shù)，計算出標(biāo)記符合率、交換率，并利用Kasambi公式計算單個標(biāo)記與甘 藍(lán)未熟抽薹基因的遺傳距離。引物S97、 U16相對引物S20、 S86顯示出較
為整齊的多態(tài)性，其中標(biāo)記S97靴和U16446與未熟抽薹基因遺傳距離分別
為8.58cM和10.45cM。
序列表
<110>上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院
<120>與甘藍(lán)未熟抽薹基因相連鎖的分子標(biāo)記及其建立方法
<130>S
<160>2
<170>Patent In versinon 3.1
<210>1
<211>392bp
<212>DNA
〈213〉甘藍(lán)CBrow7cfl O/eracea L. Var. Ca/ z'/"to L)
<220>
<221>CDS
<400> 1
ACG ACC GAC AGC CAC GTC TTC AGC GAC CAG GTT CAC GGG CCT GTG 45 GCC CCA ACT GAG CCC CGA AAT CAG AAG GTG CGA AGT TAG CTG ATG 90 AAA CCG TGT CGA GCA TGT CAT CTA CTC ATT AGA TGG ATT GAA GCG 135 ATA TTT CGT CAG TTT TCA AGA TGA TTC ACT TTA ACT ATC TTC CAT ATC 183 ACG CGA GCC CAC TTG GGC GAC GCT TCA AAG CTG ATA GGA AAC AGA 228 CCG AAA TGC CGA CAC TTC TCG CGA TAC AGG CAA GCC CTC GCC ACG 273 AAC ACT CGA CCT CCC GCA AGC TCT CGG CGG TAT TCG TTG AGA AAT 318 GGC TGG CCG CAC ACC CCG GCG GTA AAG CCA TTG AAC GCG ATC TGA 363 TTA AGA CCA ATC TGC CGT TTG TCG GTC GT 392
<210>2
<211>446bp
<212>DNA
〈213〉甘藍(lán)CSrassi'ca L Var. Capi.toto L.)
<220>
<221>CDS <400>2
ACA TAA CCG CTC TGC TCT TCA AGC AAA TTG AGA ACG GTG ACT GGG 93
TTC CCG CAT CCA CGC CGC AAA CGC CTG CAC ATA CTC CAA CCC GGC 282
ATG CTC TTG CGC CAC GTC GAG CCA ATA CCC AAA CGG CCC CGT CAC 327 CTC GAT ATC GGA AAA CTG CGC GAG ACT TCC ATC GGC CAG TTC TTC GAC 375
GAT CAT GTT GCG ATC GAC GAT CGC CAG CCC CGC GCC TTT GCG CGC 420
GGC GCG AAT CGC CTG CTC CAG CGC AG 44權(quán)利要求
1.一種與甘藍(lán)未熟抽薹基因相連鎖的分子標(biāo)記，其特征在于，所述的分子標(biāo)記S97392和U16446，是用下述方法得到的(1)、利用甘藍(lán)易未熟抽薹親本2002-45與耐未熟抽薹親本2002-90進(jìn)行雜交得到F1代，再經(jīng)過自交獲得F2分離群體；(2)、用SDS方法提取F2代單株的DNA，并選取10株典型的發(fā)生未熟抽薹的單株DNA等量混合為未熟抽薹池(F池)，選取10株正常生理發(fā)育而包球成熟的單株DNA混合為耐未熟抽薹池(R池)；(3)、利用兩個基因池篩選引物，再利用獲得的候選引物對F2代單株進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(4)、篩選出分子標(biāo)記S97392和U16446。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的與甘藍(lán)未熟抽薹基因相連鎖的分子標(biāo)記，其 特征在于，是采用RAPD分子標(biāo)記進(jìn)行篩選的，具體的方法是(1)、基因池間DNA多態(tài)性分析以10bp寡核苷酸作為隨機(jī)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為20 pl， 其中25 mmol/LMgCl2 2.0^1， 10 X PCR Buffer 2.0 |xl， 10 mmol/L dNTP 0.5 pl， 5 U/ (iL Taq E 0.5 |il， 20ng / pi Primer 2.0 |il， lOng/ (il模板DNA 3 jil，滅菌 雙蒸水10 pl，加蓋一滴礦物油進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序為94'C預(yù)變性5 min; 94-C變性lmin， 37"C退火1 min， 72。C延伸1.5 min， 40個循環(huán)；72。C延伸 10 min后15"C保存。RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析采用濃度為15 g/L的瓊脂糖 凝膠(含0.15 ng/L EB)，電泳緩沖液為lxTAE，保持90 V恒壓(4 5 V/cm) 電泳1.5 2h，凝膠成像儀成像分析；(2)、分子標(biāo)記的連鎖性鑒定在同一條件下鑒定F2代分離群體的未熟抽薹發(fā)生情況，用 Mapmaker/3.0軟件對分離群體單株的未熟抽薹性和分子標(biāo)記的分離數(shù)據(jù)進(jìn) 行連鎖分析，利用Kosambi函數(shù)將重組率轉(zhuǎn)化為遺傳圖距cM(centimorgan)。
3、 一種與甘藍(lán)未熟抽薹基因相連鎖的分子標(biāo)記，其特征在于所說的分 子標(biāo)記為S97w和U16446。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的與甘藍(lán)未熟抽薹基因相連鎖的分子標(biāo)記的應(yīng) 用，其特征在于，用于甘藍(lán)未熟抽薹的早期鑒定和針對該特性的分子標(biāo)記 輔助育種。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種與甘藍(lán)未熟抽薹基因相連鎖的分子標(biāo)記的建立方法。本發(fā)明克服常規(guī)標(biāo)記方法工作量大、易受環(huán)境影響、育種周期長等缺點。采用RAPD分子標(biāo)記方法對易未熟抽薹和耐未熟抽薹的甘藍(lán)親本及其雜交后代“2002-45×2002-90”進(jìn)行未熟抽薹基因標(biāo)記的篩選。PCR反應(yīng)采用的是上海生工生物工程有限公司合成的10bp寡核苷酸隨機(jī)引物，篩選后得到與甘藍(lán)未熟抽薹基因相連鎖的分子標(biāo)記S97₃₉₂和U16₄₄₆。這些標(biāo)記可用于甘藍(lán)未熟抽薹的早期鑒定和針對該特性的分子標(biāo)記輔助育種，本發(fā)明對甘藍(lán)育種實踐及未熟抽薹理論研究都很有價值。
文檔編號C12N15/29GK101191132SQ20061011851
公開日2008年6月4日 申請日期2006年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月20日
發(fā)明者任云英, 沖 劉, 薄天岳, 陳錦秀 申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院