專利名稱：甘藍(lán)型油菜c染色體組定向轉(zhuǎn)基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因植物生態(tài)安全研究領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及基因定向轉(zhuǎn)化方法，應(yīng)用該方法獲得的轉(zhuǎn)基因油菜，環(huán)境釋放時(shí)外源轉(zhuǎn)基因擴(kuò)散的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)小。
背景技術(shù)：
油菜是以收獲種子榨油為目的的栽培十字花科蕓薹屬植物的統(tǒng)稱，主要包括甘藍(lán)型油菜(Brassica napus L.)、白菜型油菜(B.campestris L.)和芥菜型油菜(B.juncea Czern.et Coss.)。當(dāng)今世界各國(guó)種植的油菜主要是甘藍(lán)型油菜，其它類型油菜種植面積很小。現(xiàn)在所說(shuō)的油菜如不特別說(shuō)明，均指甘藍(lán)型油菜。
油菜是重要的油料作物，在世界油料作物生產(chǎn)中，僅次于大豆，居第二位。中國(guó)、印度、加拿大、澳大利亞、歐洲是世界主要油菜生產(chǎn)國(guó)。自1999年以來(lái)，中國(guó)油菜播種面積一直在1億畝以上，總產(chǎn)量在1100萬(wàn)噸左右，中國(guó)是世界油菜第一生產(chǎn)大國(guó)，油菜種植面積和總產(chǎn)量均居世界第一位。
1996年全球第一次大面積種植轉(zhuǎn)基因抗除草劑作物，其后持續(xù)擴(kuò)大，轉(zhuǎn)基因作物迅速發(fā)展，到2004年全球轉(zhuǎn)基因作物的種植面積達(dá)8,100萬(wàn)公頃，比9年前增加了47倍。2004年全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積的增長(zhǎng)率為20％，連續(xù)9年增長(zhǎng)率達(dá)兩位數(shù)。2004年全球共17個(gè)國(guó)家(11個(gè)發(fā)展中國(guó)家及6個(gè)發(fā)達(dá)國(guó)家)825萬(wàn)農(nóng)民種植8,100萬(wàn)公頃的轉(zhuǎn)基因作物。
轉(zhuǎn)基因油菜的種植面積則由2002年的300萬(wàn)公頃增長(zhǎng)至2005年的360萬(wàn)公頃，占全球轉(zhuǎn)基因作物總種植面積的5％，主要集中在加拿大和美國(guó)。
國(guó)內(nèi)外大量的研究已證實(shí)在人工授粉和自然生態(tài)條件下，轉(zhuǎn)基因油菜中的外源基因能夠通過(guò)花粉傳給其它有親緣關(guān)系的蕓苔屬植物，如白菜類(小白菜、大白菜、菜薹、白菜型油菜等)(Brassica rapa或B.campestris)、芥菜類(芥菜、榨菜、芥菜型油菜等)(B.juncea)，且能在該物種種群中生存下來(lái)(劉后利，油菜的遺傳和育種.上海上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，19859～63；Scheffler JA，Dale PJ.Opportunities for gene transfer andorigin of crop Brassicas，a review.Opera Bot，1994a，553-57；Scheffler JA，DalePJ.Opportunities for gene transfer from transgenic oilseed rape(Brassica napus)to related species.Transgenic Res，1994b，3263-278)。在加拿大和歐洲許多國(guó)家，野生白菜類植物(B.rapa)還是農(nóng)田優(yōu)勢(shì)種群雜草。在我國(guó)冬油菜產(chǎn)區(qū)和春油菜產(chǎn)區(qū)野生芥菜類(B.juncea)和白菜類(B.rapa)植物也是農(nóng)田優(yōu)勢(shì)種群雜草。轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜中的抗除草劑、抗蟲(chóng)、抗病等外源基因如果擴(kuò)散到這類野生植物中，可能形成超級(jí)雜草，將會(huì)給生態(tài)環(huán)境帶來(lái)不可預(yù)測(cè)的可怕后果，也會(huì)給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)不可估量的損失。
由于轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜的環(huán)境釋放和商業(yè)化應(yīng)用，轉(zhuǎn)基因油菜中的外源目的基因(如抗除草劑、抗病、抗蟲(chóng)等外源基因)通過(guò)花粉擴(kuò)散到自然界油菜野生近緣物種中形成“超級(jí)雜草”，造成生態(tài)平衡的破壞，引發(fā)生態(tài)災(zāi)難，引起人們廣泛關(guān)注，也給轉(zhuǎn)基因油菜推廣應(yīng)用帶來(lái)很大阻力。因此，世界上除加拿大和美國(guó)已商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因油菜多年，其他國(guó)家還沒(méi)有轉(zhuǎn)基因油菜商業(yè)化種植。
甘藍(lán)型油菜(B.napus，AACC，2n＝38)屬于異源多倍體作物，是由白菜(B.rapa，AA，2n＝20)與甘藍(lán)(B.oleracea，CC，2n＝18)自然雜交，染色體加倍，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的自然進(jìn)化和人工選擇而形成現(xiàn)在人們廣泛種植的栽培甘藍(lán)型油菜(劉后利，油菜的遺傳和育種.上海上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，19859～63)。
前人大量研究表明蕓苔屬AA染色體組白菜類物種與AC染色體組的甘藍(lán)型油菜雜交較容易獲得雜種，但雜交后代的自然結(jié)實(shí)率很低；AB染色體組的芥菜類植物與甘藍(lán)型油菜雜交也比較容易，但雜種F1代不育或部分可育；甘藍(lán)型油菜與C染色體組的甘藍(lán)類植物雜交極為困難，自然條件下很難獲得雜種(劉后利，油菜的遺傳和育種.上海上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，19859～63)。
對(duì)于異源多倍體作物來(lái)說(shuō)，只有某一套染色體和其近緣種具有雜交親和性。比如，甘藍(lán)型油菜的A染色體組和白菜類植物(B.rapa)、芥菜類植物(B.juncea)的A染色體組具有雜交親和性，因而轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜中的外源轉(zhuǎn)基因很容易通過(guò)A染色體組轉(zhuǎn)移到這一類植物中；但在自然條件下位于甘藍(lán)型油菜C染色體組上的基因極少會(huì)轉(zhuǎn)移到其相應(yīng)的近緣物種中。因此，通過(guò)染色體定位轉(zhuǎn)基因獲得那些轉(zhuǎn)基因插入到安全性較高染色體組的轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化，可以在很大程度上降低產(chǎn)生超級(jí)雜草的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。
Metz等(1997)將轉(zhuǎn)基因抗除草劑甘藍(lán)型油菜作父本與蕪菁(B.rapa)雜交，然后研究回交后代不同世代的外源基因消失速度，2個(gè)轉(zhuǎn)bar基因甘藍(lán)型油菜品系研究結(jié)果明顯不同，1個(gè)品系回交后代的抗除草劑植株減少快，表示外源bar基因快速丟失，難以整合到蕪菁(B.rapa)基因組中(Metz PLJ，Jacobsen E，Nap JP，Pereira A，et al..The impacton biosafety of the phosphinothricin-tolerance transgene in inter-specific B.rapa×B.napus hybrids and their successive backcrosses.TheorAppl Genet，1997，95442-450)；Zhu等(2004)研究9個(gè)轉(zhuǎn)GFP-Bt基因甘藍(lán)型油菜品系與三個(gè)野生白菜材料雜交、回交后代轉(zhuǎn)基因遺傳行為，也發(fā)現(xiàn)有2個(gè)轉(zhuǎn)基因品系的外源基因在甘白雜種的回交后代中快速丟失(Zhu B，John R.LAWRENCE，Suzanne I.WARWICK et al..Inheritance of GFP-Bttransgenes from Brassica napus in backcrosses with three wild B.rapa accessions.Environ.Biosafety Res.2004，345-54)。上述研究結(jié)果都推測(cè)是由于外源基因插入甘藍(lán)型油菜C染色體上所形成，表明甘藍(lán)型油菜C染色體轉(zhuǎn)基因品系基因擴(kuò)散的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)小。
目前，所有的轉(zhuǎn)基因方法(如基因槍介導(dǎo)法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、花粉管通道法等)都不能準(zhǔn)確地將外源目標(biāo)基因轉(zhuǎn)到甘藍(lán)型油菜特定染色體上，現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因方法轉(zhuǎn)基因時(shí)，外源基因向受體油菜基因組(染色體組)整合是隨機(jī)的，目前還沒(méi)有快速有效的方法鑒定外源基因是轉(zhuǎn)到A染色體上還是轉(zhuǎn)到C染色體上。應(yīng)用現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因方法，要想獲得目標(biāo)基因準(zhǔn)確插入C染色體上的轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜難度很大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種甘藍(lán)型油菜C染色體組定向轉(zhuǎn)基因的方法，以便外源基因準(zhǔn)確無(wú)誤地定向插入甘藍(lán)型油菜C染色體，獲得C染色體轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜。該方法解決如何將外源基因準(zhǔn)確插入甘藍(lán)型油菜特定染色體組上的技術(shù)難題，可使100％的轉(zhuǎn)基因油菜株系的目標(biāo)基因插在特定的C染色體組上。
根據(jù)本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)基因方法并使用本發(fā)明提供的方法可以實(shí)現(xiàn)上述目的。
甘藍(lán)型油菜C染色體組定向轉(zhuǎn)基因方法，該方法包括以下步驟1、甘藍(lán)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化1)、農(nóng)桿菌菌液制備將含有bar基因表達(dá)載體pCAMBIA3300質(zhì)粒(購(gòu)自澳大利亞CAMBIA，地址Vectors，CAMBIA，GPO Box 3200，Canberra ACT 2601，Australia)的農(nóng)桿菌菌株LBA4404(購(gòu)自澳大利亞CAMBIA，地址Vectors，CAMBIA，GPO Box 3200，Canberra ACT 2601，Australia)劃線接種于附加50mg/L卡那霉素的YEB平板培養(yǎng)基[Beef extract(牛肉浸膏)5g/L，Yeast extract(酵母膏)1g/L，Peptone(蛋白胨)5g/L，Sucrose(蔗糖)5g/L，MgSO4.7H2O 0.4g/100ml，Agar(瓊脂)1.5g/100ml，pH7.4]上，在28℃溫度下倒置培養(yǎng)2-3天。待菌落長(zhǎng)出后，從YEB平板上挑取一個(gè)單菌落，接種于5ml YEB(內(nèi)含50mg/L卡那霉素)液體培養(yǎng)基中，置搖床上200rpm，28℃下培養(yǎng)過(guò)夜。取菌液劃線接種于附加50mg/L卡那霉素的YEB平板上，在28℃下倒置培養(yǎng)2天，見(jiàn)菌落長(zhǎng)出后，將培養(yǎng)皿至于4℃冰箱備用。每次實(shí)驗(yàn)時(shí)，取一個(gè)單菌落接種于附加50mg/L卡那霉素的YEB平板培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)1-2天，用1/2濃度的MS液體培養(yǎng)基(pH5.4)洗下菌體，并將菌液稀釋至OD600＝0.08，作為侵染用菌液。
2)、外植體制備選擇籽粒飽滿的甘藍(lán)種子消毒[70％酒精5-10秒、1％二氯異氰尿酸(Dichloroisocyanuric acid，DICA)消毒8-15分鐘、無(wú)菌水洗3-4次]，植入1/2濃度的MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)4-5天(25℃、光16小時(shí)/暗8小時(shí))，切下葉柄長(zhǎng)約1-2mm的子葉和長(zhǎng)約的0.5-0.7cm的下胚軸分別作為具柄子葉和下胚軸外植體。
3)、遺傳轉(zhuǎn)化將外植體置于農(nóng)桿菌菌株LBA4404菌液中，22℃侵染5-10分鐘，其間輕輕搖動(dòng)。在無(wú)菌吸水紙上吸干菌液，轉(zhuǎn)至共培培養(yǎng)基[MS培養(yǎng)基+1mg/L2，4-D+0.2mg/L6-芐氨基嘌呤(6-BA)]上，22℃暗培養(yǎng)2-3天，然后轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基[MS培養(yǎng)基+4.5mg/L6-BA+5mg/L AgNO3+500mg/L羧芐青霉素(Cb)]上延遲培養(yǎng)5-7天，再轉(zhuǎn)到篩選培養(yǎng)基[MS培養(yǎng)基+4.5mg/L 6-BA+5mg/L AgNO3+500mg/L Cb+10mg/L草胺膦(PPT)]上培養(yǎng)3-4周，每2周轉(zhuǎn)接一次。待再生綠苗長(zhǎng)至1-2cm時(shí)，切下小綠苗，植入生根培養(yǎng)基[MS培養(yǎng)基+0.2mg/L萘乙酸(NAA)+10mg/LPPT]上，待形成完整植株時(shí)，經(jīng)煉苗移栽花盆中遮蔭保濕培養(yǎng)。轉(zhuǎn)基因結(jié)果見(jiàn)表1。
表1農(nóng)桿菌介導(dǎo)的子葉與下胚軸遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果

4)、除草劑抗性檢測(cè)T0代轉(zhuǎn)基因植株5-6片真葉期用13.5％的Basta(德國(guó)拜耳公司生產(chǎn)的草胺膦注冊(cè)商標(biāo))1∶200倍稀釋液噴施。轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株對(duì)該除草劑沒(méi)有反應(yīng)，表現(xiàn)除草劑抗性；轉(zhuǎn)基因陰性植株在噴藥5天后死亡。
5)、PCR分子檢測(cè)為盡量避免T0代轉(zhuǎn)基因植株的假陽(yáng)性和農(nóng)桿菌菌株LBA4404污染，選取用草胺膦篩選呈陽(yáng)性的T0代株系植株進(jìn)行剝蕾自交，獲得T1代種子。將T1代種子種在網(wǎng)室，苗期用13.5％的Basta1∶200倍稀釋液噴施。取抗性轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)和非轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)植株的幼嫩葉片，采用CTAB法提取植物基因組DNA(Doyle JJ，Doyle JL.A rapid DNA isolationprocedure for small quantities of fresh leaf tissue.Phytochemical Bulletin，1987，1911-15)。采用20ul反應(yīng)體系對(duì)目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，設(shè)陰性對(duì)照(以非轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)植株總DNA為模板)和陽(yáng)性對(duì)照(以pCAMBIA3300質(zhì)粒DNA為模板)。反應(yīng)程序?yàn)?5℃，2分鐘；94℃，30秒；50℃，30秒；72℃，1分鐘；35cycles；72℃，5分鐘。PCR產(chǎn)物用l％的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。
檢測(cè)bar基因所用的正向引物為5′-GAT CTC GGT GAC GGG CAG GA-3′，反向引物為5′-GGC GGT CTG CAC CAT CGT CAA-3′，由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成。
2、轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜的人工合成1)、白菜細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜人工合成以白菜作母本、轉(zhuǎn)bar基因甘藍(lán)作父本進(jìn)行種間雜交。取授粉7天后的子房，消毒(70％酒精5～10秒、1％DICA消毒8～10分鐘、無(wú)菌水洗3～4次)后進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基為附加500mg/L水解酪蛋白的MS培養(yǎng)基(瓊脂濃度0.8％，蔗糖濃度3.0％)。待子房培養(yǎng)約35～40天后，剝出子房中的種子，將剝出的癟小種子接種在MS培養(yǎng)基上萌發(fā)，直到長(zhǎng)成正常小苗。然后轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基+0.2mg/L NAA)上生根和擴(kuò)繁植株，每株系至少擴(kuò)繁3株以上。待健壯根系形成后，經(jīng)煉苗移栽花盆中遮蔭保濕培養(yǎng)。結(jié)果見(jiàn)表2。
表2白菜×芥藍(lán)子房培養(yǎng)雜種獲得率a)

注結(jié)實(shí)率＝獲得種子數(shù)/子房數(shù)×100％；雜種獲得率＝雜種苗數(shù)/子房數(shù)×100％。
黑葉白(編號(hào)QF01)、蓉優(yōu)矮抗青(QF04)、特早50白菜苔(QF05)、黃金地小白菜(QF06)、黃金小白菜(QF08)、九月鮮紅菜薹(QF10)、潮汕甜白菜(QF11)和一個(gè)雙低白菜型油菜品種(QF15)，轉(zhuǎn)基因芥藍(lán)(編號(hào)J)2)、甘藍(lán)細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜人工合成以轉(zhuǎn)bar基因甘藍(lán)藍(lán)作母本、白菜作父本進(jìn)行種間雜交。取授粉17～20天的子房，消毒(70％酒精5～10秒、1％DICA消毒8～10分鐘、無(wú)菌水洗3～4次)后，剝出莢中的胚進(jìn)行離體培養(yǎng)，培養(yǎng)基為附加500mg/L水解酪蛋白的MS培養(yǎng)基(瓊脂濃度0.8％，蔗糖濃度3.0％)，直到長(zhǎng)成正常小苗。轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基+0.2mg/L NAA)上生根和擴(kuò)繁，每株系至少擴(kuò)繁3株以上。待健壯根系形成后，經(jīng)煉苗移栽花盆中遮蔭保濕培養(yǎng)。結(jié)果見(jiàn)表3。
表3芥藍(lán)×白菜組合胚培養(yǎng)雜種獲得率

注雜種獲得率＝成苗數(shù)/培養(yǎng)胚數(shù)×100％。黑葉白(編號(hào)QF01)、蓉優(yōu)矮抗青(QF04)、特早50白菜苔(QF05)、黃金地小白菜(QF06)、黃金小白菜(QF08)、九月鮮紅菜薹(QF10)、潮汕甜白菜(QF11)、一個(gè)雙低白菜型油菜品種(QF15)和轉(zhuǎn)基因芥藍(lán)(編號(hào)J)3)、染色體加倍對(duì)人工合成的單倍體油菜采取如下方法進(jìn)行染色體加倍處理①切下幼苗移植于含0.01％秋水仙堿的MS培養(yǎng)基上處理7～10天，取出幼苗，切去粘有0.01％秋水仙堿的MS培養(yǎng)基的莖基部，轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基+0.2mg/L NAA)上生根和擴(kuò)繁，每株系至少擴(kuò)繁3株以上。待健壯根系形成后，經(jīng)煉苗移栽花盆中遮蔭保濕培養(yǎng)；②秋水仙堿溶液浸根處理。將現(xiàn)蕾的植株從土壤中挖出來(lái)，洗凈根部泥土，將根浸泡在800mg/L的秋水仙堿水溶液中。4小時(shí)之后，用自來(lái)水沖洗根部2分鐘，移栽到田間。移栽成活后，剪掉現(xiàn)蕾的主花序和分枝，使其產(chǎn)生更多的新枝；③油菜植株現(xiàn)蕾時(shí)，將蘸有0.3％秋水仙堿的棉球置于植株的葉腋處，每天處理2次，連續(xù)處理3天。結(jié)果見(jiàn)表4。
表4人工合成油菜的花粉育性

注觀察花粉數(shù)(平均)＝同一株系各株觀察的花粉數(shù)之和/觀察株數(shù)。黑葉白(編號(hào)QF01)、特早50白菜苔(QF05)、黃金小白菜(QF08)、潮汕甜白菜(QF11)和轉(zhuǎn)基因芥藍(lán)(編號(hào)J)。
3、轉(zhuǎn)基因油菜的鑒定1)、植株染色體數(shù)目觀察種子萌發(fā)植株根尖觀察法將種子在10-15℃冷水浸泡2-4小時(shí)，置濕潤(rùn)濾紙上于25℃下萌發(fā)，待根長(zhǎng)至1～1.5cm時(shí)，取根尖在22℃下、0.002mol/L8-羥基喹啉中處理3小時(shí)，用卡諾液固定24小時(shí)，然后置于70％乙醇中4℃下保存。
幼小雌蕊觀察法剝?nèi)∮仔』ɡ僦械拇迫?，?.002mol/L 8-羥基喹啉處理5小時(shí)。經(jīng)卡諾液固定24小時(shí)后，然后置于70％乙醇中4℃下保存。
幼小花蕾觀察法將幼小花蕾用0.002mol/L 8-羥基喹啉處理4小時(shí)后，轉(zhuǎn)到卡諾液中固定，24小時(shí)后轉(zhuǎn)到70％乙醇中保存。
觀察時(shí)，取上述固定保存的根尖、幼小雌蕊和幼小花蕾材料，在60℃下用1mol/L的鹽酸水解10分鐘，移至載玻片上，加一滴改良的卡寶品紅染液，壓片鏡檢。甘藍(lán)型油菜的染色體數(shù)為38條。
2)、轉(zhuǎn)基因油菜的除草劑抗性檢測(cè)人工合成油菜植株5-6葉期，噴施13.5％的Basta1∶200倍稀釋液，5天后調(diào)查葉片藥害表現(xiàn)，設(shè)非轉(zhuǎn)基因油菜噴施對(duì)照?？钩輨┯筒藳](méi)有反應(yīng)，非轉(zhuǎn)基因抗除草劑油菜枯死。
3)、轉(zhuǎn)基因油菜基因組Southern blotting分子檢測(cè)采用CTAB法提取植物基因組DNA(Doyle JJ，Doyle JL.A rapid DNA isolation procedure for small quantities of freshleaf tissue.Phytochemical Bulletin，1987，1911-15)。取人工合成的C染色體組轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)行油菜、轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)、非轉(zhuǎn)基因油菜、非轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)等材料基因組總DNA和pCAMBIA3300質(zhì)粒DNA各約20μg，分別用內(nèi)切酶EcoR I將其完全消化后在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳分離。預(yù)雜交、雜交和洗膜的程序按Sharpe等(1995)報(bào)道的方法(Sharpe AG，ParkinIA，Keith DJ.Frequent nonreciprocal translocations in the amphidiploid genome ofoilseed rape(Brassica napus).Genome，1995，381112-1121)進(jìn)行。所用探針為pCAMBIA3300質(zhì)粒PCR擴(kuò)增bar基因的0.5kb片段，檢測(cè)使用地高辛標(biāo)記試劑盒進(jìn)行(購(gòu)自Roche Diagnostics，Swiss)。pCAMBIA3300質(zhì)粒、轉(zhuǎn)基因油菜、轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)有特異帶出現(xiàn)，并且，轉(zhuǎn)基因油菜與轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)帶型一致；非轉(zhuǎn)基因油菜和甘藍(lán)沒(méi)有特異帶出現(xiàn)。
4)、外源基因位于甘藍(lán)型油菜C染色體上的細(xì)胞遺傳學(xué)驗(yàn)證以轉(zhuǎn)基因油菜作父本或母本與白菜雜交，甘白雜種與白菜回交，獲得回交一代種子。苗期對(duì)回交一代植株進(jìn)行抗除草劑涂葉鑒定，不抗除草劑植株出現(xiàn)癥狀時(shí)將涂藥葉片摘除，并對(duì)所有植株進(jìn)行PCR分子檢測(cè)。根據(jù)抗除草劑表型和分子檢測(cè)結(jié)果給每株掛抗、感牌。花期取每株幼小花蕾用2mM 8-羥基喹啉處理4小時(shí)，轉(zhuǎn)到卡諾固定液中固定，24小時(shí)后轉(zhuǎn)到70％乙醇中保存?zhèn)溆谩?br> 觀察時(shí)，將花藥挑出在60℃下、1M鹽酸中解離5分鐘，然后在改良卡寶品紅中進(jìn)行染色、壓片，在顯微鏡下觀察、照相。
所有20條染色體(AA)的植株都是不抗除草劑，并且PCR檢測(cè)為陰性；染色體在20-28條之間的植株出現(xiàn)抗、感除草劑分離；染色體數(shù)為29的植株抗除草劑，PCR分子檢測(cè)陽(yáng)性。
本發(fā)明的方法與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)1、外源目的基因可以準(zhǔn)確無(wú)誤地轉(zhuǎn)到甘藍(lán)型油菜C染色體組上，獲得C染色體組轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜概率是100％。傳統(tǒng)方法則不能確定可以將外源目的基因定向轉(zhuǎn)到甘藍(lán)型油菜C染色體組上，即使能實(shí)現(xiàn)，轉(zhuǎn)到C染色體組的概率最高只有47.4％(甘藍(lán)型油菜有38條染色體，C染色體18條，18/38＝0.474)。
2、操作簡(jiǎn)單，只需按傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因方法先將外源目的基因轉(zhuǎn)到甘藍(lán)中，再人工合成甘藍(lán)型油菜即可。
3、應(yīng)用本發(fā)明的方法獲得的轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜，可以不作任何鑒定就可以確定外源目的基因是插在甘藍(lán)型油菜的C染色體組上。傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因方法獲得的轉(zhuǎn)基因油菜必須經(jīng)過(guò)一系列鑒定才能從中找出很少一些外源基因插在C染色體組上的株系，但目前還沒(méi)有切實(shí)可行的鑒定方法。
4、應(yīng)用本發(fā)明的方法獲得的轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜，釋放到環(huán)境中，其外源轉(zhuǎn)基因向甘藍(lán)型油菜近緣物種(如白菜類植物、芥菜類植物、甘藍(lán)類植物等)擴(kuò)散的概率極低?？梢越鉀Q人們對(duì)轉(zhuǎn)基因油菜環(huán)境釋放引起的基因擴(kuò)散所造成的生態(tài)環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)切。
為了敘述方便，在本發(fā)明中轉(zhuǎn)基因方法僅使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，其它能將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞并整合到基因組中的各種轉(zhuǎn)基因方法都適用，包括直接轉(zhuǎn)化法(PEG介導(dǎo)法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法、電激法、微注射法、基因槍介導(dǎo)法、超聲波介導(dǎo)法、脈沖電泳法、激光微束法、碳硅纖維導(dǎo)入法、離子束介導(dǎo)法等)、間接轉(zhuǎn)化法(農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、病毒介導(dǎo)法、染色體介導(dǎo)的直接轉(zhuǎn)化等)和生殖細(xì)胞轉(zhuǎn)化法(花粉管通道法、花粉管介導(dǎo)法、種胚浸泡法等)等。MS培養(yǎng)基是指Murashige T和Skoog F 1962年發(fā)明的培養(yǎng)基(Murashige T，Skoog F.A revisedmedium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures.Physiol Plant，1962，15473-497.)，1/2MS培養(yǎng)基是將MS培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分稀釋一倍。卡寶品紅染色液配制方法1)原液A稱取3g堿性品紅(Basic fuchsin)溶于100ml 70％乙醇中；2)原液B取10ml原液A加入90ml 5％的苯酚水溶液，在37℃下溫浴2～4小時(shí)(2～4周內(nèi)使用)；3)原液C取55ml原液B加入6ml冰乙酸和6ml甲醛，充分混勻；4)卡寶品紅染液取10～20ml原液C加入約80ml 45％的冰乙酸和1g山梨醇(配制兩周后使用)。卡諾固定液是3份甲醇和1份冰醋酸配成，現(xiàn)配現(xiàn)用。
本發(fā)明中的甘藍(lán)是指任一甘藍(lán)(B.oleracea)品種，白菜是指任一白菜(B.rapa)品種。


圖1十字花科蕓薹屬基本物種與復(fù)合物種間親緣關(guān)系禹氏三角圖，本圖說(shuō)明甘藍(lán)型油菜(B.napus)是由白菜(B.rapa)和甘藍(lán)(B.oleracea)雜交、染色體加倍形成的異源多倍體新物種，以及甘藍(lán)型油菜與蕓薹屬內(nèi)其它物種的親緣關(guān)系。
圖2pCAMBIA3300質(zhì)粒圖譜，該質(zhì)?？烧系街参锘蚪M中的T-DNA由CaMV35S啟動(dòng)子、草胺膦除草劑抗性bar基因和CaMV35S polyA終止子組成，農(nóng)桿菌中表達(dá)的卡那霉素(kanamycin)抗性基因是細(xì)菌篩選標(biāo)記基因。
圖3轉(zhuǎn)bar基因芥藍(lán)抗除草劑Basta鑒定抗、感植株癥狀圖?？剐灾仓耆~片綠色，沒(méi)有任何癥狀；不抗除草劑植株葉片變黃、卷曲、整株枯死。
圖4人工合成轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜花期圖片，具有典型的栽培甘藍(lán)型油菜植物學(xué)特征，下部葉大頭羽裂，葉緣具鈍齒，總狀花序，花乳白色。抗除草劑草胺膦。
圖5人工合成油菜染色體圖，白菜和甘藍(lán)分別有20條和18條染色體，由白菜和甘藍(lán)人工合成的甘藍(lán)型油菜具有38條染色體，是白菜和甘藍(lán)染色體總和。
圖6人工合成轉(zhuǎn)基因油菜的基因組southern blot分析。圖中M帶是DNA分子量marker帶；1號(hào)是具有bar基因的pCAMBIA3300質(zhì)粒陽(yáng)性雜交帶；2號(hào)是非轉(zhuǎn)基因油菜，沒(méi)有雜交帶；3號(hào)是轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)，具有陽(yáng)性雜交帶；4-6號(hào)是人工合成的C染色體組轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜，具有陽(yáng)性雜交帶。轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)與人工合成油菜帶型一致，表明合成油菜中的外源基因所在的染色體和在該染色體上的位點(diǎn)與甘藍(lán)一樣，證明外源基因在合成油菜C染色體上。
具體實(shí)施例方式
以下是本發(fā)明的實(shí)施例，這些實(shí)施例不以任何方式對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成限制。
實(shí)施例1轉(zhuǎn)bar基因芥藍(lán)(B.oleracea var.alboglabra)1芥藍(lán)的遺傳轉(zhuǎn)化1.1農(nóng)桿菌準(zhǔn)備將含有bar基因表達(dá)載體pCAMBIA3300質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌株LBA4404劃線接種于附加50mg/L卡那霉素的YEB平板培養(yǎng)基上，在28℃下倒置培養(yǎng)2-3天。待菌落長(zhǎng)出后，從YEB平板上挑取一個(gè)單菌落，接種于5ml YEB(內(nèi)含50mg/L卡那霉素)液體培養(yǎng)基中，置搖床上200rpm，28℃下培養(yǎng)過(guò)夜。取菌液劃線接種于附加50mg/L卡那霉素的YEB平板上，在28℃下倒置培養(yǎng)2天，見(jiàn)菌落長(zhǎng)出后，將培養(yǎng)皿至于4℃冰箱備用。每次實(shí)驗(yàn)時(shí)，取一個(gè)單菌落接種于附加50mg/L卡那霉素的YEB平板培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)1-2天，用1/2MS液體培養(yǎng)基(pH5.4)洗下菌體，并將菌液稀釋至OD600＝0.08，作為侵染用菌液。
1.2具柄子葉的遺傳轉(zhuǎn)化外植體準(zhǔn)備選擇籽粒飽滿的香港尖葉中花芥藍(lán)種子消毒(70％酒精5-10秒、1％DICA消毒8-15分鐘、無(wú)菌水洗3-4次)，植入1/2MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)3-4天(25℃、光16小時(shí)/暗8小時(shí))，從子葉節(jié)上1mm處切下具柄子葉作為外植體。
二步組培再生方法將具柄子葉接至MS+1mg/L2，4-D+0.2mg/L6-BA培養(yǎng)基上，22℃暗培養(yǎng)2-3天，然后轉(zhuǎn)移到MS+4.5mg/L6-BA+5mg/LAgNO3上繼續(xù)培養(yǎng)2-3周，待再生綠苗長(zhǎng)至1-2cm大時(shí)，切下，植入生根培養(yǎng)基MS+0.2mg/L NAA上，待根系發(fā)達(dá)成為完整植株時(shí)，經(jīng)煉苗移栽花盆中遮蔭保濕培養(yǎng)。
遺傳轉(zhuǎn)化采用二步法組培方法，將具柄子葉置入農(nóng)桿菌菌液中，22℃侵染5-10分鐘，其間輕輕搖動(dòng)。撈出后在無(wú)菌吸水紙上吸干菌液，將子葉轉(zhuǎn)至MS+1mg/L 2.4-D+0.2mg/L6-BA培養(yǎng)基上，22℃暗培養(yǎng)2-3天，然后轉(zhuǎn)移到MS+4.5mg/L6-BA+5mg/L AgNO3+500mg/LCb(羧芐)上延遲培養(yǎng)5-7天，再轉(zhuǎn)至篩選培養(yǎng)基MS+4.5mg/L6-BA+5mg/L AgNO3+500mg/LCb+10mg/L草胺膦(PPT)上培養(yǎng)3-4周，待再生綠苗長(zhǎng)至1-2cm大時(shí)，切下，植入生根培養(yǎng)基MS+0.2mg/L NAA+10mg/L PPT上，待根系發(fā)達(dá)成為完整植株時(shí)，經(jīng)煉苗移栽花盆中遮蔭保濕培養(yǎng)。
1.3轉(zhuǎn)基因芥藍(lán)的PCR檢測(cè)取F1代抗性轉(zhuǎn)基因芥藍(lán)和非轉(zhuǎn)基因芥藍(lán)植株的幼嫩葉片各1-2g，采用CTAB法提取植物基因組DNA。
檢測(cè)Bar基因所用的引物為5′端引物5′GAT CTC GGT GAC GGG CAG GA3′，3′端引物5′GGC GGT CTG CAC CAT CGT CAA3′。引物由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成。
轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)以上制備的基因組DNA為模板，采用25ul反應(yīng)體系對(duì)目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，設(shè)陰性對(duì)照(以非轉(zhuǎn)基因芥藍(lán)植物總DNA為模板)和陽(yáng)性對(duì)照(以質(zhì)粒DNA為模板)。反應(yīng)程序?yàn)?5℃，2分鐘；94℃，30秒；50℃，30秒；72℃，1分鐘；35cycles；72℃，5分鐘。PCR產(chǎn)物用1％的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。
轉(zhuǎn)bar基因陽(yáng)性的植株P(guān)CR擴(kuò)增出500bp特異性條帶。
實(shí)施例2C染色體轉(zhuǎn)bar基因甘藍(lán)型油菜的人工合成1.1白菜類植物作母本的甘藍(lán)型油菜人工合成以黑葉白、蓉優(yōu)矮抗青、特早50白菜苔、黃金小白菜、紅菜薹、潮汕甜白菜和雙低白菜型油菜等7個(gè)白菜類品種作母本、轉(zhuǎn)bar基因芥藍(lán)作父本進(jìn)行種間雜交。授粉后4-7天，取受精子房消毒，進(jìn)行子房培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含500mg/L水解酪蛋白的MS培養(yǎng)基。子房培養(yǎng)40天后，從成熟的莢果中剝出種子，轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基中萌發(fā)。當(dāng)種子萌發(fā)出幼苗時(shí)，切下幼苗移植于含0.01％秋水仙堿的MS培養(yǎng)基上處理7-10天，進(jìn)行染色體加倍。然后，將小苗轉(zhuǎn)入MS加0.2％NAA的培養(yǎng)基中生根，待根系發(fā)達(dá)時(shí)，移栽花盆中遮蔭保濕培養(yǎng)，開(kāi)花結(jié)果，收獲種子。
1.2甘藍(lán)類植物作母本的甘藍(lán)型油菜人工合成以轉(zhuǎn)bar基因芥藍(lán)作母本，黑葉白、蓉優(yōu)矮抗青、特早50白菜苔、黃金小白菜、紅菜薹、潮汕甜白菜和雙低白菜型油菜等7個(gè)白菜類品種作父本進(jìn)行種間雜交。授粉后20天，取子房消毒，剝出雜種胚，進(jìn)行胚拯救培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含6-BA(0.5mg/L)的MS培養(yǎng)基。當(dāng)胚上長(zhǎng)出幼芽時(shí)，切下幼芽移于含0.01％秋水仙堿的MS培養(yǎng)基上，進(jìn)行7-10天的染色體加倍。然后，將小苗轉(zhuǎn)入MS加0.2％NAA的培養(yǎng)基中生根，待根系發(fā)達(dá)時(shí)，移栽花盆中遮蔭保濕培養(yǎng)，開(kāi)花結(jié)果，收獲種子。
1.3人工合成的轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜的PCR檢測(cè)、除草劑抗性檢測(cè)及細(xì)胞學(xué)檢測(cè)人工合成的轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜的PCR分子檢測(cè)方法參照轉(zhuǎn)基因芥藍(lán)的方法進(jìn)行。
除草劑抗性檢測(cè)；油菜苗4-5葉期，用13.5％的Basta1∶200倍稀釋液噴灑植株葉片，5天后開(kāi)始調(diào)查植株是否死亡，設(shè)非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?。PCR檢測(cè)是陽(yáng)性的植株抗除草劑，植株不死亡，陰性的植株和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓晁劳觥?br> 細(xì)胞學(xué)檢測(cè)在合成油菜花期，每個(gè)雜交組合取3個(gè)株系，剝?nèi)∮仔』ɡ僦械拇迫?，?.002mol/L8-羥基喹啉處理4小時(shí)，經(jīng)卡諾液固定24小時(shí)后，4℃保存于70％乙醇中，觀察時(shí)取出材料，在60℃下，用1mol/L鹽酸水解10分鐘，移至玻片上，加一滴改良的卡寶品紅染液，壓片鏡檢。花粉育性正常的植株，觀察到細(xì)胞的染色體是38條，植株能正常結(jié)實(shí)；花粉育性不正常的植株，觀察到細(xì)胞的染色體是19條，植株不能正常結(jié)實(shí)。
實(shí)施例3bar基因位于甘藍(lán)型油菜C染色體上的分子驗(yàn)證基因組Southern blotting分析取轉(zhuǎn)bar基因芥藍(lán)、C染色體轉(zhuǎn)bar基因甘藍(lán)型油菜和非轉(zhuǎn)基因油菜基因組總DNA約20μg，分別用內(nèi)切酶EcoR I將其完全消化后在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳分離，以質(zhì)粒pCAMBIA3300的DNA作為陽(yáng)性對(duì)照。預(yù)雜交、雜交和洗膜的程序按Sharpe等(1995)報(bào)道的方法進(jìn)行。所用探針為質(zhì)粒PCR擴(kuò)增bar基因的0.5kb片段，檢測(cè)使用地高辛標(biāo)記試劑盒進(jìn)行(Roche Diagnostics，Swiss)。
隨機(jī)抽取三個(gè)PCR及Basta檢測(cè)為陽(yáng)性人工合成油菜株系(同一轉(zhuǎn)基因芥藍(lán)父本)及其父本芥藍(lán)進(jìn)行基因組Southern blot分析結(jié)果顯示外源bar基因已經(jīng)整合到了人工合成甘藍(lán)型油菜的基因組中，父本芥藍(lán)與三個(gè)人工合成甘藍(lán)型油菜株系的Southern blot隨機(jī)酶切的雜交帶型一致，表明人工合成轉(zhuǎn)基因油菜中的bar基因位點(diǎn)與轉(zhuǎn)bar基因芥藍(lán)中的bar基因位點(diǎn)一致，即在人工合成的轉(zhuǎn)bar基因甘藍(lán)型油菜中，外源bar基因位于C染色體上。
實(shí)施例4bar基因位于甘藍(lán)型油菜C染色體上的細(xì)胞遺傳學(xué)驗(yàn)證以轉(zhuǎn)基因油菜作父本或母本與白菜雜交，甘白雜種與白菜回交，獲得回交一代種子。苗期對(duì)回交—代植株進(jìn)行抗除草劑涂葉鑒定，不抗除草劑植株出現(xiàn)癥狀時(shí)將涂藥葉片摘除，并對(duì)所有植株進(jìn)行PCR分子檢測(cè)(方法同上)。根據(jù)抗除草劑表型和分子檢測(cè)結(jié)果給每株掛抗、感牌。花期取每株幼小花蕾用2mM 8-羥基喹啉處理4小時(shí)，轉(zhuǎn)到卡諾固定液中固定，24小時(shí)后轉(zhuǎn)到70％乙醇中保存?zhèn)溆谩?br> 觀察時(shí)，將花藥挑出在60℃下、1M鹽酸中解離5分鐘，然后在改良卡寶品紅中進(jìn)行染色、壓片，在顯微鏡下觀察、照相。
所有20條染色體(AA)的植株都是不抗除草劑，并且PCR檢測(cè)為陰性；染色體數(shù)大于20的植株出現(xiàn)抗、感除草劑分離；染色體數(shù)為29的植株抗除草劑，PCR分子檢測(cè)陽(yáng)性。
權(quán)利要求
1.一種甘藍(lán)型油菜C染色體組定向轉(zhuǎn)基因的方法，該方法包括下列步驟A、甘藍(lán)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化首先是農(nóng)桿菌菌液制備，將含有bar基因表達(dá)載體pCAMBIA3300質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌株LBA4404劃線接種于附加50mg/L卡那霉素的YEB平板培養(yǎng)基上，在28℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2-3天，待菌落長(zhǎng)出后，從YEB平板上挑取一個(gè)單菌落，接種于5ml YEB液體培養(yǎng)基中，置搖床上，培養(yǎng)過(guò)夜，取菌液劃線接種于附加50mg/L卡那霉素的YEB平板上，在28℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2天，見(jiàn)菌落長(zhǎng)出后，將培養(yǎng)皿至于4℃冰箱備用，在甘藍(lán)轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)時(shí)，取一個(gè)單菌落接種于附加50mg/L卡那霉素的YEB平板培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)1-2天，用1/2濃度的MS液體培養(yǎng)基洗下菌體，并將菌液稀釋至OD600＝0.08；其次是外植體制備，將甘藍(lán)種子消毒，植入1/2濃度MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)4-5天，25℃、光16小時(shí)/暗8小時(shí)，切下葉柄長(zhǎng)1-2mm的子葉和長(zhǎng)0.5-0.7cm的下胚軸分別作為具柄子葉和下胚軸外植體；第三是遺傳轉(zhuǎn)化，將外植體置于農(nóng)桿菌菌液中，22℃侵染5-10分鐘，其間搖動(dòng)，在無(wú)菌吸水紙上吸干菌液，轉(zhuǎn)至培養(yǎng)基MS+1mg/L 2，4-D+0.2mg/L 6-芐氨基嘌呤上，22℃暗培養(yǎng)2-3天，然后轉(zhuǎn)到培養(yǎng)基MS+4.5mg/L 6-BA+5mg/L AgNO3+500mg/L羧芐青霉素上延遲培養(yǎng)5-7天，再轉(zhuǎn)到篩選培養(yǎng)基MS+4.5mg/L 6-BA+5mg/L AgNO3+500mg/L Cb+10mg/L草胺膦上培養(yǎng)3-4周，每2周轉(zhuǎn)接一次，待再生綠苗長(zhǎng)至1-2cm時(shí)，切下綠苗，植入生根培養(yǎng)基上，待形成植株時(shí)，經(jīng)煉茁移栽花盆中遮蔭保濕培養(yǎng)；第四是除草劑抗性檢測(cè)，T0代轉(zhuǎn)基因植株5-6片真葉期用13.5％的Basta1∶200倍稀釋液噴施，轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株對(duì)該除草劑沒(méi)有反應(yīng)，表現(xiàn)除草劑抗性，轉(zhuǎn)基因陰性植株在噴藥5天后死亡；第五是PCR分子檢測(cè)，為避免T0代轉(zhuǎn)基因植株的假陽(yáng)性和農(nóng)桿菌LBA4404污染，選取用草胺膦篩選呈陽(yáng)性的T0代株系植株進(jìn)行剝蕾自交，獲得T1代種子，將T1代種子種在網(wǎng)室，苗期用13.5％的Basta1∶200倍稀釋液噴施，取抗性轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)和非轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)植株的幼嫩葉片，采用CTAB法提取植物基因組DNA，然后用20ul反應(yīng)體系對(duì)目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，設(shè)陰性對(duì)照以非轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)植株總DNA為模板和陽(yáng)性對(duì)照以pCAMBIA3300質(zhì)粒DNA為模板，反應(yīng)程序?yàn)?5℃，2分鐘；94℃，30秒；50℃，30秒；72℃，1分鐘，35cycles，72℃，5分鐘，PCR產(chǎn)物用1％的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株與陽(yáng)性對(duì)照均擴(kuò)增出500bp的條帶，檢測(cè)bar基因所用的正向引物為5′-GAT CTC GGT GAC GGG CAG GA-3′，反向引物為5′-GGC GGTCTG CAC CAT CGT CAA-3′；B、轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜的人工合成，首先是白菜細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜人工合成，以白菜作母本、轉(zhuǎn)bar基因甘藍(lán)作父本進(jìn)行種間雜交，取授粉7天后的子房，消毒用70％酒精5～10秒、1％DICA消毒8～10分鐘、無(wú)菌水洗3～4次后進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+500mg/L水解酪蛋白，待子房培養(yǎng)35～40天后，剝出子房中的種子，將剝出的種子接種在MS培養(yǎng)基上萌發(fā)，直到長(zhǎng)成苗，然后轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上生根和擴(kuò)繁植株，待根系形成后，經(jīng)煉苗移栽花盆中遮蔭保濕培養(yǎng)；其次是甘藍(lán)細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜人工合成，以轉(zhuǎn)bar基因甘藍(lán)作母本、白菜作父本進(jìn)行種間雜交，取授粉17～20天的子房，消毒后，剝出雜種胚，進(jìn)行胚拯救培養(yǎng)，培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+0.5mg/L 6-BA，當(dāng)胚上長(zhǎng)出芽時(shí)，切下芽移植到含0.01％秋水仙堿的MS培養(yǎng)基上，進(jìn)行7-10天的培養(yǎng)，然后，將苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中生根，待根系發(fā)達(dá)時(shí)，移栽花盆中遮蔭保濕培養(yǎng)，開(kāi)花結(jié)果，收獲種子；第三是染色體加倍，對(duì)人工合成的單倍體油菜采取如下方法進(jìn)行染色體加倍處理a、切下幼苗移植于含0.01％秋水仙堿的MS培養(yǎng)基上處理7～10天，取出苗，切去粘有0.01％秋水仙堿的MS培養(yǎng)基的莖基部，轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上生根和擴(kuò)繁，每株系至少擴(kuò)繁3株，待根系形成后，經(jīng)煉苗移栽花盆中遮蔭保濕培養(yǎng)；b、秋水仙堿溶液浸根處理，將現(xiàn)蕾的植株從土壤中挖出來(lái)，洗凈根部泥土，將根浸泡在800mg/L的秋水仙堿水溶液中，4小時(shí)之后，用自來(lái)水沖洗根部2分鐘，移栽到田間，移栽成活后，剪掉已現(xiàn)蕾的主花序和分枝，使其產(chǎn)生新枝；c、油菜植株現(xiàn)蕾時(shí)，將蘸有0.3％秋水仙堿的棉球置于植株的葉腋處，每天處理2次，連續(xù)處理3天；C、轉(zhuǎn)基因油菜的鑒定a、植株染色體數(shù)目觀察，首先是種子萌發(fā)植株根尖觀察法，將種子在10-15℃冷水浸泡2-4小時(shí)，置濕潤(rùn)濾紙上于25℃下萌發(fā)，待根長(zhǎng)至1～1.5cm時(shí)，取根尖在22℃下、0.002mol/L8-羥基喹啉中處理3小時(shí)，用卡諾液固定24小時(shí)，然后置于70％乙醇中4℃下保存；其次是幼小雌蕊觀察法剝?nèi)∮仔』ɡ僦械拇迫?，?.002mol/L 8-羥基喹啉處理5小時(shí)，用卡諾液固定24小時(shí)，然后置于70％乙醇中4℃下保存；第三是幼小花蕾觀察法將幼小花蕾用0.002mol/L 8-羥基喹啉處理4小時(shí)后，轉(zhuǎn)到卡諾液中固定，24小時(shí)后轉(zhuǎn)到70％乙醇中4℃下保存；b、轉(zhuǎn)基因油菜的除草劑抗性檢測(cè)，人工合成油菜植株5-6葉期，噴施13.5％的Basta1∶200倍稀釋液，5天后調(diào)查葉片藥害表現(xiàn)，設(shè)非轉(zhuǎn)基因油菜噴施對(duì)照，轉(zhuǎn)基因油菜沒(méi)有反應(yīng)，非轉(zhuǎn)基因油菜枯死；c、轉(zhuǎn)基因油菜基因組Southern blotting分子檢測(cè)，采用CTAB法提取植物基因組DNA，取人工合成的C染色體組轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)行油菜、轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)、非轉(zhuǎn)基因油菜、非轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)材料基因組總DNA和轉(zhuǎn)基因pCAMBIA3300質(zhì)粒DNA各20μg，分別用內(nèi)切酶EcoR I將其消化后在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳分離，進(jìn)行預(yù)雜交、雜交和洗膜的程序，所用探針為pCAMBIA3300質(zhì)粒PCR擴(kuò)增bar基因的0.5kb片段，檢測(cè)使用地高辛標(biāo)記試劑盒進(jìn)行，質(zhì)粒、轉(zhuǎn)基因油菜、轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)有特異帶出現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因油菜與轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)帶型一致，非轉(zhuǎn)基因油菜和甘藍(lán)沒(méi)有特異帶出現(xiàn)；d、外源基因位于甘藍(lán)型油菜C染色體上的細(xì)胞遺傳學(xué)驗(yàn)證，以轉(zhuǎn)基因油菜作父本或母本與白菜雜交，甘白雜種與白菜回交，獲得回交一代種子，苗期對(duì)回交一代植株進(jìn)行抗除草劑涂葉鑒定，不抗除草劑植株葉片出現(xiàn)枯死癥狀時(shí)，將該葉片摘除，并對(duì)植株進(jìn)行PCR分子檢測(cè)，根據(jù)抗除草劑表型和分子檢測(cè)結(jié)果給每株掛抗、感牌，花期取每株幼小花蕾用0.002mol/L 8-羥基喹啉處理4小時(shí)，轉(zhuǎn)到卡諾固定液中固定，24小時(shí)后轉(zhuǎn)到70％乙醇中保存?zhèn)溆?，將幼小花蕾中的花藥挑出，?0℃下、1M鹽酸中解離5分鐘，然后在改良卡寶品紅中進(jìn)行染色、壓片，在顯微鏡下觀察、照相，觀察到20條染色體的植株都是不抗除草劑，并且PCR檢測(cè)為陰性；染色體在21-28條之間的植株出現(xiàn)抗、感除草劑分離；染色體數(shù)為29的植株抗除草劑，PCR分子檢測(cè)陽(yáng)性。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種甘藍(lán)型油菜C染色體組定向轉(zhuǎn)基因的方法，其步驟是A.甘藍(lán)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，首先是農(nóng)桿菌菌液制備，其次是外植體制備，第三是將外植體置于農(nóng)桿菌液中進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，第四是除草劑抗性檢測(cè)，第五是PCR分子檢測(cè)；B.轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜的人工合成，首先是白菜細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜人工合成，其次是甘藍(lán)細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜人工合成，最后是對(duì)人工合成的單倍體油菜進(jìn)行染色體加倍；C.轉(zhuǎn)基因油菜的鑒定。本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，外源目的基因可準(zhǔn)確無(wú)誤地轉(zhuǎn)到甘藍(lán)型油菜C染色體上，所獲得的轉(zhuǎn)基因油菜，環(huán)境釋放時(shí)外源轉(zhuǎn)基因擴(kuò)散的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)小。
文檔編號(hào)A01H1/02GK1884518SQ20061001946
公開(kāi)日2006年12月27日 申請(qǐng)日期2006年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月27日
發(fā)明者方小平, 李均, 王轉(zhuǎn), 羅莉霞, 李俊 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所