專利名稱：一種菌種粉的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物肥料菌種的制造方法，具體來說，本發(fā)明涉及 一種菌種粉的制備方法。
技術(shù)背景-
傳統(tǒng)微生物肥料制造方法不足之處是所有菌種發(fā)酵液只宜在本廠 自產(chǎn)自用，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)的菌種液體積大，難于包裝運輸?shù)狡渌蕪S 和當(dāng)?shù)赜袡C(jī)肥原料混合加工成顆粒菌肥；而各地菌肥企業(yè)要生產(chǎn)此種 菌肥，勢必都要自行建立菌種廠發(fā)酵生產(chǎn)菌種。如此，則需成倍增加 各地同類生物肥料廠的設(shè)備投資和技術(shù)力量，而在企業(yè)資金不足和發(fā) 酵技術(shù)人員缺乏的情況下，如無菌種來源勢必影響到復(fù)合生物肥料的 發(fā)展和推廣應(yīng)用。
現(xiàn)有技術(shù)中也有采用高速離心濃縮方法和板框過濾機(jī)脫水濃縮方 法對菌種進(jìn)行濃縮，但是板框過濾機(jī)濾孔較菌體大很多，菌體的收集 率較低。 發(fā)明內(nèi)容-
本發(fā)明的目的在于提供一種菌種粉的制備方法，所述的復(fù)制備方 法解決了現(xiàn)有技術(shù)中對菌種的芽孢粉收集率較低的技術(shù)問題。
本發(fā)明提供了一種菌種粉的制備方法，包括一個將菌種培養(yǎng)發(fā)酵 成芽孢的過程、 一個濃縮的過程、 一個吸附的過程、 一個粉碎和干燥
的過程，在所述的將菌種培養(yǎng)發(fā)酵成芽孢的過程中，在芽孢率達(dá)到80%以上并且占總數(shù)目20%的芽孢從孢囊中脫出時停止發(fā)酵，其中，在所 述的濃縮的過程中，利用直徑為12 18cm、長度為90 110cm的4 8萬分子量的中空纖維膜將菌種的發(fā)酵液循環(huán)濃縮到原液體積的 10°/。 15%，在所述的吸附的過程中，利用吸附劑將濃縮后的發(fā)酵液吸 附成直徑小于5 6mm的顆粒，在所述的粉碎和干燥的過程中，禾糊 氣流干燥機(jī)以120 16(TC溫度下的熱風(fēng)將吸附處理后的顆粒干燥成含 水率小于等于8%、細(xì)度小于60目的菌粉。
進(jìn)一步的，所述的吸附劑采用輕質(zhì)碳酸鈣。 進(jìn)一步的，所述的菌種是固氮芽孢菌CCTCCM95040 。 進(jìn)一步的，所述的菌種是巨大芽孢桿菌ACCC 10010。 或者，所述的菌種是膠凍樣芽孢桿菌ACCC 10013 。 進(jìn)一步的，在吸附的過程中，吸附劑和濃縮后的發(fā)酵液的重量百 分比為3: 1.5 2.5。
進(jìn)一步的，在吸附的過程中，吸附劑和濃縮后的發(fā)酵液的重量百 分比為3: 2。
本發(fā)明采用的固氮菌是指固氮芽孢桿菌(Bacillus azotofixans)，因 其含有固氮酶，能將空氣中的氮轉(zhuǎn)化為氨態(tài)氮，簡稱為"固氮菌"。固 氮菌己在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，編號為CCTCC M95040，公眾可按保藏號向該保藏中心購買磷細(xì)菌。
本發(fā)明采用的磷細(xì)菌是指巨大芽孢桿菌(Bacilllus megatherium) ACCC 10010，因其能分解土壤難溶性磷，因此俗稱為磷細(xì)菌。磷細(xì)菌已 在中國微生物菌種保藏管理委員會農(nóng)業(yè)微生物中心(ACCC)保藏，編
號為ACCC 10010，公眾可按保藏號向該保藏中心購買磷細(xì)菌。
本發(fā)明采用的鉀細(xì)菌是膠凍樣芽孢桿菌(Bacilllus mucilaginosus) ACCC 10013，此菌因其能分解土壤礦物中鉀素能力，因此俗稱為鉀細(xì) 菌，鉀細(xì)菌己在中國微生物菌種保藏管理委員會農(nóng)業(yè)微生物中心 (ACCC)保藏，編號為ACCC 10013，公眾可按號索取。
本發(fā)明改進(jìn)了已有菌種的制造方法，將菌種發(fā)酵液濃縮干燥成干 菌種粉，濃縮成含有高濃度(每克至少含芽孢30億個)的芽孢菌種粉。 濃縮加工制成的芽孢菌種粉可長期貯存?zhèn)溆?1)供本廠自用作為制 造顆粒/粉狀菌肥的菌種；(2)經(jīng)包裝運輸?shù)礁鞯厣锓柿蠌S加工制造 菌肥使用，各地同類企業(yè)不需另投資建立菌種廠。
固氮菌的培養(yǎng)發(fā)酵可使用公知的培養(yǎng)條件和方法。 一般培養(yǎng)時間 是20-24小時，培養(yǎng)溫度是25-30。C，培養(yǎng)pH是7.0-7.4，通氣量0.5-1: l立方米/1000升，攪拌速度200-300轉(zhuǎn)/分。本菌種優(yōu)選的培養(yǎng)時間是 28小時形成芽孢，培養(yǎng)溫度30'C，培養(yǎng)pH7.2，通氣量0.5-1: 1立方 米/1000升，罐壓0.5kg/cm氣攪拌速度200轉(zhuǎn)/分。其優(yōu)選培養(yǎng)基如下 篩選及保存菌種用無氮培養(yǎng)基
淀粉0.8%
蛋白胨0.15%
酵母膏0.01%
硫酸銨((NH4) 2S04)0.15%
碳酸鈣(CaC03)0.15%
磷酸氫二鉀(K2HP04)0.005%
硫酸錳(MnS04) 0.005% 葡萄糖 0.30% 瓊脂 2.5% pH=7.2-7.4
用于CCTCC M95040固氮菌的搖瓶培養(yǎng)和發(fā)酵生產(chǎn)的培養(yǎng)基是上 述無氮培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上另加如下成份
硫酸鎂(MgS04) 0.005% 磷酸二氫鉀(KH2P04) 0.02% 氯化鈉(NaCl) 0.01°/。
磷細(xì)菌的培養(yǎng)發(fā)酵可使用公知的培養(yǎng)條件和方法。
磷細(xì)菌大量培養(yǎng)發(fā)酵的培養(yǎng)基為淀粉0.5%，黃豆粉0.075%,蛋 白胨0.15%，硫酸銨0.2%，硫酸鎂0.005%，硫酸錳0.005%，磷酸氫二 鉀0.2%,酵母粉0.1%，碳酸鈣0.01%， pH=7.2-7.4。其余發(fā)酵條件與 固氮芽孢菌相同。
鉀細(xì)菌的培養(yǎng)發(fā)酵可使用公知的培養(yǎng)條件和方法。
鉀細(xì)菌大量培養(yǎng)發(fā)酵的培養(yǎng)基為淀粉1%，黃豆粉0.08%，磷酸 氫二鉀0.2%，硫酸銨0.1%,硫酸錳0.005%,硫酸鎂0.005%，三氯化 鐵0.001%,碳酸鈣0.01%，酵母膏0.01%, pH=7.2-7.4。其余發(fā)酵條件 與固氮芽孢菌磷細(xì)菌相同。
芽孢菌種濃縮干燥成粉技術(shù)
1、發(fā)酵液濃縮處理
在固氮菌、磷細(xì)菌及鉀細(xì)菌培養(yǎng)發(fā)酵25-30小時，經(jīng)顯微鏡檢查三 種菌體的芽孢形成率，當(dāng)芽孢率達(dá)到80%以上且有20%芽孢從孢囊中 脫出之時即可停止發(fā)酵。然后將三種菌的發(fā)酵液分別用通過直徑 12-18cm，長90-110cm的4-8萬分子量中空纖維膜循環(huán)濃縮到原液體 積的10%-15%。
2、 濃縮液吸附處理
將濃縮后的發(fā)酵液分別用輕質(zhì)碳酸鈣等吸附劑吸附成直徑 <5-6mm的顆粒。
加入到發(fā)酵液中的吸附劑數(shù)量根據(jù)以下比例配比 吸附劑濃縮液=3: 1.5-2.5 (質(zhì)量比)
3、 熱風(fēng)粉碎、干燥處理
將吸附處理后的顆粒經(jīng)氣流干燥機(jī)120-160 ""C的熱風(fēng)干燥成含水 率^8%，細(xì)度<60目的菌粉。
4、 混合包裝
將干芽孢菌粉按比例混合后即可包裝貯存?zhèn)溆谩?芽孢干菌粉含菌數(shù)檢測
按照常規(guī)的稀釋平板記數(shù)法檢測干菌粉中的活芽孢菌數(shù)。稱取干 菌粉10克，加入到90毫升無菌水中稀釋到適當(dāng)濃度，(每毫約含有菌 數(shù)20-200個)，然后移取O.l毫升稀釋菌液加入到無菌的培養(yǎng)甲皿中， 分別加入適量溶化后的固氮菌或磷細(xì)菌或鉀細(xì)菌培養(yǎng)基，充分混合冷 凝后形成平板，在3(TC保溫箱中培養(yǎng)二天，計算培養(yǎng)皿平板上的菌落 數(shù)。每種菌的計算平板重復(fù)3次，取記數(shù)平板上生長出的平均菌落數(shù)，
乘以樣品稀釋倍數(shù)即為每克干菌粉中有的活菌數(shù)(即活芽孢數(shù))，其計 算公式如下
干菌粉活芽孢數(shù)
(億個/克) =平均每個平板菌落數(shù)(個)x樣品稀釋倍
數(shù)(個/克)
千菌粉成品質(zhì)量要求 3種菌活芽孢熟總量》30X108 (億個/克)(其中固氮菌、磷細(xì)菌、 鉀細(xì)菌各約占1/3)干菌粉含水量<5% 干菌粉細(xì)度95%以上過80目篩孔
本發(fā)明和已有技術(shù)相比，采用中空纖維膜濃縮后熱風(fēng)干燥成粉方法 濃縮菌種芽孢，比高速離心濃縮方法更節(jié)省能源和成本而回收率高， 比板框過濾機(jī)脫水濃縮方法菌種濃縮率高(板框過濾機(jī)濾孔較菌體大 很多，而本發(fā)明使用的中空纖維膜濾孔較菌體略小，提高了菌體收集 率)，經(jīng)實踐證明是一種最經(jīng)濟(jì)有效的微生物肥料菌種粉制造新技術(shù)。
具體實施方式
-
實施例l(固氮菌芽孢粉)
1、 固氮菌種培養(yǎng)發(fā)酵
將固氮菌芽孢菌CCTCC M95040接種到盛有1000ml的如前所述 的用于本發(fā)明固氮菌培養(yǎng)基的三角瓶中搖瓶培養(yǎng)18小時，然后按1% 接種量接種到300升種子發(fā)酵罐中，通氣(1: 0.5)，攪拌，3(TC保溫 培養(yǎng)15小時，再按3%接種量接種到5000升大發(fā)酵罐中，同樣條件培 養(yǎng)20小時后升溫到35。C并加大通氣量(1: 1)再培養(yǎng)10小時待菌體
芽孢形成率達(dá)80%并有20%芽孢從孢囊中脫出后即可出罐成為產(chǎn)芽固 氮菌種發(fā)酵液。
2、 芽孢菌種濃縮干粉的制備 將形成芽孢的固氮菌發(fā)酵液放入貯存罐中，經(jīng)直徑15cm，長100cm
的5萬分子量中空纖維膜進(jìn)行濃縮處理，待濃縮液體積降至原液 10%-15%左右，加入濃縮液質(zhì)量150%的輕質(zhì)碳酸鈣吸附成直徑 <5-6mm的顆粒，然后將吸附處理后的顆粒經(jīng)氣流干燥機(jī)13(TC的熱風(fēng) 干燥成含水率^8%，細(xì)度<60目的菌粉，即可包裝貯存?zhèn)溆?。按此法?備成的菌種干粉應(yīng)含芽孢數(shù)至少30億個/克，干燥貯存二年活性保持 80%以上。
按本發(fā)明制成的菌種粉可供本廠或外廠和有機(jī)肥基質(zhì)混合加工成 顆粒菌肥或以菌種粉作為農(nóng)作物的拌種劑應(yīng)用。
3、 和有機(jī)肥基質(zhì)混合加工成顆粒菌肥 將腐熟的城市生活污泥和雞糞按比例混合粉碎，過80目篩，然后
加入10%硫酸銨混合成為肥料基質(zhì)。在上述肥料基質(zhì)中加入1%如前述 步驟制成的固氮菌芽孢粉充分混合，在成球盤中噴加20%水分滾動制 成直徑3-5mm球型顆粒，再經(jīng)8(TC熱風(fēng)滾筒干燥即制成顆粒狀固氮菌 肥。本產(chǎn)品含有固氮芽孢菌至少0.3億/克，干燥貯存二年活性保持80% 以上。
實施例2 (磷細(xì)菌芽孢粉)
按前述磷細(xì)菌培養(yǎng)基和實施例1所述方法培養(yǎng)磷細(xì)菌發(fā)酵液，再 經(jīng)同法中空纖維膜濃縮和熱風(fēng)干燥制成濃縮加工的磷細(xì)菌芽孢粉。制
成的磷細(xì)菌菌種粉含磷細(xì)菌芽孢至少30億個/克，可供本廠或外地菌肥 廠作菌種，如實施例1所述，按1%比例加入到有機(jī)肥基質(zhì)即可制成顆 粒狀磷細(xì)菌肥，每克顆粒菌肥含磷細(xì)菌至少0.3億個。 實施例3(鉀細(xì)菌芽孢粉)
按前述鉀細(xì)菌培養(yǎng)基和實施例1所述方法培養(yǎng)鉀細(xì)菌發(fā)酵液，再 經(jīng)同法中空纖維膜濃縮和噴霧干燥制成濃縮加工的鉀細(xì)菌芽孢粉。制 成的鉀細(xì)菌菌種粉含鉀細(xì)菌芽孢至少30億個/克，可供本廠或外地菌肥 廠作菌種，如實施例1-3中所述方法，按01%比例加入到有機(jī)肥基質(zhì) 中混合造粒，即可制成顆粒鉀細(xì)菌肥，每克成品含鉀細(xì)菌至少0.3億個。
實施例4 (復(fù)合菌芽孢粉)
按前述例1、例2及例3中所述方法制成的芽孢菌粉按比例混合， 即制成含有固氮菌、磷細(xì)菌和鉀細(xì)菌三菌混合的芽孢菌粉。三種菌復(fù) 合的芽孢粉含有芽孢至少30億個/克。
如施例1-例3所述，在有機(jī)肥基質(zhì)中加入0.5-1%復(fù)合菌芽孢粉即 可制成含有固氮菌、磷細(xì)菌和鉀細(xì)菌的有機(jī)無機(jī)微生物復(fù)合菌肥粒肥 料。此種產(chǎn)品含三種復(fù)合菌至少0.3億個/克，符合目前我國農(nóng)業(yè)部發(fā) 的微物肥料行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(NY227-94)中顆粒壯復(fù)合微生物肥料含有效菌 要求。
本發(fā)明制得的復(fù)合微生物肥料自2003年起經(jīng)中國農(nóng)墾經(jīng)濟(jì)中心在 云南、海南、廣東等墾區(qū)的橡膠、甘蔗、茶葉、熱帶水果等多種作物 上進(jìn)行了大量的試驗，結(jié)果顯示該肥料使作物對比增產(chǎn)4.8-21.8%，能
顯著提高作物品質(zhì)，并對培肥墾區(qū)土壤有促進(jìn)作用。
權(quán)利要求
1.一種菌種粉的制備方法，包括一個將菌種培養(yǎng)發(fā)酵成芽孢的過程、一個濃縮的過程、一個吸附的過程、一個粉碎和干燥的過程，在所述的將菌種培養(yǎng)發(fā)酵成芽孢的過程中，在芽孢率達(dá)到80％以上并且占總數(shù)目20％的芽孢從孢囊中脫出時停止發(fā)酵，其特征在于在所述的濃縮的過程中，利用直徑為12～18cm、長度為90～110cm的4～8萬分子量的中空纖維膜將菌種的發(fā)酵液循環(huán)濃縮到原液體積的10％～15％，在所述的吸附的過程中，利用吸附劑將濃縮后的發(fā)酵液吸附成直徑小于5～6mm的顆粒，在所述的粉碎和干燥的過程中，利用氣流干燥機(jī)以120～160℃溫度下的熱風(fēng)將吸附處理后的顆粒干燥成含水率小于等于8％、細(xì)度小于60目的菌粉。
2. 如權(quán)利要求1所述的菌種粉的制備方法，其特征在于所述的吸附 劑采用輕質(zhì)碳酸鈣。
3. 如權(quán)利要求1所述的菌種粉的制備方法，其特征在于所述的菌種 是固氮芽孢菌CCTCC M95040 。
4. 如權(quán)利要求1所述的菌種粉的制備方法，其特征在于所述的菌種 是巨大芽孢桿菌ACCC 10010。
5. 如權(quán)利要求1所述的菌種粉的制備方法，其特征在于所述的菌 種是膠凍樣芽孢桿菌ACCC 10013 。
6. 如權(quán)利要求1所述的菌種粉的制備方法，其特征在于在吸附的過 程中，吸附劑和濃縮后的發(fā)酵液的重量百分比為3: 1.5 2.5。
7.如權(quán)利要求6所述的菌種粉的制備方法，其特征在于在吸附的過
全文摘要
本發(fā)明一種菌種粉的制備方法，包括一個將菌種培養(yǎng)發(fā)酵成芽孢的過程，一個濃縮的過程，一個吸附的過程，一個粉碎和干燥的過程，在培養(yǎng)發(fā)酵成芽孢的過程中，當(dāng)芽孢率達(dá)到80％以上且有20％芽孢從孢囊中脫出之時即可停止發(fā)酵，在濃縮的過程中，將菌種的發(fā)酵液采用直徑12-18cm，長90-110cm的4-8萬分子量中空纖維膜循環(huán)濃縮到原液體積的10％-15％，在吸附的過程中，將濃縮后的發(fā)酵液分別用輕質(zhì)碳酸鈣等吸附劑吸附成直徑＜5-6mm的顆粒，在吸附和干燥的過程中，將吸附處理后的顆粒經(jīng)氣流干燥機(jī)熱風(fēng)干燥成菌粉。本發(fā)明使用的中空纖維膜濾孔較菌體略小，提高了菌體收集率，是一種經(jīng)濟(jì)有效的微生物肥料菌種粉制造技術(shù)。
文檔編號C12N1/20GK101186884SQ20061011846
公開日2008年5月28日 申請日期2006年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月17日
發(fā)明者曹寶玲, 林木森, 歐震雷, 謙 肖 申請人:上海豫園生物工程有限公司