專利名稱：一種嵌合型病毒樣顆粒dna疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種DNA疫苗，特別涉及一種嵌合型病毒樣顆粒DNA疫苗。
背景技術(shù)：
有多種方法可以預(yù)防各種病原體感染，提高機(jī)體免疫力是最主要的手段，一般是以接種疫苗而達(dá)到的。接種疫苗是預(yù)防各種病原體感染的有效措施。常見的病原體有病毒、微生物、真核細(xì)胞、寄生蟲和環(huán)境因子等有機(jī)體和分子。目前已有多種方法用來生產(chǎn)抗傳染性病原體的疫苗，如滅活疫苗，減毒活疫苗、重組疫苗，亞單位疫苗和核酸疫苗等。它們的基本作用原理是相同的，即借助與病原體結(jié)合的組織相容性蛋白激發(fā)免疫反應(yīng)，達(dá)到免疫個(gè)體不被傳染性病原體感染的目的。當(dāng)個(gè)體與傳染性病原體接觸時(shí)，其免疫系統(tǒng)能夠識(shí)別病原體蛋白而產(chǎn)生有效的保護(hù)反應(yīng)抵抗傳染。目前所用的許多疫苗就是由從病原體中分離出來的非傳染性和低傳染性的蛋白或核酸物質(zhì)所組成。較為安全的疫苗有兩類，重組蛋白疫苗和核酸疫苗。
重組蛋白疫苗又稱重組亞單位苗，是指將不致病保護(hù)性抗原基因在原核或真核細(xì)胞中表達(dá)，再以這種生物合成的基因產(chǎn)物制成的疫苗。這種亞單位疫苗只含有產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答所必需的免疫原成分，不含免疫所不需要的成分，因此有很多優(yōu)點(diǎn)。首先是安全性好，疫苗中不含傳染性材料，接種后不會(huì)發(fā)生急性、持續(xù)或潛伏感染，可用于不宜使用活疫苗的一些情況，如妊娠動(dòng)物。其次，這些疫苗減少或消除了常規(guī)疫苗或死疫苗難以避免的熱原、變應(yīng)原、免疫抑制原和其它有害的反應(yīng)原。此外，這種疫苗產(chǎn)生的免疫應(yīng)答可以與感染產(chǎn)生的免疫應(yīng)答相區(qū)別，因此更適合于疫病的控制和消滅計(jì)劃。但此類疫苗存在嚴(yán)重的不足之處，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，重組蛋白疫苗難以產(chǎn)生完整的免疫反應(yīng)，即不產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng)，包括毒性T-淋巴細(xì)胞。原因是多方面的。如1)基因片段體外表達(dá)不能提供與天然病毒一致的空間構(gòu)像，從而激活的免疫反應(yīng)效率低；2)基因重組蛋白的抗原提呈過程往往只是局限于與MHC-II型分子的結(jié)合，無法激活細(xì)胞免疫活性，從而使多數(shù)研制的基因重組疫苗達(dá)不到應(yīng)有的保護(hù)水平。目前世界上成功的基因重組疫苗是八十年代初研制的人乙肝疫苗。由于其特殊的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)形成的病毒樣顆粒，使其成為唯一上市的基因重組疫苗。另外DNA疫苗的出現(xiàn)，給疫苗的發(fā)展提供了一個(gè)新的希望。它不僅安全，方便，更重要的是，它可以激活體液和細(xì)胞雙重反應(yīng)。但是幾年的研究表明，DNA疫苗的免疫源性比減毒病毒疫苗低一些(Berzofsky，J.A.Nature Reviews，2001，1209)。所以探索更有效的方法成為今后方向。近年來，免疫學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，空殼的病毒顆粒，即病毒樣顆粒作為免疫原，可以提高免疫效率，尤其是在重組蛋白疫苗達(dá)不到的激活毒性T-淋巴細(xì)胞活性方面，病毒樣顆?？梢酝ㄟ^交叉提呈方式激活毒性T-淋巴細(xì)胞活性，同時(shí)激活高強(qiáng)度的抗體水平。
病毒樣顆粒作為載體的研究近年來成為關(guān)注的方向之一，如利用VSV-G抗原(Marsac，D.，et al，2002)、HBV-S抗原(Chengalvala，M.V.et al.1999.Vaccine 171035；Netter，H.，et al.2001.J.Virol，752130)、parvovirus(Sedlik，C.，et al，1997.Proc.Natl.Acad.Sci.947503)、酵母轉(zhuǎn)座子的Ty抗原等(Layton，G.，et al.，1993.J.of Immunol.1511097)。采用病毒樣顆粒有許多優(yōu)勢(shì)如1)更有效的使抗原提呈；2)非復(fù)制型，安全性好；3)不需佐劑；4)可產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng)，尤其是可以激活MHC-1限制性CTL反應(yīng)(Fehr，T.，et al，1998.Proc.Natl.Acad.Sci.959477)。所以此技術(shù)將被看成有前景的技術(shù)。關(guān)于病毒樣顆粒如何使得抗原激活CTL活性，仍然有許多需要探討的問題。許多研究表明，納米至微米的小球結(jié)構(gòu)使得抗原提呈細(xì)胞提呈過程與可溶性蛋白不同，如內(nèi)吞(endocytic)或吞噬(phagocytic)，從而激活不同的MHC分子途徑(Lee，I.-H.et al，1996.J.Med.Virol.50145；Schirmbeck，R.1995，J.Immunology，1554676)。
雖然HBV-S抗原可以形成顆粒，并且加載在S抗原上的重組瘧疾疫苗已加入臨床試驗(yàn)(Bojang，et al.2001.Lancet 3581927)，但是S抗原顆粒所產(chǎn)生免疫反應(yīng)要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于核心抗原。幾乎所有HBV感染的病人都會(huì)產(chǎn)生針對(duì)核心抗原C表位較強(qiáng)的免疫反應(yīng)(Salfeld，J.，et al，1989.J.Virol.63798)。核心抗原分子小，只有22kd，有利于基因操作和表達(dá)(Koletzki，D.，et al，1997，J.Gen.Virol，782049)。
但是，以上的改造只是將體外表達(dá)的產(chǎn)物進(jìn)行純化后免疫機(jī)體，而產(chǎn)生免疫反應(yīng)。其制備和純化過程復(fù)雜，成本高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種嵌合型病毒樣顆粒DNA疫苗。
本發(fā)明所提供的嵌合型病毒樣顆粒DNA疫苗，是在多克隆位點(diǎn)插入有由人乙肝病毒核心抗原的自氨基端第1至78位氨基酸殘基、不致病保護(hù)性目的抗原和人乙肝病毒核心抗原的自氨基端第80至148位氨基酸殘基組成的嵌合蛋白的編碼基因的重組真核表達(dá)載體。
所述嵌合蛋白中，人乙肝病毒核心抗原的自氨基端第1至78位氨基酸殘基位于氨基端，人乙肝病毒核心抗原的自氨基端第80至148位氨基酸殘基位于羧基端，不致病保護(hù)性目的抗原位于中間。
為了不影響目的抗原的空間結(jié)構(gòu)和抗原表位的展示，所述不致病保護(hù)性目的抗原的氨基端與人乙肝病毒核心抗原的自氨基端的第78位氨基酸殘基通過具有序列表中序列5的氨基酸殘基序列的連接肽linker1連接；所述不致病保護(hù)性目的抗原的羧基端與人乙肝病毒核心抗原的自氨基端的第80位氨基酸殘基通過具有序列表中序列6的氨基酸殘基序列的連接肽linker2連接。
所述人乙肝病毒核心抗原的自氨基端第1至78位氨基酸殘基具有序列表中序列1的氨基酸殘基序列；所述人乙肝病毒核心抗原的自氨基端第80至148位氨基酸殘基具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列。
用于構(gòu)建所述重組真核表達(dá)載體的出發(fā)載體為可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)外源基因的表達(dá)載體，如proVAX，pVAX，pcDNA3或pCI等可以用于真核細(xì)胞表達(dá)的載體。
所述不致病保護(hù)性目的抗原可為現(xiàn)有的已知不致病保護(hù)性抗原，如口蹄疫病毒VP1，或禽流感病毒NA和NH抗原，或新城疫病毒HN和F抗原，或艾滋病病毒GP160抗原和NEF抗原或腫瘤相關(guān)抗原如，MAG-1、gastrin等。
所述嵌合蛋白具有序列表中序列3的氨基酸殘基序列，名稱為HBc-VP1。
序列表中的序列3由370個(gè)氨基酸殘基組成，自氨基端第79位至83位氨基酸殘基為連接肽linker1，自氨基端第297位至301位氨基酸殘基為連接肽linker2。
所述嵌合蛋白HBc-VP1的編碼基因具有下述核苷酸序列之一1)序列表中序列4的DNA序列；2)編碼序列表中序列3蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中序列4的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中序列4限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
上述高嚴(yán)謹(jǐn)條件可為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下雜交并洗膜。
序列表中的序列4由1110個(gè)脫氧核苷酸組成，其編碼序列為自5′端第1位至1110位脫氧核苷酸。
所述疫苗具體可為proVAX-ABC；proVAX-ABC是將序列表中序列4的DNA序列插入proVAX的EcoRI及XbaI的酶切位點(diǎn)間得到的重組表達(dá)載體。
所述DNA疫苗中還可含有佐劑，如左旋咪唑、礦物油或鋁鹽佐劑。
為了使不致病保護(hù)性目的抗原能在人乙肝病毒核心抗原中進(jìn)行有效地表達(dá)并且能夠展示在核心抗原之外，本發(fā)明以可形成病毒樣顆粒的人乙肝病毒核心抗原為載體，將不致病保護(hù)性目的抗原基因片段克隆和嵌合于人乙肝病毒核心抗原表位的編碼基因中(人乙肝病毒核心抗原的自氨基端第78位氨基酸和80位氨基酸的密碼子之間)形成DNA疫苗，再將該DNA疫苗注射于體內(nèi)，在表達(dá)過程中，不致病保護(hù)性目的抗原與人乙肝病毒核心抗原共同形成嵌合型病毒樣顆粒。不致病保護(hù)性目的抗原呈現(xiàn)在人乙肝病毒核心抗原表面而提高其免疫的提呈，不僅可以產(chǎn)生較強(qiáng)的B細(xì)胞活性，激發(fā)高強(qiáng)度的抗體水平，更重要的是通過間接提呈(crosspresentation)增強(qiáng)細(xì)胞免疫水平，激活T細(xì)胞和毒性T細(xì)胞活性，激活更為強(qiáng)烈的完全免疫反應(yīng)，使機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫能力。
本發(fā)明的嵌合型病毒樣顆粒DNA疫苗可與佐劑或不與佐劑混合免疫動(dòng)物，激活細(xì)胞內(nèi)一系列信號(hào)而產(chǎn)生完全免疫反應(yīng)。本發(fā)明的嵌合型病毒樣顆粒DNA疫苗可防治病原體感染、抗腫瘤、治療自主免疫疾病和清除蛋白性毒素引起的中毒癥狀等。本發(fā)明的嵌合型病毒樣顆粒DNA疫苗針對(duì)性的致病病原體有病毒、原核細(xì)胞、真核細(xì)胞。真核細(xì)胞病原體包括單細(xì)胞致病病原體和多細(xì)胞寄生蟲類。病毒性病原體包括呼吸道病毒(冠狀病毒、流感和輪狀病毒)、瘡疹病毒(德國麻疹、水痘、牛痘、天花、帶狀瘡疹等)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)病毒(沅病毒)、免疫系統(tǒng)病毒(艾滋病毒)、生殖系統(tǒng)病毒(尖銳濕疣)、畜牧病毒(口蹄疫病毒、豬瘟)、和一切可能的致病性病毒。
本發(fā)明的嵌合型病毒樣顆粒DNA疫苗能夠有效的激發(fā)完全免疫反應(yīng)，又避免使用感染性的制劑，載體和不安全的遺傳物質(zhì)。其它常規(guī)免疫接種技術(shù)(除了核酸疫苗以外)，如果不使用感染性制劑就不會(huì)激活細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)，因此滅活或失活疫苗，亞單位疫苗接種均不產(chǎn)生完全的免疫反應(yīng)。本發(fā)明的嵌合型病毒樣顆粒DNA疫苗能有效地克服常規(guī)免疫接種技術(shù)的這些不足。本發(fā)明的嵌合型病毒樣顆粒DNA疫苗能夠有效的提高激發(fā)完全免疫反應(yīng)的能力，保護(hù)機(jī)體抵抗病原體侵染，而且制備簡單無需復(fù)雜設(shè)備，使用時(shí)操作簡單。


圖1為嵌合蛋白HBc-VP1基因克隆示意2為RT-PCR檢測(cè)嵌合型病毒樣顆粒DNA疫苗proVAX-ABC在Hela細(xì)胞中的表達(dá)結(jié)果圖3為透射電鏡檢測(cè)嵌合型病毒樣顆粒DNA疫苗proVAX-ABC在Hela細(xì)胞中的表達(dá)結(jié)果圖4A為轉(zhuǎn)proVAX-ABC的Hela細(xì)胞培養(yǎng)上清液與抗口蹄疫VP1的抗體反應(yīng)結(jié)果圖4B為轉(zhuǎn)proVAX-ABC的Hela細(xì)胞培養(yǎng)上清液與抗人乙肝病毒核心抗原的抗體反應(yīng)結(jié)果圖5為ELISA檢測(cè)proVAX-ABC免疫小鼠IgG抗體水平的變化結(jié)果。
圖6為流式細(xì)胞檢測(cè)免疫proVAX-ABC的小鼠T細(xì)胞體外增殖情況。
圖7為RT-PCR檢測(cè)免疫proVAX-ABC的小鼠體內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)水平結(jié)果。
圖8為流式細(xì)胞檢測(cè)免疫proVAX-ABC的小鼠體內(nèi)CTL水平結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)驗(yàn)方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
實(shí)施例1、嵌合型病毒樣顆粒DNA疫苗的制備1、含有嵌合蛋白HBc-VP1的編碼基因的重組表達(dá)載體proVAX-ABC的構(gòu)建為了使口蹄疫病毒VP1基因能在人乙肝病毒核心抗原中進(jìn)行有效地表達(dá)并且能夠展示在核心抗原之外，將口蹄疫病毒VP1基因片段克隆于人乙肝病毒核心抗原的自氨基端第78位氨基酸和80位氨基酸的密碼子之間，以利于抗原的展示和提呈。具體方法如下(1)引物設(shè)計(jì)根據(jù)人乙肝病毒核心抗原基因及口蹄疫病毒VP1基因的序列，并按照?qǐng)D1中的克隆思路設(shè)計(jì)3套引物。引物序列分別為CP015’-AAGAATTCGGCACGGACATTGACCCGTATAAA-3’，CP025’-ACCTCCACCTCCGGAGTCTTCCAAATTACTTCCC-3’)，CP01與CP02克隆得到人乙肝病毒核心抗原基因的上游區(qū)(1-78氨基酸)，并命名為A片段；CP035’-TCCGGAGGTGGAGGTTCCACCACCTCTGCGGGTGAG-3’，
CP045’-TCCACCTCCACCCAGAAGCTGTTTTGCGGG-3’，CP03與CP04克隆得到口蹄疫VP1基因，并命名為B片段；CP055’-GGAGGTGGAGGTTCCAGGGAATTAGTAGTCAG-3’，CP065’-AATCTAGACTAACATTGAGATTCCCGAG-3’，CP05與CP06克隆得到人乙肝病毒核心抗原基因的下游區(qū)(80-148氨基酸)，并命名為C片段。
(2)基因克隆利用上述3對(duì)引物分別以人乙肝病毒核心抗原基因及口蹄疫VP1基因的cDNA(H.L.Jing，Z.Ma，Y.Li，F(xiàn).H.Zhang and B.Wang.Effects of ChemicalAdjuvants on DNA vaccination.2004，Vaccine，22，2925-2935)為模板，PCR得到3個(gè)基因片段。將3種PCR產(chǎn)物通過凝膠回收、純化并定量。根據(jù)圖1設(shè)計(jì)，再以CP01及CP06為引物，以3種PCR產(chǎn)物混合后為模板，利用3種PCR產(chǎn)物兩兩重疊的性質(zhì)，PCR得到嵌合基因ABC，即具有序列表中序列4的DNA序列的嵌合蛋白HBc-VP1的編碼基因。其中，3個(gè)基因片段PCR反應(yīng)體系2μl PCR緩沖液(100mM Tris-HCl，pH8.3，500mM KCl，15mM MgCl2，0.01％(0.01g/100ml)gelatin；Takara公司，大連)，2μl 10mM dNTP(Takara公司，大連)和0.25U of exTaq聚合酶(Takara公司，大連)。PCR擴(kuò)增程序先94℃30s，58℃30s，74℃50s，30個(gè)循環(huán)；然后72℃，10min。將PCR得到的ABC以T-A克隆的方式克隆至pMD18-T載體，對(duì)其進(jìn)行序列分析，選擇正確的陽性克隆命名為pMD18-T-ABC，進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)。
(3)proVAX-ABC的構(gòu)建由于引物CP01與CP06中分別設(shè)計(jì)有EcoRI及XbaI的酶切位點(diǎn)，利用EcoRI及XbaI分別對(duì)pMD18-T-ABC及真核表達(dá)載體proVAX(proVAX真核表達(dá)載體在pGEM-T載體(Promega公司產(chǎn)品)的基礎(chǔ)上構(gòu)建而成。具體的方法是，將pGEM-T載體的啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)及其polyA等序列切除，再將含有CMV啟動(dòng)子、人絨毛膜促性腺激素的信號(hào)肽序列、多克隆位點(diǎn)及BGH polyA等序列插入載體的相應(yīng)部位。同時(shí)，將pGEM-T載體的氨芐青霉素抗性基因的序列切除，并將以pEGFP-N3載體(Clonetech公司產(chǎn)品)為模板，PCR擴(kuò)增出的卡那霉素抗性基因序列插入載體的相應(yīng)部位。最終得到的新載體命名為proVAX)并進(jìn)行雙酶切，將酶切獲得的ABC與proVAX載體進(jìn)行回收、連接，選擇含有具有序列表中序列4的DNA序列的嵌合蛋白HBc-VP1的編碼基因(ABC)的陽性克隆，命名為proVAX-ABC。
2、嵌合型病毒樣顆粒DNA疫苗proVAX-ABC在Hela細(xì)胞中的體外表達(dá)檢測(cè)堿裂解法大量提取純化三種質(zhì)粒DNA proVAX，proVAX-VP1(將口蹄疫VP1的cDNA基因克隆到proVAX載體的EcoRI及XbaI位點(diǎn)內(nèi)而得到的重組載體)和proVAX-ABC，利用脂質(zhì)體方法轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，按Lipofectamine轉(zhuǎn)染試劑盒(Invitrogen公司產(chǎn)品)說明書進(jìn)行操作。在轉(zhuǎn)染后48h，收獲細(xì)胞。用Trizol法提取細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，然后用VP1特異性引物(P1-5’ACCACCTCTGCGGGTGAG-3’，P2-5’TTCCAGGGAATTAGTAGTCAG-3’)和ABC特異性的引物(CP01與CP06)進(jìn)行PCR，檢測(cè)Hela細(xì)胞中目的基因的表達(dá)。結(jié)果如圖2所示，proVAX-VP1轉(zhuǎn)染后的Hela細(xì)胞在700bp左右出現(xiàn)特異性條帶，proVAX-ABC轉(zhuǎn)染后的Hela細(xì)胞在1100bp左右出現(xiàn)特異性條帶，表明VP1基因與ABC均能在Hela細(xì)胞中成功的表達(dá)。圖2中，泳道1為DNA2000分子量標(biāo)準(zhǔn)(購自大連寶生物公司)；泳道2-3分別為proVAX-VP1和proVAX-ABC轉(zhuǎn)染后的RT-PCR結(jié)果；泳道4-5為proVAX空載體轉(zhuǎn)染后的RT-PCR對(duì)照；泳道6-7分別為proVAX-VP1和pro-VAX-ABC轉(zhuǎn)染后，以RNA為模板的PCR對(duì)照。
同時(shí)，由于proVAX載體為分泌型表達(dá)載體，其表達(dá)產(chǎn)物可被分泌到培養(yǎng)基上清液中。為進(jìn)一步鑒定上述ABC表達(dá)產(chǎn)物是否是病毒樣顆粒，在轉(zhuǎn)染后48h，收集細(xì)胞培養(yǎng)液的上清液，利用投射電鏡檢測(cè)培養(yǎng)上清中是否有病毒樣顆粒的表達(dá)。結(jié)果如圖3所示，投射電鏡檢測(cè)檢測(cè)結(jié)果表明轉(zhuǎn)染proVAX-ABC后培養(yǎng)液中有30-50nm病毒樣顆粒的表達(dá)(圖3中A箭頭示)，表明嵌合蛋白HBc-VP1的編碼基因ABC能在真核細(xì)胞中成功的表達(dá)并分泌。圖3中，A為轉(zhuǎn)染proVAX-ABC后Hela細(xì)胞上清液透射電鏡檢測(cè)結(jié)果；B為轉(zhuǎn)染proVAX-VP1后Hela細(xì)胞上清液透射電鏡檢測(cè)結(jié)果。
3、Western Blot法檢測(cè)ABC產(chǎn)物的正確性在上述表達(dá)后，取20μl上清在樣品變性液中100℃處理后，置于12％SDS-PAGE膠電泳后，電轉(zhuǎn)移至尼龍薄膜上。鑒定上述電泳中的條帶是否是嵌合蛋白HBc-VP1和VP1，利用兔抗口蹄疫的抗血清(以商品的口蹄疫疫苗為抗原按常規(guī)方法免疫兔子得到的抗血清)或抗人乙肝病毒核心抗原的抗體(華美生物公司)與分別于轉(zhuǎn)移后的硝酸纖維素膜上反應(yīng)，在有HRP標(biāo)記的第二抗體下，使其顯色。結(jié)果如圖4所示，圖4A為與抗口蹄疫VP1的抗體反應(yīng)結(jié)果，圖4B為與抗人乙肝病毒核心抗原的抗體反應(yīng)結(jié)果；結(jié)果表明在與抗口蹄疫的抗體反應(yīng)后，56kd的ABC產(chǎn)物(嵌合蛋白HBc-VP1)呈現(xiàn)陽性(A)；在與抗人乙肝病毒核心抗原的抗體反應(yīng)后，ABC產(chǎn)物(嵌合蛋白HBc-VP1)顯陽性(B)。說明Hela細(xì)胞表達(dá)的ABC正確。圖4A和圖4B中，泳道1為Hela細(xì)胞培養(yǎng)上清液，泳道2為轉(zhuǎn)proVAX的Hela細(xì)胞培養(yǎng)上清液，泳道3為轉(zhuǎn)proVAX-ABC的Hela細(xì)胞培養(yǎng)上清液。
實(shí)施例2、嵌合型病毒樣顆粒DNA疫苗proVAX-ABC的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)1、小鼠實(shí)驗(yàn)4-6周齡雌性C57BL/6小鼠(購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所)，分4組，每組6只，分別為免疫proVAX-VP1(100μg/每只/次)，proVAX-ABC(100μg/每只/次)，proVAX(100μg/每只/次)及其PBS對(duì)照組(100μl/每只/次)。每只小鼠第0天首免，第14天加強(qiáng)免疫一次。第一次免疫后14，28，42，56，70天采集小鼠血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> (1)ELISA檢測(cè)proVAX-VP1免疫小鼠IgG抗體水平的變化以1μg/ml 146S抗原(去除牛口蹄疫O型滅活疫苗(購自內(nèi)蒙古金宇生物制藥廠)中的礦物油，得到146S抗原)包被96孔酶標(biāo)板，100μl/孔，4℃過夜；PBST(0.05％Tween20溶于PBS)洗滌3次，每次5min，3％BSA，100μl/孔，37℃封閉1h；PBST洗滌后，將第一次免疫后14，28，42，56，70天的小鼠血清做2倍梯度稀釋，以未免疫的小鼠血清作對(duì)照，100μl/孔，37℃孵育1h；PBST洗滌3次，加入經(jīng)1∶1000稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(其終濃度為1ng/ml)，100μl/孔，37℃孵育1h；PBST洗滌3次，加底物TMB顯色，100μl/孔，37℃避光顯色15min；加入0.2M硫酸終止顯色，100μl/孔；OD 450nm/620nm處測(cè)光密度值。實(shí)驗(yàn)孔的OD值為對(duì)照孔的兩倍時(shí)認(rèn)為是陽性。結(jié)果如圖5所示，表明免疫空載體proVAX組未產(chǎn)生病毒特異性IgG；proVAX-VP1及proVAX-ABC免疫后均能產(chǎn)生較高水平的IgG，但后者較前者有顯著的增強(qiáng)。
(2)proVAX-VP1免疫小鼠T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)加強(qiáng)免疫后7天處死小鼠，在無菌條件下，取小鼠脾臟，研碎，用紅細(xì)胞裂解液除去紅細(xì)胞，并過尼龍柱除去B細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，PBS液洗3次，離心并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度到1×107個(gè)/ml，加入綠色熒光染料CFSE(終濃度為5μM)，室溫染色20min。PBS液洗3次，將細(xì)胞懸于1640培養(yǎng)基并調(diào)整細(xì)胞濃度到加1×105個(gè)/ml，入24孔培養(yǎng)板中。每組細(xì)胞加rHBsAg抗原(購自北京生物制品研究所)至終濃度為5μg/ml，培養(yǎng)48h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞增殖的比例。結(jié)果如圖6所示，表明免疫空載體proVAX后僅能產(chǎn)生低水平的本底T細(xì)胞擴(kuò)增(增殖比例為18.5％)，而proVAX-VP1及proVAX-ABC免疫后能產(chǎn)生較高水平的淋巴細(xì)胞擴(kuò)增，與空載體有顯著差異(P＜0.05)；且proVAX-ABC組產(chǎn)生的增殖效果(增殖比例為49.1％)比proVAX-VP1組(增殖比例為36.7％)又有顯著的提高(圖6)。圖6中，A為免疫空載體proVAX的小鼠T細(xì)胞增殖情況，B為免疫proVAX-VP1的小鼠T細(xì)胞增殖情況，C為免疫proVAX-ABC的小鼠T細(xì)胞增殖情況；圖中，M1表示細(xì)胞增值的百分比。
(3)RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞因子加強(qiáng)免疫后7天后，按步驟(2)的方法得到T淋巴細(xì)胞，用Trizol(北京鼎國生物公司)提淋巴細(xì)胞的總RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，通過PCR檢測(cè)持家基因HPRT的表達(dá)，調(diào)節(jié)各組cDNA的濃度一致，各組cDNA進(jìn)行特異引物PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)照相。PCR反應(yīng)條件和引物序列見表1。
表1.PCR引物

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示，表明免疫空載體組與未免疫的對(duì)照組僅有IL-12和IL-5有少量表達(dá)，其余各種細(xì)胞因子的表達(dá)均未檢測(cè)到；而proVAX-VP1及proVAX-ABC免疫后IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-5的表達(dá)均顯著提高，且后者與前者相比，IL-12和IFN-γ的表達(dá)也有顯著的提高。圖7中，泳道1為免疫空載體組，泳道2為免疫proVAX-VP1組，泳道3為免疫proVAX-ABC組，泳道4為未免疫的對(duì)照組。
(4)流式細(xì)胞儀檢測(cè)體內(nèi)CTL加強(qiáng)免疫后7天，取未免疫Balb/c小鼠，引頸處死，無菌條件下制備脾臟單細(xì)胞懸液，按步驟(2)的方法得到CFSE高濃度(5μM)和CFSE低濃度(5μM)染色的脾臟細(xì)胞。將高濃度染色后的細(xì)胞與口蹄疫病毒VP1蛋白肽(SSKYGDTSTNNVRGD，由上海吉爾生化合成)共孵育30min，作為靶細(xì)胞。低濃度染色的細(xì)胞不孵育肽作為對(duì)照。將兩組染色后的細(xì)胞混合，以尾靜脈注射的方法轉(zhuǎn)移到各免疫組小鼠的體內(nèi)。四小時(shí)后，將轉(zhuǎn)移細(xì)胞后的小鼠處死，制備脾臟細(xì)胞懸液，銅網(wǎng)過濾后流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組小鼠體內(nèi)陽性熒光細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算其殺傷率。殺傷率＝100×[1-(試驗(yàn)組的CFSE高濃度陽性熒光細(xì)胞百分比/試驗(yàn)組CFSE低濃度陽性熒光細(xì)胞百分比)/(陰性對(duì)照組的CFSE高濃度陽性熒光細(xì)胞百分比/陰性對(duì)照CFSE低濃度陽性熒光細(xì)胞百分比)]。該公式中，陰性對(duì)照組為未免疫小鼠，試驗(yàn)組為免疫空載體組、proVAX-VP1免疫組、proVAX-ABC免疫組。結(jié)果如圖8所示，表明免疫空載體組和未免疫組均未能產(chǎn)生有效的CTL反應(yīng)，而proVAX-VP1及proVAX-ABC免疫后CTL反應(yīng)有顯著的提高，其殺傷效率分別達(dá)到24.8％和41.7％。圖8中，A、B、C、D分別為未免疫小鼠(陰性對(duì)照組)、免疫空載體組小鼠、proVAX-VP1免疫組小鼠、proVAX-ABC免疫組小鼠；M1表示CFSE低濃度陽性熒光細(xì)胞的百分比，M2表示CFSE高濃度陽性熒光細(xì)胞的百分比。
2、豚鼠實(shí)驗(yàn)400-500g豚鼠(購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所)隨機(jī)分六組，分別免疫proVAX-VP1(200μg/每只/次)，proVAX-VP1(500μg/每只/次)，proVAX-ABC(200μg/每只/次)，proVAX-ABC(500μg/每只/次)，proVAX(500μg/每只/次)及口蹄疫滅活疫苗FMDV疫苗(內(nèi)蒙古金宇生物藥品廠)(1mL/每只/次)。第一次免疫后14天加強(qiáng)免疫一次。第一次免疫后28天心臟采血法采集抗血清，利用口蹄疫中和抗體試劑盒(中國農(nóng)科院蘭州獸醫(yī)研究所購買)對(duì)血清口蹄疫特異性中和抗體水平進(jìn)行檢測(cè)。豚鼠加強(qiáng)免疫后14天，采集血清后，對(duì)其進(jìn)行活病毒攻毒實(shí)驗(yàn)。方法是腳掌皮下注射O型口蹄疫活病毒(內(nèi)蒙古金宇生物藥品廠)0.2ml，毒量為100半數(shù)感染量(100ID50)。攻毒后1至7天對(duì)其發(fā)病情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)，其保護(hù)程度可以分為全保護(hù)(豚鼠所有腳掌均無水皰發(fā)生)；半保護(hù)(只有豚鼠攻毒的腳掌發(fā)生水皰)；未保護(hù)(除攻毒外其它腳掌發(fā)生水皰)。其嚴(yán)重程度可分為無癥狀；中等癥狀(注射腳掌出現(xiàn)水皰)；嚴(yán)重(兩只或兩只以上的腳掌發(fā)生水皰)。
結(jié)果如表2所示，表明免疫空載體組未產(chǎn)生有效的中和抗體水平；免疫proVAX-VP1和proVAX-ABC后，中和抗體水平顯著提高，且高劑量組與低劑量組中和抗體也有顯著差別。當(dāng)中和抗體水平達(dá)到或超過32時(shí)，豚鼠基本能保護(hù)；保護(hù)率與抗原免疫劑量也有正相關(guān)的關(guān)系(表2)。
表2.各免疫組豚鼠中和抗體產(chǎn)生情況及攻毒后1至7天的發(fā)病和保護(hù)情況

序列表<160>6<210>1<211>78<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>1Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu Leu1 5 10 15Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp
65 70 75<210>2<211>69<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>2Ser Arg Glu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys1 5 10 15Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg20 25 30Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr35 40 45Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro50 55 60Glu Thr Thr Val Val<210>3
<211>370<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>3Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu Leu1 5 10 15Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Gly Gly65 70 75 80Gly Gly Ser Thr Thr Ser Thr Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Ala85 90 95
Thr Val Glu Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg Gln His100 105 110Thr Asp Val Ser Phe Ile Leu Asp Arg Phe Val Lys Val Thr Pro Arg115 120 125Asp Gln Ile Asn Val Leu Asp Leu Met Gln Thr Pro Ala His Thr Leu130 135 140Val Gly Ala Leu Leu Arg Thr Ala Thr Tyr Tyr Phe Ala Asp Leu Glu145 150 155 160Val Ala Val Lys His Glu Gly Asn Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala165 170 175Pro Glu Thr Ala Leu Asp Asn Thr Thr Asn Pro Thr Ala Tyr His Lys180 185 190Ala Pro Leu Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val
195 200 205Leu Ala Thr Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Gly Asp Thy Ser Thr210 215 220Asn Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg225 230 235 240Thr Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys Ala Thr Arg Val245 250 255Thr Glu Leu Leu Tyr Arg Met Lys Arg Ala Glu Thr Tyr Cys Pro Arg260 265 270Pro Leu Leu Ala Ile Gln Pro Ser Asp Ala Arg His Lys Gln Lys Ile275 280 285Val Ala Pro Val Lys Gln Leu Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu290 295 300
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln305 310 315 320Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val325 330 335Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala340 345 350Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr355 360 365Val Val<210>4<211>1110<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>4atggacattg acccgtataa agaatttgga gcttctgtgg agttactctc ttttttgcct 60
tctgacttct ttccttctat tcgagatctc ctcgacaccg cctctgctct gtatcgggag 120gccttagagt ctccggaaca ttgttcacct caccatacag cactcaggca agctattctg 180tgttggggtg agttgatgaa tctggccacc tgggtgggaa gtaatttgga agacggaggt 240ggaggttcca ccacctccac aggtgagtcg gctgatcccg tgactgccac tgttgagaac 300tacggtggtg agacacaggt ccagagacgc caacacacgg atgtctcgtt catattagac 360agatttgtga aagtaacacc aagagaccaa attaatgtgt tggacctgat gcaaacccct 420gcacacactt tggtaggcgc gctcctccgt actgccacct actacttcgc agatctagaa 480gtggcagtga aacacgaggg gaaccttacc tgggtcccga atggggcgcc cgagacagcg 540ttggacaata ccaccaatcc aacggcttac cacaaggcac cgctcacccg gcttgcactg 600ccttacacgg caccacaccg tgtcttggct actgtttaca acgggaactg caagtatggc 660gagagccccg tgaccaatgt gagaggtgac ctgcaagtat tggcccagaa ggcggcaaga 720acgctgccta cctccttcaa ttacggtgcc atcaaagcca ctcgggtgac tgaactgctt 780taccgcatga agagggccga aacatactgc ccccggcctc ttttggccat tcacccgagc 840gaagctagac acaaacaaaa gattgtggcg cctgtgaaac agcttttggg aggtggaggt 900ggatccaggg aattagtagt cagctatgtc aacgttaata tgggcctaaa aatcagacaa 960ctattgtggt ttcacatttc ctgtcttact tttggaagag aaactgttct tgagtatttg 1020gtgtcttttg gagtgtggat tcgcactcct cccgcttaca gaccaccaaa tgcccctatc 1080ttatcaacac ttccggaaac tactgttgtt 1110<210>5<211>5<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>5Gly Gly Gly Gly Ser1 5<210>6<211>5<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>6Gly Gly Gly Gly Gly1 權(quán)利要求
1.嵌合型病毒樣顆粒DNA疫苗，是在多克隆位點(diǎn)插入有由人乙肝病毒核心抗原的自氨基端第1至78位氨基酸殘基、不致病保護(hù)性目的抗原和人乙肝病毒核心抗原的自氨基端第80至148位氨基酸殘基組成的嵌合蛋白的編碼基因的重組真核表達(dá)載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA疫苗，其特征在于所述嵌合蛋白中，人乙肝病毒核心抗原的自氨基端第1至78位氨基酸殘基位于氨基端，人乙肝病毒核心抗原的自氨基端第80至148位氨基酸殘基位于羧基端，不致病保護(hù)性目的抗原位于中間；所述不致病保護(hù)性目的抗原的氨基端與人乙肝病毒核心抗原的自氨基端的第78位氨基酸殘基通過具有序列表中序列5的氨基酸殘基序列的連接肽連接；所述不致病保護(hù)性目的抗原的羧基端與人乙肝病毒核心抗原的自氨基端的第80位氨基酸殘基通過具有序列表中序列6的氨基酸殘基序列的連接肽連接。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA疫苗，其特征在于所述人乙肝病毒核心抗原的自氨基端第1至78位氨基酸殘基具有序列表中序列1的氨基酸殘基序列；所述人乙肝病毒核心抗原的自氨基端第80至148位氨基酸殘基具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA疫苗，其特征在于用于構(gòu)建所述重組真核表達(dá)載體的出發(fā)載體為可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)外源基因的表達(dá)載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的DNA疫苗，其特征在于用于構(gòu)建所述重組真核表達(dá)載體的出發(fā)載體為proVAX，pVAX，pcDNA3或pCI。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3或4所述的DNA疫苗，其特征在于所述不致病保護(hù)性目的抗原為口蹄疫病毒VP1，或禽流感病毒NA和NH抗原，或新城疫病毒HN和F抗原，或艾滋病病毒GP160抗原和NEF抗原或腫瘤相關(guān)抗原MAG-1和gastrin。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的DNA疫苗，其特征在于所述嵌合蛋白具有序列表中序列3的氨基酸殘基序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的DNA疫苗，其特征在于所述嵌合蛋白的編碼基因具有下述核苷酸序列之一1)序列表中序列4的DNA序列；2)編碼序列表中序列3蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中序列4的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中序列4限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3或4所述的DNA疫苗，其特征在于所述疫苗為proVAX-ABC；proVAX-ABC是將序列表中序列4的DNA序列插入proVAX的EcoR I及Xba I的酶切位點(diǎn)間得到的重組表達(dá)載體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的DNA疫苗，其特征在于所述疫苗中還含有佐劑；所述佐劑為左旋咪唑、礦物油或鋁鹽佐劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種嵌合型病毒樣顆粒DNA疫苗。該嵌合型病毒樣顆粒DNA疫苗是在多克隆位點(diǎn)插入有由人乙肝病毒核心抗原的自氨基端第1至78位氨基酸殘基、不致病保護(hù)性目的抗原和人乙肝病毒核心抗原的自氨基端第80至148位氨基酸殘基組成的嵌合蛋白的編碼基因的重組真核表達(dá)載體。該嵌合型病毒樣顆粒DNA疫苗不僅可以產(chǎn)生較強(qiáng)的B細(xì)胞活性，激發(fā)高強(qiáng)度的抗體水平，更重要的是通過間接提呈(cross presentation)增強(qiáng)細(xì)胞免疫水平，激活T細(xì)胞和毒性T細(xì)胞活性，激活更為強(qiáng)烈的完全免疫反應(yīng)，使機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫能力。
文檔編號(hào)C12N15/51GK1903363SQ20061008909
公開日2007年1月31日 申請(qǐng)日期2006年8月2日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月2日
發(fā)明者王賓, 金華利 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)