專利名稱：硅藻的硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及來源于硅藻的硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白、硅藻硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白的編碼基因，及其在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應用。
背景技術：
氮肥是各種作物(尤其是水稻、草坪草、煙草等)生長所必需的肥料。水稻是我國重要的糧食作物，占糧食總產(chǎn)量的44％(凌啟鴻等，論水稻生產(chǎn)在我國南方經(jīng)濟發(fā)達地區(qū)可持續(xù)發(fā)展中的不可替代作用，《中國稻米》，2004增刊)。氮肥是水稻生長所必需的第一大肥料，隨著氮肥施用量的增加，水稻的產(chǎn)量、分蘗數(shù)、總?cè)~片數(shù)均成明顯的增加趨勢(潘志高等，水稻強化栽培不同氮肥用量對產(chǎn)量的影響初探，《中國稻米》，2005年第2期)。因此，為提高水稻產(chǎn)量，人們在生產(chǎn)中大量施用氮肥。
草坪草的生長需要16種元素，其中氮素起到重要作用，它對草坪草的色澤、生長勢、密度、抗性及恢復力度均有較大影響。如果土壤中沒有施加足夠的氮肥，草坪草的生長就會減緩，草色也會變淺，甚至變黃，因此培養(yǎng)草坪草時必須定期施加氮肥。
煙草也是我國重要的經(jīng)濟作物，全國烤煙種植面積達1674萬畝，全國煙葉收購量保持在210萬噸左右，是我國重要的稅收來源。氮肥的施用量直接影響到煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)。近年來，我國煙草產(chǎn)區(qū)氮肥的施用量顯著增高。
近年來各類作物的的氮肥施用量不斷增加，施用量嚴重超標，但是作物對土壤中氮肥的利用率卻很低，對環(huán)境造成污染，河流嚴重富營養(yǎng)化。NAT(Diatom NitrateTransporter)基因，是由Mark Hildebrand從海中生長的硅藻(Cylindrothecafusiformis)中克隆得到的，該基因沒有內(nèi)含子。NAT基因編碼的硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白與硝酸鹽具有非常高的結(jié)合力，可使硅藻從海水中富集硝酸鹽。
研究表明，NAT轉(zhuǎn)基因植株具有在低含量硝酸鹽土壤中正常生長的能力，NAT可促進轉(zhuǎn)基因植物在低氮土壤中的生長，并在不影響作物產(chǎn)量的前提下，減少或不施用氮肥，避免了環(huán)境污染。
目前，人們從植物中已經(jīng)克隆了多個與氮轉(zhuǎn)運相關的基因，例如從金藻(Isochrysis galbana)中克隆的硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白(IgNRT)基因、氨轉(zhuǎn)運蛋白(IgAMT)基因和谷氨酸鹽合成酶(IgGSII)基因，其cDNA長度分別為540bp，658bp和852bp。實時熒光定量PCR檢測結(jié)果表明，在存在硝酸鹽的情況下，IgNRT和IgAMT轉(zhuǎn)錄子數(shù)量平均為27.6和28.5，氮缺乏時的轉(zhuǎn)錄子數(shù)量分別增加390％和178％；銨存在時，IgNRT和IgAMT基因的轉(zhuǎn)錄受到嚴重抑制，轉(zhuǎn)錄子數(shù)量分別降低2.4％和6.5％。比較IgGSII的表達量，在硝酸鹽中生長的細胞最高，其次是生長在氮缺乏情況下的細胞(50％)，再次是生長在銨中的細胞(25％)。比較不同硅藻和綠藻中硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達情況發(fā)現(xiàn)，不同硅藻和綠藻的IgNRT，IgAMT和IgGSII基因的表達方式是相似的，均受到外加氮濃度和氮種類的調(diào)控。同源性分析結(jié)果表明，金藻IgNRT與硅藻NAT的同源性為47％，與硅藻的氨轉(zhuǎn)運蛋白(CylAMT)的同源性為48％。IgGSII與來源于中肋骨條藻(Skeletonema costatum)的谷氨酸鹽合成酶(SGSA)的同源性為61％。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一個來源于硅藻的硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白。
本發(fā)明所提供的硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白，名稱為NAT3，來源于硅藻(Cylindrothecafusiformis)，是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加具有硝酸鹽轉(zhuǎn)運功能的蛋白質(zhì)。
序列表中的SEQ ID №1由482個氨基酸殘基組成。
編碼上述硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白的基因(NAT3)，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №1的DNA序列；3)與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有硝酸鹽轉(zhuǎn)運功能的核苷酸序列；4)在高嚴謹條件下可與序列表中的SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴謹條件為用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在65℃下雜交并洗膜。
序列表中的SEQ ID №2由1449個堿基組成，其編碼序列為自5’端第1-1449位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
含有所述硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因NAT3的表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系和宿主菌，以及擴增NAT3中任一片段的引物也屬于本發(fā)明的保護范圍。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種提高植物氮吸收能力的方法。
本發(fā)明所提供的提高植物氮吸收能力的方法，是將所述硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因NAT3導入植物組織或細胞，得到氮吸收能力提高的植物。
所述硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因NAT3可通過含有所述硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因NAT3的植物表達載體導入植物組織或細胞。
用于構(gòu)建所述植物表達載體的出發(fā)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它的參與mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(Ti)質(zhì)?；?如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3’端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)等均具有類似功能。
使用NAT3構(gòu)建植物表達載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型啟動子或誘導型啟動子，如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動子、根部特異表達啟動子等，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉(zhuǎn)錄增強子，這些增強子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。
具體來講，用于構(gòu)建所述植物表達載體的出發(fā)載體可為pCAMBIA2301、pBI121、pCAMBIA1301或pCAMBIA1300等，優(yōu)選為pCAMBIA2301。
以pCAMBIA2301為出發(fā)載體，構(gòu)建的植物表達載體為pNAT121。
為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標記物(慶大霉素標記物、卡那霉素標記物等)或是抗化學試劑標記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。
攜帶有本發(fā)明NAT3的植物表達載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電導、農(nóng)桿菌介導等常規(guī)生物學方法轉(zhuǎn)化植物細胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物細胞或組織培育成植株。
上述提高植物氮吸收能力的方法對所有植物都適用，既適用于水稻、玉米、小麥等單子葉植物，也適用于煙草、草坪草、擬南芥等雙子葉植物。
本發(fā)明提供了一個來源于硅藻的硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白NAT3及其編碼基因。同源性分析結(jié)果表明，該基因與在GenBank上公布的硅藻NAT1基因(GenBank號gi5733416)的核苷酸序列同源性為99.31％，編碼蛋白的氨基酸序列同源性為99.76％。NAT3轉(zhuǎn)基因煙草、水稻和草坪草均可在氮元素含量為正常值1/32的培養(yǎng)基上正常生長，表明NAT3可提高植物的氮吸收能力，使植物在低氮條件下仍可正常生長。本發(fā)明將在植物氮肥吸收領域及抗低氮植物品種的繁育工作中發(fā)揮重要作用，應用前景廣闊。
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。


圖1為PCR擴增的硅藻硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因NAT3的1％瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果圖2為陽性克隆質(zhì)粒pNAT的BamH I酶切鑒定結(jié)果圖3為中間載體pUC121的Sac I和EcoR I雙酶切鑒定結(jié)果圖4為中間載體pMV121的Hind III和BamH I雙酶切鑒定結(jié)果圖5為中間載體pCV121的Hind III和EcoR I雙酶切鑒定結(jié)果圖6為中間載體pCV121的構(gòu)建流程7為NAT3植物表達載體pNAT121的構(gòu)建流程8為NAT3植物表達載體pNAT121的BamH I酶切鑒定結(jié)果圖9為NAT3轉(zhuǎn)基因煙草的PCR鑒定結(jié)果圖10為NAT3轉(zhuǎn)基因水稻的PCR鑒定結(jié)果圖11為NAT3轉(zhuǎn)基因白三葉草的PCR鑒定結(jié)果圖12為NAT1、NAT3轉(zhuǎn)基因煙草及非轉(zhuǎn)基因煙草在1/32N MS0培養(yǎng)基上的生長情況圖13為NAT1、NAT3轉(zhuǎn)基因水稻及非轉(zhuǎn)基因水稻在1/32N營養(yǎng)土上的生長情況圖14為NAT1、NAT3轉(zhuǎn)基因白三葉草及非轉(zhuǎn)基因白三葉草在1/32N營養(yǎng)土上的生長情況具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。所用引物均由上海生工合成，所有測序工作均由三博遠志生物技術有限責任公司協(xié)助完成。
實施例1.硅藻硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因NAT3的克隆用下述方法克隆硅藻的硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因，具體過程包括以下步驟1.提取硅藻的總RNA使用Invitrogen公司的TRIZOLRReagent試劑盒(Cat.No.15596-026)并參照試劑盒說明書提取硅藻的總RNA，具體方法包括以下步驟1)取50-100mg硅藻，置于液氮中研磨成粉末，轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中。
2)加入1mL TRIZOL Reagent充分混勻，室溫放置5min。
3)加200μl氯仿，振蕩15s，室溫放置2-3min，4℃、12000g離心10min。
4)取上清，加入500μl異丙醇，室溫放置10min，4℃、12000g離心5min，在離心管底部可見白色片狀的RNA沉淀。
5)棄上清，小心加入1mL 70％乙醇，不要破壞RNA片狀沉淀，5s后用加樣器將液體全部吸出。
6)室溫放置5-10min使乙醇揮發(fā)(不要讓其完全干，否則影響溶解性)，加入20μlDEPC水溶解沉淀，得到硅藻總RNA。
2.反轉(zhuǎn)錄合成cDNA以步驟1獲得的硅藻總RNA為模板，用Invitrogen公司的GeneRacer試劑盒并參照試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成其cDNA，具體方法包括以下步驟1)取硅藻總RNA 10μl，加入1μl Gene Racer Oligo dT Primer，1μl dNTPs，1μl無菌蒸餾水。
2)65℃溫浴5min以去掉RNA二級結(jié)構(gòu)，冰浴5min，短暫離心。
3)依次加入4μl 5×第一鏈緩沖液，1μl 0.1M DTT，1μl RNaseOutTM，1μlSuperScriptTMIII RT緩沖液至總體積為20μl，用移液器混勻。
4)短暫離心后，50℃溫浴50min。
5)70℃溫浴15min，冰上放置2min停止反應，最大轉(zhuǎn)速短暫離心。
6)加入1μl RnaseH，37℃溫浴20min。
7)短暫離心，得到cDNA，可立即用于PCR擴增或-20℃保存。
3.目的基因的PCR擴增以步驟2獲得的cDNA為模板，在引物P1(上游引物)5’-ATGAGTGGAACTGATGTTGCA-3’和P2(下游引物)5’-TCTTCTCGGTATCAGGTTGGG-3’(引物P1和P2根據(jù)NAT1設計)的引導下進行PCR擴增，PCR反應條件為95℃5min；94℃30s，67℃1min，72℃2min，30個循環(huán)后，72℃延伸10min。反應結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖1所示(泳道1為λDNA/EcoR I+Hind III分子量Marker，泳道2為PCR擴增產(chǎn)物)，在1449bp處有一明顯的擴增條帶。
4.凍融法回收PCR擴增產(chǎn)物用凍融法回收步驟3中PCR擴增的長度為1449bp的DNA片段，具體方法包括以下步驟1)將長度約1449bp的目的片段從瓊脂糖凝膠上切下，置于一新的離心管中。
2)加入TE緩沖液200μl，在振蕩器上振蕩5min，再放入液氮中冷凍5min。
3)取出，在65℃下水浴5min。
4)按步驟2)-3)的方法重復冷凍、融化兩次。
5)依次用苯酚、苯酚/氯仿(混合比例1∶1)、氯仿抽提，用無水乙醇沉淀DNA，然后加入4ul無菌水溶解沉淀，沉淀即為回收的目的片段。
5.目的片段的克隆及測序用載體pMD18-T(TaKaRa，Cat.No.D504A)試劑盒進行目的片段的克隆，具體方法為取回收的PCR擴增產(chǎn)物4ul，依次加入1ul pMD18-T載體、5ul Ligase SolutionI，然后16℃連接4h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)篩選得到陽性重組克隆，提質(zhì)粒進行酶切鑒定，鑒定結(jié)果如圖2所示(泳道1為MarkerλDNA/EcoRI+Hind III，泳道2為酶切產(chǎn)物)，經(jīng)酶切獲得了1449bp的酶切片段，與預期結(jié)果一致，將此重組質(zhì)粒命名為pNAT，再對其進行測序，測序結(jié)果表明插入片段具有序列表中SEQ ID №2的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID №2由1449個堿基組成，其編碼序列為自5’端第1-1449位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID №2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。對該基因序列及其編碼的氨基酸殘基序列進行比對分析，結(jié)果該基因與在GenBank上公布的硅藻NAT1基因(GenBank號gi5733416)的核苷酸序列同源性為99.31％，編碼蛋白的氨基酸序列同源性為99.76％，表明獲得了硅藻的硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因，命名為NAT3，將其編碼蛋白命名為NAT3。
實施例2.構(gòu)建NAT3及硅藻NAT1基因的植物表達載體一、中間載體pCV121的構(gòu)建參見圖6構(gòu)建中間載體pCV121，具體過程包括以下步驟1.中間載體pUC121的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶Sac I和EcoR I對載體pBI121(北京拜爾迪生物技術有限公司)進行雙酶切，回收260bp的T-NOS終止子片段，將其與經(jīng)相同酶雙酶切的載體pUC19(購自大連寶生物公司)連接，得到中間載體pUC121。對其用限制性內(nèi)切酶SacI和EcoRI進行雙酶切鑒定，酶切鑒定結(jié)果如圖3所示(泳道1為MarkerλDNA/EcoR I+Hind III，泳道2和3為酶切產(chǎn)物)，經(jīng)酶切獲得了大小約為260bp的DNA片段，與預期結(jié)果相符。
2.中間載體pMV121的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶Hind III和BamH I對載體pBI121進行雙酶切，回收800bp的P35S啟動子片段，將其與經(jīng)相同酶雙酶切的步驟1構(gòu)建的載體pUC121連接，獲得中間載體pMV121。對其用限制性內(nèi)切酶Hind III和BamH I進行雙酶切鑒定，酶切鑒定結(jié)果如圖4所示(泳道1為酶切產(chǎn)物，泳道2為MarkerλDNA/EcoR I+Hind III)，經(jīng)酶切獲得了大小約為800bp的DNA片段，與預期結(jié)果相符。
3.中間載體pCV121的獲得用限制性內(nèi)切酶Hind III和EcoR I對載體pCAMBIA 2301(北京拜爾迪生物技術有限公司)進行雙酶切，回收1.0kb的目的片段，將其與經(jīng)相同酶雙酶切的步驟2構(gòu)建的載體pMV121連接，獲得一中間載體，命名為pCV121。對其用限制性內(nèi)切酶Hind III和EcoR I進行酶切鑒定，酶切鑒定結(jié)果如圖5所示(泳道1為酶切產(chǎn)物，泳道2為MarkerλDNA/EcoR I+Hind III)，酶切產(chǎn)物片段大小約為1.0kb，與預期結(jié)果相符。
二、NAT3植物表達載體pNAT121的獲得參見圖7構(gòu)建NAT3的植物表達載體，具體方法為用限制性內(nèi)切酶BamH I對實施例1構(gòu)建的攜帶有NAT3的質(zhì)粒載體pNAT進行酶切，回收1449bp的NAT3目的片段，將其與經(jīng)相同酶酶切的步驟一構(gòu)建的中間載體pCV121進行連接，對連接產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶BamH I進行酶切鑒定，酶切鑒定結(jié)果如圖8所示(泳道1為MarkerλDNA/EcoR I+Hind III，泳道2為酶切產(chǎn)物)，酶切產(chǎn)物片段大小為1449bp，與預期結(jié)果相符，得到了NAT3的植物表達載體，命名為pNAT121。
用相同方法將硅藻NAT1基因(GenBank號gi5733416)連入中間載體pCV121的BamH I酶切位點，得到硅藻NAT1基因的植物表達載體，命名為pNAT1121。
實施例3.NAT3轉(zhuǎn)基因煙草的氮降低敏感性實驗將實施例2構(gòu)建的植物表達載體pNAT121、pNAT1121分別用凍融法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LBA4404，再用葉盤法將整合有pNAT121的根癌農(nóng)桿菌LBA4404轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化煙草NC89，篩選陽性轉(zhuǎn)基因植株，其中用引物P1(上游引物)5’-ATGAGTGGAACTGATGTTGCA-3’和P2(下游引物)5’-TCTTCTCGGTATCAGGTTGGG-3’對NAT3轉(zhuǎn)基因煙草進行PCR鑒定的結(jié)果如圖9所示(泳道1為MarkerλDNA/EcoR I+Hind III，泳道2為PCR產(chǎn)物)，陽性轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)PCR擴增可獲得1449bp條帶，結(jié)果獲得NAT3、NAT1轉(zhuǎn)基因煙草各10株。將NAT3、NAT1轉(zhuǎn)基因煙草和NC89非轉(zhuǎn)基因煙草(對照，CK)的種子經(jīng)嚴格消毒滅菌后，分別播種在MS0[(按常規(guī)濃度配制)含大量元素(母液INH4NO3，KNO3，CaCl2·2H2O，MgSO4·7H2O，KH2PO4)，微量元素(母液IIKI，H3BO3，MnSO4·4H2O，ZnSO4·7H2O，Na2MoO4·2H2O，CuSO4·5H2O，CoCl2·6H2O)，鐵鹽(母液III，F(xiàn)eSO4·7H2O，Na2-EDTA·2H2O)，有機成分(母液肌醇，鹽酸吡哆醇(維生素B6)，煙酸，硫胺素(維生素B1)，甘氨酸)，pH 5.8，氫離子濃度為1.585微摩/升]、1/8N(N含量為MS0的1/8，包括氨態(tài)氮和硝態(tài)氮)、1/16N、1/32N、1/8NO3-(硝態(tài)氮含量為MS0的1/8)MS0培養(yǎng)基中，觀察NAT3、NAT1轉(zhuǎn)基因煙草和非轉(zhuǎn)基因煙草在不同氮濃度MS0培養(yǎng)基中的生長情況，葉片大小，以及干重、濕重情況，以確定NAT3基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的作用。
播種后26d，在MS0，氨態(tài)氮、硝態(tài)氮含量同時降低及僅硝態(tài)氮含量降低的MS0培養(yǎng)基中的NAT3轉(zhuǎn)基因煙草、NAT1轉(zhuǎn)基因煙草和NC89非轉(zhuǎn)基因煙草的生長情況(葉片大小)如表1所示(實驗重復3次，每次重復均設2個處理)，在MS0培養(yǎng)基中的NAT3、NAT1轉(zhuǎn)基因煙草、非轉(zhuǎn)基因煙草的生長狀況沒有明顯差別，在1/8N、1/16N培養(yǎng)基中的NAT3轉(zhuǎn)基因煙草與播種在相同培養(yǎng)基中的NAT1轉(zhuǎn)基因煙草、非轉(zhuǎn)基因煙草相比，葉片略大。在1/32N培養(yǎng)基中的NAT3轉(zhuǎn)基因煙草、NAT1轉(zhuǎn)基因煙草、非轉(zhuǎn)基因煙草均嚴重黃化、生長緩慢，但與NAT1轉(zhuǎn)基因煙草、非轉(zhuǎn)基因煙草相比，NAT3轉(zhuǎn)基因煙草的葉片較大，顏色也綠些，煙草在1/32N MS0培養(yǎng)基上的生長情況如圖12所示(左側(cè)瓶非轉(zhuǎn)基因煙草，中間瓶NAT1轉(zhuǎn)基因煙草，右側(cè)瓶NAT3轉(zhuǎn)基因煙草)。在1/8NO3-培養(yǎng)基中的NAT3轉(zhuǎn)基因、NAT1轉(zhuǎn)基因煙草、非轉(zhuǎn)基因煙草均比在MS0培養(yǎng)基中的煙草生長緩慢、葉片發(fā)黃，但轉(zhuǎn)基因煙草比非轉(zhuǎn)基因煙草葉片略大，葉色稍深，而且NAT3轉(zhuǎn)基因煙草比NAT1轉(zhuǎn)基因煙草長勢更好一些?？傮w來講，在MS0氮缺乏培養(yǎng)基中的NAT3轉(zhuǎn)基因煙草、NAT1轉(zhuǎn)基因煙草和非轉(zhuǎn)基因煙草的生長狀況差異明顯，NAT1轉(zhuǎn)基因煙草比非轉(zhuǎn)基因煙草的葉片大2-3倍，NAT3轉(zhuǎn)基因煙草比NAT1轉(zhuǎn)基因煙草的葉片大1.5-2倍，表明本發(fā)明的NAT3較NAT1更能提高植物的氮利用率，使植物在低氮情況下仍能正常生長狀況。
播種后61d，稱取在MS0，氨態(tài)氮、硝態(tài)氮含量同時降低及僅硝態(tài)氮含量降低的MS0培養(yǎng)基中的NAT3轉(zhuǎn)基因煙草、NAT1轉(zhuǎn)基因煙草和NC89非轉(zhuǎn)基因煙草的濕重，再將各植株放入80℃烘箱烘烤1小時，稱取各植株的干重，統(tǒng)計結(jié)果如表2所示，在不同氮含量培養(yǎng)基上生長的NAT3轉(zhuǎn)基因煙草的干、濕重均顯著高于NAT1轉(zhuǎn)基因煙草及對照植株，進一步證明本發(fā)明的NAT3較NAT1更能提高植物的氮利用率，使植物在低氮情況下仍能正常生長。
表1 氨態(tài)氮、硝態(tài)氮含量同時降低及僅硝態(tài)氮含量降低對NAT3、NAT1轉(zhuǎn)基因煙草及非轉(zhuǎn)基因煙草NC89生長情況(葉片大小)的影響


表2 播種后61d在MS0，氨態(tài)氮、硝態(tài)氮含量同時降低及僅硝態(tài)氮含量降低的MS0培養(yǎng)基中的NAT3、NAT1轉(zhuǎn)基因煙草及非轉(zhuǎn)基因煙草NC89的干、濕重統(tǒng)計結(jié)果

實施例3 NAT3轉(zhuǎn)基因水稻的抗低氮性檢測一、NAT3轉(zhuǎn)基因水稻的獲得1.將植物表達載體pNAT121轉(zhuǎn)化水稻(1)水稻成熟胚愈傷組織的誘導a)水稻種子去殼，70％酒精處理1min，然后用20％次氯酸鈉溶液表面消毒兩次，每次各20min，再用無菌水漂洗3遍。
b)在超凈工作臺上將上述消毒過的種子接種到愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，在22-25℃下暗培養(yǎng)約15d長出愈傷組織，用繼代4d的新鮮愈傷組織進行農(nóng)桿菌侵染。
(2)農(nóng)桿菌的準備a)挑取含目的質(zhì)粒的農(nóng)桿菌單菌落，將其接種于2mL含50mg/L鏈霉素和50mg/L氨芐青霉素的YEB培養(yǎng)基(Yeast extract 1g/L，Tryptonc 5g/L，蔗糖5g/L，硫酸鎂0.98g/L)b)吸取2mL培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入50mL含50mg/L鏈霉素和50mg/L氨芐青霉素的YEB培養(yǎng)基(Yeast extract 1g/L，Tryptonc 5g/L，蔗糖5g/L，硫酸鎂0.98g/L)中，28℃、200rpm繼續(xù)暗培養(yǎng)至OD600值約為1.0。
c)將菌液轉(zhuǎn)至無菌離心管中，5000rpm離心2min。
d)將菌體沉淀用AAM液體培養(yǎng)基(AA鹽(20×，250mg/L MgSO4·7H2O+150mg/LCaCl2·2H2O+150mg/L NaH2PO4·H2O+2.95g/L KCl)，氨基酸(谷氨酰胺(Glutamine)876mg/L+天冬氨酸(Aspartic acid)266mg/L+精氨酸(Arginine)174mg/L+甘氨酸(Glycine)7.5mg/L)，MS Vitamins，水解酪蛋白(Casamino acid)1g/L，葡萄糖(Glucose)36g/L，蔗糖(Sucrose)68.5g/L，100μM乙酰丁香酮，pH 5.2。)重懸至OD600值約為1.0，供侵染水稻愈傷組織用。
(3)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻a)選步驟(1)獲得的直徑0.2-0.4cm的愈傷組織顆粒，放入AAM農(nóng)桿菌懸液中浸泡15-20min。
b)將愈傷組織放在一疊無菌濾紙上吸干，轉(zhuǎn)移到鋪有兩層無菌濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基(N6培養(yǎng)基+100-200μM乙酰丁香酮+10g/L葡萄糖+1mg/L 2，4-D+1.0-1.2％瓊脂，pH 5.2)上，在25℃下暗培養(yǎng)2-3d。
c)先用無菌水漂洗愈傷組織5-10次，室溫干燥。
d)用無菌濾紙吸干愈傷組織，置培養(yǎng)皿中在室溫下干燥0.5-1h。
e)挑選色澤黃亮的愈傷組織，轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基上，在25℃下暗培養(yǎng)，兩周繼代一次。
f)經(jīng)2-3次繼代培養(yǎng)后，將新長出的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到預分化培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基+2g/L水解酪蛋白+20g/L蔗糖+1mg/L 2，4-D+300-500mg/L噻孢霉素+30mg/L Basta或3-5mg/L Bialaphos+1.0-1.2％瓊脂，pH 5.8)上，在25℃下暗培養(yǎng)10d。
g)將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)到芽分化培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基+2-3mg/L 6BA(6-Benzyladenin)+2-3mg/L KT(Kinetin)+0.2-0.4mg/L Zeitin+1.0-1.2％瓊脂，pH 5.8)上，在25℃下每天10-14h光照培養(yǎng)，10-15d后新鮮愈傷組織上開始有綠點出現(xiàn)，每2-3周繼代一次，待長出完整小苗，轉(zhuǎn)入壯苗培養(yǎng)基(1/2MS培養(yǎng)基+2-4mg/L多效唑+1.0-1.2％瓊脂，pH 5.8)。
h)從壯苗培養(yǎng)基上剝離幼苗，在清水中浸根煉苗，每天換水一次，約4-5d長出新根后移栽。
2.NAT3轉(zhuǎn)基因水稻的PCR鑒定提取NAT3轉(zhuǎn)基因水稻葉片的基因組DNA并以此為模板，在引物P35’-CCTTCTTCATCTGGTTCGCCA-3’和引物P45’-AGCGGCGGTGTTGTTCAT-3’的引導下進行PCR鑒定，反應結(jié)束后，對PCR擴增產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖10所示(泳道1為MarkerλDNA/EcoR I+Hind III，泳道2為PCR擴增產(chǎn)物)，NAT3陽性轉(zhuǎn)基因植株可擴增出約700bp的特異性條帶，表明NAT3已導入到水稻基因組中并獲得表達，得到了NAT3轉(zhuǎn)基因水稻。同時，用上述相同方法獲得了轉(zhuǎn)化有pNAT1121的NAT1轉(zhuǎn)基因水稻。
二、轉(zhuǎn)基因水稻的抗低氮性檢測將NAT3轉(zhuǎn)基因水稻、NAT1轉(zhuǎn)基因水稻和NC89非轉(zhuǎn)基因水稻幼苗分別播種在正常營養(yǎng)土(全N含量在0.2％左右，速效氮含量在60-200mg/千克)、1/8N(氮含量為正常營養(yǎng)土含量的1/8)、1/16N、1/32N營養(yǎng)土中，觀察各植株的生長情況。播種后30d觀察發(fā)現(xiàn)，移植在正常營養(yǎng)土中的NAT3轉(zhuǎn)基因、NAT1轉(zhuǎn)基因、非轉(zhuǎn)基因水稻的生長狀況沒有明顯差別，1/8N、1/16N營養(yǎng)土中的NAT3轉(zhuǎn)基因水稻與播種在相同營養(yǎng)土中的NAT1轉(zhuǎn)基因水稻、非轉(zhuǎn)基因水稻相比，葉片略大。1/32N營養(yǎng)土中的NAT3轉(zhuǎn)基因水稻、NAT1轉(zhuǎn)基因水稻、非轉(zhuǎn)基因水稻植株逐漸變小，生長緩慢，但與NAT1轉(zhuǎn)基因水稻和非轉(zhuǎn)基因水稻相比，NAT3轉(zhuǎn)基因煙草葉片較大，顏色也綠些，而且NAT3轉(zhuǎn)基因水稻比NAT1轉(zhuǎn)基因水稻長勢更好一些，如圖13所示(左側(cè)NAT3轉(zhuǎn)基因水稻，中間NAT1轉(zhuǎn)基因水稻，右側(cè)非轉(zhuǎn)基因水稻)，證明本發(fā)明的NAT3較NAT1更能提高植物的氮利用率，使植物的抗低氮性得到提高。
實施例5.NAT3轉(zhuǎn)基因草坪草-白三葉草的抗低氮性檢測一、NAT3轉(zhuǎn)基因草坪草-白三葉草的獲得及PCR鑒定1.將植物表達載體pNAT121轉(zhuǎn)化草坪草采用與實施例4相同的方法將植物表達載體pNAT121轉(zhuǎn)化草坪草-白三葉草。
2.轉(zhuǎn)基因白三葉草的分子生物學檢測提取NAT3轉(zhuǎn)基因白三葉草葉片的基因組DNA并以此為模板，在引物P55’TGGAACTGATGTTGCAACTGG 3’和引物P65’TGACAAGACAGAAGACGCACA 3’的引導下進行PCR鑒定，反應結(jié)束后，對PCR擴增產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖11所示(泳道1為MarkerλDNA/EcoRI+HindIII，泳道2為PCR擴增產(chǎn)物)，NAT3陽性轉(zhuǎn)基因植株可擴增出約1350bp的特異性條帶，表明NAT3已導入到白三葉草的基因組中并獲得表達，得到了NAT3轉(zhuǎn)基因白三葉草。同時，用上述相同方法獲得了NAT1轉(zhuǎn)基因白三葉草。
二、轉(zhuǎn)基因白三葉草的抗低氮性檢測將NAT3轉(zhuǎn)基因白三葉草、NAT1轉(zhuǎn)基因白三葉草和NC89非轉(zhuǎn)基因白三葉草的種子經(jīng)嚴格滅菌后分別播種在MS0、1/8N、1/16N、1/32N、1/8NO3-MS0培養(yǎng)基中，觀察各植株的生長情況。播種后30d觀察發(fā)現(xiàn)，在MS0培養(yǎng)基中的NAT3轉(zhuǎn)基因白三葉草、NAT1轉(zhuǎn)基因白三葉草、非轉(zhuǎn)基因白三葉草的生長狀況沒有明顯差別，1/8N、1/16N MS0培養(yǎng)基中的NAT3轉(zhuǎn)基因白三葉草與播種在相同培養(yǎng)基中的NAT1轉(zhuǎn)基因白三葉草、非轉(zhuǎn)基因白三葉草相比，葉片略大，植株略高。1/32N MS0培養(yǎng)基中NAT3轉(zhuǎn)基因白三葉草、NAT1轉(zhuǎn)基因白三葉草、非轉(zhuǎn)基因白三葉草均嚴重黃化、生長遲滯，但與NAT1轉(zhuǎn)基因白三葉草、非轉(zhuǎn)基因白三葉草比較，NAT3轉(zhuǎn)基因白三葉草葉片較大，顏色也綠些。1/8NO3-MS0培養(yǎng)基中的NAT3轉(zhuǎn)基因白三葉草、NAT1轉(zhuǎn)基因白三葉草、非轉(zhuǎn)基因白三葉草均比MS0培養(yǎng)基中的白三葉草生長緩慢、葉片發(fā)黃，但轉(zhuǎn)基因白三葉草比非轉(zhuǎn)基因白三葉草的葉片略大，葉色也稍深，而且NAT3轉(zhuǎn)基因草坪草比NAT1轉(zhuǎn)基因白三葉草的長勢更好一些，見圖14(左側(cè)NAT1轉(zhuǎn)基因白三葉草，右側(cè)NAT3轉(zhuǎn)基因白三葉草)，進一步證明本發(fā)明的NAT3較NAT1更能提高植物的氮利用率，使植物的抗低氮性得到提高。
序列表<160>2<210>1<211>482<212>PRT<213>硅藻(Cylindrotheca fusiformis)<400>1Met Ser Gly Thr Asp Val Ala Thr Gly Ala Pro Ala Glu Trp Lys Lys1 5 10 15Tyr Gln Glu Tyr Ser Leu Asp Val Asp Pro Asp Gln Asp Asp Arg Ala20 25 30Thr Glu Ile Lys Leu Cys Asn Phe Ser Arg Pro His Met Arg Ala Phe35 40 45His Phe Ser Trp Ile Gly Phe Phe Ile Ala Phe Phe Ile Trp Phe Ala50 55 60Ile Ala Pro Leu Leu Ser Glu Ile Gln Asp Thr Leu Asp Leu Asp Lys65 70 75 80Lys Glu Val Trp Thr Ser Ser Ile Val Gly Val Gly Gly Thr Ile Phe85 90 95Met Arg Phe Leu Leu Gly Pro Phe Cys Asp Lys Ile Gly Pro Arg Val100 105 110Leu Phe Thr Phe Val Leu Cys Phe Ala Ser Ile Pro Thr Ala Cys Thr115 120 125Gly Phe Val Asn Ser Ala Thr Ser Leu Ala Val Leu Arg Leu Phe Ile130 135 140Gly Thr Ala Gly Gly Thr Phe Val Met Cys Gln Tyr Trp Thr Ser Arg145 150 155 160Met Phe Thr Lys Gln Val Val Gly Thr Ala Asn Ala Leu Val Gly Gly165 170 175
Trp Gly Asn Leu Gly Gly Gly Val Thr Gln Leu Val Met Gly Ser Ala180 185 190Leu Phe Pro Leu Phe Lys Glu Ile Phe Lys Asn Glu Pro Asp Pro Ala195 200 205Glu Thr Ala Trp Arg Trp Val Ser Ile Val Pro Ala Val Val Ala Phe210 215 220Ala Ile Gly Leu Leu Ile Phe Phe Tyr Ser Asp Asp Ala Pro Lys Gly225 230 235 240Asn Tyr Asn Glu Met Lys Lys Asn Gly Ala Met Ala Asp Val Ser Ala245 250 255Ala Ala Ser Phe Arg Thr Gly Ala Leu Asn Leu Asn Thr Trp Phe Leu260 265 270Phe Ile Gln Tyr Ala Cys Cys Phe Gly Val Glu Leu Thr Met Asn Asn275 280 285Ala Ala Ala Leu Tyr Phe Lys Glu Lys Phe Ser Leu Thr Thr Glu Glu290 295 300Ala Ala Ala Ile Ala Ser Ile Phe Gly Trp Met Asn Leu Phe Ala Arg305 310 315 320Gly Ala Gly Gly Phe Leu Ser Asp Lys Ala Asn Ala Arg Met Gly Met325 330 335Arg Gly Arg Leu Trp Thr Gln Thr Ile Leu Leu Ala Cys Glu Gly Ala340 345 350Leu Val Leu Val Phe Ala Asn Thr Gly Ser Leu Thr Gly Ala Ile Val355 360 365Val Met Val Phe Phe Ser Leu Phe Val Gln Ala Ala Glu Gly Ser Ser370 375 380Tyr Gly Ile Val Pro Tyr Val Asp Pro Pro Ala Thr Gly Ala Ile Ala385 390 395 400Gly Ile Ile Gly Ala Gly Gly Asn Thr Gly Ala Val Ala Phe Gly Met405 410 415Gly Phe Arg Gln Leu Asp Tyr Lys Asp Ala Phe Ile Ile Met Gly Ala420 425 430
Val Ile Cys Ala Ser Ser Val Leu Ser Val Phe Ile Cys Ile Pro Gly435 440 445Ser Ser Arg Met Ile Gly Gly Glu Ala Asp Asp Val Gly Ala Lys Asp450 455 460Pro Thr Leu Ser Val Pro Gln Pro Asp Thr Glu Lys Thr Gln Asp Val465 470 475 480Asn Ala<210>2<211>1449<212>DNA<213>硅藻(Cylindrotheca fusiformis)<400>2atgagtggaa ctgatgttgc aactggtgct cctgccgaat ggaagaagta ccaagagtac 60tcccttgacg tcgatcccga tcaagacgac cgggccactg agatcaagct atgtaacttc120tctcggcccc atatgagagc tttccatttc tcatggattg gattcttcat tgccttcttc180atctggttcg ccatcgctcc ccttctcagt gagatccaag atactcttga cttggacaag240aaggaagtct ggacttcatc tattgtcggt gtcggaggta caattttcat gcgtttcctt300ctaggaccgt tctgcgacaa gatcgggccc cgagtcctct tcacctttgt cctttgcttc360gcttctattc ccactgcctg taccggattt gtcaactctg ccacttccct tgccgtcctc420cgattgttca ttggaactgc tggaggtact ttcgtcatgt gccaatattg gaccagccga480atgttcacaa agcaagtggt cggaactgcc aatgctcttg tcggtggatg gggaaatctt540ggaggaggtg tcacgcagct tgtcatggga tcagcgttgt ttccactgtt caaggaaatc600ttcaagaacg agcctgaccc cgctgagact gcgtggcgat gggtttctat cgttcccgcc660gtcgttgcat tcgcaattgg tctcctaatt ttcttctatt ccgacgatgc gcccaaggga720aactacaacg agatgaagaa gaatggggcc atggccgatg tttccgccgc cgcttccttc780cgcaccggag cactcaacct caatacttgg tttttgttca ttcaatacgc atgctgcttc840ggtgtggaac tgaccatgaa caacgccgcc gctctgtact tcaaggagaa gttctcgctg900accactgaag aagcggccgc cattgcctcc atcttcggat ggatgaatct tttcgcccgt960ggcgctggtg gattccttag tgacaaggcc aacgccagga tgggaatgcg tggacgcctt 1020tggactcaga ccatcttgct ggcttgtgag ggtgctcttg tcttggtttt tgccaacaca 1080
ggatcgttga cgggagccat tgtcgttatg gtcttctttt ctctattcgt ccaagccgcc1140gaagggtcct cttatggaat cgtcccctac gttgacccac ccgccactgg ggccattgcc1200ggtatcattg gagctggagg aaacactgga gccgtcgctt ttggaatggg attccgtcag1260ttggactaca aagatgcttt catcatcatg ggagccgtca tctgtgcgtc ttctgtcttg1320tcagtcttca tctgcatccc cggatcgtct agaatgattg gaggagaagc ggatgatgtc1380ggtgccaagg accccacttt gtcggttccc caacctgata ccgagaagac tcaagatgtc1440aatgcctaa1449
權(quán)利要求
1.硅藻的硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白，是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加具有硝酸鹽轉(zhuǎn)運功能的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白，其特征在于所述蛋白具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列。
3.編碼權(quán)利要求1或2所述硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白的基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于所述基因是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №1的DNA序列；3)與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有硝酸鹽轉(zhuǎn)運功能的核苷酸序列；4)在高嚴謹條件下可與序列表中的SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因，其特征在于所述基因具有序列表中SEQ ID №2的DNA序列。
6.含有權(quán)利要求3所述基因的表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系和宿主菌。
7.一種提高植物氮吸收能力的方法，是將權(quán)利要求3所述的硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因?qū)胫参锝M織或細胞，得到氮吸收能力提高的植物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因通過含有所述硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因的植物表達載體導入植物組織或細胞；用于構(gòu)建所述植物表達載體的出發(fā)載體為pBI121、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301或pCAMBIA1300。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述植物表達載體為pNAT121。
10.根據(jù)權(quán)利要求7或8或9所述的方法，其特征在于所述植物包括單子葉植物和雙子葉植物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一個來源于硅藻的硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白及其編碼基因與應用，其目的是提供一個硅藻的硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白及其編碼基因與其在轉(zhuǎn)基因植物中的應用。該蛋白是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加具有硝酸鹽轉(zhuǎn)運功能的蛋白質(zhì)。轉(zhuǎn)有本發(fā)明基因NAT3的煙草、水稻和草坪草均可在氮元素含量為正常值1/32的培養(yǎng)基上正常生長，表明NAT3可提高植物的氮吸收能力，使植物在低氮條件下仍可正常生長。本發(fā)明將在植物氮肥吸收領域及抗低氮植物品種的繁育工作中發(fā)揮重要作用，應用前景廣闊。
文檔編號C12N15/82GK1887903SQ20061008882
公開日2007年1月3日 申請日期2006年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月19日
發(fā)明者劉昱輝, 賈士榮, 伍祥貴, 包駿 申請人:北京優(yōu)利康生物農(nóng)業(yè)技術有限公司