專利名稱：一種納豆激酶的表達(dá)方法及其專用表達(dá)載體和工程菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及納豆激酶的表達(dá)方法及其專用表達(dá)載體和工程菌。
背景技術(shù)：
納豆激酶(Nattokinase，NK，GenBank號(hào)AA065246)是一種來(lái)源于傳統(tǒng)發(fā)酵食品一納豆的絲氨酸蛋白酶。研究表明，納豆激酶具有較強(qiáng)的纖溶活性，是一種潛在的溶栓藥物，它不僅具有良好的溶栓效果，而且可經(jīng)口服達(dá)到纖溶目的，同時(shí)也可促進(jìn)內(nèi)源組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)增加。納豆激酶作為溶栓藥物具有藥效時(shí)間長(zhǎng)，無(wú)抗原性，能使生物體自身纖溶酶系統(tǒng)活化的優(yōu)點(diǎn)，可溫和、持續(xù)地提高血液的纖溶活性，對(duì)心腦血管栓塞類疾病達(dá)到方便、安全、有效的預(yù)防和治療，其特性優(yōu)于當(dāng)前臨床應(yīng)用的溶栓藥物，如鏈激酶、尿激酶等。目前，納豆激酶主要來(lái)源于野生枯草芽孢桿菌發(fā)酵的納豆、豆豉等，但是納豆、豆豉的風(fēng)味還不能被許多人所習(xí)慣和接受，從發(fā)酵液中分離純化納豆激酶通常產(chǎn)量較低、生產(chǎn)成本高，這些因素都在一定程度上限制了納豆激酶的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。
乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是一類在食品工業(yè)中應(yīng)用最廣泛的革蘭氏陽(yáng)性菌，包括乳酸球菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌等十幾個(gè)屬。很早以前，該菌即被用于制作泡菜、醬油、奶酪和酸奶等，被公認(rèn)為是安全的(GRAS)食品級(jí)微生物。乳酸菌的主要作用包括改善食品風(fēng)味、防止食品腐敗、增加養(yǎng)分、平衡消化道菌群、降低膽固醇、控制內(nèi)毒素等。近年來(lái)，LAB的遺傳學(xué)及分子生物學(xué)研究取得了顯著進(jìn)展，使其作為一種新的表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源基因成為可能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種納豆激酶的專用表達(dá)載體。
本發(fā)明所提供的用于表達(dá)納豆激酶的載體，是含有組成型表達(dá)啟動(dòng)子、納豆激酶前導(dǎo)肽及其成熟肽編碼序列的乳酸菌組成型表達(dá)載體，或是含有誘導(dǎo)型表達(dá)啟動(dòng)子、跨膜信號(hào)肽編碼序列、納豆激酶前導(dǎo)肽及其成熟肽編碼序列的乳酸菌誘導(dǎo)型分泌表達(dá)載體；在所述乳酸菌組成型表達(dá)載體中，組成型表達(dá)啟動(dòng)子位于納豆激酶前導(dǎo)肽及其成熟肽編碼序列的上游；在所述乳酸菌誘導(dǎo)型分泌表達(dá)載體中，跨膜信號(hào)肽編碼序列與納豆激酶前導(dǎo)肽及其成熟肽編碼序列形成融合基因，跨膜信號(hào)肽編碼序列位于納豆激酶前導(dǎo)肽及其成熟肽編碼序列的5’端，誘導(dǎo)型表達(dá)啟動(dòng)子位于所述融合基因的上游。
所述乳酸菌組成型表達(dá)載體中組成型表達(dá)啟動(dòng)子的選擇是多種多樣的，如乳酸菌啟動(dòng)子P32(GenBank號(hào)M24764)、P23(GenBank號(hào)M24763)、P59(GenBank號(hào)24806)或Pnuc(GenBank號(hào)V01281)等。
所述乳酸菌誘導(dǎo)型分泌表達(dá)載體中的誘導(dǎo)型表達(dá)啟動(dòng)子的選擇也是多種多樣的，如乳鏈菌肽基因啟動(dòng)子PnisZ(GenBank號(hào)L16226)、PlacA(GenBank號(hào)M32103)或Pgad(GenBank號(hào)AF005098)等；所述跨膜信號(hào)肽可為乳酸菌信號(hào)肽Usp45(GenBank號(hào)M60178)或信號(hào)肽Nuc(GenBank號(hào)V01281)等。
用于構(gòu)建納豆激酶基因的乳酸菌組成型和誘導(dǎo)型分泌表達(dá)載體的出發(fā)載體選擇范圍是非常廣泛的，比如可為pMG36e、pMG36c、pIL253、pVE5523、pOri23、pOri59、pZTE32、pNZ9700、pNZ9800或pNZ9000等。
以pMG36e為出發(fā)載體，構(gòu)建的含有所述乳酸菌啟動(dòng)子P32，納豆激酶前導(dǎo)肽及其成熟肽編碼序列的乳酸菌組成型表達(dá)載體為pXB520；以pMG36e為出發(fā)載體，構(gòu)建的含有所述乳鏈菌肽基因啟動(dòng)子PnisZ、信號(hào)肽Usp45、納豆激酶前導(dǎo)肽及其成熟肽編碼序列的乳酸菌誘導(dǎo)型分泌表達(dá)載體為pXB622。
上述表達(dá)載體可按照基因工程領(lǐng)域的常規(guī)方法構(gòu)建。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種納豆激酶的專用表達(dá)工程菌。
本發(fā)明所提供的用于表達(dá)納豆激酶的工程菌，是將上述納豆激酶的專用表達(dá)載體導(dǎo)入乳酸菌中得到的。
所述乳酸菌可為任何一種適于表達(dá)外源基因的乳酸菌，如L.lactis MG1363、L.lactis LM0230、L.lactis NZ9000、L.lactis NZ9700或L.lactis NZ9800等乳酸乳球菌，Lb.casei、Lb.acidophilus、Lb.bulgaricus或Lb.plantarum等乳酸乳桿菌。
以乳酸乳球菌MG1363為出發(fā)菌株，構(gòu)建的轉(zhuǎn)化有pXB520的重組乳酸菌菌株為L(zhǎng).lactis MG1363/pKB520。
以乳酸乳球菌NZ9000為出發(fā)菌株，構(gòu)建的轉(zhuǎn)化有pXB622的重組乳酸菌菌株為L(zhǎng).lactis NZ9000/pXB622。
可采用生物工程領(lǐng)域中常用的方法，例如電穿孔轉(zhuǎn)化法、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法等將所構(gòu)建的重組表達(dá)載體導(dǎo)入乳酸菌中。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種納豆激酶的表達(dá)方法。
本發(fā)明所提供的納豆激酶的表達(dá)方法，是發(fā)酵上述納豆激酶的專用表達(dá)工程菌，得到納豆激酶。
發(fā)酵攜帶有誘導(dǎo)型分泌表達(dá)載體的重組乳酸菌表達(dá)納豆激酶時(shí)需加入乳鏈菌肽nisin，所加入nisin的濃度為10-100ng/mL，優(yōu)選為50ng/mL，誘導(dǎo)溫度為15-30℃，優(yōu)選為30℃，誘導(dǎo)時(shí)間為6-10小時(shí)，優(yōu)選為8小時(shí)。
本發(fā)明提供了一種納豆激酶的表達(dá)方法及其專用表達(dá)載體和工程菌。所構(gòu)建的納豆激酶的專用表達(dá)載體是含有組成型表達(dá)啟動(dòng)子、納豆激酶前導(dǎo)肽及其成熟肽編碼序列的乳酸菌組成型表達(dá)載體，或是含有誘導(dǎo)型表達(dá)啟動(dòng)子、跨膜信號(hào)肽編碼序列、納豆激酶前導(dǎo)肽及其成熟肽編碼序列的乳酸菌誘導(dǎo)型分泌表達(dá)載體。將所構(gòu)建的納豆激酶專用表達(dá)載體導(dǎo)入乳酸菌，即可得到納豆激酶的專用表達(dá)工程菌，培養(yǎng)工程菌可使納豆激酶基因得到表達(dá)。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明工程菌的表達(dá)產(chǎn)物具有較高的纖溶活性，每毫升發(fā)酵液活性最高可達(dá)41.7尿激酶單位，食用安全，對(duì)人體無(wú)毒副作用，穩(wěn)定性好，適用于各種食品，便于直接口服，生產(chǎn)成本低的優(yōu)點(diǎn)，為將納豆激酶開(kāi)發(fā)生產(chǎn)為口服溶栓功能性保健食品奠定了基礎(chǔ)，工業(yè)應(yīng)用前景廣闊。
以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。


圖1為納豆激酶組成型表達(dá)載體pXB520構(gòu)建過(guò)程的示意2為納豆激酶誘導(dǎo)型分泌表達(dá)載體pXB622構(gòu)建過(guò)程的示意3為pXB520和pXB622的酶切鑒定結(jié)果圖4為納豆激酶在乳酸菌中組成型表達(dá)產(chǎn)物的Western-blot檢測(cè)結(jié)果圖5為納豆激酶在乳酸菌中誘導(dǎo)型表達(dá)產(chǎn)物的Western-blot檢測(cè)結(jié)果圖6為分泌表達(dá)的納豆激酶的活性檢測(cè)結(jié)果圖7為檢測(cè)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間和Nisin濃度對(duì)納豆激酶在乳酸菌中誘導(dǎo)分泌表達(dá)影響的結(jié)果具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法，所有引物合成及測(cè)序工作均由上海生工完成。
實(shí)施例1、納豆激酶專用表達(dá)載體的構(gòu)建一、納豆激酶組成型表達(dá)載體的構(gòu)建參見(jiàn)圖1構(gòu)建納豆激酶的組成型表達(dá)載體，具體過(guò)程包括以下步驟1、構(gòu)建含乳酸菌啟動(dòng)子P32的中間載體pXB100根據(jù)乳酸菌啟動(dòng)子P32的序列(GenBank號(hào)M24764)設(shè)計(jì)引物，并在引物序列的兩端分別添加上限制性內(nèi)切酶EcoRI和SacI的識(shí)別位點(diǎn)，在下游引物中引入連續(xù)的3個(gè)終止密碼子和一個(gè)乳酸菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)以形成轉(zhuǎn)錄融合，引物序列如下引物1(上游引物)5′-atcgaattcggtcctcgggatatg-3′(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶EcoRI識(shí)別位點(diǎn))引物2(下游引物)5′-acgagctcgtatttggcctccctttatcactatcgaattacgaatttttc-3′(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶SacI識(shí)別位點(diǎn)，帶雙下劃線堿基為連續(xù)的3個(gè)終止密碼子，斜體堿基為乳酸菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)。)以乳酸菌質(zhì)粒pMG36e為模板，在引物1和引物2的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件為94℃ 30sec，53℃ 30sec，72℃ 30sec，共30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶EcoRI和SacI進(jìn)行雙酶切，再將230bp的酶切產(chǎn)物純化后與用相同酶雙酶切并經(jīng)純化的載體pUC18(TaKaRa公司)用T4DNA連接酶在16℃下反應(yīng)16小時(shí)進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物用氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，用含100mg/L紅霉素的LB抗性平板篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，抽提陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子中的重組質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶EcoRI和SacI進(jìn)行酶切鑒定，經(jīng)酶切獲得230bp和2700bp片段的為陽(yáng)性克隆，再對(duì)陽(yáng)性克隆質(zhì)粒用PCR的方法做進(jìn)一步鑒定，所用引物為引物1和引物2，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明乳酸菌啟動(dòng)子P32片段已插入pUC18中，且序列正確，將此含乳酸菌啟動(dòng)子P32的重組載體，命名為pXB100。
2、構(gòu)建含納豆激酶前導(dǎo)肽和成熟肽編碼序列的中間載體pXB120根據(jù)納豆激酶前導(dǎo)肽和成熟肽的編碼序列(GenBank號(hào)AY219901)設(shè)計(jì)引物，并在引物序列的兩端分別添加上限制性內(nèi)切酶BamHI和PstI的識(shí)別位點(diǎn)，引物序列如下引物3(上游引物)5′-cgcggatccttaaaaagagggaataaaatggccggaaaaagcag-3′(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶BamHI識(shí)別位點(diǎn))引物4(下游引物)5′-ttctgcagttattgtgcagctgcttg-3′(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶PstI識(shí)別位點(diǎn))以含有納豆激酶全基因的載體pXBL2(將納豆激酶全基因克隆入載體pUC18多克隆位點(diǎn)的EcoRI和SalI酶切位點(diǎn)得到的重組載體)為模板，在引物3和引物4的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件為94℃ 1min，54℃ 1min，72℃ 1min，共30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶BamHI和PstI進(jìn)行雙酶切，再將1060bp的酶切產(chǎn)物純化后與用相同酶雙酶切并經(jīng)純化的載體pXB100用T4DNA連接酶在16℃下反應(yīng)20小時(shí)進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物用氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，用含100mg/L氨芐青霉素的LB抗性平板篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，抽提陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子中的重組質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶BamHI和PstI進(jìn)行酶切鑒定，經(jīng)酶切獲得1080bp和2900bp片段的為陽(yáng)性克隆，再對(duì)陽(yáng)性克隆質(zhì)粒用PCR的方法做進(jìn)一步鑒定，所用引物為引物3和引物4，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明納豆激酶前導(dǎo)肽和成熟肽的編碼序列已插入pXB100中，且序列正確，將此含乳酸菌啟動(dòng)子P32及納豆激酶前導(dǎo)肽和成熟肽的編碼序列的重組載體，命名為pXB120。
3、納豆激酶的組成型表達(dá)載體的獲得用限制性內(nèi)切酶EcoRI和PstI對(duì)載體pXB120進(jìn)行雙酶切，回收并純化1330bp的小片段，將該片段與用相同酶雙酶切并經(jīng)純化的載體pMG36e用T4DNA連接酶在16℃反應(yīng)20小時(shí)進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物用氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，用含100mg/L紅霉素的LB抗性平板篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，抽提陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子中的重組質(zhì)粒，先對(duì)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶EcoRI進(jìn)行酶切鑒定，再對(duì)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶KpnI+SacI進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切鑒定結(jié)果如圖3所示(泳道1為1kb DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道4為pXB520的EcoRI酶切產(chǎn)物，泳道5為pXB520的KpnI+SacI的雙酶切產(chǎn)物)，經(jīng)EcoRI酶切獲得了4700bp的片段，經(jīng)KpnI+SacI雙酶切獲得1200bp和3500bp的片段，與預(yù)期結(jié)果相符，得到了納豆激酶的組成型表達(dá)載體，命名為pXB520。
二、納豆激酶誘導(dǎo)型分泌表達(dá)載體的構(gòu)建參見(jiàn)圖2構(gòu)建納豆激酶的誘導(dǎo)型分泌表達(dá)載體，具體過(guò)程包括以下步驟1、構(gòu)建含納豆激酶前導(dǎo)肽和成熟肽編碼序列的中間載體pXB020根據(jù)納豆激酶前導(dǎo)肽和成熟肽的編碼序列設(shè)計(jì)引物，并在引物序列的兩端分別添加上限制性內(nèi)切酶EcoRI和SalI的識(shí)別位點(diǎn)，引物序列如下引物5(上游引物)5′-gacgaattcatggccggaaaaagcagt-3′(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶EcoRI識(shí)別位點(diǎn))引物6(下游引物)5′-aggcgtcgacttattgtgcagctgcttg-3′(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶SalI識(shí)別位點(diǎn))以含有納豆激酶全基因的載體pXBL2(將納豆激酶全基因克隆入載體pUC18多克隆位點(diǎn)的EcoRI和SalI酶切位點(diǎn)得到的重組載體)為模板，在引物5和引物6的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件為94℃ 1min，54℃ 1min，72℃ 1min，共30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶EcoRI和SalI進(jìn)行雙酶切，再將1060bp的酶切產(chǎn)物純化后與用相同酶雙酶切并經(jīng)純化的載體pBluescript SK+(Stratagene)用T4DNA連接酶在16℃下反應(yīng)20小時(shí)進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物用氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，用含100mg/L氨芐青霉素的LB抗性平板篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，抽提陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子中的重組質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶EcoRI和SalI進(jìn)行酶切鑒定，經(jīng)酶切獲得1060bp和2900bp片段的為陽(yáng)性克隆，再對(duì)陽(yáng)性克隆質(zhì)粒用PCR的方法做進(jìn)一步鑒定，所用引物為引物5和引物6，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明納豆激酶前導(dǎo)肽和成熟肽的編碼序列已插入pXB100中，且序列正確，將此含納豆激酶前導(dǎo)肽和成熟肽的編碼序列的重組載體，命名為pXB020。
2、構(gòu)建含乳酸菌信號(hào)肽Usp45編碼序列的中間載體pXB022根據(jù)乳酸菌信號(hào)肽Usp45的編碼序列(GenBank號(hào)M60178)設(shè)計(jì)引物，并在引物序列的兩端分別添加上限制性內(nèi)切酶SacI和EcoRI的識(shí)別位點(diǎn)，引物序列如下引物7(上游引物)5′-cgagctcgtatgaaaaaaaagattatctcagc-3′(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶SacI識(shí)別位點(diǎn))引物8(下游引物)5′-ctagaattcagcgtaaacagctggc-3′(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶EcoRI識(shí)別位點(diǎn))以乳酸乳球菌MG1363的基因組DNA為模板，在引物7和引物8的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件為94℃30sec，52℃30sec，72℃20sec，共30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶SacI和EcoRI進(jìn)行雙酶切，再將100bp的酶切產(chǎn)物純化后與用相同酶雙酶切并經(jīng)純化的載體pXB020用T4DNA連接酶在16℃下反應(yīng)16小時(shí)進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物用氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，用含100mg/L氨芐青霉素的LB抗性平板篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，抽提陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子中的重組質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶SacI和EcoRI進(jìn)行酶切鑒定，經(jīng)酶切獲得100bp和4000bp片段的為陽(yáng)性克隆，再對(duì)陽(yáng)性克隆質(zhì)粒用PCR的方法做進(jìn)一步鑒定，所用引物為引物7和引物8，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明乳酸菌信號(hào)肽Usp45的編碼序列已插入pXB020中，且序列正確，將此含乳酸菌信號(hào)肽Usp45編碼序列，納豆激酶前導(dǎo)肽和成熟肽編碼序列的重組載體，命名為pXB022。
3、構(gòu)建含乳鏈菌肽基因啟動(dòng)子PnisZ的中間載體pXB600根據(jù)乳鏈菌肽基因啟動(dòng)子PnisZ的序列(GenBank號(hào)L16226)設(shè)計(jì)引物，并在引物序列的兩端分別添加上限制性內(nèi)切酶EcoRI和SacI的識(shí)別位點(diǎn)，引物序列如下引物9(上游引物)5′-cggaattcgatataggtttattgag-3′(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶EcoRI識(shí)別位點(diǎn))引物10(下游引物)5′-tcagagctctttgagtgcctccttataa-3′(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶SacI識(shí)別位點(diǎn))以乳酸菌質(zhì)粒pHJ201(陳秀珠，胡海菁，楊巍，還連棟，乳鏈菌肽前體基因(nisZ)在乳酸乳球菌中的克隆和表達(dá)，遺傳學(xué)報(bào)，2001，28(3)285-290)為模板，在引物9和引物10的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件為94℃ 30sec，53℃ 30sec，72℃ 30sec，共30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶EcoRI和SacI進(jìn)行雙酶切，再將240bp的酶切產(chǎn)物純化后與用相同酶雙酶切并經(jīng)純化的載體pMG36e用T4DNA連接酶在16℃下反應(yīng)16小時(shí)進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物用氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，用含100mg/L紅霉素的LB抗性平板篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，抽提陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子中的重組質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶EcoRI和SacI進(jìn)行酶切鑒定，經(jīng)酶切獲得240bp和3400bp片段的為陽(yáng)性克隆，再對(duì)陽(yáng)性克隆質(zhì)粒用PCR的方法做進(jìn)一步鑒定，所用引物為引物9和引物10，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明乳鏈菌肽基因啟動(dòng)子PnisZ片段已插入pMG36e中，且序列正確，將此含乳鏈菌肽基因啟動(dòng)子PnisZ的重組載體，命名為pXB600。
4、納豆激酶誘導(dǎo)型分泌表達(dá)載體的獲得用限制性內(nèi)切酶SacI和KpnI對(duì)載體pXB022進(jìn)行雙酶切，回收并純化1200bp的小片段，將該片段與用相同酶雙酶切并經(jīng)純化的載體pXB600用T4DNA連接酶在16℃反應(yīng)20小時(shí)進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物用氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，用含100mg/L紅霉素的LB抗性平板篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，抽提陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子中的重組質(zhì)粒，先對(duì)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶EcoRI進(jìn)行酶切鑒定，再對(duì)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶KpnI+SacI進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切鑒定結(jié)果如圖3所示(泳道1為1kb DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道2為pXB622的EcoRI酶切產(chǎn)物，泳道3為pXB622的KpnI+SacI的雙酶切產(chǎn)物)，經(jīng)EcoRI酶切獲得了330bp和4340bp的片段，經(jīng)KpnI+SacI雙酶切獲得1200bp和3500bp的片段，與預(yù)期結(jié)果相符，得到了納豆激酶的誘導(dǎo)型分泌表達(dá)載體，命名為pXB622。
實(shí)施例2、納豆激酶在乳酸菌中的表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的鑒定一、納豆激酶在乳酸菌中的表達(dá)1、納豆激酶在乳酸菌中的組成型表達(dá)將實(shí)施例1構(gòu)建的納豆激酶的乳酸菌組成型表達(dá)載體pXB520轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌L.lactis MG1363，用含5μg/mL紅霉素的GM17抗性平板(胰蛋白胨0.5％，大豆蛋白胨0.5％，牛肉浸膏0.5％，酵母提取物0.25％，葡萄糖0.5％，維生素C 0.05％，β-甘油磷酸鈉1.9％，硫酸鎂1mmol/L)篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，抽提陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子中的重組質(zhì)粒，先對(duì)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶EcoRI進(jìn)行酶切鑒定，再對(duì)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶KpnI+SacI進(jìn)行雙酶切鑒定，經(jīng)KpnI+SacI雙酶切獲得1200bp和3500bp的片段，與預(yù)期結(jié)果相符，得到了納豆激酶組成型表達(dá)工程菌，命名為L(zhǎng).lactisMG1363/pXB520。將該工程菌接種于含有5μg/mL紅霉素的GM17液體培養(yǎng)基的試管中，在30℃下靜置培養(yǎng)12小時(shí)，再按1％接種量接種于GM17液體培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)4-10小時(shí)。
2、納豆激酶在乳酸菌中的誘導(dǎo)型表達(dá)將實(shí)施例1構(gòu)建的納豆激酶的乳酸菌誘導(dǎo)型表達(dá)載體pXB622轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌NZ9000，用含5μg/mL紅霉素的GM17抗性平板篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，抽提陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子中的重組質(zhì)粒，先對(duì)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶EcoRI進(jìn)行酶切鑒定，再對(duì)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶KpnI+SacI進(jìn)行雙酶切鑒定，經(jīng)KpnI+SacI雙酶切獲得1200bp和3500bp的片段，與預(yù)期結(jié)果相符，得到了納豆激酶誘導(dǎo)型表達(dá)工程菌，命名為L(zhǎng).lactisNZ9000/pXB622。將該工程菌接種于含有5μg/mL紅霉素的GM17液體培養(yǎng)基的試管中，在30℃下靜置培養(yǎng)12小時(shí)，再按1％接種量接種于GM17液體培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)3-6小時(shí)至OD600nm值為0.4-0.5，最高不超過(guò)0.6，然后加入終濃度為10-100ng/mL的乳酸鏈球菌素(Nisin)進(jìn)行誘導(dǎo)，在30℃下靜置培養(yǎng)4-10小時(shí)。
二、表達(dá)產(chǎn)物的Western-blot鑒定對(duì)步驟一的組成型和誘導(dǎo)型表達(dá)產(chǎn)物12000rpm離心1min，分別收集上清液和沉淀，將沉淀用GM17液體培養(yǎng)基洗滌一次后重懸于1/20(V/V)GM17液體培養(yǎng)基中，超聲波破碎菌體細(xì)胞，離心，分別收集上清液和沉淀，對(duì)上清和沉淀進(jìn)行Western-blot鑒定，具體方法如下1)SDS-PAGE采用Tris-甘氨酸電泳系統(tǒng)對(duì)收集的上清液和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE(分離膠濃度為12％)，方法為取待測(cè)樣品液10μL，加入樣品緩沖液10μL(含100mmol/L Tris-HCl，pH 6.8，200mmol/L DTT，4％SDS，0.2％溴酚藍(lán)，20％甘油)，水浴煮沸5min，20μL全部上樣，用25mA穩(wěn)流電泳，約2h后停止電泳。
2)免疫雜交SDS-PAGE電泳結(jié)束后，不對(duì)膠染色，進(jìn)行Western-blot分析，具體方法為將膠用蒸餾水沖洗并在電轉(zhuǎn)移液(10mM碳酸氫鈉，4mM碳酸鈉，pH9.5，10％甲醇)中浸潤(rùn)，用電轉(zhuǎn)移的方法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，轉(zhuǎn)移在冰浴中進(jìn)行，電流200mA，電轉(zhuǎn)移時(shí)間約2.5h；轉(zhuǎn)有蛋白的硝酸纖維素膜在溶液III(3-5％BSA，用溶液I(20mMTris-HCl，pH7.4，0.15M NaCl，1mM EDTA，0.1％Tween-20，0.04％NaN3)配制)中4℃封閉8-12h，然后與一抗溶液(用從B.Subtilis YF38(CGMCC No.1308)中純化的納豆激酶為抗體制備)37℃保溫1h，用溶液I洗膜三次，每次10min；與二抗(羊抗兔IgG，華美生物工程公司)溶液37℃保溫1h；用溶液I洗膜三次，每次10min；用水沖洗一次，溶液II沖洗一次；最后加入10mL溶液II和底物(50mg/mL NBT 66ul，50mg/mL BCIP 33uL)，37℃避光顯色5-10min。納豆激酶在乳酸菌中組成型表達(dá)產(chǎn)物的Western-blot檢測(cè)結(jié)果如圖4所示(泳道1為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(94kDa、62kDa、40kDa、30kDa、12kDa)，泳道2為B.subtilis YF38的發(fā)酵上清液(陽(yáng)性對(duì)照)，泳道3為轉(zhuǎn)化有空載體pMG36e的乳酸乳球菌L.lactis MG1363經(jīng)發(fā)酵的菌體(陰性對(duì)照)，泳道4-7分別為組成型表達(dá)工程菌L.lactis MG1363/pXB520發(fā)酵8小時(shí)及10小時(shí)的菌體(泳道4、6)與上清液(泳道5、7)，在28kDa和36kDa大小處均出現(xiàn)兩條特異的雜交條帶(箭頭所指)，分別與納豆激酶成熟肽以及未加工的原肽的大小相符，表明重組菌經(jīng)發(fā)酵后，菌體中產(chǎn)生能夠與納豆激酶的抗體特異性相互作用的蛋白，但有一部分表達(dá)產(chǎn)物還沒(méi)有切除前導(dǎo)肽。納豆激酶在乳酸菌中誘導(dǎo)型表達(dá)產(chǎn)物的Western-blot檢測(cè)結(jié)果如圖5所示(泳道1為經(jīng)Nisin誘導(dǎo)發(fā)酵的工程菌L.lactisNZ9000/pXB622的菌體，泳道2為經(jīng)Nisin誘導(dǎo)的工程菌L.lactisNZ9000/pXB622的發(fā)酵上清液，泳道3為未經(jīng)誘導(dǎo)的誘導(dǎo)型表達(dá)工程菌L.lactis NZ9000/pXB622的發(fā)酵上清液(陰性對(duì)照)，泳道4為轉(zhuǎn)化有空載體pMG36e的乳酸乳球菌NZ9000的發(fā)酵上清液(陰性對(duì)照)，泳道5為B.subtilis YF38的發(fā)酵上清液(陽(yáng)性對(duì)照)，泳道6為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(94kDa、62kDa、40kDa、30kDa、20kDa、12kDa)，在Nisin的誘導(dǎo)下，納豆激酶在所構(gòu)建的誘導(dǎo)型表達(dá)工程菌L.lactis NZ9000/pXB622中成功表達(dá)并可有效地分泌到胞外。
實(shí)施例3、誘導(dǎo)表達(dá)的納豆激酶的纖溶活性檢測(cè)檢測(cè)實(shí)施例2誘導(dǎo)表達(dá)的納豆激酶的纖溶活性，具體方法如下首先制作纖維蛋白檢測(cè)平板取10mL巴比妥鈉緩沖液(含0.05M巴比妥鈉，0.09MNaCl，0.0017M CaCl2，0.0007M MgCl2)熔化瓊脂糖(0.6％)，再取10mL相同緩沖液溶解人血纖維蛋白原(購(gòu)自中國(guó)藥品鑒定檢驗(yàn)所)(20mg/mL)，于45℃保溫45min和10min后，加入10μL凝血酶(購(gòu)自中國(guó)藥品檢驗(yàn)鑒定所)溶液(0.1BP/μL)混勻，與上述20mg/mL人血纖維蛋白原溶液混合后倒入水平無(wú)菌培養(yǎng)皿，室溫放置1h后，用打孔器打孔。取30μL樣品注入小孔，37℃溫育16-18h，結(jié)果如圖6所示(1為經(jīng)Nisin誘導(dǎo)發(fā)酵的工程菌L.lactisNZ9000/pXB622的菌體，2為經(jīng)Nisin誘導(dǎo)的工程菌L.lactis NZ9000/pXB622的發(fā)酵上清液，3為未經(jīng)誘導(dǎo)的誘導(dǎo)型表達(dá)工程菌L.lactis NZ9000/pXB622的發(fā)酵上清液(陰性對(duì)照)，4為轉(zhuǎn)化有空載體pMG36e的乳酸乳球菌NZ9000的發(fā)酵上清液(陰性對(duì)照)，5為B.subtilis YF38的發(fā)酵上清液(陽(yáng)性對(duì)照))，用游標(biāo)卡尺測(cè)定透明圈的直徑，同時(shí)以尿激酶為標(biāo)準(zhǔn)品制作纖溶活性標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)比較計(jì)算得到發(fā)酵液的纖溶活性單位。結(jié)果發(fā)酵上清液的纖溶活性最高可達(dá)41.7尿激酶單位/mL，分泌效率達(dá)94％，而轉(zhuǎn)化有空載體pMG36e的乳酸乳球菌NZ9000的發(fā)酵上清液及未經(jīng)誘導(dǎo)的工程菌L.lactis NZ9000/pXB622的上清液均沒(méi)有檢測(cè)到纖溶活性，進(jìn)一步證明工程菌L.lactis NZ9000/pXB622中的納豆激酶基因受Nisin誘導(dǎo)表達(dá)，且表達(dá)產(chǎn)物能夠有效分泌到胞外。
實(shí)施例4、檢測(cè)不同誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間及Nisin濃度對(duì)納豆激酶誘導(dǎo)表達(dá)的影響1、檢測(cè)溫度對(duì)納豆激酶誘導(dǎo)表達(dá)的影響在Nisin誘導(dǎo)濃度為50ng/mL，誘導(dǎo)時(shí)間為8小時(shí)情況下，分別在20℃，30℃和37℃對(duì)工程菌L.lactis NZ9000/pXB622進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)定菌液的菌體濃度和纖溶活性。結(jié)果見(jiàn)圖7A，30℃培養(yǎng)時(shí)菌體的生長(zhǎng)情況最好，納豆激酶的表達(dá)活性也最高。
2、檢測(cè)誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)納豆激酶表達(dá)的影響在Nisin誘導(dǎo)濃度為50ng/mL，誘導(dǎo)溫度為30℃情況下，分別在發(fā)酵2小時(shí)，4小時(shí)，6小時(shí)，8小時(shí)，10小時(shí)和12小時(shí)時(shí)取樣，測(cè)定菌液的菌體濃度和纖溶活性。結(jié)果見(jiàn)圖7C，發(fā)酵6小時(shí)時(shí)菌液濃度達(dá)到最大，而到8小時(shí)纖溶活性才達(dá)到最大值。
3、檢測(cè)Nisin濃度對(duì)納豆激酶表達(dá)的影響在誘導(dǎo)溫度為30℃，誘導(dǎo)時(shí)間為8小時(shí)情況下，分別用10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、150ng/mL的Nisin進(jìn)行誘導(dǎo)，測(cè)定菌液的菌體濃度和纖溶活性。結(jié)果見(jiàn)圖7B，隨著Nisin濃度的升高，乳酸菌的生長(zhǎng)受到抑制，而在10-50ng/mL范圍內(nèi)，纖溶活性隨Nisin濃度的升高而升高，而當(dāng)Nisin濃度超過(guò)50ng/mL時(shí)，纖溶活性隨Nisin濃度的升高反而降低。
上述試驗(yàn)結(jié)果表明，納豆激酶在乳酸菌中誘導(dǎo)分泌表達(dá)的溫度優(yōu)選為30℃，誘導(dǎo)時(shí)間優(yōu)選為8小時(shí)，誘導(dǎo)物Nisin的濃度優(yōu)選為50ng/mL。
權(quán)利要求
1.用于表達(dá)納豆激酶的載體，是含有組成型表達(dá)啟動(dòng)子、納豆激酶前導(dǎo)肽及其成熟肽編碼序列的乳酸菌組成型表達(dá)載體，或是含有誘導(dǎo)型表達(dá)啟動(dòng)子、跨膜信號(hào)肽編碼序列、納豆激酶前導(dǎo)肽及其成熟肽編碼序列的乳酸菌誘導(dǎo)型分泌表達(dá)載體；在所述乳酸菌組成型表達(dá)載體中，組成型表達(dá)啟動(dòng)子位于納豆激酶前導(dǎo)肽及其成熟肽編碼序列的上游；在所述乳酸菌誘導(dǎo)型分泌表達(dá)載體中，跨膜信號(hào)肽編碼序列與納豆激酶前導(dǎo)肽及其成熟肽編碼序列形成融合基因，跨膜信號(hào)肽編碼序列位于納豆激酶前導(dǎo)肽及其成熟肽編碼序列的5’端，誘導(dǎo)型表達(dá)啟動(dòng)子位于所述融合基因的上游。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于所述乳酸菌組成型表達(dá)載體中的組成型表達(dá)啟動(dòng)子為乳酸菌啟動(dòng)子P32、P23、P59或Pnuc。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于所述乳酸菌誘導(dǎo)型表達(dá)載體中的誘導(dǎo)型表達(dá)啟動(dòng)子為乳鏈菌肽基因啟動(dòng)子PnisZ、PlacA或Pgad，跨膜信號(hào)肽為乳酸菌信號(hào)肽Usp45或信號(hào)肽Nuc。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于用于構(gòu)建所述納豆激酶乳酸菌組成型和誘導(dǎo)型分泌表達(dá)載體的出發(fā)載體為pMG36e、pMG36c、pIL253、pVE5523、pOri23、pOri59、pZTE32、pNZ9700、pNZ9800或pNZ9000；以pMG36e為出發(fā)載體，構(gòu)建的納豆激酶乳酸菌組成型表達(dá)載體為pXB520；以pMG36e為出發(fā)載體，構(gòu)建的納豆激酶乳酸菌誘導(dǎo)型分泌表達(dá)載體為pXB622。
5.表達(dá)納豆激酶的工程菌，是將權(quán)利要求1或2或3或4所述的載體導(dǎo)入乳酸菌中得到的重組菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的工程菌，其特征在于所述乳酸菌為乳酸乳球菌L.lactisMG1363、L.lactisLM0230、L.lactisNZ9000、L.lactisNZ9700、L.lactisNZ9800，或乳酸乳桿菌Lb.casei、Lb.acidophilus、Lb.bulgaricus、Lb.plantarum。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的工程菌，其特征在于所述重組乳酸菌為L(zhǎng).lactisMG1363/pXB520或L.lactis NZ9000/pXB622。
8.一種納豆激酶的表達(dá)方法，是發(fā)酵權(quán)利要求5所述的工程菌，得到納豆激酶。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的表達(dá)方法，其特征在于所述發(fā)酵攜帶有誘導(dǎo)型分泌表達(dá)載體的重組乳酸菌表達(dá)納豆激酶時(shí)需加入乳鏈菌肽Nisin，所加入Nisin的濃度為10-100ng/mL，誘導(dǎo)溫度為15-30℃，誘導(dǎo)時(shí)間為6-10小時(shí)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的表達(dá)方法，其特征在于所述乳鏈菌肽Nisin的濃度為50ng/mL，誘導(dǎo)溫度為30℃，誘導(dǎo)時(shí)間為8小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種納豆激酶的表達(dá)方法及其專用表達(dá)載體和工程菌。該載體是含有組成型表達(dá)啟動(dòng)子、納豆激酶前導(dǎo)肽及其成熟肽編碼序列的乳酸菌組成型表達(dá)載體，或是含有誘導(dǎo)型表達(dá)啟動(dòng)子、跨膜信號(hào)肽編碼序列、納豆激酶前導(dǎo)肽及其成熟肽編碼序列的乳酸菌誘導(dǎo)型分泌表達(dá)載體。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明工程菌的表達(dá)產(chǎn)物具有較高的纖溶活性，活性最高可達(dá)每毫升發(fā)酵上清液41.7尿激酶單位，食用安全，對(duì)人體無(wú)毒副作用，穩(wěn)定性好，適用于各種食品，便于直接口服，生產(chǎn)成本低的優(yōu)點(diǎn)，為將納豆激酶開(kāi)發(fā)生產(chǎn)為口服溶栓功能性保健食品奠定了基礎(chǔ)，工業(yè)應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號(hào)C12R1/225GK1900289SQ20061008882
公開(kāi)日2007年1月24日 申請(qǐng)日期2006年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月19日
發(fā)明者鐘瑾, 梁小波, 還連棟 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所