專利名稱：一個(gè)水稻愈傷組織特異性啟動子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物啟動子及其應(yīng)用，特別是涉及一個(gè)水稻愈傷組織特異性啟動子及其在培育安全性轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
篩選標(biāo)記基因在植物基因工程中具有重要作用，利用篩選標(biāo)記基因可以在植物轉(zhuǎn)基因過程中從大量未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中篩選出轉(zhuǎn)化細(xì)胞。然而，轉(zhuǎn)基因植物中的篩選基因又引起了人們對一系列生物安全方面的擔(dān)心，如選擇標(biāo)記基因是否編碼有毒的物質(zhì)和過敏源，是否不利于植物代謝的改變，是否會降低治療性藥物的療效，以及是否會在相近的物種和病原體間遷移等。如何從轉(zhuǎn)基因植物中剔除篩選標(biāo)記基因已經(jīng)成為人們關(guān)心的問題。目前，主要有兩種具有潛在的應(yīng)用價(jià)值的剔除篩選標(biāo)記基因的技術(shù)一種是目的基因和篩選標(biāo)記基因共轉(zhuǎn)化技術(shù)，它可以使目的基因和篩選標(biāo)記基因通過基因自由分離的原則在后代中剔除篩選標(biāo)記基因而保留目的基因；另一種是通過位點(diǎn)特異性重組來剪除篩選標(biāo)記基因的技術(shù)；此外，還有轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的篩選標(biāo)記基因剔除技術(shù)和同源重組介導(dǎo)的篩選標(biāo)記基因剔除技術(shù)等。但上述從基因水平上剔除篩選標(biāo)記基因具有繁瑣復(fù)雜，轉(zhuǎn)化周期長的缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一個(gè)在水稻愈傷組織中特異性表達(dá)的啟動子。
本發(fā)明所提供的水稻愈傷組織特異性啟動子，名稱為rcsP(rice calli-specificpromoter)，來源于稻屬水稻(Oryza sativa L.ssp.japonica)，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。
序列表中的SEQ ID №1由1584個(gè)堿基組成。
含有本發(fā)明啟動子的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
擴(kuò)增rcsP中任一片段的引物對也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種轉(zhuǎn)基因水稻的篩選方法。
本發(fā)明所提供的轉(zhuǎn)基因水稻的篩選方法，是構(gòu)建含有權(quán)利要求1所述的水稻愈傷組織特異性啟動子、篩選基因和目標(biāo)基因的植物表達(dá)載體，所述篩選基因位于水稻愈傷組織特異性啟動子的下游；利用所述植物表達(dá)載體對受體水稻的外植體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并形成愈傷組織；利用篩選基因?qū)τ鷤M織進(jìn)行篩選，自經(jīng)篩選得到的轉(zhuǎn)基因愈傷組織誘導(dǎo)分化出轉(zhuǎn)基因水稻。
用于構(gòu)建所述植物表達(dá)載體的出發(fā)載體可為任意一種雙元農(nóng)桿菌載體或可用于植物微彈轟擊的載體等，如pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300或pBI121等。
所述篩選基因?yàn)榭稍谥参镏斜磉_(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。
攜帶有本發(fā)明水稻愈傷組織特異性啟動子和篩選基因的植物表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化水稻細(xì)胞或組織。
本發(fā)明提供了一個(gè)水稻愈傷組織特異性啟動子rcsP，該啟動子在水稻愈傷組織中特異表達(dá)，可通過該啟動子控制篩選標(biāo)記基因在正常水稻植株中表達(dá)的方法對轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行篩選，用該方法篩選轉(zhuǎn)基因水稻具有周期短、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，而且由于篩選基因只會在愈傷組織階段表達(dá)，在以后的轉(zhuǎn)基因植株中不會表達(dá)，可以從根本上解決生物安全方面的問題，具有較大的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。


圖1為S126在水稻不同組織器官中表達(dá)情況的RT-PCR檢測結(jié)果圖2為pFGH-rcspT-DNA的部分物理圖譜圖3為pFGH-rcsp轉(zhuǎn)基因水稻的RT-PCR檢測結(jié)果圖4為pFGH-rcsp轉(zhuǎn)基因植物的GUS染色結(jié)果圖5為pCAMBIA1301-RCSP-hpt和pCAMBIA1301-RCSP-bar載體構(gòu)建過程的示意6為篩選劑對pCambia1301-RCS-hpt和pCambia1301-RCS-bar轉(zhuǎn)基因水稻愈傷組織的篩選結(jié)果圖7A為潮霉素對pCambia1301-RCS-hpt轉(zhuǎn)基因水稻的篩選結(jié)果圖7B為PPT對pCambia1301-RCS-bar轉(zhuǎn)基因水稻的篩選結(jié)果
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所用引物均由北京賽百勝生物技術(shù)公司合成，測序由上海博亞生物技術(shù)有限公司完成，PCR試劑盒和載體構(gòu)建過程中的核酸內(nèi)切酶均購自于自寶生物工程有限公司，連接試劑盒購自Invitrogen公司，方法均參照試劑盒說明書進(jìn)行。
實(shí)施例1、水稻愈傷組織特異性啟動子rcsP的分離及鑒定一、水稻愈傷組織特異性表達(dá)的基因S126的獲得對142個(gè)水稻轉(zhuǎn)錄因子在水稻幼苗的葉、成苗的葉、水稻的根、花、種子、正在萌發(fā)的胚及水稻愈傷組織共7種組織、器官中的表達(dá)情況進(jìn)行RT-PCR檢測，以Actin為參照，結(jié)果獲得了一個(gè)在水稻愈傷組織中特異性表達(dá)的基因，將其命名為S126(NCBI核酸序列號為AK106306)，如圖1所示(泳道1為幼苗的葉，泳道2為成苗的葉，泳道3為根，泳道4為花，泳道5為種子，泳道6為正在萌發(fā)的胚，泳道7為水稻愈傷組織)，擴(kuò)增S126的引物序列如下引物1(上游引物)5’-CACCAAGGATGGACAGACAAGGAAGGGA-3’引物2(下游引物)5’-TGCCAGCAACCCTGCCAATCCGAG-3’在NCBI網(wǎng)站上將其ORF區(qū)進(jìn)行blastX的同源性比較，結(jié)果S126與擬南芥的胚珠發(fā)育相關(guān)基因(ovule development protein aintegumenta，ANT)具有較高的同源性，同源性可達(dá)90％以上，但在水稻的花器官中未檢測到S126的表達(dá)，推測S126只在水稻的愈傷組織中表達(dá)。
二、水稻愈傷組織特異性啟動子rcsP的分離將啟動S126表達(dá)的啟動子命名為rcsP(rice calli-specific promoter)，根據(jù)S126上游長度為1584bp的核苷酸序列設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增該片段的引物，引物序列如下引物3(上游引物)5’-CACCGTCTCTGTAGATTTCTGTCCCATCCGCC-3’引物4(下游引物)5’-TCTCGTGCCGTTCTTGCGTTGCTCTCTC-3’提取水稻愈傷組織的基因組DNA并以此為模板，在引物3和引物4的引導(dǎo)下，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為10X Pyrobest Buffer5ul；10mM dNTP2ul；10uM引物32ul；10uM引物42ul；水稻愈傷組織的基因組DNA 10pg；Pyrobest DNA Polymerase(5U/ul)0.25ul；
ddH2O37.5ul。
PCR反應(yīng)條件為 最后72℃，10分鐘。
反應(yīng)結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收并純化約1584bp的目的片段，利用pENTR.Directional TOPOCloning試劑盒將其克隆到載體pENTR/D-TOPO(Invitrogen公司)(方法見pENTR.Directional TOPOCloning試劑盒說明書)中，PCR篩選陽性克隆，進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明rcsP具有序列表中SEQ ID №1的DNA序列，序列表中的SEQ ID №1由1584個(gè)堿基組成，將含有rcsP DNA序列的重組質(zhì)粒載體命名為pENTR-RSCP。
三、水稻愈傷組織特異性啟動子rcsP的鑒定用于檢測潮霉素抗性基因的引物序列引物5(上游引物)5’-CTTGTTCGGTCGGCATCTAC-3’引物6(下游引物)5’-GCTTGTATGGAGCAGCAGAC-3’；用于檢測GUS基因的引物序列引物7(上游引物)5’-GCAAAGTGTGGGTCAATAAT-3’引物8(下游引物)5’-TGACGCACAGTTCATAGAGA-3’利用LR Reaction Kit(Invitrogen公司)通過LR交換反應(yīng)，將rcsP DNA序列從重組質(zhì)粒載體pENTR-RSCP上交換至雙元載體pFGH(Invitrogen公司)中，得到含有rcsP的重組表達(dá)載體，命名為pFGH-rcsp，其T-DNA的部分物理圖譜如圖2所示(LB和RB分別為T-DNA的左臂和右臂；hpt潮霉素抗性基因，在該基因上游有一nos啟動子；RCSP啟動子rcsP；gusglucoronidase基因，即GUS報(bào)告基因；nos終止子)，在其下游是GUS報(bào)告基因。然后通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將pFGH-rcsp轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織，使pFGH-rcsp的T-DNA區(qū)整合在水稻基因組中。以轉(zhuǎn)基因水稻的總RNA為模板，在引物5和引物6的引導(dǎo)下，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，檢測到潮霉素抗性基因的表達(dá)，同時(shí)用引物7和引物8進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，沒有檢測到GUS基因的表達(dá)，上述潮霉素抗性基因和GUS報(bào)告基因的RT-PCR檢測結(jié)果如圖3所示(hpt潮霉素抗性基因擴(kuò)增條帶，330bp；actin水稻actin基因擴(kuò)增條帶，250bp；gusgus基因擴(kuò)增條帶，480bp；泳道ck+將pFGH-rcsp中的rcsp啟動子換為花椰菜病毒(CAMV)35S啟動子的陽性對照；泳道ck-野生型水稻；泳道1、2、3、4分別為獨(dú)立來源的pFGH-rcsp轉(zhuǎn)基因水稻)。對陽性轉(zhuǎn)化植株用30mg/L潮酶素進(jìn)行抗性篩選，結(jié)果轉(zhuǎn)基因植株具有潮酶素抗性，再次證明潮霉素抗性基因獲得表達(dá)。為進(jìn)一步驗(yàn)證rcsP在水稻愈傷組織中特異性表達(dá)，對轉(zhuǎn)基因水稻的葉、根、莖、節(jié)間、不同發(fā)育時(shí)期的花以及T1代種子誘導(dǎo)的愈傷組織進(jìn)行GUS染色，染色結(jié)果如圖4所示(AT0代轉(zhuǎn)基因愈傷組織和T0帶的葉和根；B為葉和不同發(fā)育時(shí)期的花；C為剖開的帶有節(jié)間的莖；D為T1代種子誘導(dǎo)的愈傷組織)，在轉(zhuǎn)基因植株的正常器官中都沒有檢測到GUS基因的表達(dá)，而在誘導(dǎo)的愈傷組織中檢測到GUS基因的表達(dá)，從而證明rcsP僅在水稻愈傷組織中特異性表達(dá)。
實(shí)施例2、利用水稻愈傷組織特異性啟動子rcsP控制篩選標(biāo)記基因的表達(dá)一、含水稻愈傷組織特異性啟動子rcsP和抗性篩選標(biāo)記基因的重組載體pCAMBIA1301-RCSP-hpt和pCAMBIA1301-RCSP-bar的構(gòu)建(見圖5)參見圖5(LB和RB分別為T-DNA的左臂和右臂；RCSP啟動子rcsP；hpt潮霉素抗性基因；barPPT抗性基因；attL1和attL2pENTR載體上LR反應(yīng)的交換臂；P35S花椰菜病毒35S啟動子；T35花椰菜病毒35S終止子)構(gòu)建含水稻愈傷組織特異性啟動子rcsP和不同抗性篩選標(biāo)記基因的重組載體pCAMBIA1301-RCSP-hpt和pCAMBIA1301-RCSP-bar，具體過程如下1、基因擴(kuò)增和中間載體構(gòu)建擴(kuò)增rcsP的引物引物9(上游引物)5’-CACCAACTGCAGAACCAAGTCTCTGTAGATTTCTGTCCCATCCGCC-3’引物10(下游引物)5’-CCGCTCGAGCGGCGGAATTCCGTCTCGTGCCGTTCTTGCGTTGCTCTCTC-3’；擴(kuò)增hpt基因的引物引物11(上游引物)5’-CACCGGAATTCCGTATGAAAAAGCCTGAACTCACC-3’引物12(下游引物)5’-TCCCTTATCTGGGAACTACTCA-3’；擴(kuò)增bar基因的引物引物13(上游引物)5’-CGGAATTCCGTCGAGGGGGATCTACCATGAGC-3’引物14(下游引物)5’-CCGCTCGAGCGGATCTGCTTGACTCTAGGGGTC-3’利用引物9和引物10以pENTR-RSCP為模板擴(kuò)增rcsP，利用引物11和引物12以載體pCambia1301(CAMBIA公司)為模板擴(kuò)增hpt基因，利用引物13和引物14以載體pBOS(Invitrogen公司)為模板擴(kuò)增bar基因，然后分別克隆到載體pENTR/D-TOPO中，得到含有rcsP的重組載體pENTR-RSCP-PXE、含有hpt基因的重組載體pENTR-hpt和含有bar基因的重組載體pENTR-bar。
2、pCAMBIA1301-RCSP-hpt和pCAMBIA1301-RCSP-bar載體的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶Pst I和Xho I分別酶切載體pCambia1301和pENTR-RSCP-PXE，把pCambia1301上的植物抗性hpt基因和上游CaMV35S的啟動子切下，再連接上pENTR-RSCP-PXE中的RSCP啟動子，得到一重組載體，命名為pCAMBIA1301-RCSP。
用限制性內(nèi)切酶Xho I和EcoR I分別酶切載體pCAMBIA1301-RCSP、pENTR-hpt和pENTR-bar，回收pCAMBIA1301-RCSP的11283bp載體片段，pENTR-hpt的1069bp的hpt基因片段和pENTR-bar的591bp的bar基因片段，然后利用Invitrogen公司的連接試劑盒將hpt基因片段和bar基因片段分別與pCAMBIA1301-RCSP的載體片段連接，得到最終載體pCAMBIA1301-RCSP-hpt和pCAMBIA1301-RCSP-bar，載體pCAMBIA1301-RCSP-hpt和pCAMBIA1301-RCSP-bar均含有在植物中呈組成型表達(dá)的GUS報(bào)告基因，可在轉(zhuǎn)基因植物中，僅通過GUS染色的方法就可以檢測插入基因在所插入位置的表達(dá)情況。
二、pCAMBIA1301-RCSP-hpt和pCAMBIA1301-RCSP-bar轉(zhuǎn)基因水稻愈傷組織的篩選將上述構(gòu)建的重組載體pCAMBIA1301-RCSP-hpt和pCAMBIA1301-RCSP-bar分別轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織，然后分別用含有50mg/L潮霉素的N6D培養(yǎng)基(培養(yǎng)基配方見Hiei Y，et al.Plant J，1994，(62)271-282)和含30mg/L ppt的N6D培養(yǎng)基對轉(zhuǎn)基因愈傷組織進(jìn)行抗性篩選，篩選結(jié)果如圖6所示(A潮霉素對pCAMBIA1301-RCSP-hpt轉(zhuǎn)基因愈傷組織及其陽性對照和陰性對照的篩選，左、中、右分別為pCAMBIA1301-RCSP-hpt轉(zhuǎn)基因愈傷組織及其陽性對照和陰性對照。BPPT對pCAMBIA1301-RCSP-bar轉(zhuǎn)基因愈傷組織及其陽性對照和陰性對照的篩選，左、中、右分別為陽性對照、pCAMBIA1301-RCSP-bar轉(zhuǎn)基因愈傷組織及其陰性對照)，結(jié)果陽性對照和相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因愈傷組織在篩選培養(yǎng)基中能夠正常生長，而陰性對照褐變或生長受到抑制，證明rcsP啟動子可以在愈傷組織階段驅(qū)動篩選標(biāo)記基因表達(dá)，來進(jìn)行轉(zhuǎn)基因篩選。
三、pCAMBIA1301-RCSP-hpt和pCAMBIA1301-RCSP-bar轉(zhuǎn)基因植株的篩選對得到的9株pCAMBIA1301-RCSP-hpt轉(zhuǎn)化植株和10株pCAMBIA1301-RCSP-bar轉(zhuǎn)化植株的葉進(jìn)行GUS染色，結(jié)果都呈陽性，表明GUS基因都可以正常表達(dá)。然后分別用50mg/L的潮霉素和30mg/L的PPT篩選一個(gè)星期，潮霉素篩選結(jié)果如圖7A所示(“1”為陰性對照，“2”為pCAMBIA1301-RCSP-hpt轉(zhuǎn)基因植株，“3”為陽性對照)，用潮霉素篩選的9棵pCAMBIA1301-RCSP-hpt轉(zhuǎn)基因植株和相應(yīng)的陰性對照全部死亡，陽性對照生長良好。PPT篩選結(jié)果如圖7B所示(“1”為陰性對照，“2”為pCAMBIA1301-RCSP-bar轉(zhuǎn)基因植株，“3”為陽性對照)，在PPT篩選的10棵pCAMBIA1301-RCSP-bar轉(zhuǎn)基因植株中，PA、PD、PF和PG的pCAMBIA1301-RCSP-bar轉(zhuǎn)基因植株和同一瓶中陰性對照全被篩死，陽性對照生長，PB和PC陰性對照被篩死，而相應(yīng)的同一瓶中pCAMBIA1301-RCSP-bar轉(zhuǎn)基因植株沒有被篩死，其它4棵pCAMBIA1301-RCSP-bar轉(zhuǎn)基因植株和相應(yīng)的陰性對照都沒有被篩死，所有的陽性對照都生長良好，原因可能是PPT的篩選強(qiáng)度沒有潮霉素的篩選強(qiáng)度大，在PPT篩選下那些生長狀態(tài)良好的植株生存下來，而生長狀態(tài)不好的植株被篩死。上述轉(zhuǎn)基因植株的篩選結(jié)果證明啟動子rcsP在水稻愈傷組織中可以有效地啟動篩選標(biāo)記基因的表達(dá)，而在正常植株中不表達(dá)篩選標(biāo)記基因。
序列表<160>1<210>1<211>1584<212>DNA<213>稻屬水稻(Oryza sativa L.ssp.japonica)<400>1gtctctgtag atttctgtcc catccgccac agacacactg ttggcacact gcttctctgc 60cgtcatagcc agatccacgt tccaaaccgg cccttcaccc ccgaacaaca acaggaggtc 120tggtgacatc gaatcacaaa acaatttctt cttcttctct ctctctcttt tgaaaattca 180caacaatttc ttcaatattg aatactccta ctactactcc tactgcattg cagtgaattt 240tagtatattc agatcaagaa gcacactttc agggagaaag aagaagacaa atgctgtttc 300ctctttatgg caattgcgtg cactgatttc cctcctaaat tttaagcgat ccgtatggaa 360tcagaatgtt tggcttgggc aaaagtgaag ccgggctggc ttttatcatg ccagtgggtg 420actttggggc cctttcctca tcattcctgg aacatatgtg aaggctggct accaaagacc 480cacacaaacg cacagcacag gcattctttg tctgcatggc tgccttgcgc tgtgcttctt 540tgaccaaact ccaagccaaa aacaaacgca cacagcacac tagtgtataa tactagtagt 600aataccttga caaagcacaa gtgtttatta catgcatgcc ttgttcatcc ggttgatcag 660aggtgaagcg cgattaacta atgcacgtat caaccgccgc taatacgtgc caatcttgct 720ctttttgagc tttctagaac acgtccaagt tgagcattgt ttcagtgaag cagtgtgcta 780aattgaatag cagtactccg gttaagataa ttaataggcg ggcttgattc gttcgttcgc 840tcgcgggctt tgctcgcatt tgcgacacaa gcagtgcagc ccagctaagc tagctgttac 900tgttgcgaag tgactggctc cttgtacagt tgtcctgccg tttcaatctc tgttagatac 960actctcccct tgtctctctc tctctctctc tctttctctc tccaatgtcc atgaagtctg 1020tggcaaaagc agccttcttt cagccactct gggcagcatc cagctacatc gtctaggcag 1080cagtagcata tggtggaaca gagagaggaa gtcctggcca tcctgtccaa tggcaacttc 1140acaattaaat tcttgcatct ttatgggggt gcttgtttgt gcttgtgtgc tttgaacagc 1200atggtgctta attgcctcga taagaaaagg agagggggtt aagcagctag gagtaccagt 1260ggtgttcgtg gcttcatgtc atgcaagaga gctcagctca cagatcccta tggagtggat 1320
agctatcgtg ggagaggcca agaacaaact gctctagatt ttgtatcgta tcctcgcgtt1380gcattacggc tactactgct gctgctgcta cttatccacc gcttttttgc tttggccctc1440tcattccttt tgcagttttt ttctgctcag ctcaccgggt cccctctctc atcttcctcg1500tcgtgcacct tgcatggatg tagaagtagc gagctagcgc gcggcgactg cgagccgaga1560gagcaacgca agaacggcac gaga 158權(quán)利要求
1.水稻愈傷組織特異性啟動子，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻愈傷組織特異性啟動子，其特征在于所述啟動子具有序列表中SEQ ID №1的DNA序列。
3.含有權(quán)利要求1所述啟動子的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和宿主菌。
4.一種培育轉(zhuǎn)基因水稻的方法，是構(gòu)建含有權(quán)利要求1所述的水稻愈傷組織特異性啟動子、篩選基因和目標(biāo)基因的植物表達(dá)載體，所述篩選基因位于水稻愈傷組織特異性啟動子的下游；利用所述植物表達(dá)載體對受體水稻的外植體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并形成愈傷組織；利用篩選基因?qū)τ鷤M織進(jìn)行篩選，自經(jīng)篩選得到的轉(zhuǎn)基因愈傷組織誘導(dǎo)分化出轉(zhuǎn)基因水稻。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于；用于構(gòu)建所述植物表達(dá)載體的出發(fā)載體為pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300或pBI121。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于；所述篩選基因?yàn)樵谥参镏斜磉_(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因、具有抗性的抗生素標(biāo)記物或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于；所述篩選基因?yàn)镚US基因、螢光素酶基因、慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物或抗除莠劑基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了一個(gè)水稻愈傷組織特異性啟動子及其應(yīng)用。其目的是提供一個(gè)水稻愈傷組織特異性啟動子及其在調(diào)控篩選基因在植物中表達(dá)中的應(yīng)用。該啟動子是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。可通過該啟動子控制篩選標(biāo)記基因在正常水稻植株中表達(dá)的方法對轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行篩選，用該方法篩選轉(zhuǎn)基因水稻具有周期短、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，并可解決生物安全方面的問題。本發(fā)明具有較大的實(shí)際意義。
文檔編號C12N15/65GK1834245SQ20061007293
公開日2006年9月20日 申請日期2006年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月6日
發(fā)明者翟晨光, 夏勉, 王喜萍, 吳艷斌, 曹小近, 謝秀娟 申請人:北京未名凱拓農(nóng)業(yè)生物技術(shù)有限公司