專利名稱：一種檢測(cè)細(xì)胞色素p450酶系突變位點(diǎn)的寡核苷酸探針及基因芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于DNA基因型的核酸檢測(cè)技術(shù)范疇。具體的說(shuō)，本發(fā)明涉及一套能夠檢測(cè)人體肝細(xì)胞色素CYP450酶系統(tǒng)中的亞型酶CYP1A2*1F、CYP1A2*1C、CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2D6*10、CYP2D6*2和CYP3A4*18的代表性突變位點(diǎn)基因型的寡核苷酸探針，該套探針的序列及用途。
背景技術(shù)：
細(xì)胞色素P450廣泛存在于動(dòng)物、真核有機(jī)體、植物、真菌和細(xì)菌中，是必不可少的結(jié)構(gòu)酶。細(xì)胞色素P450參與藥物在肝內(nèi)降解的第I相反應(yīng)。據(jù)估計(jì)，60％普通處方藥需要通過(guò)細(xì)胞色素P450系統(tǒng)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。細(xì)胞色素P450超家族依次可分為家族、亞家族和亞型。人類已確定357個(gè)細(xì)胞色素P450基因和33個(gè)假基因，分為18個(gè)家族，42個(gè)亞家族，各基因尚存在著大量等位基因，調(diào)控180多個(gè)人類細(xì)胞色素P450亞型蛋白質(zhì)。大量等位基因的存在是細(xì)胞色素P450引起藥物氧化代謝個(gè)體差異和種族差異的生化基礎(chǔ)。細(xì)胞色素P450系統(tǒng)廣泛分布于肝、腎、腦、皮膚、肺、胃腸道、胎盤組織，腎上腺、主動(dòng)脈等處組織，細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，線粒體和核膜內(nèi)均有細(xì)胞色素P450表達(dá)。細(xì)胞色素P450催化反應(yīng)可發(fā)生在體內(nèi)不同的組織器官，但最重要的器官是肝臟。細(xì)胞色素催化體內(nèi)多種反應(yīng)，包括氧化N還原作用，環(huán)氧化作用，UN脫羥基作用，VN脫羥基作用，WN氧化和羥基化作用。細(xì)胞色素P450可代謝大約25萬(wàn)種外源性物質(zhì)，包括藥物，環(huán)境中的化合物和污染物，自然界中植物產(chǎn)物，殺蟲劑，鹵化烴，多環(huán)芳香烴、芳基胺、燃燒的成分，除草劑等。
目前，困擾臨床醫(yī)療及制藥行業(yè)最常見的問(wèn)題是不同病人對(duì)同一藥物的反應(yīng)不同，表現(xiàn)為不同的藥物療效和毒副作用。1998年的一項(xiàng)統(tǒng)計(jì)表明美國(guó)醫(yī)院中每年有10萬(wàn)病人因?yàn)樗幬锏亩靖弊饔枚劳觯敲绹?guó)人身死亡的第四大原因(Lazarou，1998)。1995年的一份評(píng)估顯示，1994年全美國(guó)由于不合適的藥物處方使用帶來(lái)的健康護(hù)理系統(tǒng)上的額外花銷和浪費(fèi)竟比這些藥物本身的價(jià)值還要高出36億美元(Johnson，1995)。另外，在新藥研發(fā)過(guò)程中，相當(dāng)一部分具有良好藥理活性的藥物因在三期臨床實(shí)驗(yàn)中少數(shù)個(gè)體嚴(yán)重的毒副作用而被剔除，造成前期巨大投入的浪費(fèi)和新藥研制成本居高不下。研究表明，臨床藥物治療產(chǎn)生的藥物不良反應(yīng)的產(chǎn)生主要分為兩大類，一類是由于P450代謝酶與藥物的相互作用引起的，最常見的是P450的誘導(dǎo)和抑制；另一類是由P450酶基因多態(tài)性引起的，造成酶代謝功能的變化，而且這種變化存在顯著的患者之間的個(gè)體差異。因此，藥物代謝酶基因多態(tài)性與藥物反應(yīng)個(gè)體差異之間的相關(guān)性研究是藥物基因組學(xué)研究中的重要組成部分，也是目前研究比較深入的領(lǐng)域。從理論上講，所有的藥物代謝酶都具有遺傳多態(tài)性。絕大多數(shù)藥物代謝酶的多態(tài)性是一種單基因性狀，是由于同一基因位點(diǎn)上具有多個(gè)等位基因引起的。等位基因所編碼的代謝酶具有不同的代謝能力正常野生型表現(xiàn)為快代謝型(EM，extensive metabolism)；絕大多數(shù)突變型等位基因，因堿基的突變、插入或缺失而造成酶代謝能力降低，表現(xiàn)為慢代謝型(PM，poormetabolism)；極少數(shù)突變型因基因多拷貝重復(fù)造成酶的過(guò)量表達(dá)，表現(xiàn)為超快代謝型(UM，ultrarapid metabolism)。這種多態(tài)性造成了不同個(gè)體間藥物代謝反應(yīng)的差異，是產(chǎn)生藥物毒副作用、降低或喪失藥物療效的主要原因之一。
通過(guò)對(duì)受試者的基因型分子診斷來(lái)實(shí)現(xiàn)臨床個(gè)體化醫(yī)療，需要對(duì)個(gè)體基因型進(jìn)行檢測(cè)，而基因分型技術(shù)作為目前常用的基因分型方法，大致可分為兩類一類是基于凝膠電泳的技術(shù)，如PCR反應(yīng)結(jié)合限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(RFLP)，多重PCR，等位基因特異性擴(kuò)增(AS-PCR)等?；跇?gòu)象的SNP檢測(cè)方法相對(duì)簡(jiǎn)單快速，但是不能給出序列信息，因而無(wú)法確定具體突變位點(diǎn)與突變形式，不能區(qū)分一個(gè)片段中的多個(gè)突變，而且對(duì)操作者技術(shù)要求較高，難以推廣；另一類是基于熒光標(biāo)記雜交反應(yīng)的基因分型技術(shù)，包括寡核苷酸連接分析，焦磷酸法DNA測(cè)序，直接雜合子測(cè)序以及等位基因特異性引物延伸等。這類方法需要投入大量的資金用與購(gòu)置專用儀器和探針等配套試劑，只有實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)，降低使用成本，才能得到廣泛運(yùn)用。
DNA芯片(DNA microarrays)是近年來(lái)發(fā)展成熟的一種高通量基因檢測(cè)技術(shù)，是分子生物學(xué)發(fā)展史上的又一重大技術(shù)突破，其特點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)操作和數(shù)據(jù)處理的集成化、微型化、自動(dòng)化。DNA芯片能夠進(jìn)行快速多基因平行檢測(cè)，是一種發(fā)展前景廣闊的多基因大規(guī)模檢測(cè)新技術(shù)。DNA芯片技術(shù)檢測(cè)的關(guān)鍵之處在于設(shè)計(jì)、篩選一系列高特異性、高靈敏度、高穩(wěn)定性的匹配探針，固定于玻璃片等固相載體上，利用樣品與探針的雜交反應(yīng)，經(jīng)掃描、分析后即可得出正確的結(jié)果。就本實(shí)驗(yàn)而言，通過(guò)一次簡(jiǎn)單操作就可確定多個(gè)受試個(gè)體DNA樣本中多個(gè)位點(diǎn)的基因型，極大地提高了檢測(cè)效率，為臨床基因診斷及個(gè)體化醫(yī)療提供了簡(jiǎn)便、快捷的技術(shù)手段。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一套用于檢測(cè)常見CYP450代謝酶基因熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的寡核苷酸探針，包含以下各組探針的組合1.CYP1A2*1F DNA-163G＞A位點(diǎn)檢測(cè)探針2.CYP1A2*1C DNA-3860A＞C位點(diǎn)檢測(cè)探針
3.CYP2C9*3DNA1075A＞C位點(diǎn)檢測(cè)探針4.CYP2C19*2DNA681G＞A位點(diǎn)檢測(cè)探針5.CYP2C19*3DNA991G＞A位點(diǎn)檢測(cè)探針6.CYP2D6*10DNA188C＞T位點(diǎn)檢測(cè)探針7.CYP2D6*2DNA4268G＞C位點(diǎn)檢測(cè)探針8.CYP3A4*18DNA878T＞C位點(diǎn)檢測(cè)探針本發(fā)明還提供了各部分探針的核苷酸序列，并對(duì)其長(zhǎng)度進(jìn)行了優(yōu)化，以提高探針的檢測(cè)特異性和靈敏度，詳見表1-1。
利用上述寡核苷酸探針，可通過(guò)核酸雜交反應(yīng)對(duì)人體基因組DNA樣本進(jìn)行檢測(cè)，尤其適用于基于基因芯片技術(shù)的檢測(cè)。利用探針可同時(shí)檢測(cè)出純合野生型、純合突變型和雜合突變型三種基因型位點(diǎn)的DNA片段，從而直接判斷得到分型結(jié)果。
另一方面，本發(fā)明還提供了用于檢測(cè)細(xì)胞色素P450酶系突變位點(diǎn)的基因芯片，包括固定在固相載體上的與檢測(cè)位點(diǎn)DNA正鏈的堿基序列一致的寡核苷酸片段，其中特征片段相應(yīng)于SEQ ID NO1～16的序列。
本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)細(xì)胞色素P450酶系突變位點(diǎn)的方法，包括如下步驟(1)選用前述的基因芯片；(2)標(biāo)記特異性引物，擴(kuò)增待測(cè)DNA樣品；(3)在適于與所選基因芯片進(jìn)行雜交的條件下，加入待測(cè)樣品的PCR產(chǎn)物并反應(yīng)足夠時(shí)間；(4)掃描分析雜交反應(yīng)結(jié)果。
具體的說(shuō)，本發(fā)明內(nèi)容是這樣實(shí)現(xiàn)的首先在NCBI的核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中查找選取的CYP450酶各亞型酶基因組DNA的全序列，下載序列文檔，利用分子生物學(xué)軟件Primer5.0在選取位點(diǎn)上下游各15個(gè)堿基范圍內(nèi)尋找特異性的探針，在包含檢測(cè)位點(diǎn)的一定范圍內(nèi)設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物，將特異性擴(kuò)增DNA片段長(zhǎng)度限制在150-250堿基之間。共設(shè)計(jì)8對(duì)16條寡核苷酸探針。寡核苷酸探針序列與上述基因特定區(qū)域DNA正鏈的堿基序列一致(探針序列見表1-1)。
利用上述的一套探針，可以通過(guò)雜交反應(yīng)對(duì)人體基因組DNA樣本進(jìn)行檢測(cè)，尤其適用于基于DNA芯片原理的檢測(cè)，具有較高的靈敏度和特異性。在進(jìn)行基于DNA芯片原理的檢測(cè)時(shí)，需要把探針全部或其中一部分用適當(dāng)?shù)姆椒ü潭ㄓ诠滔噍d體上(如玻璃片、硅基片、聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜等)，成為M×N排布的探針陣列，即為DNA芯片。然后利用優(yōu)化的相應(yīng)的PCR引物擴(kuò)增待檢人體基因組DNA樣本，選擇引物的要求是能夠擴(kuò)增出基因組DNA標(biāo)本的包含探針?biāo)趨^(qū)域的片段。在擴(kuò)增的同時(shí)引入熒光標(biāo)記、生物素標(biāo)記或其他合適的標(biāo)記物。擴(kuò)增產(chǎn)物作為探針檢測(cè)的靶分子，在一定條件下與芯片共保溫30分鐘至數(shù)小時(shí)，利用熒光掃描儀或其他相應(yīng)的檢測(cè)設(shè)備即可以檢測(cè)到雜交信號(hào)。根據(jù)待測(cè)位點(diǎn)探針信號(hào)的比值可以判定出該位點(diǎn)的基因型。
本發(fā)明提供的探針能夠快速、準(zhǔn)確、高效地檢測(cè)出人體基因組DNA樣本中各待測(cè)位點(diǎn)的基因型。本發(fā)明提供的基因芯片與檢測(cè)方法可以廣泛用于臨床個(gè)體DNA基因型診斷，在對(duì)預(yù)防臨床用藥導(dǎo)致的毒副作用、指導(dǎo)醫(yī)生臨床合理治療、建立高效的個(gè)體化醫(yī)療體系、開展CYP450遺傳學(xué)調(diào)查等方面具有顯著的實(shí)用價(jià)值。
圖1為CYP450基因八個(gè)PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果。從右至左依次為DL2000Marker；1.CYP1A2*1F；2.CYP1A2*1C；3.CYP2C9*3；4.CYP2C19*2；5.CYP2C19*3；6.CYP2D6*10；7.CYP2D6*2；8.CYP3A4*18。
圖2為八個(gè)位點(diǎn)二重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果。從右至左依次為DL2000Marker；5/8.CYP2C19*3和CYP3A4*18；3/7.CYP2C9*3和CYP2D6*2；2/4.CYP1A2*1C和CYP2C19*2；1/6.CYP1A2*1F和CYP2D6*10。
圖3為CYP450酶熱點(diǎn)SNP位點(diǎn)檢測(cè)基因芯片探針排列數(shù)字1-10分別表示一張芯片可同時(shí)檢測(cè)10個(gè)標(biāo)本；右圖為探針矩陣放大效果圖；箭頭下表中，W表示野生型探針，M表示突變型探針，字母右側(cè)的數(shù)字1-8依次表示1.CYP1A2*1F；2.CYP1A2*1C；3.CYP2C9*3；4.CYP2C19*2；5.CYP2C19*3；6.CYP2D6*10；7.CYP2D6*2；8.CYP3A4*18。
圖4為基因芯片與野生型和突變型重組質(zhì)粒的熒光標(biāo)記PCR產(chǎn)物雜交掃描結(jié)果(左側(cè)為野生型質(zhì)粒，右側(cè)為突變型質(zhì)粒)，雜交圖均系二重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物雜交結(jié)果。
圖5為基因芯片與四個(gè)不同臨床DNA樣本的熒光標(biāo)記PCR產(chǎn)物雜交掃描結(jié)果，雜交圖均系二重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物雜交結(jié)果。
具體實(shí)施例方式為了進(jìn)一步說(shuō)明一套用于同時(shí)檢測(cè)上述CYP450各亞型酶八個(gè)位點(diǎn)寡核苷酸探針的實(shí)施方式和用途，參照以下實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明。實(shí)施例是為了解釋而不是以任何方式限制本發(fā)明的范圍，本領(lǐng)域技術(shù)人員在權(quán)利要求的范圍內(nèi)所做出的某些改變和調(diào)整也應(yīng)認(rèn)為屬于本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1.檢測(cè)CYP450八個(gè)SNP位點(diǎn)的寡核苷酸探針的篩選和優(yōu)化
1.寡核苷酸基因芯片的制備和寡核苷酸探針的設(shè)計(jì)和篩選優(yōu)化探針?lè)謩e設(shè)計(jì)在人體CYP450酶系統(tǒng)各亞型酶DNA序列上，具有較高的靈敏度和特異性，寡核苷酸探針序列與上述基因特定區(qū)域DNA正鏈的堿基序列一致。探針合成時(shí)在其3’端氨基修飾，用于探針與載玻片表面的活性醛基發(fā)生反應(yīng)并固定到載體表面。將備選寡核苷酸探針純化、定量后，用基因芯片點(diǎn)樣儀點(diǎn)到醛基活化的載玻片上，制成探針微陣列。
以基因組DNA為模板的PCR產(chǎn)物經(jīng)試劑盒純化后，用T4DNA連接酶連接至PGEMT4-載體上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌dH5α。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證重組質(zhì)粒為野生型后，再以野生型重組質(zhì)粒為模板，采用突變引物構(gòu)建特定位點(diǎn)引入突變堿基的目的片段，經(jīng)過(guò)純化，連接轉(zhuǎn)化，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證獲得突變型重組質(zhì)粒。以重組質(zhì)粒作模板進(jìn)行特異性擴(kuò)增，用熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物與基因芯片雜交，得到各探針的雜交圖(優(yōu)化的質(zhì)粒雜交見附圖4)。針對(duì)不同的基因片段，根據(jù)芯片雜交結(jié)果選擇各自特異性好，靈敏度高的探針。探針長(zhǎng)度在15-18堿基之間。(探針序列見表1-1)表1-1檢測(cè)CYP450八個(gè)SNP位點(diǎn)的寡核苷酸探針備選序列
2.擴(kuò)增含有靶基因片斷的PCR引物的設(shè)計(jì)和優(yōu)化根據(jù)CYP450各亞型酶DNA全基因序列設(shè)計(jì)引物，引物序列見表1-2。利用引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物序列中包含各靶基因片段上的探針序列。所有反向引物序列5’端用熒光素Cy3標(biāo)記，以保證PCR產(chǎn)物經(jīng)雜交反應(yīng)后，帶有熒光的反向互補(bǔ)鏈與核苷酸探針結(jié)合產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)。分別對(duì)八對(duì)引物進(jìn)行四套二重PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化(優(yōu)化的PCR反應(yīng)電泳檢測(cè)結(jié)果見附圖2)。
表1-2用于擴(kuò)增含有探針序列靶基因片段的引物序列
實(shí)施例2.寡核苷酸探針的特異性和靈敏度評(píng)價(jià)1.基因芯片制備 將寡核苷酸探針用點(diǎn)樣液(6×SSC，0.1％SDS)稀釋至終濃度50μmol/L，取5ul轉(zhuǎn)移至384孔板。用Cartesian芯片制備儀將探針點(diǎn)到醛基片上(探針排列見附圖3，芯片分別與CYP450酶基因組DNA的熒光標(biāo)記PCR產(chǎn)物雜交結(jié)果見附圖5)。
熱點(diǎn)突變位點(diǎn)CYP450寡核苷酸芯片特異性檢測(cè)在優(yōu)化好的兩套二重PCR擴(kuò)增和雜交反應(yīng)條件下，檢測(cè)了36個(gè)臨床DNA樣本，以DNA樣本為模板進(jìn)行四套二重PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物與芯片雜交。其中出現(xiàn)信號(hào)的探針均與其雜交的產(chǎn)物片段對(duì)應(yīng)，任何一個(gè)片段單獨(dú)雜交時(shí)該位點(diǎn)探針以外的探針不出現(xiàn)信號(hào)。這說(shuō)明所選取的用于檢測(cè)上述八個(gè)CYP450酶基因SNP位點(diǎn)的探針是特異的，也說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)建立在四套二重PCR基礎(chǔ)上，同時(shí)檢測(cè)CYP450酶八個(gè)SNP位點(diǎn)的基因分型芯片是可靠的。
以上實(shí)施例的技術(shù)要點(diǎn)如下1.寡核苷酸合成 寡核苷酸(引物或探針)采用標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺化學(xué)方法在自動(dòng)合成儀(ABI8909)上合成。所有熒光引物在合成中用Cy3亞磷酰化試劑在5’端進(jìn)行標(biāo)記。所有寡核苷酸探針在3′端進(jìn)行氨基修飾，氨基與探針序列之間以間隔臂(聚乙二醇磷?；噭?相連。合成完畢用濃氨水55℃作用15小時(shí)脫保護(hù)/切割，OPC柱純化。紫外定量，凍存?zhèn)溆谩?br>
2.多重PCR擴(kuò)增 20ul常規(guī)PCR反應(yīng)體系中，正、反向引物濃度均0.5μM，dNTP為100μM，1U Taq DNA聚合酶，1×PCR反應(yīng)緩沖液，50-100ng模板DNA；擴(kuò)增條件為預(yù)變性(94℃，5min)；35個(gè)循環(huán)變性(94℃，30sec)，退火(58℃，30sec)延伸(72℃，40sec)；延伸(72℃，5min)。
多重不對(duì)稱PCR反應(yīng)中，兩對(duì)引物之間濃度的改變對(duì)目的基因的擴(kuò)增效率有明顯的影響，每個(gè)基因的正向與反向熒光引物的比例和雜交信號(hào)的強(qiáng)弱密切相關(guān)。經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，使一個(gè)反應(yīng)管中兩個(gè)產(chǎn)物均能達(dá)到相近而且較好的擴(kuò)增效率和雜交信號(hào)。優(yōu)化的結(jié)果為一套二重PCR反應(yīng)中的正向引物濃度分別為0.1μM、0.1μM，反向熒光標(biāo)記引物濃度分別為0.5μM、0.5μM。20ul反應(yīng)體系中，dNTP為200μM，MgCl2為3mmol，2U TaqDNA聚合酶，1×PCR反應(yīng)緩沖液；擴(kuò)增條件為預(yù)變性(94℃，5min)；35個(gè)循環(huán)變性(94℃，30sec)，退火(58℃，30sec)延伸(72℃，40sec)；延伸(72℃，5min)。
3.熱點(diǎn)突變位點(diǎn)CYP450寡核苷酸芯片制備寡核苷酸探針用點(diǎn)樣液(6×SSC，0.1％SDS)稀釋至終濃度50μmol/L，取5ul轉(zhuǎn)移至384孔板。用Cartesian芯片制備儀將探針點(diǎn)到醛基片(Telechem)上，點(diǎn)樣儀內(nèi)保持溫度為23℃，相對(duì)濕度大于85％。寡核苷酸芯片制備完畢后，置于載玻片盒內(nèi)室溫放置備用。點(diǎn)樣后的芯片在使用前至少在室溫放置24h。
4.熱點(diǎn)突變位點(diǎn)CYP450寡核苷酸芯片雜交與檢測(cè)4.1寡核苷酸基因芯片預(yù)處理 寡核苷酸芯片用0.2％SDS清洗2次，接著以水清洗2次，晾干后用于雜交。
4.2雜交和雜交后處理 熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物變性(98℃、5min，冰浴、5min)后與雜交液(8×SSC，3％甲酰胺，0.2％SDS)混勻，取10μl轉(zhuǎn)移至芯片反應(yīng)區(qū)，芯片置于雜交盒內(nèi)，連同雜交盒浸入42℃水浴中反應(yīng)60分鐘，雜交后的芯片依次在洗液A(1×SSC，0.2％SDS)，洗液B(0.2×SSC)和洗液C(0.1×SSC)中于室溫各洗滌1min。置室溫晾干。
4.3掃描和結(jié)果判定 芯片用芯片掃描儀GenePix 4000B進(jìn)行掃描，用GenePix Pro 4.0軟件分析結(jié)果。
核苷酸序列表<110>中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所<120>一種檢測(cè)細(xì)胞色素P450酶系突變位點(diǎn)的寡核苷酸探針及基因芯片<160>16<210>1<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>1GCCTCTCGGA TTCAAG16<210>2<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>2CGCCTCTCAG ATTCAAG17<210>3<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>3TGTGGGCACA GGACG15<210>4<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>4
TGTGGGCCCA GGACG15<210>5<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>5AGAGATACAT TGACCTTC18<210>6<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>6AGAGATACCT TGACCTTC18<210>7<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>7CACCCCCTGG ATCCAG 16<210>8<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>8CACCCCCTGA ATCCAG16<210>9
<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>9TTATTTCCCG GGAACCCA18<210>10<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>10TTATTTCCCA GGAACCCA18<210>11<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>11GCACGCTACC CACCAGGC18<210>12<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>12GCACGCTACT CACCAGGC18<210>13<211>17<212>DNA<213>人工序列
<400>13CCTGGTGAGC CCATCCC17<210>14<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>14CCTGGTGACC CCATCCC17<210>15<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>15TCCGATCTGG AGCTC15<210>16<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>16TCCGATCCGG AGCTC1權(quán)利要求
1.一套檢測(cè)細(xì)胞色素P450酶系突變位點(diǎn)的寡核苷酸探針，其特征在于包含檢測(cè)以下各組基因突變位點(diǎn)的全部或部分探針的組合(1)CYP1A2*1F的DNA-163G＞A位點(diǎn)檢測(cè)探針；(2)CYP1A2*1C的DNA-3860A＞C位點(diǎn)檢測(cè)探針；(3)CYP2C9*3的DNA1075A＞C位點(diǎn)檢測(cè)探針；(4)CYP2C19*2的DNA681G＞A位點(diǎn)檢測(cè)探針；(5)CYP2C19*3的DNA991G＞A位點(diǎn)檢測(cè)探針；(6)CYP2D6*10的DNA188C＞T位點(diǎn)檢測(cè)探針；(7)CYP2D6*2的DNA4268G＞C位點(diǎn)檢測(cè)探針；(8)CYP3A4*18的DNA878T＞C位點(diǎn)檢測(cè)探針。
2.如權(quán)利要求1所述的一套寡核苷酸探針，其特征在于各組探針的核苷酸序列為探針(1)核苷酸序列為SEQ-1和SEQ-2；探針(2)核苷酸序列為SEQ-3和SEQ-4；探針(3)核苷酸序列為SEQ-5和SEQ-6；探針(4)核苷酸序列為SEQ-7和SEQ-8；探針(5)核苷酸序列為SEQ-9和SEQ-10；探針(6)核苷酸序列為SEQ-11和SEQ-12；探針(7)核苷酸序列為SEQ-13和SEQ-14；探針(8)核苷酸序列為SEQ-15和SEQ-16。
3.如權(quán)利要求1所述的一套寡核苷酸探針，其特征在于同時(shí)包含八組探針。
4.一種檢測(cè)細(xì)胞色素P450酶系突變位點(diǎn)的基因芯片，包括固定在固相載體上的與檢測(cè)位點(diǎn)DNA正鏈的堿基序列一致的寡核苷酸片段，其中特征片段相應(yīng)于SEQ IDNO1～16的序列。
5.一種檢測(cè)細(xì)胞色素P450酶系突變位點(diǎn)的方法，其特征在于包括如下步驟(1)選用權(quán)利要求4所述的基因芯片；(2)標(biāo)記特異性引物，擴(kuò)增待測(cè)DNA樣品；(3)在適于與所選基因芯片進(jìn)行雜交的條件下，加入待測(cè)樣品的PCR產(chǎn)物并反應(yīng)足夠時(shí)間；(4)掃描分析雜交反應(yīng)結(jié)果。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于步驟(2)中引物標(biāo)記采用熒光標(biāo)記或生物素標(biāo)記。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于步驟(3)所述反應(yīng)條件為42℃水浴中反應(yīng)60分鐘。
全文摘要
本發(fā)明提供了一套用于檢測(cè)CYP450酶基因熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的寡核苷酸探針及其用途，屬于臨床分子診斷領(lǐng)域。探針?lè)謩e設(shè)計(jì)在CYP450各亞型酶DNA全基因序列上，具有較高的靈敏度和特異性。本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)細(xì)胞色素P450酶系突變位點(diǎn)的基因芯片，能夠?qū)εR床DNA標(biāo)本進(jìn)行基因分型檢測(cè)，可用于多種方面，如P450基因型診斷、指導(dǎo)臨床用藥、預(yù)防藥物不良反應(yīng)等。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101054601SQ20061007259
公開日2007年10月17日 申請(qǐng)日期2006年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月13日
發(fā)明者王升啟, 文思遠(yuǎn), 許力 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所