專利名稱：一種發(fā)夾rna及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種發(fā)夾RNA及其用途，更具體地說是一種能有效抑制HER-2基因表達(dá)的發(fā)夾狀小干涉RNA及其在治療HER-2陽(yáng)性腫瘤中的用途。
背景技術(shù)：
人表皮生長(zhǎng)因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，HER-2/c-erbB-2/neu)基因位于染色體17q21，編碼產(chǎn)物是一個(gè)具有酪氨酸蛋白激酶活性的跨膜糖蛋白p185HER-2，該受體蛋白是表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)或HER家族中的一個(gè)重要成員，該家族還包括HER-1(EGFR，erbB-1)、HER-3(erbB-3)、HER-4(erbB-4)。EGFR家族成員與特定配體結(jié)合后，受體之間可以形成同源二聚體或異源二聚體，受體二聚化可誘導(dǎo)酪氨酸蛋白激酶活化，使受體C末端酪氨酸殘基發(fā)生自身磷酸化，然后激活細(xì)胞內(nèi)一系列信號(hào)傳導(dǎo)通路，刺激細(xì)胞增殖、發(fā)育、分化、遷移及腫瘤形成等。目前HER-2的配體還不清楚，但當(dāng)HER-2家族的其它成員與其相應(yīng)的配體結(jié)合后，可優(yōu)先與HER-2形成異源二聚體，并且HER-2異源二聚體更穩(wěn)定，引起的傳導(dǎo)信號(hào)更強(qiáng)。與其它HER成員不同的是，HER-2在缺乏配體激活的情況下仍可形成同源二聚體，激活其自身的酪氨酸蛋白激酶活性，進(jìn)而激活受體介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路。
在人類中，HER-2多通過野生型基因的擴(kuò)增和過表達(dá)激活。之后，通過這些信號(hào)傳導(dǎo)通路影響細(xì)胞的增殖、分化、遷移、粘附、轉(zhuǎn)化、存活和凋亡。HER-2的高表達(dá)將導(dǎo)致細(xì)胞增殖速度加快、細(xì)胞周期加速、惡性表現(xiàn)增強(qiáng)，并出現(xiàn)抗凋亡及對(duì)多種化療藥物產(chǎn)生耐藥等現(xiàn)象。HER-2在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、肺癌等多種惡性腫瘤中擴(kuò)增或過度表達(dá)，而在正常人體腔上皮、腺上皮和胚胎中的表達(dá)水平很低。約30％的乳腺癌、卵巢癌存在HER-2的過表達(dá)。HER-2的過表達(dá)與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良密切相關(guān)?；?、放療、內(nèi)分泌治療及聯(lián)合治療對(duì)HER-2過表達(dá)的乳腺癌患者無顯著療效，且預(yù)后不良。因此，抑制HER-2的過表達(dá)有望成為腫瘤治療和改善預(yù)后的有效方法。
近年來，HER-2已成為乳腺癌防治研究的熱點(diǎn)之一，被認(rèn)為是一個(gè)判斷乳腺癌預(yù)后的獨(dú)立標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。人源化單克隆抗體Herceptin(赫賽汀)是第一個(gè)針對(duì)HER-2陽(yáng)性轉(zhuǎn)移性乳腺癌的治療藥物，也是第一個(gè)靶向治療乳腺癌的生物藥物。研究表明，Herceptin單用作為HER-2過度表達(dá)的轉(zhuǎn)移性乳腺癌一線治療藥物，不僅安全有效，而且耐受性好。若與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用，則能顯著抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)，延長(zhǎng)存活期，改善患者的總體生存率。
但采用Herceptin治療HER-2過度表達(dá)的乳腺癌也存在一些問題與局限性，Herceptin的心臟毒性問題一直未得到解決。Herceptin是在蛋白水平上發(fā)揮作用，并不能從根本上抑制HER-2基因的表達(dá)。RNA干涉(RNA interference，RNAi)是通過短的雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)誘導(dǎo)靶基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptional gene sileneing，PTGS)的現(xiàn)象，是一種快速、高效的靶基因失活技術(shù)。本發(fā)明提供了一種發(fā)夾狀小分子干涉RNA(smallinterfering RNA，siRNA)，該siRNA能有效抑制腫瘤細(xì)胞中HER-2的表達(dá)，并能抑制HER-2陽(yáng)性腫瘤的生長(zhǎng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是設(shè)計(jì)一種能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞中HER-2基因表達(dá)的發(fā)夾狀小干涉RNA，利用該發(fā)夾狀小干涉RNA或其基因?qū)崿F(xiàn)對(duì)HER-2陽(yáng)性腫瘤的治療。
具體的說，本發(fā)明提供了一種發(fā)夾狀siRNA，命名為siRNA 3P，其序列從5′端到3′端為GAGUCCCAACCAUGUCAAAUUCAAGAGAUUUGACAUGGUUGGGACUCUUUUU。
本發(fā)明還提供了一種能有效轉(zhuǎn)錄所述發(fā)夾狀siRNA的DNA分子。
含有上述siRNA或DNA分子的藥物組合物可用于制備治療HER-2陽(yáng)性腫瘤的藥物。
例如，將人工合成的發(fā)夾siRNA 3P制成藥學(xué)上合理的藥物制劑，如脂質(zhì)體，能有效抑制HER-2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞中HER-2的表達(dá)；將其與其它腫瘤治療藥物，如化學(xué)治療藥物和基因治療藥物，制成藥學(xué)上可接受的藥物組合物，能有效抑制HER-2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞中HER-2的表達(dá)，并能抑制腫瘤的生長(zhǎng)。
將能有效轉(zhuǎn)錄siRNA 3P的DNA(如含有siRNA 3P基因的病毒、含有siRNA 3P基因的質(zhì)粒和含有siRNA 3P基因的單純RNA轉(zhuǎn)錄單元等)制成藥學(xué)上合理的制劑，能有效抑制HER-2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞中HER-2的表達(dá)；將其與其它腫瘤治療藥物，如化學(xué)治療藥物和基因治療藥物，制成藥學(xué)上可以接受的藥物組合物，能有效抑制HER-2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞中HER-2的表達(dá)，并能抑制腫瘤的生長(zhǎng)。
將人工合成的發(fā)夾siRNA 3P進(jìn)行硫磷酰等修飾能更好地發(fā)揮其抑制HER-2表達(dá)的作用。
本發(fā)明通過以下方式得以實(shí)施。
首先通過GenBank獲得了6條人HER-2mRNA序列，其中被研究較多的是序列號(hào)為NM_004448.2、長(zhǎng)度為4624bp的HER-2mRNA序列。與其它HER-2mRNA序列相比，此mRNA序列最長(zhǎng)，且其編碼區(qū)(coding DNA sequence，CDS)也最完整。因此，我們以該HER-2mRNA為靶序列，從mRNA序列的AUG起始密碼子開始，在編碼區(qū)內(nèi)尋找“AA”二核苷酸序列，并且選擇GC含量在40％～50％的序列，使用BLAST程序(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)將潛在的靶序列和相應(yīng)的人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，排除那些和其它基因明顯同源的靶序列，并利用互聯(lián)網(wǎng)上Iris Genetics的軟件程序siRNA DNA Designer 1.3設(shè)計(jì)針對(duì)HER-2的siRNA。
按照pSilencerTM 2.1-U6 hygro siRNA Expression Vector Kit(Ambion公司)的說明書設(shè)計(jì)并合成siRNA轉(zhuǎn)錄模板。附圖1說明了如何將siRNA的靶序列轉(zhuǎn)換為轉(zhuǎn)錄模板寡核苷酸序列。兩個(gè)反向互補(bǔ)排列的長(zhǎng)度為19核苷酸的特異性靶序列由一段9個(gè)核苷酸組成的序列(5′-UUCAAGAGA-3′)相連接，形成莖環(huán)狀發(fā)夾結(jié)構(gòu)。轉(zhuǎn)錄模板兩端分別為BamH I、HindIII酶切位點(diǎn)，并以6個(gè)T作為RNA polIII的轉(zhuǎn)錄終止子。
根據(jù)上述方法最終設(shè)計(jì)了一條發(fā)夾siRNA基因，命名為3P，其序列為GAGTCCCAACCATGTCAAATTCAAGAGATTTGACATGGTTGGGACTCTTTTT。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了包含發(fā)夾siRNA基因的質(zhì)粒pSilencer-HER-2-3P，其表達(dá)的發(fā)夾siRNA 3P的序列見SEQ NO1。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MCF-7乳腺癌細(xì)胞，經(jīng)篩選得到了穩(wěn)定表達(dá)發(fā)夾siRNA 3P的細(xì)胞株。然后，通過半定量PCR和流式細(xì)胞術(shù)分別在mRNA和蛋白水平上檢測(cè)了發(fā)夾siRNA 3P對(duì)HER-2表達(dá)的抑制作用。結(jié)果表明，發(fā)夾siRNA 3P能明顯降低MCF-7乳腺癌細(xì)胞中HER-2的表達(dá)(附圖2，附圖3)。
將穩(wěn)定表達(dá)發(fā)夾siRNA 3P的MCF-7細(xì)胞接種裸鼠進(jìn)行成瘤性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，與未轉(zhuǎn)染pSilencer-HER-2-3P質(zhì)粒的對(duì)照MCF-7細(xì)胞相比，穩(wěn)定表達(dá)發(fā)夾siRNA 3P的MCF-7細(xì)胞的成瘤性明顯降低(附圖4)。而通過免疫組化檢測(cè)瘤組織中HER-2蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，穩(wěn)定表達(dá)siRNA 3P的MCF-7細(xì)胞形成的腫瘤組織中HER-2蛋白的表達(dá)被明顯抑制(附圖5)。
以上結(jié)果表明，發(fā)夾siRNA 3P和有效轉(zhuǎn)錄siRNA 3P的DNA，以及其藥物制劑或其藥物組合物能夠治療HER-2陽(yáng)性腫瘤，其中包括乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌和肺癌等。


圖1.發(fā)夾siRNA轉(zhuǎn)錄模板設(shè)計(jì)圖。
圖2.發(fā)夾siRNA 3P抑制MCF-7細(xì)胞中HER-2mRNA的表達(dá)。泳道從左到有分別為核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)，MCF-7細(xì)胞中HER-2的RT-PCR產(chǎn)物，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的MCF-7細(xì)胞中HER-2的RT-PCR產(chǎn)物，和轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pSilencer-HER-2-3P的MCF-7細(xì)胞中HER-2的RT-PCR產(chǎn)物。
圖3.發(fā)夾siRNA 3P抑制MCF-7細(xì)胞表面HER-2蛋白的表達(dá)。其中，實(shí)線峰為陰性對(duì)照細(xì)胞，虛線峰為轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pSilencer-HER-2-3P的MCF-7細(xì)胞。
圖4.穩(wěn)定表達(dá)發(fā)夾siRNA 3P的MCF-7細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤性降低。其中，N接種為陰性對(duì)照細(xì)胞形成的腫瘤體積，3P為接種穩(wěn)定表達(dá)siRNA 3P的MCF-7細(xì)胞形成的腫瘤體積。
圖5.穩(wěn)定表達(dá)發(fā)夾siRNA 3P的MCF-7細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)形成的腫瘤中HER-2的表達(dá)明顯降低。
圖6.順時(shí)轉(zhuǎn)染siRNA 3P表達(dá)質(zhì)粒的SK-BR-3人乳腺癌細(xì)胞的增殖能力降低。其中，N代表轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒的SK-BR-3細(xì)胞，3P代表轉(zhuǎn)染siRNA 3P表達(dá)質(zhì)粒的SK-BR-3細(xì)胞。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例用于詳細(xì)說明本發(fā)明及其效果，但是本發(fā)明并不僅僅局限于這些實(shí)施例，這些實(shí)施例不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，但所作改動(dòng)或修改的等價(jià)形式同樣落在本申請(qǐng)權(quán)利要求書所限定的范圍之內(nèi)。
實(shí)施例一發(fā)夾siRNA靶序列的設(shè)計(jì)通過GenBank獲得了6條人HER-2mRNA序列(GenBank序列號(hào)分別為NM_004448.2、NM_001005862.1、M11730.1、X03363.1、BC080193.1和AF177761.2)，其中被研究較多的是序列號(hào)為NM_004448.2、長(zhǎng)度為4624bp的HER-2mRNA序列，經(jīng)過與其它HER-2mRNA序列進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)此mRNA序列與其它序列具有很高的同源性，且其編碼區(qū)也最完整。因此，我們以該HER-2mRNA為靶序列，從mRNA序列的AUG起始密碼子開始，在編碼區(qū)內(nèi)尋找“AA”二核苷酸序列，并且選擇GC含量在40％～50％的序列，利用BLAST程序?qū)撛诘陌行蛄泻拖鄳?yīng)的人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，排除那些和其它基因明顯同源的靶序列，并利用互聯(lián)網(wǎng)上Iris Genetics的軟件程序siRNA DNA Designer 1.3設(shè)計(jì)針對(duì)HER-2mRNA的siRNA。最終設(shè)計(jì)并選擇了3P序列(5’-GAGUCCCAACCAUGUCAAA-3’)作為發(fā)夾siRNA的靶序列。
實(shí)施例二發(fā)夾siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建按照附圖1設(shè)計(jì)路線設(shè)計(jì)表達(dá)發(fā)夾siRNA 3P的DNA轉(zhuǎn)錄模板，合成相應(yīng)的兩條DNA單鏈，將兩條DNA單鏈退火后連接到pSilencer hygro載體上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli(JM109)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)LB-Amp+瓊脂平板篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒，測(cè)定序列，插入序列正確的質(zhì)粒即為表達(dá)siRNA 3P的表達(dá)載體。
實(shí)施例三發(fā)夾siRNA抑制MCF-7乳腺癌細(xì)胞中HER-2表達(dá)的驗(yàn)證MCF-7乳腺癌細(xì)胞按照每孔4×105細(xì)胞接種于六孔板，待培養(yǎng)板80～90％鋪滿細(xì)胞后，在無血清條件下，采用LipofectamineTM2000(Invitrogen，1mg/ml)試劑并參照說明書轉(zhuǎn)染發(fā)夾siRNA 3P表達(dá)質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染5小時(shí)后，換含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時(shí)。之后，換含有200μg/ml Hygromycin B的選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，以進(jìn)行初步篩選，三天更換一次選擇培養(yǎng)基，最終篩選出穩(wěn)定表達(dá)siRNA 3P的細(xì)胞株。
收集穩(wěn)定表達(dá)siRNA 3P的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，按照Trizol(Invitrogen)試劑說明書提取細(xì)胞總RNA，采用半定量RT-PCR方法檢測(cè)HER-2mRNA的表達(dá)。從附圖2可以看出，siRNA 3P能有效抑制HER-2mRNA的表達(dá)，其干涉效果明顯。
收集穩(wěn)定表達(dá)siRNA 3P的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面HER-2蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表明，細(xì)胞表面HER-2蛋白的表達(dá)水平也顯著降低(附圖3)。
可見，發(fā)夾siRNA 3P在mRNA和蛋白水平上均能明顯抑制MCF-7乳腺癌細(xì)胞中HER-2的表達(dá)。
實(shí)施例四發(fā)夾siRNA降低MCF-7細(xì)胞的成瘤性培養(yǎng)穩(wěn)定表達(dá)發(fā)夾siRNA 3P的MCF-7細(xì)胞，用0.2％胰酶溶液消化后收集細(xì)胞，用PBS清洗兩次后，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度后于裸鼠(每組8只)背部皮下接種2×106個(gè)細(xì)胞。在接種后第21天將裸鼠拉頸處死，分離出瘤組織，用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤大小，按下列公式計(jì)算腫瘤體積V＝π/6×abc，其中V為腫瘤體積(mm3)；a、b、c分別為瘤體的長(zhǎng)度、寬度、高度。經(jīng)測(cè)量，與對(duì)照組未轉(zhuǎn)染siRNA 3P表達(dá)質(zhì)粒的MCF-7細(xì)胞形成的腫瘤相比，穩(wěn)定表達(dá)siRNA 3P的MCF-7細(xì)胞形成的腫瘤體積減小了41.0％(附圖4)。
腫瘤標(biāo)本經(jīng)10％福爾馬林溶液中固定3天后，經(jīng)石蠟包埋，切片，采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)腫瘤組織中HER-2蛋白的表達(dá)水平，光鏡下觀察，HER-2陽(yáng)性染色呈棕黃色。采用CMIAS-II多功能真彩色病理圖像分析系統(tǒng)，以積分光密度(IOD)值反映免疫組化HER-2陽(yáng)性信號(hào)的強(qiáng)度，IOD值越大，HER-2陽(yáng)性越強(qiáng)；IOD值越小，HER-2陽(yáng)性則越弱。方差分析結(jié)果表明，siRNA 3P組與對(duì)照組相比存在顯著性差異(P＜0.01)(附圖5)。
實(shí)施例五發(fā)夾siRNA對(duì)細(xì)胞增殖的影響SK-BR-3人乳腺癌細(xì)胞為HER-2高表達(dá)細(xì)胞株，接種于24孔板(每孔2×104個(gè)細(xì)胞)，待培養(yǎng)板60％-80％鋪滿細(xì)胞后，采用LipofectamineTM2000(Invitrogen)轉(zhuǎn)染pSilencer-HER-2-3P和對(duì)照質(zhì)粒。分別于轉(zhuǎn)染后第1～6天，各取三孔細(xì)胞測(cè)定細(xì)胞增殖情況，繪制生長(zhǎng)曲線(圖6)。結(jié)果轉(zhuǎn)染pSilencer-HER-2-3P組的細(xì)胞增殖速度變慢，與對(duì)照組細(xì)胞相比差異顯著(P＜0.05)。
核苷酸序列表<110>中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所<120>一種發(fā)夾RNA及其應(yīng)用<160>1<210>1<211>52<212>RNA<213>人工序列<400>1GAGUCCCAAC CAUGUCAAAU UCAAGAGAUU UGACAUGGUU GGGACUCUUU UU 5權(quán)利要求
1.一種發(fā)夾狀小干涉RNA，其序列從5′端到3′端為GAGUCCCAACCAUGUCAAAUUCAAGAGAUUUGACAUGGUUGGGACUCUUUUU。
2.一種藥物組合物，其特征在于包含權(quán)利要求1所述的發(fā)夾狀小干涉RNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的藥物組合物，其特征在于包含權(quán)利要求1所述的發(fā)夾狀小干涉RNA和腫瘤化學(xué)治療藥物。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的藥物組合物，其特征在于包含權(quán)利要求1所述的發(fā)夾狀小干涉RNA和腫瘤基因治療藥物。
5.一種DNA分子，其特征在于其能有效轉(zhuǎn)錄權(quán)利要求1所述的發(fā)夾狀小干涉RNA。
6.一種藥物組合物，其特征在于包含權(quán)利要求5所述的DNA分子。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其特征在于包含權(quán)利要求5所述的DNA分子和腫瘤化學(xué)治療藥物。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其特征在于包含權(quán)利要求5所述的DNA分子和腫瘤基因治療藥物。
9.權(quán)利要求2、3、4、6、7和8所述的任一藥物組合物在制備治療HER-2陽(yáng)性腫瘤的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種發(fā)夾狀小干涉RNA及其應(yīng)用，具體地說是根據(jù)人表皮生長(zhǎng)因子受體HER－2基因設(shè)計(jì)并制備的一種發(fā)夾狀小干涉RNA，該發(fā)夾狀小干涉RNA能有效抑制HER－2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞中HER－2基因的表達(dá)，并能抑制裸鼠體內(nèi)HER－2陽(yáng)性腫瘤的生長(zhǎng)。本發(fā)明還提供了該小干涉RNA在制備抗癌藥物中的用途。
文檔編號(hào)C12N15/113GK101054578SQ20061007259
公開日2007年10月17日 申請(qǐng)日期2006年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月13日
發(fā)明者王清明, 吳峰, 陳惠鵬, 陳吉中, 范國(guó)才 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所