專利名稱：豬生產(chǎn)性狀相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)及其編碼基因與應(yīng)用，特別是涉及一種豬生產(chǎn)性狀相關(guān)蛋白及其編碼基因與利用該蛋白編碼基因的單核苷酸多態(tài)性和限制片段長度多態(tài)性檢測豬生產(chǎn)性狀的方法。
背景技術(shù)：
隨著生活水平不斷提高，人們對肉品質(zhì)的要求也越來越高，尤其是肉的風(fēng)味。因此選擇合適的遺傳標(biāo)記對于開展標(biāo)記輔助選擇，加快遺傳進(jìn)展是極其重要的。
肌內(nèi)脂肪含量是影響豬肉質(zhì)的一項重要指標(biāo)，與肉質(zhì)呈正相關(guān)，影響肉的嫩度、風(fēng)味及多汁性，尤其肉的嫩度。Patrici等人對丹麥商品豬肉質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，肉的風(fēng)味多汁性隨肌內(nèi)脂肪含量的增加而持續(xù)改善，因此增高肌內(nèi)脂肪含量可以增加肉的嫩度及多汁性，增強(qiáng)肉的可口性(Patrici等，Eating quality of pork inDenmark.PigFarming(supplement).1985，10，56～57)。由于肌內(nèi)脂肪含量的測定在活體中較難實現(xiàn)，并且研究表明肌內(nèi)脂肪含量具有較高的遺傳力(Hovenier等，Livest Prod Sci，1992，32，309～321)，所以利用分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇，提高肌內(nèi)脂肪含量，改善豬肉品質(zhì)是一個行之有效的方法。在國外，已經(jīng)把提高肌內(nèi)脂肪含量作為豬育種的重要選擇性狀。
到目前為止，一些與肌內(nèi)脂肪含量有關(guān)的候選基因也已相繼發(fā)現(xiàn)，主要有Gerbens等人對心臟脂肪酸結(jié)合蛋白基因(H-FABP)多態(tài)研究發(fā)現(xiàn)其與肌內(nèi)脂肪含量及背膘厚有顯著的相關(guān)性(Gerbens等，Effect of genetic variants of the heartfatty acid-binding protein gene on intramuscular fat and performance traitsin pigs.Journal of Animal Science.1999，77(4)846-852)。H-FABP基因定位于豬6號染色體上(Gerbens等，Characterization，chromosomal localization，and genetic variation of the porcine heart fatty acid-binding protein gene.Mamm Genome.1997，8(5)328-32)。在心臟及骨骼肌中高效表達(dá)。而脂肪組織脂肪酸結(jié)合蛋白基因(A-FABP)是另一個與肌內(nèi)脂肪含量有關(guān)的基因，位于豬4號染色體上，對A-FABP基因第一內(nèi)含子(CA)21微衛(wèi)星序列多態(tài)性分析顯示A-FABP的遺傳變異和肌內(nèi)脂肪含量有關(guān)(Gerbens等，The adipocyte fatty acid binding proteinlocuscharacterization and association with intramuscular fat content inpigs.Mamm Genome.1998，9(12)1022-1026)。而Janss等對19頭梅山公豬和126頭荷蘭母豬雜交產(chǎn)生的850頭F2的肉質(zhì)性狀進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一個影響肌內(nèi)脂肪含量的主效基因(命名為MI基因)，并且是隱性遺傳(Janss等，Bayesian statisticalanalyses for presence of single genes affecting meat quality traits in acrossed pig population.Genetics.1997，145395～408)，但其進(jìn)一步的研究還未見報道。
數(shù)量性狀基因座(QTL)的研究顯示豬2、4、6、7號染色體上存在影響肌內(nèi)脂肪含量的QTL(De Koning等，Detection of quantitative trait loci for backfatthinknes and intramuscular fat content in pigs(sus scrofa).Genetics，1999，1521679～1690；Bidanel等，Mapping of quantitative trait loci(QTL)in F2crosses between Meishan and Large white pig breeds in France.Pro of InternConf on Pig Production.1998，51～55)。
碳酸酐酶3(Carbonic anhydrase 3，CA3)是碳酸酐酶家族的一個成員。碳酸酐酶是一個編碼鋅金屬酶的家族，可以催化的可逆反應(yīng)，維持機(jī)體內(nèi)酸堿平衡及體液平衡(Dodgson等，The carbonic anhydrasescellular physiologyand molecular genetics.New YorkPlenum，1991)。在人上至少有14個家族成員已被發(fā)現(xiàn)，由于它們在細(xì)胞中的位置及結(jié)構(gòu)不同而在機(jī)體中顯示不同的作用，其中CA1，CA2，CA3，CA7和CA13位于細(xì)胞質(zhì)中，CA5A和CA5B位于線粒體中，CA6位于分泌顆粒中，而CA4，CA9，CA12和CA14和細(xì)胞膜結(jié)合，另外還包含三個相關(guān)的蛋白CA8，CA10，and CA1(Kuo等，The differential expression of cytosolic carbonicanhydrase in human hepatocellular carcinoma.Life Sciences.2003，732211-2223)。但在豬中關(guān)于碳酸酐酶家族成員的研究較少。
人的CA3基因定位到8號染色體的長臂，和CA1及CA2基因位于同一條染色體上并緊密連鎖(Wade等，Nucleotide sequence，tissue-specific expression，andchromosome location of human carbonic anhydrase IIIThe human CAIII gene islocated on the same chromosome as the closely linked CAI and CAII genes.Proc.Natl.Acad.Sci.1986，839571-9575)，基因組全長為10817bp，由7個外顯子和6個內(nèi)含子組成，其cDNA全長為2357bp，編碼260個氨基酸。
CA3主要存在于I型骨骼肌纖維中，同其它成員相比具有不同的特征，例如具有較低的CO2水解酶活性、磷酸酶活性等，在調(diào)控能量的組織(肌肉、肝臟及脂肪)中含量較高。研究顯示抑制CA3的活性可以提高抗疲勞的能力，降低在機(jī)體中具有磷酸己糖的濃度并能提高糖原利用率(Cté等，Metabolic and contractile influence ofcarbonic anhydrase III in skeletal muscle is age dependent.Am J Physiol RegulIntegr Comp Physiol.1999，276559-565.)。而基因敲除試驗顯示CA3可能參與谷胱苷肽介導(dǎo)的抗氧化反應(yīng)(Zimmerman等，Anti-oxidative response of carbonicanhydrase III in skeletal muscle.IUBMB Life.2004，56343-347)。雖然CA3占骨骼肌肌質(zhì)可溶性蛋白的8％左右，但CA3在骨骼肌中的具體生物學(xué)作用還不太清楚。
基因突變研究是分析基因功能的一個重要手段。通過群體中性狀關(guān)聯(lián)分析尋找與豬重要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的基因，進(jìn)行分子育種是科研工作者的一項重要且艱巨的任務(wù)。并且性狀關(guān)聯(lián)分析也是研究豬CA3基因在骨骼肌中的作用的一個重要的途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種豬生產(chǎn)性狀相關(guān)蛋白及其編碼基因。
本發(fā)明所提供的豬生產(chǎn)性狀相關(guān)蛋白，名稱為CA3，來源于豬，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №10；2)將序列表中SEQ ID №10的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與豬生產(chǎn)性狀相關(guān)的蛋白質(zhì)。
其中，序列表中的序列10由260個氨基酸殘基組成。
所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
上述豬生產(chǎn)性狀相關(guān)蛋白的編碼基因(CA3)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
上述豬生產(chǎn)性狀相關(guān)蛋白的編碼基因包括豬生產(chǎn)性狀相關(guān)蛋白的cDNA基因和豬生產(chǎn)及免疫性狀相關(guān)蛋白的基因組基因。其基因組基因具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №9的多核苷酸；2)編碼序列表中SEQ ID №10蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中的SEQ ID №9限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為雜交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。
序列表中的SEQ ID №9由10489個堿基組成，自5′端的第1-237位核苷酸為該基因組基因的第一個外顯子，自5′端的第949-1146位核苷酸為該基因組基因的第二個外顯子，自5′端的第3548-3666位核苷酸為該基因組基因的第三個外顯子，自5′端的第5389-5481位核苷酸為該基因組基因的第四個外顯子，自5′端的第6803-6865位核苷酸為該基因組基因的第五個外顯子，自5′端的第8392-8547位核苷酸為該基因組基因的第六個外顯子，自5′端的第9524-10489位核苷酸為該基因組基因的第七個外顯子；自5′端的第204-206位核苷酸為該基因組基因的起始密碼子ATG，自5′端的第9644-9646位核苷酸為該基因組基因的終止密碼子TGA；自5′端的第238-948位核苷酸為該基因組基因的第一個內(nèi)含子，自5′端的第1147-3547位核苷酸為該基因組基因的第二個內(nèi)含子，自5′端的第3667-5388位核苷酸為該基因組基因的第三個內(nèi)含子，自5′端的第5482-6802位核苷酸為該基因組基因的第四個內(nèi)含子，自5′端的第6866-8391位核苷酸為該基因組基因的第五個內(nèi)含子，自5′端的第8548-9523位核苷酸為該基因組基因的第六個內(nèi)含子。
其cDNA基因，可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的多核苷酸；2)編碼序列表中SEQ ID №10蛋白質(zhì)序列的DNA；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中的SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為雜交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。
序列表中的SEQ ID №1由1837個堿基組成，自序列表序列1的5’端第183-965位核苷酸為開放閱讀框，自5’端第1-182位核苷酸序列為5’非翻譯區(qū)，自5’端第963-1794位核苷酸序列為932bp的3’非翻譯區(qū)，自5’端第1795-1800位核苷酸序列為AATAAA加尾信號，自5’端第1812-1837位核苷酸序列為PolyA尾巴。
含有本發(fā)明的豬生產(chǎn)性狀相關(guān)蛋白編碼基因的載體、細(xì)胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明的第二個目的是提供一種檢測豬生產(chǎn)性狀的方法。
本發(fā)明所提供的檢測豬生產(chǎn)性狀的方法，是檢測自序列表中序列9的5′端第8603位核苷酸或自序列表中序列3的5′端第200位核苷酸為G還是A，確定豬的基因型，然后通過基因型確定生產(chǎn)性狀。
如果自序列表中序列9的5′端第8603位核苷酸或自序列表中序列3的5′端第200位核苷酸為A時，其純合體的基因型為BB；自序列表中序列9的5′端第8603位核苷酸或自序列表中序列3的5′端第200位核苷酸為G時，其純合體的基因型為AA；它們的雜合體基因型為AB。
所述方法中，檢測自序列表中序列9的5′端第8603位核苷酸或自序列表中序列3的5′端第200位核苷酸為G還是A的方法包括先PCR擴(kuò)增含有自序列表中序列9的5′端第8603位核苷酸的基因組片段，然后對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序或者用HinfI酶切擴(kuò)增產(chǎn)物。
所述擴(kuò)增產(chǎn)物可為自序列表中SEQ ID NO3的5′端第1-817位核苷酸的817bp的片段。
HinfI酶切所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，若得到553bp 202bp，62bp三個酶切片段，其基因型為AA純合體；若得到755bp，553bp，202bp及62bp四個酶切片段時，其基因型AB雜合體；若得到755bp和62bp兩個片段時，其基因型為BB純合體。
AA與AB基因型豬以及AB與BB基因型豬的肌內(nèi)脂肪含量呈極顯著差異(P＜0.01)，而AA型與BB型豬的肌內(nèi)脂肪含量差異不顯著(P＝0.098)。同時AA與AB基因型豬的腿臀比率差異顯著(p＝0.02)，而AA型與BB豬及AB型與BB型豬的腿臀比率差異不顯著。并且AB和BB基因型豬在達(dá)90kg日齡，背膘厚及剪切力方面存在相關(guān)趨勢(P值分別為0.098，0.107，0.076)。
本發(fā)明的豬生產(chǎn)相關(guān)蛋白及其編碼基因可用于檢測豬腿臀比率、背膘厚、肉質(zhì)、肌內(nèi)脂肪等生產(chǎn)性狀，為豬的分子育種提供了一個新的遺傳標(biāo)記，將在豬的育種中發(fā)揮重要作用。


圖1為豬CA3基因的HinfI-RFLP的三種基因型電泳結(jié)果具體實施方式
下述實施例中所用實驗方法，如無特別說明均為常規(guī)方法。
實施例中所用材料通城豬(Tongcheng pig)；大白(Yorkshire)；長白(Landrance)；杜洛克(Duroc)；萊蕪豬(Laiwu pig)；五指山小型豬(Wuzhishan mini-pig)；巴馬小型豬(Bama mini-pig)；貴州小型豬(Guizhou mini-pig)實施例1、豬CA3及其全長cDNA基因和基因組基因的獲得1、豬CA3及其全長cDNA基因的獲得提取大白豬55天胚胎骨骼肌總RNA，經(jīng)過mRNA的純化、cDNA合成、蛋白酶K和Sfi I消化以及cDNA分級分離后，將獲得的cDNA與pBluescript II SK+載體連接，從而構(gòu)建豬骨骼肌cDNA文庫(朱正茂，博士論文，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2003)。隨機(jī)挑取克隆子進(jìn)行商業(yè)測序，將測序所獲得的序列經(jīng)美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI，National Center for Biotechnology Information，http//www.ncbi.nlm.nih.gov)檢索并根據(jù)比較基因組的信息獲得相應(yīng)的豬的基因，其中有一個克隆子序列所對應(yīng)的基因為豬CA3基因。該豬CA3基因序列具有序列表中SEQ ID No.1的核苷酸序列。
為驗證該拼接得到的cDNA為豬CA3全長cDNA序列，用TRIZOL的方法提取長白豬的總RNA，按照大連寶生物公司提供的方法合成cDNA第1條鏈，再設(shè)計1對特異性引物F15’CAGTGCCCACGAAGACGAC 3’，R15’TGAAGTTCGTGAAGGGTGCC 3’，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其中，PCR擴(kuò)增體系為20μl2μL cDNA(50ng)，含1×buffer，1.5mM MgCl2，dNTP終濃度為150μM，引物終濃度為0.2μM，2.0U Taq DNA聚合酶。PCR擴(kuò)增程序是先94℃5min；然后94℃30s，58℃40s，72℃1min循環(huán)35次；最后72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳分離，然后按照下述方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化、克隆和測序(1)PCR產(chǎn)物的純化用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(北京天為時代科技有限公司)純化上述PCR產(chǎn)物，按照試劑盒說明書操作，具體步驟是在紫外燈下將單一的目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠上切下，放入1.5ml Ependorff管中，加入3倍體積的PN溶膠液(如果膠重0.1g，其體積可視為100ul，則加入300ul溶膠液)，于50℃水浴10分鐘至凝膠完全融化，將上一步所得的凝膠液加入吸附柱中，12,000rpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放入收集管中。向吸附柱中加入700ul漂洗液PW，12,000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱重新放入收集管中。向吸附柱中加入500ul漂洗液PW，12,000rpm離心30秒，倒掉廢液。將吸附柱放回收集管中，12,000rpm離心2分鐘。將吸附柱放到一個干凈的離心管中向吸附膜中間加入20ul超純水，室溫放置2分鐘，12,000rpm離心1分鐘。
(2)連接反應(yīng)將純化的PCR產(chǎn)物與pGEM-Teasy載體連接，連接反應(yīng)總體積是5μl，其中包括2.5μl 2×buffer，0.5μl的pGEM-Teasy載體，1.5μl的純化PCR產(chǎn)物，0.5μl的T4連接酶，混勻后置于16℃水浴12小時。
(3)感受態(tài)細(xì)胞的制備從37℃培養(yǎng)了16-20h的新鮮平板上挑取一個DH5α單菌落接種于2ml LB中，于37℃振蕩培養(yǎng)3h，轉(zhuǎn)接1ml菌液于含有100ml LB的錐形瓶中，繼續(xù)在37℃振蕩培養(yǎng)約4h，待OD600達(dá)到0.3-0.4時將錐形瓶從搖床取出置冰浴冷卻10-15min，然后將菌液轉(zhuǎn)入離心管中于4℃4,000g離心10min以收集細(xì)胞，將離心管倒置以棄凈培養(yǎng)液，用10ml冰預(yù)冷的0.1mol/L的CaCl2重懸沉淀，冰浴30min，重復(fù)4℃4,000g離心10min一次，用4ml冰預(yù)冷的0.1mol/L的CaCl2重懸沉淀，置4℃保存?zhèn)溆谩?br> (4)轉(zhuǎn)化無菌狀態(tài)下取100-120μl感受態(tài)細(xì)胞于1.5ml Ependorff管中，將5μl的上述連接產(chǎn)物加入混勻，在冰上放置30min，42℃熱激90s，其間不要搖動Ependorff管，取出后冰浴3-4min，加入600μl無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)60min。取100μl涂布于已提前4h涂布了IPTG(Isopropylthio-β-D-galactoside，異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)和X-gal的瓊脂平板上，37℃平放1h后倒置培養(yǎng)。
(5)菌液PCR鑒定及測序分別挑取上述轉(zhuǎn)化后平板上的單菌落，接種于2-3mlLB中，37℃300r/min培養(yǎng)過夜。以菌液為PCR擴(kuò)增模板進(jìn)行擴(kuò)增，引物分別為上述F15’CAGTGCCCACGAAGACGAC 3’，R15’TGAAGTTCGTGAAGGGTGCC 3’，PCR擴(kuò)增體系為20μl，其中菌液1ul，含1×buffer，1.5mM MgCl2，dNTP終濃度為150μM，引物終濃度為0.2μM，2.0U Taq DNA聚合酶。另外設(shè)一個不含模板的陰性對照。PCR擴(kuò)增程序是94℃5min，然后循環(huán)35次94℃30s，58℃40s，72℃1min，最后72℃延伸10min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR檢測后，將陽性克隆子的菌液送到測序公司(北京英駿生物技術(shù)有限公司)測序，測序結(jié)果表明，該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物具有序列表中序列1的豬CA3全長cDNA序列。該豬CA3cDNA全序列長為1837bp，自序列表序列1的5’端第183-965位核苷酸為開放閱讀框，編碼具有序列表中序列10的氨基酸殘基序列的豬CA3；自序列表序列1的5’端第1-182位核苷酸序列為5’非翻譯區(qū)，自5’端第963-1794位核苷酸序列為932bp的3’非翻譯區(qū)，自5’端第1795-1800位核苷酸序列為AATAAA加尾信號，自5’端第1812-1837位核苷酸序列為PolyA尾巴。在GenBank中的同源檢索表明該基因在物種間具有較高的同源性，其中CDS編碼區(qū)序列(自序列表序列1的5’端第183-962位核苷酸)與人和小鼠的同源性都為87％。
2、豬CA3基因組基因的獲得從40頭通城豬血液中提取基因組DNA，根據(jù)序列表中序列1的cDNA序列設(shè)計引物CF15’-AGTGCCCACGAAGACGAC-3’，CR15’-GCGATTGGTTGTCTCCCT-3’；CF25’-GCCAAGGGAGACAACCAAT-3’，CR25’-GAGCCCCAGTGAAGATGAA-3’；CF35’-GGAGTCAAGTATGCTGCGG-3’，CR35’-CTCCATCAGGGTGCTTCA-3’；CF45’-GCTCTGAAGCACCCTGATG-3’，CR45’-AGGACTAGTTGGAACTCGCC-3’；CF55’-GGCGAGTTCCAACTAGTCCT-3’，CR55’-TGGTCAGAGCTCACGGTGA-3’；CF65’-CCCTTCACGAACTTCAACC-3’，CR65’-GCTCTCACCTTCATTGCTC-3’，PCR擴(kuò)增體系為20μl，其中基因組DNA 50ng，含1×buffer，1.5mM MgCl2，dNTP終濃度為150μM，引物終濃度為0.2μM，2.0U Taq DNA聚合酶。PCR擴(kuò)增程序是94℃5min，然后循環(huán)35次94℃30s，58℃40s，72℃1min，最后72℃延伸10min。在豬的基因組DNA中進(jìn)行擴(kuò)增，得到6條特異條帶，用軟件DNAStar中的Seqman程序拼接得到一條10489bp的序列，表明具有序列表中序列9的核苷酸序列，該序列即為豬CA3的基因組序列，編碼具有序列表中序列10的氨基酸殘基序列(豬CA3)。自5′端的第1-237位核苷酸為該基因組基因的第一個外顯子，自5′端的第949-1146位核苷酸為該基因組基因的第二個外顯子，自5′端的第3548-3666位核苷酸為該基因組基因的第三個外顯子，自5′端的第5389-5481位核苷酸為該基因組基因的第四個外顯子，自5′端的第6803-6865位核苷酸為該基因組基因的第五個外顯子，自5′端的第8392-8547位核苷酸為該基因組基因的第六個外顯子，自5′端的第9524-10489位核苷酸為該基因組基因的第七個外顯子；自5′端的第204-206位核苷酸為該基因組基因的起始密碼子ATG，自5′端的第9644-9646位核苷酸為該基因組基因的終止密碼子TGA；自5′端的第238-948位核苷酸為該基因組基因的第一個內(nèi)含子，自5′端的第1147-3547位核苷酸為該基因組基因的第二個內(nèi)含子，自5′端的第3667-5388位核苷酸為該基因組基因的第三個內(nèi)含子，自5′端的第5482-6802位核苷酸為該基因組基因的第四個內(nèi)含子，自5′端的第6866-8391位核苷酸為該基因組基因的第五個內(nèi)含子，自5′端的第8548-9523位核苷酸為該基因組基因的第六個內(nèi)含子。
其中，自序列表中序列9的5′端第8603位為多態(tài)位點，有2頭通城豬的自序列表中序列9的5′端第8603位為G，該2頭通城豬為純合體，將其基因型命名為AA；有26頭通城豬的自序列表中序列9的5′端第8603位為A，該26頭通城豬為純合體，將其基因型命名為BB，有12頭通城豬的自序列表中序列9的5′端第8603位為G和A，該12頭通城豬為雜合體，將其基因型命名為AB。
DNA序列同源性檢索鑒定通過NCBI(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)網(wǎng)站的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)軟件，將測序后獲得的DNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中公布的已知生理功能基因進(jìn)行序列同源性比較，以鑒定和獲得該DNA序列的功能信息，結(jié)果表明豬CA3基因具有和人CA3基因相似的基因組結(jié)構(gòu)，即都是由7個外顯子和6個內(nèi)含子組成，而編碼序列在物種間具有較高的同源性說明豬CA3基因可能具有和人CA3基因相似的功能。
實施例2、CA3基因組基因的物理定位1、用于物理定位的實驗材料用豬×嚙齒類體細(xì)胞雜種板(Pig×rodent somatic cell hybrid panel，SCHP)進(jìn)行染色體區(qū)域定位，用美國Minnesota大學(xué)共同構(gòu)建的豬輻射雜種板(INRA-Minnesota porcine radiation hybrid panel，IMpRH)進(jìn)行染色體精確定位，兩套體細(xì)胞雜種板的制備方法見參考文獻(xiàn)(Yerle等，A somatic cell hybrid panelfor pig regional gene mapping characterized by molecular cytogenetics.Cytogenet Cell Genet.1996，73194-202；Yerle等，Construction of awhole-genome radiation hybrid panel for high-resolution gene mapping in pigs.Cytogenet Cell Genet.1998，82182-188)。
其中SCHP包括27個體細(xì)胞雜種細(xì)胞系，1-19號是豬×倉鼠體細(xì)胞雜種細(xì)胞系，20-27號是豬×小鼠體細(xì)胞雜種細(xì)胞系，并以倉鼠、小鼠和豬基因組DNA作為陽性對照(Yerle等，A somatic cell hybrid panel for pig regional gene mappingcharacterized by molecular cytogenetics.Cytogenet Cell Genet.1996，73194-202)。經(jīng)細(xì)胞遺傳學(xué)鑒定該雜種板保留了豬的除Y染色體外的全部18條常染色體以及X染色體，其中含有127個非重疊的染色體區(qū)域，各細(xì)胞系中所包含的豬染色體及染色體片段信息可從WWW(http//www.toulouse.inra.fr/lgc/lgc.html/)獲得。
IMpRH使用的輻射劑量是7,000-rad。IMpRH包括118個豬×倉鼠輻射雜種細(xì)胞系，以及倉鼠和豬基因組DNA陽性對照，用757個標(biāo)記的鑒定結(jié)果表明IMpRH中的平均標(biāo)記存留率為29.3％，包含有128個連鎖群，覆蓋了18對常染色體及X染色體，用于估計標(biāo)記間距離的kb/cR比值是～70kb/cR(1Ray＝100cR)，理論分辨率是145kb。結(jié)果在IMpRH定位程序中進(jìn)行分析(http//imprh.toulouse.inra.fr/)。
2、豬CA3基因的定位分別以SCHP和IMpRH克隆板中的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，引物為ML15’-AGTGCCCACGAAGACGAC-3’(正向，如序列表SEQ ID4所示)和MR25’-GCGATTGGTTGTCTCCCT-3’(反向，如序列表SEQ ID5所示)進(jìn)行擴(kuò)增的PCR反應(yīng)總體積為10μl，其中模板DNA為20ng，含1×buffer(Promega)，1.5mmol/L MgCl2，dNTP終濃度為150μmol/L，引物終濃度為0.2μmol/L，1.5U Taq DNA聚合酶(Promega)。PCR擴(kuò)增程序是先94℃5min；然后94℃30s，59℃30s，72℃40s，共循環(huán)35次；最后72℃延伸5min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用2.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測。
SCHP克隆板PCR分型結(jié)果表明，19個豬×中國倉鼠體細(xì)胞雜種細(xì)胞系(1-19號)中，1，5，6，9，12，14，15，18，19號出現(xiàn)與豬基因組DNA陽性對照擴(kuò)增一致的818bp(序列表中序列2)的目的片段，而在8個豬×小鼠體細(xì)胞雜種細(xì)胞系(20-27號)中，20，25，27號雜種細(xì)胞系均擴(kuò)增得到818bp(序列表中序列2)的目的片段。將上述實際觀測的PCR分型數(shù)據(jù)提交給HybWeb(http//www.toulouse.inra.fr/lgc/lgc.html/)進(jìn)行統(tǒng)計分析以獲得區(qū)域定位信息，數(shù)據(jù)分析結(jié)果是豬CA3基因定位于豬4號染色體上(P＝1.000)，進(jìn)一步的區(qū)域定位結(jié)果為SSC4 q11-q14(P＝0.9864，與該區(qū)域標(biāo)記間的相關(guān)系數(shù)為1.000，P＜0.1％)。
用IMpRH克隆板對CA3進(jìn)行精確定位。統(tǒng)計分析結(jié)果表明CA3基因定位于SSC4q，與豬4號染色體上的SW317緊密連瑣，LOD值為6.28，RH圖距是61Ray。
實施例3、豬CA3的部分DNA序列的單核苷酸多態(tài)性和RFLP多態(tài)性檢測1、豬CA3的部分DNA序列的單核苷酸多態(tài)性的檢測分別以大白豬、杜洛克、萊蕪豬、五指山小型豬和巴馬小型豬各2頭的基因組為模板，用引物SL15’-CCCTTCACGAACTTCAACC-3’(正向，如序列表SEQ ID6所示)，SR15’-GCTCTCACCTTCATTGCTC-3’(反向，如序列表SEQ ID7所示)擴(kuò)增豬部分基因組DNA，均得到了1369bp特異性擴(kuò)增片段(序列表中序列3)，進(jìn)行測序和序列分析。序列分析結(jié)果表明在序列表中序列3的自5′端第200位(即自序列9的5′端第8603位)核苷酸處存在1個HinfI酶切位點(G↓ANTC)，在此處存在G200-A200的突變。當(dāng)200位核苷酸處為G時，序列可以被HinfI酶切開(定為等位基因A)，而當(dāng)200位核苷酸處為A時，序列不能被HinfI酶切開(定為等位基因B)，純合體為AA和BB，雜合體為AB。
為了進(jìn)一步分析這個突變位點，右端引物重新設(shè)計，得到下述引物SL15’-CCCTTCACGAACTTCAACC-3’(正向，如序列表SEQ ID6所示)，SR25’-GGGGAAGACAGTATCAGGG-3’(反向，如序列表SEQ ID8所示)此時擴(kuò)增產(chǎn)物為817bp(自序列3的5′端第1位至817位核苷酸)，該擴(kuò)增產(chǎn)物并包含兩個HinfI酶切位點(自序列3的5′端第200-204位核苷酸和自序列3的5′端第753-757位核苷酸)。這兩個等位基因組成三種等位基因型為AA(HinfI酶切為553bp 202bp，62bp三個片段)，AB(HinfI酶切為755bp，553bp，202bp及62bp四個片段)，BB(HinfI酶切為755bp和62bp兩個片段)。
2、PCR-RFLP-HinfI多態(tài)性在不同豬品種中的分布情況分別以通城豬(Tongcheng pig)；大白(Yorkshire)；長白(Landrance)；杜洛克(Duroc)；萊蕪豬(Laiwu pig)；五指山小型豬(Wuzhishan mini-pig)；巴馬小型豬(Bama pig)和貴州小型豬(Guizhou mini-pig)的基因組DNA為模板，具體取樣的分配如表1所示，以下述序列為引物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)SL15’-CCCTTCACGAACTTCAACC-3’(正向，如序列表SEQ ID6所示)，SR25’-GGGGAAGACAGTATCAGGG-3’(反向，如序列表SEQ ID8所示)PCR擴(kuò)增條件PCR反應(yīng)總體積為20μl，其中豬基因組DNA約100ng，含1×buffer(Promega)，1.5mmol/L MgCl2，dNTP終濃度為150μmol/L，引物終濃度為0.3μmol/L，2.0U Taq DNA聚合酶(Promega)。
PCR擴(kuò)增程序是先94℃4min；然后按94℃30s，58℃30s，72℃40s，循環(huán)35次；最后72℃延伸5min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到擴(kuò)增片段的長度均為817bp(自序列3的5′端第1位至817位核苷酸)。
(3)RFLP檢測條件PCR產(chǎn)物酶切反應(yīng)體積是10μl，其中1×buffer 1.0μl，PCR產(chǎn)物3-5μl，限制性內(nèi)切酶HinfI為0.5μl(5U)，用H2O補(bǔ)足10μl，將樣品混勻后離心，37℃水浴4h，用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果，記錄基因型，在紫外燈下拍照。HinfI酶切PCR產(chǎn)物，得到553bp、202bp和62bp三個片段的基因型為AA，得到755bp，553bp，202bp及62bp四個片段的基因型為AB，得到755bp和62bp兩個片段的基因型為BB。豬CA3基因的HinfI-RFLP的三種基因型(AA、AB、BB)電泳結(jié)果如圖1所示，圖1中MDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(100bp Ladder)。PCR-RFLP-HinfI多態(tài)性在不同豬品種中的分布和不同品種中分布的差異性檢驗結(jié)果分別如表1和表2所示，表1的基因型和基因頻率的結(jié)果顯示，PCR-RFLP-HinfI多態(tài)性在國內(nèi)外豬品種中存在著較大的差異。其中，國內(nèi)品種B等位基因占優(yōu)勢(五指山小型豬除外)，而國外品種A等位基因占優(yōu)勢。
表1.PCR-RFLP-HinfI多態(tài)性在不同豬品種中的分布

表2.豬CA3基因HinfI-RFLP多態(tài)性位點在不同品種中分布的差異性檢驗結(jié)果

注肩注*表述P＜0.05；肩注**表述P＜0.01。
3、標(biāo)記性狀關(guān)聯(lián)分析利用湖北省通城豬群做性狀關(guān)聯(lián)分析，分別來自143頭豬的143個DNA樣品用于基因型檢測。
所分析的性狀有部分生產(chǎn)性能及部分肉質(zhì)性狀。為了減少系統(tǒng)效應(yīng)先建立如下的分析模型Yijk＝μ+BATCHi+SEXj+COMBINATIONk+(BS)ij+(BC)ik+εijkl，其中，Yijk是性狀觀察值，μ為總體均數(shù)，BATCHi為批次效應(yīng)，SEXj為性別效應(yīng)，COMBINATIONk為組合的效應(yīng)，(BS)ij為批次和性別的互作效應(yīng)，(BC)ik為批次和組合的互作效應(yīng)，εijkl為隨機(jī)誤差，假定服從N(0，σ2)分布。
將獲得的殘差值作為新的性狀值，應(yīng)用最小二乘法及兩兩比較分析基因型的效應(yīng)。
對豬CA3基因Hinf*I-RFLP多態(tài)性位點基因型檢測結(jié)果表明在143個個體中AA基因型有85個，AB基因型有32個個體，BB基因型有26個個體。在與部分生產(chǎn)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析中，所分析的性狀有肌內(nèi)脂肪含量，達(dá)90kg日齡，背膘厚，大理石花紋，剪切力及腿臀比率?；蛐烷g扣除系統(tǒng)效應(yīng)(性別、組合及批次效應(yīng))后的殘差值均值和標(biāo)準(zhǔn)差分析結(jié)果總結(jié)于表3、表4。性狀關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明該突變位點與肌內(nèi)脂肪含量呈極顯著相關(guān)(P＝0.002)，并且還與腿臀比率顯著相關(guān)(P＝0.039)。進(jìn)一步分析顯示，AA與AB基因型豬以及AB與BB基因型豬的肌內(nèi)脂肪含量呈極顯著差異(P＜0.01)，而AA型與BB型豬的肌內(nèi)脂肪含量差異不顯著(P＝0.098)。同時AA與AB基因型豬的腿臀比率差異顯著(p＝0.02)，而AA型與BB豬及AB型與BB型豬的腿臀比率差異不顯著。并且AB和BB基因型豬在達(dá)90kg日齡，背膘厚及剪切力方面存在相關(guān)趨勢(P值分別為0.098，0.107，0.076)。
表3不同CA3基因HinfI-RFLP基因型與部分生產(chǎn)性狀的關(guān)聯(lián)分析

表4不同CA3基因HinfI-RFLP基因型與部分生產(chǎn)性狀的關(guān)聯(lián)分析

注相同的大寫字母(黑體顯示)代表差異極顯著(P＜0.01)，相同的小寫字母(黑體顯示)代表差異顯著(P＜0.05)。*代表扣除系統(tǒng)誤差后所得殘差值的均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
序列表<160>10<210>1<211>1837<212>DNA<213>野豬屬豬(Sus scrofa domestica Brisson)<400>1cttcccccac cccgcctccc aaataccacc ccaatcctgt ttagcccccc gccccaccct 60cgctgaccta ataaggccat gcaagtgtgt ggggggaacc tatataaaag gtgtgggttc120gcggggacag tgcacggcgt ggaagagaaa gcagcagccg tccagtgccc acgaagacga180ccatggccaa ggagtggggc tacgccgacc acaatggtcc tgaccactgg catgaacttt240acccaattgc caagggagac aaccaatcgc ccattgaact gcacactaag gacatcaagc300acgacccttc tctgctgccc tggacagcat cttatgaccc tggctctgcc aagaccatcc360tgaacaatgg gaagacctgc agggttgtat ttgatgatac ttatgacagg tcaatgctga420gaggtggtcc tctcactgca gcctaccggc ttcgccagtt tcatcttcac tggggctcct480cagatgatca cggatctgag cacactgtgg atggagtcaa gtatgctgcg gagctccatt540tggttcattg gaattcaaag tataacagtt ttgcaactgc tctgaagcac cctgatggag600tggctgtagt tggcattttt ctgaagatag gacgtgagaa aggcgagttc caactagtcc660ttgatgcatt ggacaaaatt aagacaaagg gcaaggaggc acccttcacg aacttcaacc720catcctgcct gttccctgcc tgccgggact actggaccta ccatggctcc ttcaccacgc780cgccctgcga ggagtgcatt gtgtggctcc tgctgaagga gcccatcacc gtgagctctg840accagatggc caagctgcga agcctctact ccagtgcgga gaacgagccc cctgtccccc900tagtgaggaa ctggcgcccc ccacagccta tcaagggcag gatagtgaag gcctccttca960aatgaggctg ctggagcttg ccctcttcag gaaaggaagc ctgctactgc agagcttggt 1020tccttgcctc cttttggtgc tccttattcc aagtattatt tcagttttcc acactgagca 1080atgaaggtga gagctgcaat caccaagaac caaagttact attgacagat ctaatacgaa 1140agcatttggc ctttgtaaga atcatctttc ctgtaaaaga aaactcttac taagtttcaa 1200
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<221>misc-feature<222>(8603)<223>n＝a或g<400>9gcgattacta tggattcatt ggcttccccc ctccgcctcc caaataccac cccaatcctg 60tttcgccccc cgccccaccc tcgctgacct aataaggcca tgcaagtgtg tggggggaac120ctatataaaa ggtgtgggtt cgcggggaca gtgcacggcg tggaagagaa agcagcagcc180gtccagtgcc cacgaagacg accatggcca aggagtgggg ctacgccgac cacaatggtg240agcgtgagat ggtgctgttg aaaaaggggg caactctaga gagtgcattg aaaaatgggg300gaggcggagt cgaaggaaac taatgttcac tgacccccgc tgctgacccc ttttaccttt360atctcactta gttctcccca gtgtgaagct gttattactc ccattggggg aaaccaaagc420acagagaggc tgggtacctt gcccaggtca cagagcttct gactgagaag tcagacctct480gaggtccagt tctgactgtc cccttctccc tgatcctggg caagcactta acctctctga540gccaggtgat gatataagca gctctgcctg cagctcctgc ctacccatgg gaaaagaaca600tgggtgtgct ctgaaatcca tttggggtcg gtgttatttt attccagctc taggatagaa660gaggacatta gtaaaacatg tgatgaagtc catttcaaaa ataagccttt gaagctatct720tcttgagcaa gtagaggaaa taaacagagt taaatacagt ctccaggtac actattaaca780aagttatgaa aaggtcttaa actgtgagcc ttgggttgcc taatctgaaa tccaggatct840ttccgcaatc attgtccaac ccctgtgtat tttactggtt tagtcaatta gaaagaaggc900
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180 185 190Tyr His Gly Ser Phe Thr Thr Pro Pro Cys Glu Glu Cys Ile Val Trp195 200 205Leu Leu Leu Lys Glu Pro Ile Thr Val Ser Ser Asp Gln Met Ala Lys210 215 220Leu Arg Ser Leu Tyr Ser Ser Ala Glu Asn Glu Pro Pro Val Pro Leu225 230 235 240Val Arg Asn Trp Arg Pro Pro Gln Pro Ile Lys Gly Arg Ile Val Lys245 250 255Ala Ser Phe Lys260
權(quán)利要求
1.一種豬生產(chǎn)性狀相關(guān)的蛋白，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №10；2)將序列表中SEQ ID №10的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與豬生產(chǎn)性狀相關(guān)的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白，其特征在于所述豬生產(chǎn)性狀為豬肌內(nèi)脂肪含量和/或腿臀比率。
3.權(quán)利要求1或2所述的豬生產(chǎn)性狀相關(guān)蛋白的編碼基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的編碼基因，其特征在于所述豬生產(chǎn)性狀相關(guān)蛋白的基因組基因具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №9的多核苷酸；2)編碼序列表中SEQ ID №10蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中的SEQ ID №9限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的編碼基因，其特征在于所述豬生產(chǎn)性狀相關(guān)蛋白的cDNA基因具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的多核苷酸；2)編碼序列表中SEQ ID №10蛋白質(zhì)序列的DNA；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中的SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
6.含有權(quán)利要求3或4或5所述編碼基因的載體。
7.含有權(quán)利要求3或4或5所述編碼基因的細(xì)胞系或宿主菌。
8.一種檢測豬生產(chǎn)性狀的方法，是檢測自序列表中序列9的5′端第8603位核苷酸或自序列表中序列3的5′端第200位核苷酸為G還是A，確定豬的基因型，然后通過基因型確定生產(chǎn)性狀。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于檢測自序列表中序列9的5′端第8603位核苷酸或自序列表中序列3的5′端第200位核苷酸為G還是A的方法包括先PCR擴(kuò)增含有自序列表中序列9的5′端第8603位核苷酸的基因組片段，然后對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序或者用HinfI酶切擴(kuò)增產(chǎn)物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述豬生產(chǎn)性狀為豬肌內(nèi)脂肪含量和/或腿臀比率。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種豬生產(chǎn)性狀相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。該蛋白為具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №10；2)將序列表中SEQ ID №10的氨基酸殘基序列經(jīng)過一或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗逆性相關(guān)的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的豬生產(chǎn)性狀相關(guān)蛋白的基因組基因中存在一個單核苷酸多態(tài)性位點，該位點與豬的生產(chǎn)性狀，尤其是豬肌內(nèi)脂肪含量和腿臀比率相關(guān)。本發(fā)明的豬生產(chǎn)相關(guān)蛋白及其編碼基因?qū)⒃谪i的育種中發(fā)揮重要作用。
文檔編號C12N15/12GK1824676SQ20061006685
公開日2006年8月30日 申請日期2006年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月31日
發(fā)明者李奎, 王煥嶺, 楊述林, 朱正茂, 王恒 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所