專利名稱：一種用于體外診斷非綜合征性常染色體隱性遺傳耳聾基因gjb2突變的引物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及一種用于體外診斷非綜合征性常染色體隱性遺傳耳聾基因GJB2基因全編碼區(qū)突變及233-235delC熱點突變的引物。本發(fā)明還涉及該引物在制備用于體外診斷非綜合征性常染色體隱性遺傳耳聾基因GJB2全編碼區(qū)突變的試劑盒或類似產(chǎn)品中的應(yīng)用，具體是涉及含有該引物的試劑盒或類似產(chǎn)品，其可用于體外診斷非綜合征性常染色體隱性遺傳耳聾基因GJB2基因全編碼區(qū)突變及233-235delC熱點突變。
背景技術(shù)：
目前，有1/1000-3/1000的兒童出生時為極重度耳聾。一半以上的兒童期耳聾為遺傳性聾，并且大多數(shù)為常染色體隱性及非綜合征性聾。在遺傳性聾當(dāng)中，70％以上為非綜合征性聾(Cremers C W等，Ann N YAcad Sci，1991，630191-196)，其中75-80％為常染色體隱性遺傳。常染色體隱性遺傳性聾患者中50％為GJB 2突變(Kelley PM等，Am JHum Genet，1998，62792-799)；其余50％為其它基因突變所引起，并且多數(shù)只在1-2個家系中存在。GJB2基因突變與遺傳性非綜合征性耳聾密切相關(guān)，是其主要致病原因。GJB2基因編碼的Cx26屬于縫隙連接蛋白基因家族(SEQ ID NO4，編碼區(qū)兩側(cè)各有200個堿基的非翻譯區(qū)序列)，形成的縫隙連接通道在電解質(zhì)、第二信使和代謝產(chǎn)物的傳導(dǎo)和交換中起重要作用。GJB2基因編碼區(qū)的突變導(dǎo)致無功能蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，縫隙連接缺損，使鉀離子回流進(jìn)入內(nèi)淋巴液的循環(huán)受到影響，Corti氏器鉀中毒，從而引起感音神經(jīng)性聾。已發(fā)現(xiàn)GJB2基因有108種突變方式(http://davinci.crg.es/deafness/2005-1-30)，突變熱點存在種族差異。我們采用酶切的方法，對廣東、廣西、河南、河北、山西、黑龍江、吉林、內(nèi)蒙古、安徽、北京等地區(qū)聾啞學(xué)校的998例散發(fā)非綜合征性耳聾患兒進(jìn)行了GJB2 233-235位點的檢測，同時對204例聽力正常兒童進(jìn)行對照檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，998例患兒中173例(17.33％)發(fā)現(xiàn)有235delC(即第235位點C缺失，下同)突變，其中76例為235delC純合突變(7.61％)，97例為235delC雜合突變(9.72％)；正常對照204例，發(fā)現(xiàn)235delC雜合突變2例(0.98％)，未發(fā)現(xiàn)235delC純合突變。結(jié)果表明，在中國人中，兒童非綜合征性常染色體隱性遺傳性耳聾主要為GJB2基因突變所致，其突變的主要方式為233-235delC(即233、235位點中C缺失，下同)，檢出率為17.33％，同時發(fā)現(xiàn)各地GJB2基因233-235delC突變的檢出率不同(參見表2)。鑒于該基因233-235delC突變在我國非綜合征性常染色體陰性遺傳性耳聾患者中所占比例較高，使得其成為一種必要的待檢基因。
我們利用直接測序的方法，從以上所述廣東、廣西、河南、河北、山西、黑龍江、吉林、內(nèi)蒙古、安徽、北京等地區(qū)聾啞學(xué)校的998例散發(fā)非綜合征性耳聾患兒中，酶切顯示233-235delC雜合突變的患兒進(jìn)行正、反向測序，并在各地抽取40-50例進(jìn)行GJB2基因全編碼區(qū)突變檢測，同時抽取100例聽力正常兒童進(jìn)行對照檢測。發(fā)現(xiàn)GJB2基因233-235delC雜合突變者約一半伴有另一個突變位點，檢出率為49.02％，其中299-300delAT(即第299-300位點AT缺失，下同)占72％；在無233-235delC突變者中發(fā)現(xiàn)3個其他突變。結(jié)果表明，在中國人中，兒童非綜合征性常染色體隱性遺傳性耳聾GJB2基因233-235delC突變?yōu)橹饕蛔兎绞?，且多伴有另一個突變位點，即299-300delAT突變?yōu)榱硪粋€主要的突變方式。
大部分進(jìn)行遺傳咨詢的家庭由正常聽力的父母和耳聾患兒組成，咨詢目的為了解再次生出聾兒的可能性。由于導(dǎo)致語前聾的環(huán)境因素的存在，有時無法判斷患者是否為遺傳性聾。GJB2基因的突變鑒定，給遺傳咨詢帶來了很大幫助。同時，GJB2基因的突變鑒定給咨詢后的治療也帶來很大幫助。由于GJB2相關(guān)性耳聾者的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的數(shù)量正常，因此在耳蝸植入后GJB2相關(guān)性耳聾患兒的言語理解能力強于非GJB2相關(guān)性患兒，GJB2突變相關(guān)性耳聾為人工耳蝸植入的指征，并預(yù)示患兒耳蝸植入的預(yù)后良好。因此，檢測鑒定GJB2基因的突變應(yīng)當(dāng)作為耳聾篩查的一項常規(guī)內(nèi)容。
目前，檢測鑒定GJB2基因的方法多種多樣，包括限制性片段長度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)、限制酶切指紋一單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(REF-SSCP)、聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(PCR-SSCP)、變性梯度凝膠電泳法(DGGE)、變性高效液相色譜分析(dHPLC)及直接測序(DS)等。但是上述方法由于成本高，需要昂貴的設(shè)備，操作復(fù)雜，技術(shù)要求高，并且耗時耗力，并不適合篩查和推廣使用。
由于我們發(fā)現(xiàn)中國人GJB2基因的突變熱點在233-235位點，且具有該位點突變的耳聾患者即可確定其耳聾為GJB2基因突變所致；233-235位點中缺失堿基C后，導(dǎo)致230-235位點序列的改變，因此與野生型樣品相比，GJB2基因230-235位點delC突變的樣品不能被內(nèi)切酶ApaI酶切。而酶切的前提是對GJB2基因全編碼區(qū)各突變點的高效擴增和序列分析，因此設(shè)計合適的正反向引物一次擴增GJB2基因全編碼區(qū)、適用于測序反應(yīng)并保證無片斷丟失和非特異性擴增是非常重要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是基于以下原理進(jìn)行實施由于我們發(fā)現(xiàn)中國人GJB2基因的突變熱點在233-235位點，且具有該位點突變的耳聾患者即可確定其耳聾為GJB2基因突變所致；233-235位點缺失堿基C后，導(dǎo)致230-235位點序列的改變。相比之下，野生型樣品的GJB2基因230-235位點可以找到相應(yīng)的內(nèi)切酶ApaI，因此設(shè)計合適的正反向引物一次擴增GJB2基因全編碼區(qū)并結(jié)合酶切法，可用于體外診斷非綜合征性常染色體隱性遺傳耳聾基因GJB2全編碼區(qū)突變及233-235delC突變。
因此，本發(fā)明第一個目的是提供用于體外診斷非綜合征性常染色體隱性遺傳耳聾基因GJB2全編碼區(qū)突變的引物，其中正向引物Fn1的3’末端位于如序列SEQ ID NO3所示的GJB2基因編碼區(qū)上游約115bp處，反向引物Fn1的3’末端位于該編碼區(qū)下游約110bp處，正向引物Fn1和反向引物R3c長度范圍在18-22bp，并能完全擴增GJB2基因編碼區(qū)。
該引物通過通過下述的方案設(shè)計使用Genetool Lite程序(美國Biotools公司提供的軟件)協(xié)助設(shè)計引物，通過PC R擴增，將GJB2編碼區(qū)完全擴增，然后用該基因的230-235位點相應(yīng)的限制性酶消化，檢測233-235delC突變位點的存在；對于發(fā)現(xiàn)233-235delC雜合突變者進(jìn)行直接測序，檢測另一個致病突變位點的存在。引物的設(shè)計是本發(fā)明的關(guān)鍵，我們通過上百次實驗，進(jìn)行了大量的引物設(shè)計和驗證工作，最后發(fā)現(xiàn)如果正向引物Fn1的3’末端位于如序列SEQ ID NO3(GJB2基因編碼區(qū))所示的GJB2基因編碼區(qū)上游約115bp處，反向引物Fn1的3’末端位于該編碼區(qū)下游約110bp處，正向引物Fn1和反向引物R3c長度范圍在18-22bp，就能完全擴增GJB2基因編碼區(qū)。由此，最終可選擇具有極高擴增效率一對或幾對引物，一次性擴增GJB2全編碼區(qū)和重要剪切部位。所設(shè)計的引物中，正向引物Fn1的3’末端位于編碼區(qū)的上游約115bp處，；反向引物R3c的3’末端位于編碼區(qū)的下游約110bp，正向引物Fn1和反向引物R3c長度范圍在18-22bp，就能完全擴增GJB2基因編碼區(qū)。
在該發(fā)明目的一個實施方案中，所使用的軟件程序包括但不限于Genetool Lite程序(美國Biotools公司提供的軟件)、Vector NTI、Oligo、Genestar、DNAMAN、DNASTAR、DNAtool、proteintool、Enzyme、pDRAW、Primer3、Primer5、Seq Convertor、DNAassist等等。
在該發(fā)明目的另一個實施方案中，引物設(shè)計的指導(dǎo)思想是將GJB2基因的編碼區(qū)(第二外顯子)完全擴增，提供限制性酶切位點，保證測序過程中無片斷丟失。使用GenetoolLite程序協(xié)助設(shè)計引物，設(shè)計原則為根據(jù)己知的GJB2基因的序列，使正向引物Fn1的3’末端位于編碼區(qū)的上游約115bp處，反向引物R3c的3’末端位于編碼區(qū)的下游約110bp處，從而使PCR擴增后的產(chǎn)物包含整個編碼區(qū)，并超出編碼區(qū)范圍100bp，可預(yù)防測序反應(yīng)中部分片段的丟失。推薦測序應(yīng)用ABI3730序列分析儀。
用以上設(shè)計的引物Fn1、R3c，以被測樣本的DNA為模板，通過PCR擴增后能夠獲得明亮清晰的944bp的條帶。若模板為野生型分子，則944bp的PCR產(chǎn)物存在ApaI酶切位點，ApaI酶切后獲得585bp和359bp兩個條帶；若模板為233-235delC純合突變型分子，則導(dǎo)致230-235位點序列改變，944bp的PCR產(chǎn)物不存在ApaI酶切位點，不能被ApaI切開，酶切后仍是944bp 1個條帶；若模板為233-235delC雜合突變型分子，則944bp的PCR產(chǎn)物有1條帶可被ApaI酶切，另1條帶不能被ApaI切開，酶切后獲得944bp、585bp和359bp 3個條帶。利用此區(qū)別，可以對233-235delC突變型分子進(jìn)行簡單、快速的測定。
用以上設(shè)計的引物Fn1、R3c，對發(fā)現(xiàn)233-235delC雜合突變的DNA PCR產(chǎn)物進(jìn)行正、反向測序發(fā)應(yīng)擴增，純化后變性、直接測序，可以準(zhǔn)確的檢測到全編碼區(qū)的突變位點。
根據(jù)上述原理和實施方案的篩選結(jié)果，其中正向引物Fn1序列優(yōu)選選自具有序列表或表1中的SEQ ID NO1所示的序列，反向引物R3c序列優(yōu)選選自具有序列表或表1中的SEQ ID NO2所示的序列；正反向引物可用于測序PCR反應(yīng)，直接測序保證檢測到GJB2全部編碼區(qū)，無片段丟失；引入的限制酶ApaI內(nèi)切酶(GGGCC↓C)，其識別序列位于GJB2基因DNA的核苷酸230-235位點。
表1 合成的引物序列

本發(fā)明第二個目的是提供該引物在制備用于體外診斷非綜合征性常染色體隱性遺傳耳聾基因GJB2 233-235delC突變的試劑盒或類似產(chǎn)品中的應(yīng)用。
具體地說，該應(yīng)用是提供一種用于體外診斷非綜合征性常染色體隱性遺傳耳聾基因GJB2的233-235delC突變的試劑盒或類似產(chǎn)品，包括(1)PCR擴增反應(yīng)試劑，包括dNTP、10×PCR緩沖液、Mg++、三蒸水、Taq酶；(2)等比例混合的正向引物Fn1和反向引物R3c；(3)限制性酶ApaI及其配套的緩沖液；(4)陽性標(biāo)本對照、陰性標(biāo)本對照；如果需要，還包括(5)使用說明書。
上述試劑盒或類似產(chǎn)品適用于直接提供DNA的被測樣本。
如果檢測過程中還涉及樣品或血樣DNA的提取，則試劑盒或類似產(chǎn)品還包括用于提取血樣DNA的試劑。該試劑可以是提取足根血DNA的溶液I，其主要成分為Chelex(ABI公司產(chǎn)品)的DNA裂解液的溶液I；也可以是為提取外周血DNA的提取試劑(選用市售產(chǎn)品配套使用)。
也就是說，根據(jù)取血方式或被測樣本形式的不同，本發(fā)明的試劑盒有三種類型可供選用，三種類型中除了提取血樣DNA的試劑外，其余組分都相同。一型試劑盒的提取血樣DNA的試劑為用作DNA裂解液的溶液1，其主要成分是Chelex(ABI公司產(chǎn)品)，適用于足跟血血片被測樣本；二型試劑盒的提取血樣DNA的試劑為外周血DNA試劑盒(選用市售產(chǎn)品配套使用)，適用于外周血被測樣本；三型試劑盒不含提取血樣DNA的試劑，適用于直接提供DNA的被測樣本。
由此可見，該發(fā)明目的所述的試劑盒或類似產(chǎn)品，其主要功能在于將所有試劑集成在一個小盒內(nèi)，使得DNA提取、核酸片段擴增、酶切及測序鑒定可以在試劑盒提供的試劑基礎(chǔ)上順序完成。
應(yīng)當(dāng)指出，術(shù)語“類似產(chǎn)品”是指具有不同于試劑盒的名稱，但與試劑盒具有類似結(jié)構(gòu)或組分以及生物學(xué)功能的生物學(xué)產(chǎn)品。
本發(fā)明的第三個發(fā)明目的是在上述試劑盒或類似產(chǎn)品能酶切鑒定GJB2基因突變基礎(chǔ)上，提供一種還可同時對GJB2基因編碼區(qū)進(jìn)行測序的試劑盒或類似產(chǎn)品。該試劑盒或類似產(chǎn)品除含有上述試劑盒或類似產(chǎn)品的組成之外，還包括用于對GJB2基因編碼區(qū)進(jìn)行測序的PCR純化試劑、測序PCR反應(yīng)及變性試劑。其中PCR純化試劑包括PH＝5.2的3M醋酸鈉、100％酒精、75％酒精、125mM EDTA，測序PCR反應(yīng)及變性試劑包括2.5×Bigdye、5×Buffer、甲酰胺。
用本發(fā)明的方法檢測非綜合征性常染色體隱性遺傳性耳聾GJB2基因突變有以下優(yōu)點1.本研究主要創(chuàng)新點和特點是通過上百次實驗發(fā)現(xiàn)高效擴增GJB2基因全長開放閱讀框架(ORF)序列和兩側(cè)至少50bp的側(cè)翼序列的引物，該引物PCR穩(wěn)定、特異，作為測序引物工作時不論正向還是反向均一次性讀完GJB2全部ORF和兩側(cè)剪切部位序列。
2.ApaI酶切法的操作步驟簡單，限制性酶國內(nèi)供應(yīng)源豐富，成本低，這些特點為在全國范圍內(nèi)實行GJB2基因233-235delC突變的篩查和遺傳咨詢提供了便利的條件，從而減少遺傳性耳聾患兒出生的機會。
3.用ApaI酶切純合突變型分子，不能被ApaI切開；用ApaI酶切雜合突變型分子，有1條帶被ApaI切開，另1條帶不能被切開，酶切后可見3條帶；用ApaI酶切野生型分子，可完全被ApaI切開，酶切后可見2條帶。只要在此位點的突變，均可利用本方法檢測。因此，本發(fā)明的方法直接、可靠。
4.利用本發(fā)明所涉及引物的酶切法和測序法結(jié)合，大大提高了GJB2基因診斷的工作效率，由酶切法提示無235delC雜合突變的個體，僅須通過單向測序即可完成GJB2全序列測定(若全序列測定發(fā)現(xiàn)其他位點的雜合框架位移突變，再補行反向測序)；酶切法提示235delC雜合突變個體，則同時行正反向測序，本方法將節(jié)約40％的測序量。


圖1是ApaI酶切法鑒定GJB2基因233-235delC突變的2％瓊脂糖凝膠電泳圖，其中泳道1、3-5無233-235delC突變患者；泳道2233-235delC雜合突變患者；泳道6233-235delC純合突變患者；泳道7、8陰性對照；泳道9陽性對照；泳道10分子量標(biāo)志。
圖2-A是AGJB2基因233-235delC純合突變的PCR產(chǎn)物直接測序。
圖2-B是GJB2基因233-235delC雜合突變的PCR產(chǎn)物直接測序。
圖2-C是野生型GJB2基因的PCR產(chǎn)物直接測序。
圖3-A是GJB2基因299-300delAT雜合突變PCR產(chǎn)物直接測序。
圖3-B是GJB2基因299-300delAT雜合突變PCR產(chǎn)物直接測序。
具體實施例方式
現(xiàn)在僅用參考下面非限制性的實施例的方式進(jìn)一步描述本發(fā)明。但是應(yīng)當(dāng)理解，下面的實施例僅僅是作為例證的，不應(yīng)以任何方式當(dāng)作對上述本發(fā)明總體的限制。除非有其它說明，本發(fā)明的實施例使用本領(lǐng)域中的傳統(tǒng)分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、PCR擴增和突變技術(shù)等等。這些技術(shù)是技術(shù)人員熟知的，并在文獻(xiàn)中有詳細(xì)解釋。參見，例如，Sambrookand Russell″Molecular CloningA Laboratory Manual″(2001)；CloningA Practical Approach，″Volumes I and II(D.N.Glover，ed.，1985)″；T.A Brown“Genome”BIOS Scientific Publishers Limited.
實施例1 非綜合征性常染色體隱性遺傳耳聾基因GJB2基因突變的ApaI酶切法鑒定1.檢測樣本收集中國各地聾啞學(xué)校的998例非綜合征性耳聾患兒，經(jīng)PCR擴增GJB2基因編碼區(qū)，用酶切方法初步分析已知的233-235位點。同時，取204例聽力正常兒童作為對照組。對酶切顯示233-235delC雜合突變的患兒進(jìn)行正、反向測序，并在各地抽取40-50例進(jìn)行GJB2基因全編碼區(qū)突變檢測，同時抽取100例聽力正常兒童進(jìn)行對照檢測。
2.引物設(shè)計使用GenetoolLite程序協(xié)助設(shè)計改良引物，根據(jù)己公開的線粒體基因劍橋序列(Cambridge Sequence)，引物的設(shè)計方案為使正向引物Fn1的3’末端位于編碼區(qū)的上游約115bp處，反向引物R3c的3’末端位于編碼區(qū)的下游約110bp處(參照表1)；3.PCR擴增反應(yīng)根據(jù)上述設(shè)計的引物序列SEQ ID NO1和SEQ ID NO2，通過人工合成(通過給定序列由自動化核酸合成儀合成)得到正向引物Fn1和反向引物R3c，并以上述提取的被測樣本周邊血DNA為模板，進(jìn)行PCR擴增反應(yīng)反應(yīng)體系模板 100ng引物Fn 1，R3c各5pmol10×dNTP 5μl10×Buffer 5μlMg++終濃度15mmol/L
Taq酶2.5u加三蒸水 至50μl體積反應(yīng)條件94℃5min；94℃30sec，58℃30sec，72℃30sec，30個循環(huán)；72℃延伸5min。
用2％瓊脂糖凝膠電泳檢查產(chǎn)物。PCR擴增后Fn1、R3c能夠獲得明亮清晰的944bp的條帶。若模板為233-235delC純合突變型分子，則944bp的PCR產(chǎn)物，不能被ApaI切開；若模板為233-235delC雜合突變型分子，PCR產(chǎn)物有1條帶ApaI切開，酶切后可見3條帶；若模板為野生型分子，則PCR產(chǎn)物可完全被ApaI切開，酶切后可見2條帶。
4.ApaI酶切檢測被測樣本的PCR擴增產(chǎn)物按下述條件檢測233-235delC突變。
酶切反應(yīng)體系PCR產(chǎn)物5μl10×緩沖液 1μlApaI限制性酶 15u三蒸水補足體積至10μl，37℃溫育2小時。酶切反應(yīng)物用2％瓊脂糖凝膠檢查。
5.結(jié)果998例患兒中發(fā)現(xiàn)173例(17.33％％)為235delC突變，其中76(7.61％)為235delC純合突變，97(9.72％)為235delC雜合突變，各地區(qū)突變率不同(參見表2)。對照組204例正常兒童中檢測只有2例可見235delC雜合突變，余均為正常，攜帶率為0.98％。76例患兒的Fn1R3c的PCR產(chǎn)物不能被ApaI酶切開(參見圖1的泳道6)，表明其為233-235delC純合性突變。97例患兒及2例聽力正常兒童的PCR產(chǎn)物有1條帶被ApaI酶切開，另1條帶無法切開(參見圖1的泳道2)，表明其為233-235delC雜合性突變。其余患者及聽力正常兒童的PCR產(chǎn)物可被ApaI酶切開，表明其不存在233-235delC突變。
實施例2.直接測序法檢驗ApaI酶切法的可靠性步驟1-4除樣品提取足根血DNA之外，其余與實施例1的步驟1-4相同。以下是對直接測序的過程，其中使用前述的試劑盒。
5.PCR產(chǎn)物純化1被測樣本的PCR擴增產(chǎn)物按下述條件進(jìn)行第一步純化加入0.5倍體積醋酸鈉(PH＝5.2)、2.5倍體積100％酒精，室溫放置20分鐘，5700轉(zhuǎn)離心20分鐘，去上清；加入75％酒精200ul，5700轉(zhuǎn)離心15分鐘，去上清，95℃烘干1分鐘；加入20ul雙蒸水溶解；經(jīng)凝膠電泳測定DNA含量后，將其稀釋成5ng/ul。
6.測序PCR反應(yīng)純化并稀釋后的PCR擴增產(chǎn)物按下述條件擴增反應(yīng)體系為10ul模板 1ul引物 1.5ul2.5×Bigdye 0.5ul5×Buffer1.5ul三蒸水 5.5ul反應(yīng)條件96℃1min；94℃10sec，50℃5sec，60℃4min，25個循環(huán)。
7.PCR產(chǎn)物純化2被測樣本的測序PCR擴增產(chǎn)物按下述條件進(jìn)行第二步純化
加入1ul 125mM EDTA、1ul 3M醋酸鈉、25ul 100％酒精，室溫放置15min，5700轉(zhuǎn)室溫離心20min后去上清；加入75％酒精200ul，反復(fù)混勻，離心15min后去上清，重復(fù)此步驟；95℃烘干5min后，加入甲酰胺13ul溶解；置于PCR儀95℃變性5min后迅速放入冰中4min，方可進(jìn)行測序。
8.直接測序法檢測ApaI酶切法可靠性的結(jié)果廣東、廣西、河南、河北、山西、黑龍江、吉林、內(nèi)蒙古、安徽、北京等地區(qū)聾啞學(xué)校的998例散發(fā)非綜合征性耳聾患兒中，對酶切顯示233-235delC雜合突變的患兒進(jìn)行正、反向測序，并在各地抽取40-50例進(jìn)行GJB2基因全編碼區(qū)突變檢測，同時抽取100例聽力正常兒童進(jìn)行對照檢測。發(fā)現(xiàn)GJB2基因233-235delC雜合突變者約一半伴有另一個突變位點，檢出率為49.02％，其中299-300delAT占72％；無233-235delC突變者有3例存在另一個突變。其結(jié)果證明根據(jù)ApaI酶切表明，PCR擴增產(chǎn)物未被切開的7例耳聾患者，其擴增產(chǎn)物的測序圖均為233-235delC純合性突變；PCR擴增產(chǎn)物有1條帶被切開，另1條帶未被切開的102例耳聾患者，其擴增產(chǎn)物的測序圖均為233-235delC雜合性突變；而PCR擴增產(chǎn)物完全被切開的耳聾患者，其擴增產(chǎn)物的測序圖均為233-235位點正常圖，表明無233-235delC突變，以上結(jié)果參見圖2-A/B/C。酶切方法與直接測序的吻合率為100％，說明使用本發(fā)明方法檢測GJB2突變的可靠性、穩(wěn)定性和高效性。
233-235位點突變在非綜合征性常染色體隱性遺傳性耳聾患者中的頻率(17.33％)及在聽力正常兒童中攜帶率(0.98％)的明顯不同、49.02％的233-235delC雜合突變患兒伴有另一個突變位點，最常見的為299-300delAT占72％(參見圖3-A/B)，說明本發(fā)明方法檢測GJB2基因突變在大規(guī)模篩查及診斷、遺傳咨詢中的重要性。
表2 不同地區(qū)非綜合征性耳聾患兒235delC突變頻率

序列表<210>SEQ ID NO1<211>20bp<212>DNA<212>正向引物Fn15′-TTGGTGTTTGCTCAGGAAGA-3′<210>SEQ ID NO2<211>20bp<212>DNA
<213>反向引物R3c5′-GGCCTACAGGGGTTTCAAAT-3′<210>SEQ ID NO3<211>1081bp<212>DNA<213>GJB2基因編碼區(qū)(下劃線)及兩側(cè)各200個堿基的非翻譯區(qū)序列CATTTAATCCTATGACAAACTAAGTTGGTTCTGTCTTCACCTGTTTTGGTGAGGTTGTGTAAGAGTTGGTGTTTGCTCAGGAAGAGATTTAAGCATGCTTGCTTACCCAGACTCAGAGAAGTCTCCCTGTTCTGTCCTAGCTAGTGATTCCTGTGTTGTGTGCATTCGTCTTTTCCAGAGCAAACCGCCCAGAGTAGAAGATGGATTGGGGCACGCTGCAGACGATCCTGGGGGGTGTGAACAAACACTCCACCAGCATTGGAAAGATCTGGCTCACCGTCCTCTTCATTTTTCGCATTATGATCCTCGTTGTGGCTGCAAAGGAGGTGTGGGGAGATGAGCAGGCCGACTTTGTCTGCAACACCCTGCAGCCAGGCTGCAAGAACGTGTGCTACGATCACTACTTCCCCATCTCCCACATCCGGCTATGGGCCCTGCAGCTGATCTTCGTGTCCACGCCAGCGCTCCTAGTGGCCATGCACGTGGCCTACCGGAGACATGAGAAGAAGAGGAAGTTCATCAAGGGGGAGATAAAGAGTGAATTTAAGGACATCGAGGAGATCAAAACCCAGAAGGTCCGCATCGAAGGCTCCCTGTGGTGGACCTACACAAGCAGCATCTTCTTCCGGGTCATCTTCGAAGCCGCCTTCATGTACGTCTTCTATGTCATGTACGACGGCTTCTCCATGCAGCGGCTGGTGAAGTGCAACGCCTGGCCTTGTCCCAACACTGTGGACTGCTTTGTGTCCCGGCCCACGGAGAAGACTGTCTTCACAGTGTTCATGATTGCAGTGTCTGGAATTTGCATCCTGCTGAATGTCACTGAATTGTGTTATTTGCTAATTAGATATTGTTCTGGGAAGTCAAAAAAGCCAGTTTAACGCATTGCCCAGTTGTTAGATTAAGAAATAGACAGCATGAGAGGGATGAGGCAACCCGTGCTCAGCTGTCAAGGCTCAGTCGCTAGCATTTCCCAACACAAAGATTCTGACCTTAAATGCAACCATTTGAAACCCCTGTAGGCCTCAGGTGAAACTCCAGATGCCACAATGGAGCTCTGCTCCCCTAAAGCCTCAAAACA<210>SEQ ID NO4<211>6bp
<212>DNA<213>Apa I限制性內(nèi)切酶位點GGGCC↓C
權(quán)利要求
1.一種用于體外診斷非綜合征性常染色體隱性遺傳耳聾基因GJB2全編碼區(qū)突變的引物，其特征在于正向引物Fn1的3’末端位于如序列SEQ ID NO3所示的GJB2基因編碼區(qū)上游約115bp處，反向引物Fn1的3’末端位于該編碼區(qū)下游約110bp處，正向引物Fn1和反向引物R3c長度范圍在18-22bp，并能完全擴增GJB2基因編碼區(qū)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物，其中正向引物Fn1選自具有如SEQID NO1所示的引物序列；反向引物Fn1選自具有如SEQ ID NO2所示的引物序列。
3.權(quán)利要求1或2所述的引物在制備用于體外診斷非綜合征性常染色體隱性遺傳耳聾基因GJB2全編碼區(qū)突變的試劑盒或類似產(chǎn)品中的應(yīng)用。
4.一種用于體外診斷非綜合征性常染色體隱性遺傳耳聾基因GJB2的233-235delC突變的試劑盒或類似產(chǎn)品，包括(1)PCR擴增反應(yīng)試劑，包括dNTP、10×PCR緩沖液、Mg++、三蒸水、Taq酶；(2)等比例混合的權(quán)利要求1或2所述的正向引物Fn1和反向引物R3c；(3)限制性酶ApaI及其配套的緩沖液；(4)陽性標(biāo)本對照、陰性標(biāo)本對照；如果需要，還包括(5)使用說明書。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒或類似產(chǎn)品，其中還包括用于提取血樣DNA的試劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒或類似產(chǎn)品，其中所述的提取血樣DNA的試劑為提取足根DNA的溶液I，其主要成分為Chelex的DNA裂解液的溶液I。
7根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒或類似產(chǎn)品，其中所述的提取血樣DNA的試劑為提取外周血DNA的提取試劑。
8.權(quán)利要求4-7中任何一項所述的試劑盒或類似產(chǎn)品，其中還包括用于對GJB2基因編碼區(qū)進(jìn)行測序的PCR純化試劑、測序PCR反應(yīng)及變性試劑。
9.權(quán)利要求8所述的試劑盒或類似產(chǎn)品，其中PCR純化試劑包括PH＝5.2的3M醋酸鈉、100％酒精、75％酒精、125mM EDTA，測序PCR反應(yīng)及變性試劑包括2.5×Bigdye、5×Buffer、甲酰胺。
全文摘要
本發(fā)明提供用于體外診斷非綜合征性常染色體隱性遺傳耳聾基因GJB2基因全編碼區(qū)突變及233－235delC熱點突變的引物。該引物可以一次性完成GJB2全編碼區(qū)和兩側(cè)重要剪切序列的擴增。本發(fā)明還提供含有該引物和ApaI內(nèi)切酶的試劑盒或類似產(chǎn)品，其可用于體外檢測GJB2基因全編碼區(qū)突變及233－235delC熱點突變。該試劑盒或類似產(chǎn)品除了通過引物擴增、ApaI酶切鑒定GJB2基因突變的功能之外，還可同時用相同的正向引物進(jìn)行測序PCR反應(yīng)，利用測序儀直接測序，一次單向檢測GJB2全編碼區(qū)的突變位點；對于發(fā)現(xiàn)的缺失或插入雜合突變，用相同的反向引物進(jìn)行測序。因此該試劑盒或類似產(chǎn)品適用于對非綜合征性常染色體隱性遺傳耳聾基因GJB2基因突變進(jìn)行大規(guī)模的篩查及診斷、遺傳咨詢。
文檔編號C12Q1/68GK1873027SQ20061006622
公開日2006年12月6日 申請日期2006年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月30日
發(fā)明者戴樸, 于飛, 韓東一, 金政策 申請人:韓東一, 金政策