專利名稱：海藻酸鈉和胰酶混合微膠囊及其制備與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生產(chǎn)酪蛋白磷酸肽所用酶及其制備領(lǐng)域，涉及固定化酶技術(shù)，特別涉及海藻酸鈉和胰酶混合微膠囊及其制備與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
酪蛋白磷酸肽(Casein Phosphopeptides，CPPs)是牛乳酪蛋白經(jīng)適合的蛋白酶酶解所得到的一系列含有磷酸絲氨酸(phosphoseryl)簇的天然生理活性肽，以下簡稱CPPs。大量研究表明在動(dòng)物小腸內(nèi)pH呈中性到弱堿性的環(huán)境中，CPPs能使鈣保持溶解的狀態(tài)，使腸內(nèi)溶解鈣的量保持在較高水平，從而促進(jìn)鈣的吸收和利用，因此CPPs被稱之為促鈣吸收因子。然而在傳統(tǒng)的CPPs生產(chǎn)工藝中，所使用的酶有兩種一種是一般的蛋白酶，另一種是固定化酶。一般所使用的蛋白酶不穩(wěn)定，容易因條件變化如溫度、酸堿度變化而降低活力，為蛋白酶的儲(chǔ)藏和運(yùn)輸帶來了不便，并且通常情況下蛋白酶是以液態(tài)的形式參加反應(yīng)，使蛋白酶反應(yīng)后不能回收，從而增加了生產(chǎn)成本。所以，酶制劑的研究是生產(chǎn)CPPs的關(guān)鍵。
固定化酶是指固定在載體上并在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行催化反應(yīng)的酶。固定化酶技術(shù)是二十世紀(jì)六十年代開始發(fā)展起來的一項(xiàng)新技術(shù)，較一般的蛋白酶具有較好的穩(wěn)定性，易回收，使用方便等優(yōu)點(diǎn)，但從應(yīng)用的情況看，酶的固定化技術(shù)還處在起步階段，有許多技術(shù)難題還有待進(jìn)一步解決。到目前為止，真正在工業(yè)上使用的固定化酶還僅限于固定化葡萄糖異構(gòu)酶，近年來，人們的研究開始轉(zhuǎn)向固定化酶在工業(yè)、醫(yī)學(xué)、化學(xué)分析、環(huán)保、能源開發(fā)以及理論研究等方面的應(yīng)用研究。尋找合適的固定化酶載體和酶是生產(chǎn)固定化酶的兩個(gè)關(guān)鍵要素。
胰酶是存在于胰臟中的酶的混合物，含有五種蛋白水解酶(胰蛋白酶、羧肽酶A與B、糜蛋白酶、彈性蛋白酶和激肽釋放酶)和胰淀粉酶、胰脂肪酶與核糖核酸酶等成分。在水解CPPs的過程中比單一的蛋白水解酶如胰蛋白酶，具有以下兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)一、不需提純，成本低廉；二、由于胰酶是混合酶，可作用的切割位點(diǎn)更多，生成的水解產(chǎn)物(CPPs)肽鏈更短，質(zhì)量更好。
海藻酸鈉是由海藻(海帶，馬尾藻，褐藻，巨藻等可食用的海洋藻類植物)提取加工的副產(chǎn)物。海藻酸鈉可做成各種凝膠，且保持良好的膠體形態(tài)，不發(fā)生滲液或收縮，機(jī)械性能良好，是一種穩(wěn)定性極好的新型載體。
目前為止，采用海藻酸鈉為載體固定胰酶來生產(chǎn)CPPs尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種海藻酸鈉與胰酶混合微膠囊及其制備方法與用途。所制備的微膠囊對溫度和酸堿度都有很好的耐受性，可重復(fù)使用于水解酪蛋白，達(dá)到生產(chǎn)酪蛋白磷酸肽(CPPs)的目的。
本發(fā)明提供的技術(shù)方案是海藻酸鈉和胰酶混合微膠囊，以海藻酸鈉為載體固定胰酶制得，其具體方法是取海藻酸鈉溶于水中配置0.5％-4％的海藻酸鈉溶液I，再將胰酶粉末加入到溶液I中，充分混合，使得胰酶終濃度為0.1％-2.8％，得溶液II，然后使用注射器將溶液II滴入2％CaCl2溶液中，攪拌1h，得白色球體，取出用水洗至中性，經(jīng)干燥后即制得海藻酸鈉和胰酶的混合微膠囊。
需要說明的是上述CaCl2溶液的量與海藻酸鈉溶液I的體積比為1∶1-4∶1，推薦使用體積比為2∶1。
海藻酸鈉和胰酶的混合微膠囊的用途，可作為酪蛋白水解酶，水解酪蛋白生成酪蛋白磷酸肽(CPPs)。
有益效果該微膠囊有很好的機(jī)械穩(wěn)定性，最大程度的保存了酶的活力，對溫度和酸堿度有良好的耐受性，具有較長的保存期限，便于儲(chǔ)藏與運(yùn)輸。而且該微膠囊在使用后便于回收，可重復(fù)利用，既解決了一般酶成本高，不易保存且受外界條件影響較大的缺陷，又由于胰酶是混合酶，可作用的切割位點(diǎn)更多，生成的水解產(chǎn)物(CPPs)肽鏈更短，質(zhì)量更好。本發(fā)明的微膠囊為高效生產(chǎn)CPPs奠定了基礎(chǔ)。該微膠囊可作為穩(wěn)定的蛋白水解酶用于醫(yī)藥、食品添加劑等領(lǐng)域。


圖1本發(fā)明的未風(fēng)干的海藻酸鈉與胰酶混合微膠囊；圖2本發(fā)明的風(fēng)干后的海藻酸鈉與胰酶混合微膠囊。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1以海藻酸鈉為載體固定胰酶制得，具體做法為取3g海藻酸鈉溶于100mL水中配置3％的海藻酸鈉溶液I。再將0.7g胰酶粉末加入到溶液I中，充分混合，使得胰酶終濃度為0.7％，得溶液II。然后使用注射器將溶液II滴入200mL2％CaCl2溶液中，攪拌1h，得白色球體，取出用水洗至中性。干燥后的海藻酸銨和胰酶的混合微膠囊。測得固定化酶活力回收率為35.4％產(chǎn)品性能測試1.不同溫度對酶活力回收率的影響取實(shí)施例1中制得的混合微膠囊。分別于4℃、30℃、40℃、55℃、60℃水浴下反應(yīng)，測定不同溫度對固定化酶活力的影響，結(jié)果見表1。
表1不同溫度對酶活力回收率的影響

由表1可知，反應(yīng)溫度在4℃～55℃之間時(shí)，酶活力隨著溫度的升高而增加，當(dāng)溫度超過55℃時(shí)，酶活力開始下降。故55℃攝氏度為固定化酶的最適反應(yīng)溫度，較普通液態(tài)酶40℃左右的反應(yīng)溫度有所提高。并且，在40℃～60℃之間，酶活力無顯著降低，說明在此區(qū)間，固定化酶對溫度有較好耐受性，體現(xiàn)了它的優(yōu)越性。
2.不同pH對酶活力回收率的影響取實(shí)施例1中制得的混合微膠囊。分別于pH為6、7、8、9、10、11的反應(yīng)體系[醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH6)磷酸鹽緩沖液(pH7)硼砂-硼酸緩沖液(pH8)硼酸-氯化鉀緩沖液(pH9)碳酸鹽緩沖液(pH10)硼砂-NaOH緩沖液(pH11)]進(jìn)行反應(yīng)，測定不同反應(yīng)體系對酶活力的影響，結(jié)果見表2表2不同pH對酶活力回收率的影響

由表2可知，在pH為6～8之間，酶活力隨pH增加而升高，pH為8時(shí)酶活力達(dá)到最大，故確定pH8為最適反應(yīng)pH，與液態(tài)酶相近，而8～11之間酶活力無顯著遞減趨勢。可知在這個(gè)區(qū)間，酶對pH有較好耐受性，體現(xiàn)了它的優(yōu)越性。
3.固定化酶的保存穩(wěn)定性取實(shí)施例1制備好的固定化酶于4℃冰箱中保存49天，每隔7天測一次酶活力，檢驗(yàn)固定化酶的保存期限，結(jié)果見表3。
表3固定化酶的保存穩(wěn)定性

由表3可知，固定化酶具有較好的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性，在49天之后，酶活力仍為初始酶活力的75.23％。
實(shí)施例2以海藻酸鈉為載體固定胰酶制得，具體做法為取0.5g海藻酸鈉溶于100mL水中配置0.5％的海藻酸鈉溶液I。再將0.1g胰酶粉末加入到溶液I中，充分混合，使得胰酶終濃度為0.1％，得溶液II。然后使用注射器將溶液II滴入200mL 2％CaCl2溶液中，攪拌1h，得白色球體(見圖1)，取出用水洗至中性。干燥后即制得海藻酸銨和胰酶的混合微膠囊(見圖2)。采用福林-酚試劑法，測得固定化酶活力回收率為17.4％。
實(shí)施例3取4g海藻酸鈉溶于100mL水中配置4％的海藻酸鈉溶液I。再將2.8g胰酶粉末加入到溶液I中，充分混合，使得胰酶終濃度為2.8％，得溶液II。然后使用注射器將溶液II滴入200mL2％CaCl2溶液中，攪拌1h，得白色球體，取出用水洗至中性。干燥后即制得海藻酸銨和胰酶的混合微膠囊。測得固定化酶活力回收率為18.2％實(shí)施例4選取400mL2％CaCl2溶液，其它同實(shí)施例1。測的固定化酶活力回收率為16.8％應(yīng)用實(shí)施例1使用固定化酶生產(chǎn)CPPs。將海藻酸鈉和胰酶混合微膠囊g用水浸泡2h使其充分溶脹后，取出海藻酸鈉和胰酶混合微膠囊與7g酪蛋白配成5％酪蛋白溶液(7g酪蛋白溶于140mL水)置于水浴鍋中進(jìn)行水解反應(yīng)。(反應(yīng)溫度50℃，反應(yīng)pH8.0，反應(yīng)時(shí)間3h)，將所得水解液調(diào)pH為4.6，離心，于上清液中加入1.4gCaCl2使之終濃度為1.0％(w/v)，再加入140mL乙醇使乙醇終體積濃度為50％(v/v)，靜置3小時(shí)，于8000r/min的條件下離心分離。得CPPs產(chǎn)物。分離提取共生成0.9g CPPs，得率為12.86％CPPs氮磷比測定CPPs中氮與磷的摩爾比值(N/P)越小，CPPs的肽鏈就越短，磷酸基的密度就越大，則CPPs純度越高，促進(jìn)鈣的吸收和利用的作用也就越強(qiáng)，N/P值較小的樣品阻止磷酸鈣沉淀的效果好于N/P較大的樣品，結(jié)果見表4。
表4 CPPs氮磷比

表5商品CPPIII分類表

由表4和表5可知，由海藻酸鈉和胰酶混合微膠囊制備的CPPs屬于CPPsIII(高純度)，指標(biāo)達(dá)到市售水平。
權(quán)利要求
1.海藻酸鈉和胰酶混合微膠囊，其特征在于以海藻酸鈉為載體固定胰酶制得，其具體方法是取海藻酸鈉溶于水中配置0.5％-4％的海藻酸鈉溶液I，再將胰酶粉末加入到溶液I中，充分混合，使得胰酶終濃度為0.1％-2.8％，得溶液II，然后使用注射器將溶液II滴入2％CaCl2溶液中，攪拌1h，得白色球體，取出用水洗至中性，經(jīng)干燥后即制得海藻酸鈉和胰酶的混合微膠囊。
2.海藻酸鈉和胰酶混合微膠囊的制備方法，其特征在于取海藻酸鈉溶于水中配置0.5％-4％的海藻酸鈉溶液I，再將胰酶粉末加入到溶液I中，充分混合，使得胰酶終濃度為0.1％-2.8％，得溶液II，然后使用注射器將溶液II滴入2％CaCl2溶液中，攪拌1h，得白色球體，取出用水洗至中性，經(jīng)干燥后即制得海藻酸鈉和胰酶的混合微膠囊；其中CaCl2溶液的量與海藻酸鈉溶液I的體積比為1∶1-4∶1。
3.按照權(quán)利要求2所述的海藻酸鈉和胰酶混合微膠囊的制備方法，其特征在于2％CaCl2溶液量與海藻酸鈉溶液I體積比為2∶1。
4.權(quán)利要求1所述制備的海藻酸鈉和胰酶的混合微膠囊作為酪蛋白水解酶在水解酪蛋白生成酪蛋白磷酸肽CPPs中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了海藻酸鈉和胰酶混合微膠囊及其制備與應(yīng)用，屬于生產(chǎn)酪蛋白磷酸肽所用酶及制備，涉及固定化酶技術(shù)，特別涉及海藻酸鈉和胰酶混合微膠囊及其制備與應(yīng)用。它是將海藻酸鈉溶于水中制成溶液I，再將胰酶粉末置于溶液I中得溶液II，使用注射器將溶液II滴入CaCl
文檔編號(hào)C12P21/02GK1928080SQ20061001571
公開日2007年3月14日 申請日期2006年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月21日
發(fā)明者王艷萍, 劉鵬 申請人:天津科技大學(xué)