專利名稱：乳腺癌單抗m4g3單鏈抗體的制備及其dna序列的制作方法
乳腺癌單抗M4G3單鏈抗體的制備及其DNA序列[技術(shù)領(lǐng)域]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說制備出一種用于乳腺癌靶向治療的鼠源性單鏈抗體 (M4G3-scFv)并確定其DNA序列。[背景技術(shù)]鼠源性單克隆抗體M4G3是人乳腺癌特異性抗體。經(jīng)免疫病理學(xué)研究表明，其與臨床病 理診斷符合率為94%，并可鑒別診斷分化不良、來源不明的癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)。用共沉淀法制成 的磁性毫微囊(MNP)耦聯(lián)抗腫瘤藥物阿霉素、表阿霉素、氨甲喋呤等進行體外抑瘤實驗表 明，其殺瘤率顯著提高，且抗體活性保留80%以上。但是，由于M4G3單抗是鼠源性單抗， 分子量較大，長期反復(fù)使用時可誘發(fā)人體產(chǎn)生抗鼠的抗體，發(fā)生過敏反應(yīng)(HAMA)，因此在 乳腺癌的臨床應(yīng)用中受到一定的局限。[發(fā)明內(nèi)容]為了克服這一缺欠，利用基因工程抗體技術(shù)將編碼M4G3單抗的輕重鏈可變區(qū)的DNA 序列進行擴增，并構(gòu)建了可表達單鏈抗體(M4G3-scFv)的相關(guān)載體。成功地將鼠源性單克隆 抗體M4G3改造成單鏈抗體(M4G3-scFv)。由于單鏈抗體僅有M4G3單抗的V區(qū)而去掉了恒 定區(qū)(C區(qū))，因此既保存了M4G3單抗的結(jié)合特點，又大大降低了其免疫原性，并且穿透力 增強，容易進入局部組織尤其是實體瘤中發(fā)揮作用?？寺∮蠱4G3-scFv序列的表達載體可以 在宿主菌中表達M4G3-scFv單鏈抗體，為單鏈抗體的大批量生產(chǎn)提供了條件。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的。從M4G3單抗雜交瘤細胞中提取總RNA，分別擴增重鏈可變區(qū)基 因(VH)與輕鏈可變區(qū)基因(VL)，通過一段靈活的連接肽序列連接形成一個單鏈抗體(ScFv) 融合基因，與表達載體pCANTAB5E重組，置于Lac啟動子/控制子調(diào)控之下，并位于M13
噬菌體pill先導(dǎo)序列和pill基因之間，與輔助噬菌體M13K07 —起在大腸桿菌TGI中表達， 組裝成ScFv，以融合蛋白的形式表達在噬菌體表面。采用細胞淘選法，利用pIII融合蛋白進行淘選，野生型pin蛋白進行再感染，共進行三輪淘選，從中挑選重組陽性克隆，鑒定并測序。本發(fā)明制備出單鏈抗體(M4G3-scFv)并確定其DNA序列。此單鏈抗體編碼M4G3單抗的 重鏈可變區(qū)DNA序列375bp，編碼M4G3單抗的K輕鏈可變區(qū)DNA序列321bp，以及編碼 M4G3-scFv單鏈抗體的DNA序列全長為741bp。1、 編碼M4G3單抗的重鏈可變區(qū)DNA序列375bp,序列為(見說明書序列表)2、 編碼M4G3單抗的K輕鏈可變區(qū)DNA序列321bp，序列為(見說明書序列表)3、 編碼M4G3-scFv單鏈抗體的DNA序列全長為741bp,序列為(見說明書序列表) [


]圖l為鼠源性抗乳腺癌單鏈抗體(M4G3-scFv)的乳腺癌組織免疫染色反應(yīng) 圖2為大量制備可溶性M4G3-scFv的western blot鑒定 [具體實施方法]下面對本發(fā)明作詳盡描述 實驗材料1 、鼠源性乳腺癌特異性單抗M4G3雜交瘤細胞2、 Expression Module (recombinant phage antibody system) PHARMACIA BIOTECH 3 、 M-MulV逆轉(zhuǎn)錄酶；Taq DNA聚合酶；限制性核酸內(nèi)切酶Sfi I/Not I (Takara) 4、 M4G3單抗陽性的乳腺癌細胞系T47D 實驗步驟參見PHARMACIA BIOTECH (27-9401-01)試劑盒說明書 1、 輕鏈、重鏈可變區(qū)的擴增鼠源性乳腺癌特異性單抗M4G3雜交瘤細胞的培養(yǎng)一提取總 RNA —反轉(zhuǎn)錄成cDNA —用輕鏈、重鏈引物(試劑盒提供)擴增L-DNA和H-DNA2、 ScFv融合基因的克隆用Linker (試劑盒提供)進行重疊PCR將L-DNA和H-DNA連接起 來一PCR擴增ScFv融合基因 一Sfil/Notl酶切一連入pCANTAB5E載體，位于M13 噬菌體pIII先導(dǎo)序列和pIII基因之間一轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞TG13、 陽性噬菌體抗體庫的淘選選擇轉(zhuǎn)化的細菌，添加M13K07輔助噬菌體，共培養(yǎng)釋放噬菌 體，用M4G3單抗陽性的乳腺癌細胞系T47D淘選表達M4G3-scFv的噬菌體，共3次。4、 陽性克隆的鑒定經(jīng)過3次淘選得到的噬菌體感染大腸桿菌TG1，提取噬菌粒，測序鑒定。 以乳腺癌病理切片為靶抗原，陽性噬菌體為一抗，辣根過氧化物酶標記的抗噬菌體抗體為 二抗，進行酶免染色。5、 M4G3-scFv的大量制備與純化將陽性噬菌體感染大腸桿菌HB2151 ，收集培養(yǎng)上清，利 用抗E-tag sepharose柱純化富集分泌入培養(yǎng)基中的可溶性M4G3-scFv， western blot鑒定。實驗結(jié)果1、 編碼M4G3單抗的重鏈可變區(qū)DNA序列375bp，序列為(見說明書序列表)2、 編碼M4G3單抗的K輕鏈可變區(qū)DNA序列321bp，序列為(見說明書序列表)3、 編碼M4G3-scFv單鏈抗體的DNA序列全長為741bp，序列為(見說明書序列表)4、 鼠源性抗乳腺癌單鏈抗體(M4G3-scFv)的免疫染色反應(yīng) 乳腺癌細胞呈現(xiàn)明顯的陽性反應(yīng)，間質(zhì)不著色。5、 大量制備可溶性M4G3-scFv的western blot鑒定M4G3-scFv的分子量約為30KD。
序列表<110>天津醫(yī)科大學(xué)附厲腫瘤醫(yī)院<120>乳腺癌單抗M4G3單鏈抗體的制備及其DNA序列<210> 1<211> 375<212> DNA<213>小雖(Mus musculus ) <220><221> V—region <222>(1)...(375)<223> M4G3單抗重鏈可變區(qū)基因 <400> 13tggccc3gg tgaagctgc3 ggagtctggg ggaggcttat tgaagcctgg agggtccctg60 aaactctcct gtgcagcctc tggattcact ttcagtagct atgccatgtc ttgggttcgc120 cagactccgg agaagaggct ggagtgggtc gctaccatta gtagtggtgg tggttacacc180 tactatccag acagtgtgaa gggtcgattc accatctcca gagacaatgc caagaacacc 240 卿acctgc aaatgagcag tctgaggtct gaggacacgg ccatgtattt ctgtgcaaga 300agggactacg gtagtcgct3 cgggaattat gctgtggact actggggcca aggcaccacg 360 gtcsccgtct cctcs 375 <210>2 <211>321 <212> DNA<213>小鼠(Mus musculus ) <220><221> V—regi。n <222>(1)...(321)<223> M4G3單抗輕鏈可變區(qū)基因 <400> 2gacattgtgc taacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gagggtcacc60 atgacctgca gtgccagctc aagtat3cgt tacatatatt ggtaccaaca gaagcctgga120 tcctccccc3 gactcctgat tt3tgacac3 tccaacgtgg ctcctggagt ccc加cgc180 ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttat tctctcacaa tcaaccgaat ggaggctgag 240 gatgctgcca cttattactg ccaggagtgg agtggttatc cgtacacgtt cggagggggg300 3C333gttgg 333taa33cg g321 <210>3 <211>741<212> DNA<213>人工序列<220><221> V—region <222> (1)…(375)<223> M4G3單抗重鏈可變區(qū)基因 <220><222> (376)…(420) <223> linker序列 <220><221> V—region<222> (421)…(741)<223> M4G3單抗輕鏈可變區(qū)基因<400> 33tggccc3gg tgaagctgca ggagtctggg ggaggcttat tgaagcctgg agggtccctg 60 aaactctcct gtgcagcctc tggattcact ttcagtagct atgccatgtc ttgggttcgc 120 cagactccgg agaagaggct ggagtgggtc gctaccatta gtagtggtgg tggttacacc 180tactatccag acagtgtgaa gggtcgattc accatctcca gagacaatgc caagaacacc 240
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權(quán)利要求
1、一種鼠源性乳腺癌特異性的單鏈抗體及其DNA序列，此單鏈抗體源自于鼠源性乳腺癌特異性單抗M4G3。其特征在于編碼M4G3單抗的重鏈可變區(qū)DNA序列375bp，編碼M4G3單抗的K輕鏈可變區(qū)DNA序列321bp，以及編碼M4G3-scFv單鏈抗體的DNA序列全長為741bp。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的鼠源性乳腺癌特異性的單鏈抗體，其特征為編碼M4G3單抗的重鏈 可變區(qū)DNA序列375bp，序列為CTACTGGGGCCAAGGCACCACGGTCACCGTCTCCTCA
3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的鼠源性乳腺癌特異性的單鏈抗體，其特征為編碼M4G3單抗的K 輕鏈可變區(qū)DNA序列321bp，序列為
4、根據(jù)權(quán)利要求l所述的鼠源性乳腺癌特異性的單鏈抗體，其特征為編碼M4G3-scFv單鏈 抗體的DNA序列全長為741bp，序列為<formula>formula see original document page 3</formula>
全文摘要
本發(fā)明制備出一種用于乳腺癌靶向治療的鼠源性單鏈抗體(M4G3-scFv)并確定其DNA序列，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。此單鏈抗體源自于鼠源性乳腺癌特異性單抗M4G3，其編碼的DNA序列全長為741bp，包含編碼M4G3單抗的重鏈可變區(qū)DNA序列375bp，以及編碼M4G3單抗的K輕鏈可變區(qū)DNA序列321bp。本發(fā)明保留了原有抗體對于乳腺癌的特異性，又降低了對人體的抗原性，成為乳腺癌治療的靶向載體。
文檔編號C12N15/13GK101148670SQ200610015720
公開日2008年3月26日 申請日期2006年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月22日
發(fā)明者史玉榮, 孫保存, 霖 張, 毅 楊, 昀 牛, 牛瑞芳, 王德發(fā), 郝希山, 魏熙胤, 黃建英 申請人:天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院