專利名稱：人源抗體及其表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的抗表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的人源抗體系列，該類抗體可在較小的劑量下治療和預(yù)防EGFR相關(guān)的疾病。本發(fā)明還涉及采用基因重組技術(shù)在CHO細(xì)胞中生產(chǎn)該抗體的方法。
背景技術(shù)：
表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)是erbB家族的一個(gè)成員，該家族含4個(gè)相關(guān)的細(xì)胞膜受體，包括EGFR(Her 1 or erbB1)，erbB2(Her2)，erbB3(Her3)和erbB4(Her4)。該家族蛋白都為跨膜糖蛋白，含有胞外的配基結(jié)合區(qū)域和胞內(nèi)具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的酪氨酸激酶活性區(qū)域。EGFR是一個(gè)約170kD的跨膜糖蛋白，該蛋白能使許多類型的細(xì)胞擴(kuò)增和分化。已證實(shí)EGFR在許多類型的人實(shí)體瘤，如肺癌，胸腺瘤，結(jié)腸癌，胃癌，腦瘤，膀胱癌，頭頸癌，卵巢癌和胰腺癌中過度表達(dá)Mendelsohn et al.，Cancer Cells 1989.7359。其配基表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-α)均能與之結(jié)合造成EGFR酪氨酸自主磷酸化及下游一些細(xì)胞內(nèi)分子的磷酸化，從而導(dǎo)致癌細(xì)胞擴(kuò)增和腫瘤生長(zhǎng)Modjtahedi et al.Oncology 1994.4277，因此抑制EGFR已成為一個(gè)新的癌癥治療的方向。研究表明結(jié)合于EGFR的配基結(jié)合域的單克隆抗體可以阻斷EGF和TGF-α與EGFR的結(jié)合從而阻斷腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的信號(hào)傳遞途徑。
EGFR靶向藥物主要分兩種，一類是作用于其胞內(nèi)酪氨酸激酶ATP結(jié)合區(qū)的小分子化合物抑制劑，另一類是作用于EGFR胞外配體結(jié)合區(qū)的單克隆抗體。前者在體內(nèi)和體外試驗(yàn)中表現(xiàn)出對(duì)多種腫瘤細(xì)胞系很高的生長(zhǎng)抑制活性，而后者的療效可能更多地來自于對(duì)某些腫瘤進(jìn)展相關(guān)過程的抑制，如腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和新生血管生成等，還可能來自于抗體介導(dǎo)的抗體依耐性的細(xì)胞毒性效應(yīng)(ADCC)和補(bǔ)體依耐性的細(xì)胞毒性效應(yīng)(CDCC)。
抗EGFR特異性抗體可采用傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)從免疫動(dòng)物中分離。但該類抗體由于其為鼠源性抗體導(dǎo)致該類抗體的治療效果并不理想。當(dāng)注射攜帶人腫瘤異植物的小鼠中時(shí)，鼠源性抗體只能導(dǎo)致部分腫瘤消退，完全清除腫瘤細(xì)胞需化療劑的共同治療Baselga et al.，Pharmac.Therapeut.1994 64127。并且鼠源的抗體可能在人體引起強(qiáng)烈的HAMA免疫反應(yīng)。
人源抗體和人源化抗體以其特有的優(yōu)勢(shì)而越來越成為抗體藥物研發(fā)的主流趨勢(shì)。近年來，已建立了噬菌體抗體庫技術(shù)，其特點(diǎn)是能在原核細(xì)胞，如E.coli中產(chǎn)生功能性的抗體片段，如FV和Fab，特別是能產(chǎn)生VL和VH鏈相連的scFvBird et al.，Science 1988.242423。該技術(shù)可使隨機(jī)組合的抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)基因通過PCR擴(kuò)增而得到放大，并在噬菌體顆粒表面表達(dá)抗體片段。因此該噬菌體抗體庫可用于篩選目的抗原所結(jié)合的抗體。相對(duì)于雜交瘤技術(shù)，噬菌體抗體庫技術(shù)具有極強(qiáng)的篩選能力，能真正做到以任何抗體表達(dá)細(xì)胞，如人抗體生產(chǎn)細(xì)胞，包括脾臟，外周血淋巴細(xì)胞等作為起始材料，并能快速的篩選出大量不同的抗體。另外，噬菌體抗體庫技術(shù)直接獲得目的抗體可變區(qū)的基因，有利于快速進(jìn)行下步后續(xù)操作，在藥物的上游開發(fā)工作中能節(jié)省大量的時(shí)間，在實(shí)際操作中更能為廣大實(shí)驗(yàn)室所接受。在實(shí)際科研和生產(chǎn)中已經(jīng)有大量噬菌體抗體庫的成功構(gòu)建和篩選范例Bender et al.，Hum.Antibod.Hybridomas1993.474；Shenlan Mao et al.，Proc Natl Acid Sci USA 1999 96(12)6953；VaughanTJ.et al.，Nat Biotechnol 1993 14(3)309，因此該技術(shù)已廣泛用于抗體的篩選。
目前已研發(fā)了多個(gè)抗EGFR嵌合、人源化和人源單克隆抗體，包括EMD55900，h-R3，ABX-EGF和C225用于腫瘤疾病的臨床研究。其中人-鼠嵌合抗體C225已于2004年2月獲得美國(guó)FDA的批準(zhǔn)用于對(duì)依立替康耐藥的轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌、直腸癌的治療。但這些抗體的抗腫瘤活性由其結(jié)合EGFR的表位決定，如嵌合抗體C225只能在高劑量下才表現(xiàn)出抗腫瘤活性，在臨床上需與化療協(xié)同作用。因此尋找劑量更小，抗腫瘤活性更高，不激發(fā)免疫反應(yīng)并可單藥應(yīng)用的人源單克隆抗體是十分必要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一組重組人源抗EGFR單克隆抗體。
該抗體含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)。其中SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，SEQ ID NO5和SEQ ID NO7中所示的為重鏈可變區(qū)氨基酸序列，SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8所示的為輕鏈可變區(qū)氨基酸序列。
本發(fā)明的另一目的在于提供編碼上述重組人源抗EGFR scFv抗體的DNA分子。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，該單克隆抗體重鏈的可變區(qū)核苷酸序列為SEQ ID NO9所示的序列，輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列為SEQ ID NO10所示的序列，該抗體能達(dá)到的親和性KD＝3×10-10M。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，該單克隆抗體重鏈可變區(qū)的核苷酸序列為SEQ ID NO11所示的序列，輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列為SEQ ID NO12所示的序列，該抗體能達(dá)到的親和性KD＝0.5×10-10M。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，該單克隆抗體重鏈可變區(qū)的核苷酸序列為SEQ ID NO13所示的序列，輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列為SEQ ID NO14所示的序列，其scFv抗體的kD＝5.8×10-9M。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，該單克隆抗體重鏈可變區(qū)的核苷酸序列為SEQ ID NO15所示的序列，輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列為SEQ ID NO16所示的序列，其scFv抗體的kD＝0.8×10-9M。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，該單克隆抗體的輕鏈由輕鏈可變區(qū)和κ恒定區(qū)組成，重鏈由重鏈可變區(qū)和IgG1組成，然而本發(fā)明也保護(hù)其它抗體的同種型，如IgG2，IgG3，IgG4，IgM，IgA1，IgA2，IgD，IgE。本發(fā)明也保護(hù)抗體的抗原結(jié)合片段，包括Fab，F(xiàn)v，scFv和單區(qū)抗體。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供人源抗EGFR單克隆抗體的表達(dá)載體，將人源抗EGFR單克隆抗體基因構(gòu)建進(jìn)入neo弱化的表達(dá)載體中，將neo基因與抗人源EGFR單克隆抗體的重鏈基因在同一個(gè)操縱子中，位于人源抗EGFR單克隆抗體的重鏈基因的后面，使通過G418的篩選獲得neo基因和抗EGFR單克隆抗體的重鏈基因同時(shí)高表達(dá)的重組CHO細(xì)胞克隆。
本發(fā)明的另一個(gè)目的還在于提供了一種制備所述抗EGFR單克隆抗體的方法，該方法包括。
a)提供所述抗EGFR單克隆抗體的DNA分子；b)提供一種表達(dá)載體，該載體含有步驟a)中所述的DNA分子及表達(dá)該DNA分子的調(diào)控序列；c)用步驟a)中所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，更特別是CHO細(xì)胞；d)在適合所述單克隆抗體的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)步驟b)中所得的宿主細(xì)胞；和e)分離純化步驟c)中所表達(dá)的所述單克隆抗體。


圖1人抗體噬菌體庫的構(gòu)建方案圖28組抗EGFR scFv抗體對(duì)A431細(xì)胞的增值抑制活性比較。
圖3人源抗EGFR單克隆抗體的表達(dá)載體結(jié)構(gòu)圖。
圖413％SDS-PAGE蛋白電泳圖，泳道1為蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，泳道2為未純化的細(xì)胞上清液樣品，泳道3為純化后的抗體樣品。
圖5N2-1，N5-4，N6-3和N8-3 IgG1完整抗體對(duì)A431細(xì)胞的增值抑制活性的比較。
圖6ascFv抗體N5-4的重鏈可變區(qū)序列；圖6bscFv抗體N5-4的重鏈可變區(qū)序列。
圖7ascFv抗體N6-3的重鏈可變區(qū)序列；圖7bscFv抗體N6-3的重鏈可變區(qū)序列。
圖8ascFv抗體N5-7的重鏈可變區(qū)序列；圖8bscFv抗體N5-7的重鏈可變區(qū)序列。
圖9ascFv抗體N6-9的重鏈可變區(qū)序列；圖9bscFv抗體N6-9的重鏈可變區(qū)序列。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一、人源抗體庫的構(gòu)建及抗EGFR scFv抗體的篩選(1)人源抗體scFv抗體庫的構(gòu)建a)VH基因、VL基因和連接肽片段的擴(kuò)增將液氮凍存的人淋巴結(jié)、脾臟、外周血淋巴細(xì)胞混合物在Trizol(Invitrogen)中研碎，按Trizol說明書上的方法提取總RNA。并按Superscript II反轉(zhuǎn)錄酶說明書的方法取3μg總RNA用200U Superscript II反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)反轉(zhuǎn)錄為cDNA第一鏈，這些方法都是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法。
分子生物學(xué)的具體操作均為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法(薩幕布魯克J等，《分子克隆試驗(yàn)指南》，北京科學(xué)出版社)。根據(jù)抗體重鏈可變區(qū)(VH)，κ輕鏈可變區(qū)(κVL)，λ輕鏈可變區(qū)(λVL)的框架區(qū)序列設(shè)計(jì)PCR引物Vaughan etal.Nature Biotechnology 1996 14309；沈倍奮等，《重組抗體》科學(xué)出版社108；Welschof M.et al.，J immunol Methods 1995 179(2)203，其中人的VH設(shè)計(jì)了6個(gè)上游引物(VHsense)和4個(gè)下游引物(JHanti-sense)，該6個(gè)上游引物和4個(gè)下游引物共形成24個(gè)引物組合，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，總共24個(gè)VH組合。人的κVL設(shè)計(jì)6個(gè)上游引物和5個(gè)下游引物，該6個(gè)上游引物(Vκsense)和5個(gè)下游引物(Vκanti-sense)共形成30個(gè)引物組合，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共獲得30個(gè)κVL的PCR產(chǎn)物組合。人λVL設(shè)計(jì)7個(gè)上游引物(Vλsense)和3個(gè)下游引物(Vλanti-sense)，該7個(gè)上游引物和3個(gè)下游引物共形成21個(gè)引物組合，以cDNA為模板獲得21個(gè)λVLPCR產(chǎn)物組合。使用promega的Wizard SV Gel and PCRclean-up System純化試劑盒進(jìn)行純化，分光光度計(jì)下檢測(cè)OD260和OD280分析PCR產(chǎn)物的濃度和純度。
連接肽片段(Gly4Ser)3DNA序列可通過寡核苷酸鏈合成的方法獲得，并根據(jù)4個(gè)重鏈的反向引物設(shè)計(jì)4個(gè)重鏈正向連接肽引物(JHlinker sense)，根據(jù)6個(gè)κ鏈和7個(gè)λ鏈正向引物設(shè)計(jì)6個(gè)κ鏈的反向連接肽引物和7個(gè)λ鏈反向連接肽引物。將4個(gè)重鏈正向連接肽引物分別與6個(gè)κ鏈的反向連接肽引物(Vκlinkeranti-sense)和7個(gè)λ鏈反向連接肽引物混合(Vλlinker anti-sense)，以連接肽片段(Gly4Ser)3DNA為模板PCR擴(kuò)增獲得重鏈和κ輕鏈可變區(qū)及重鏈和λ輕鏈可變區(qū)的連接接頭。使用純化試劑盒純化連接接頭，分光光度計(jì)下檢測(cè)OD260和OD280分析PCR產(chǎn)物的濃度和純度。
b)人源抗體scFv基因的連接將重鏈VH分別與κ鏈Vκ和λ鏈Vλ進(jìn)行連接。具體操作為純化的人VH片段混合物、Vκ或Vλ片段混合物和相應(yīng)的κ或λ連接接頭混合物，按1μg∶1μg∶250ng混合后進(jìn)行50μl體系的PCR擴(kuò)增，再以PCR產(chǎn)物為模板，加入帶Sfi酶切位點(diǎn)的6條上游重鏈可變區(qū)引物混合物和帶Not I酶切位點(diǎn)的5條κ鏈下游可變區(qū)引物或帶Not I酶切位點(diǎn)的3條λ鏈下游可變區(qū)引物混合物，進(jìn)行進(jìn)一步PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)獲得750bp左右的含重鏈可變區(qū)和κ輕鏈可變區(qū)或含重鏈可變區(qū)和λ輕鏈可變區(qū)的scFv片段。使用純化試劑盒純化這些scFv片段，分光光度計(jì)下檢測(cè)OD260和OD280分析PCR產(chǎn)物的濃度和純度。
c)人源抗體scFv基因噬菌體庫的構(gòu)建純化的scFv PCR產(chǎn)物按說明書的方法用Sfi I和Not I(TaKaRa)雙酶切后用promega的Wizard SV Gel and PCR clean-up System純化試劑盒進(jìn)行純化，用TaKaRa的DNA Ligation Kit Ver.2.1試劑盒將純化后的scFv片段插入經(jīng)過相同酶切后的pCANTAB-5E載體(法瑪西亞)上，構(gòu)建成為pCANTAB-5E-scFv的噬菌體表達(dá)載體，整個(gè)構(gòu)建過程見圖1。該表達(dá)載體電轉(zhuǎn)化入40～400μl制備好的TG1電感受態(tài)菌，獲得的電轉(zhuǎn)化細(xì)菌在2×YT-GA(含100mg/L Amp和2％葡萄糖)擴(kuò)增至OD600＝0.5后加入2×1010M13KO7(法瑪西亞)輔助感染，37℃培養(yǎng)1h，4000rpm離心細(xì)菌液，重懸沉淀于2×YT-AK(100mg/L Amp，50mg/L Kan)的培養(yǎng)基中，30℃過夜振蕩培養(yǎng)，4000rpm離心獲得含噬菌體的上清液，經(jīng)0.45μm的濾膜過濾后4℃下加入20％PEG 8000沉淀上清液45min，10000rpm離心，PBS重懸沉淀獲得單鏈?zhǔn)删w抗體庫。
噬菌體抗體庫的濃度檢測(cè)，具體操作為取少量體積原液經(jīng)極限稀釋后電轉(zhuǎn)化TG1菌，涂板檢測(cè)單菌落個(gè)數(shù)該單鏈?zhǔn)删w抗體庫達(dá)到了3×109個(gè)克隆。
(2)EGFR胞外蛋白(EGFR ECD)的表達(dá)300g離心5min沉淀106個(gè)A431細(xì)胞(ATCC CRL1555)。按BBI公司的classical total RNA isolation kit說明書的操作方案分別提取細(xì)胞的RNA。按BBI公司的MMLV first strand cDNA synthesis kit說明書的操作方案將這些細(xì)胞的mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。
根據(jù)已知的EGFR ECD區(qū)域序列(Genbank X00588)設(shè)計(jì)PCR引物。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得目的基因。
合成引物序列EGFR-F/Nhe I5’AGCGCTAGCGGGAGCAGCGA 3’(SEQ ID No17)EGFR-R/Xho I5’GGTCAGAGCTCCCTGCCCTAGAATC 3’(SEQ ID No18)將約2.0kb的EGFR ECD序列按相應(yīng)的酶切位點(diǎn)插入到pcDNA3.1/myc-His(-)B(invitrogen)表達(dá)載體中。
ECD蛋白表達(dá)載體在HEK-293(ATCC CRL1573)細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)可按技術(shù)人員熟知的常用方法進(jìn)行，可采用Calfection轉(zhuǎn)染方法(Lindell et al.Biochimicaet Biophysica Acta 2004.1676155)將表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HEK-293細(xì)胞獲得蛋白的瞬時(shí)表達(dá)。上清液收集后，按Ni-NTA Spin Kit(Qiagen)的說明書操作純化獲得高純度的EGFR ECD蛋白。
(3)含抗EGFR ECD scFv抗體的噬菌體文庫的富集篩選采用微孔板篩選方法篩選含抗EGFR ECD scFv的噬菌體，該方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法。用100μl含20μg/ml EGFR ECD重組蛋白的0.1MNa2CO3-NaHCO3包被液4℃過夜包被Nunc培養(yǎng)板，TBS/Tween 20(50mMTris-HCl(pH7.5)，150mM NaCl，0.5％Tween 20)洗滌三次，3％小牛血清白蛋白(BSA)37℃封閉2h后加入濃縮的噬菌體，37℃溫育2h，TBS/Tween 20洗滌液清洗數(shù)次除去未結(jié)合的噬菌體，加入50μl 0.1M三乙胺室溫孵育10min洗脫已黏附在平皿上的噬菌體，然后用6～10μl 1mol/L Tris(pH 7.4)中和洗滌下的噬菌體溶液。將洗脫的噬菌體溶液感染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌受體菌TG1，培養(yǎng)擴(kuò)增使表達(dá)抗EGFR ECD重組蛋白的特異性scFv的噬菌粒得到富集，再加入M13KO7輔助感染獲得含抗EGFR ECD的scFv的噬菌體，方法同上。繼續(xù)重復(fù)4次上述“黏附、洗脫、擴(kuò)增”過程。然后用降低濃度至2μg/ml EGFR ECD重組蛋白的包被液包被Nunc培養(yǎng)板，重復(fù)上述的篩選步驟，為了去除對(duì)BSA吸附的噬菌體，以4％脫脂牛奶代替BSA進(jìn)行封閉，洗脫捕獲的噬菌體。將最后一輪篩選得到的噬菌體轉(zhuǎn)化TG1菌涂板，從中隨機(jī)挑選165株陽性單克隆菌株進(jìn)行進(jìn)一步的免疫篩選。
(4)噬菌體scFv的融合表達(dá)及ELISA篩選接種165個(gè)單菌落于2×YT-AG培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)至OD600＝1左右，2×1010M13KO7輔助感染，37℃溫育2h后，4000rpm離心去除上清，沉淀繼續(xù)在2×YT-AG中培養(yǎng)過夜，9000rpm離心獲得噬菌體上清液。
用100μl 30μg/ml EGFR ECD重組蛋白4℃過夜包被96孔板，TBS/Tween洗滌3次后，用4％脫脂牛奶-PBS 37℃封閉1h，每孔100μl scFv單克隆噬菌體上清，洗5次，然后加入1∶5000稀釋的HRP-兔抗M13(法瑪西亞)，37℃孵育1h，TMB(3，3，5，5，-四甲基聯(lián)苯胺)為底物顯色，獲得吸光度值較高的94個(gè)陽性抗體克隆。
(5)噬菌體scFv單鏈抗體的可溶性表達(dá)及ELISA篩選收獲94個(gè)陽性克隆的M13KO7輔助感染后的TG1菌液上清液，取2μl噬菌體上清液感染400μl琥珀突變非抑制型HB2151菌(Maxim Biotech)，緩慢培養(yǎng)30min，涂布2×YT-AG-N(含萘啶酮酸)平板，30℃過夜培養(yǎng)，挑取單菌落接種2×YT-AG培養(yǎng)液中，1mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)獲得可溶性scFv上清液。
將100μl可溶性scFv上清液包被96孔板，TBS/Tween清洗3次，2％BSA封閉，然后加入50μl 2μg/ml EGFR ECD重組蛋白37℃孵育2h，洗滌后用偶聯(lián)HRP的抗c-myc的單克隆抗體(Chemicon)孵育，TMB顯色，450nm檢測(cè)光吸收，獲得80個(gè)吸光值較高的陽性克隆。為了篩除抗pcDN3.1/myc-His(-)B載體所引入的myc標(biāo)簽和(His)6標(biāo)簽蛋白的抗體，我們使用公司之前構(gòu)建于該載體的NGF重組蛋白結(jié)合scFv包被的96孔板，用上述方法檢測(cè)，篩除結(jié)合于myc或(His)6標(biāo)簽的陽性克隆。最后獲得75個(gè)只與EGFR ECD結(jié)合的陽性抗體克隆。
(6)陽性克隆株DNA序列測(cè)定將篩選得到的75個(gè)陽性克隆菌株擴(kuò)增并提取質(zhì)粒，Sfi I/Not I雙酶切鑒定后進(jìn)行DNA序列測(cè)定，使用IgBLAST程序(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)對(duì)所獲得的序列進(jìn)行比對(duì)分析，使用DNAstar軟件對(duì)DNA序列進(jìn)行聚類分析，并對(duì)序列的編碼框進(jìn)行識(shí)別和翻譯；為便于進(jìn)一步篩選和鑒定，將這些所獲得的克隆劃分為8組，見表1。
表1

(7)帶(His)6標(biāo)簽scFv的構(gòu)建和產(chǎn)物的純化從8組克隆中分別隨機(jī)選取1個(gè)克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，PCR擴(kuò)增獲得帶5’-Sfi I和3’-Not I酶切位點(diǎn)并在3’端添加(His)6標(biāo)簽的片段。PCR兼并引物如下VH/Sfi I5’TCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGG 3’(SEQ ID No19)Jκ-1/Not I5’ATGATGATGATGATGACGTTTRATHTCCASYYK KGTCC 3’(SEQ ID No20)Jκ-2/Not I5’GCGGCGGCCGCATGATGATGATGATGATGACG 3’(SEQ ID No21)分別以8個(gè)克隆為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，第一步以噬菌體質(zhì)粒為模板，以VH/SfiI和Jκ-1/Not I為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，第二步以第一步的PCR產(chǎn)物為模板，以為VH/Sfi I和Jκ-2/Not I引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)promega的Wizard SV Geland PCR clean-up System純化試劑盒純化后，Sfi I和Not I(TaKaRa)酶切克隆入同樣Sfi I和Not I酶切的pCANTAB-5E載體，重新轉(zhuǎn)化TG1菌，感染獲得噬菌體上清液后再轉(zhuǎn)染HB2151菌作可溶性表達(dá)，具體方法同上。表達(dá)后的上清按照Ni-NTA Spin Kit的說明書進(jìn)行純化。
(8)抗EGFR scFv抗體對(duì)A431細(xì)胞的增值活性檢測(cè)將100μl DMEM/F12梯度系列稀釋親和純化后的scFv抗體加入96孔板中，并以一個(gè)不相關(guān)的IgG1型抗體和無抗體的DMEM/F12+10％FBS培養(yǎng)基為對(duì)照。均加入100μl 2×103個(gè)A431細(xì)胞的DMEM/F12+10％FBS培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)4天后每孔加入10μl WST-8(南京旋光科技有限公司)，繼續(xù)培養(yǎng)3h，450nm測(cè)定光吸收。結(jié)果見圖2，顯示其中4個(gè)克隆(N2-1、N5-4、N6-3、N8-3)的scFv能夠明顯抑制A431細(xì)胞的正常增殖，并誘發(fā)細(xì)胞的凋亡，其中N6-3、N5-4的效果最明顯，見圖2。
(9)scFv的親和性分析對(duì)N2-1、N5-4、N6-3、N8-34個(gè)克隆的可溶性scFv進(jìn)行親和性分析。我們用競(jìng)爭(zhēng)ELISA法進(jìn)行抗體親和力檢測(cè)，該技術(shù)為本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員所熟知的方法。具體方法簡(jiǎn)述如下100μl 20μg/ml純化的EGFR ECD重組蛋白4℃過夜包被96孔板，再加入3％脫脂牛奶室溫下封閉1h，TBS/Tween洗液清洗三次，在離心管中建立終濃度為0.1nM-1μM的EGFR ECD抗原系列稀釋度和終濃度為1nM的scFv，室溫下孵育30min后，加入到EGFR ECD重組蛋白包被的96孔板中，室溫下競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合5-10min，TBS/Tween洗液充分清洗96孔酶標(biāo)板，加入1∶2000倍稀釋的HRP-兔抗M13抗體室溫下結(jié)合2h，TMB顯色，最強(qiáng)信號(hào)的一半的抗原濃度視為抗體的解離常數(shù)KD，結(jié)果見表2。
表2

實(shí)施例二、人源EGFR單克隆完整IgG1型抗體基因的制備(1)人kappa輕鏈恒定區(qū)及人IgG1重鏈恒定區(qū)的制備收集新鮮人全血5ml，300g離心5min沉淀紅細(xì)胞和白細(xì)胞。按BBI公司的classical total RNA isolation kit說明書的操作方案提取白細(xì)胞RNA。按BBI公司的MMLV first strand cDNA synthesis kit說明書的操作方案將白細(xì)胞mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。
根據(jù)已知的人kappa和IgG1序列設(shè)計(jì)PCR引物。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得目的基因。
合成引物序列L-F/BamH I5’GCGGGATCCCGTACGGTGGCTGCACCATCT 3’(SEQ ID NO22)L-R/Xho I5’GCGCTCGAGCTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTC 3’(SEQ IDNO23)H-F/Eco52 I5’GCGCGGCCGGCTAGCACCAAGGGCCCATCGG 3’(SEQ IDNO24)H-R/Xho I5’GCGCTCGAGGATCCTCATTTACCCGGAGACAGGGA GAGGC3’(SEQ ID NO25)(2)4個(gè)scFv克隆可變區(qū)的基因的獲得N2-1、N5-4、N6-3、N8-34個(gè)scFv輕鏈和重鏈可變區(qū)基因序列可通過DNA拼接的方法在5’端加入信號(hào)肽序列獲得Crowe JS.et al.，Clin Exp Immunol 199287(1)105，也可采用交給其他公司全基因合成的方法獲得(Invitrogen)。為了優(yōu)化抗體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)，還可進(jìn)行密碼子優(yōu)化Koresawa et al.，J.Biochem，2000，127(3)367；Robinson et al.，Nucleic Acids Res.1984 126663。其中，輕鏈可變區(qū)序列的5’端設(shè)計(jì)BamH I位點(diǎn)，3’端設(shè)計(jì)BsiW I位點(diǎn)，重鏈可變區(qū)序列的5’端設(shè)計(jì)EcoR V位點(diǎn)，3’端設(shè)計(jì)Nhe I位點(diǎn)。
(3)人源EGFR單克隆抗體輕鏈的制備κ基因的PCR產(chǎn)物分別用BamH I和Xho I(TaKaRa)雙酶切，在30μl體系中加入3μl 10×K buffer，κPCR純化產(chǎn)物20μl，Xho I 2μl，BamH I 3μl，37℃酶切1h。pcDNA3(Invitrogen)載體也用BamH I和Xho I雙酶切，方法同上。用TaKaRa的DNA Ligation Kit Ver.2.1試劑盒將κ序列分別插入到pcDNA3中，構(gòu)建為pcDNA3-κ。
N2-1、N5-4、N6-3、N8-3輕鏈可變區(qū)合成基因和pcDNA3-κ分別用Kpn I(TaKaRa)酶切，酶切體系為在50μl體系中加入5μl 10×L buffer，輕鏈可變區(qū)合成基因30μl或pcDNA3-κ10μ，Kpn I 3μl，37℃酶切1h。酶切產(chǎn)物使用promega的Wizard SV Gel and PCR clean-up System純化試劑盒進(jìn)行純化，再分別使用BsiW I(ToYoBo)酶切，酶切體系為在50μl體系中加入5μl 10×H buffer，輕鏈可變區(qū)合成基因Kpn I酶切產(chǎn)物30μl或pcDNA3-κKpn I酶切產(chǎn)物30μl，BsiW I 3μl，37℃酶切1h。膠回收400bp左右的輕鏈可變區(qū)Kpn I和BsiW I酶切產(chǎn)物，并用TaKaRa的DNA Ligation Kit Ver.2.1試劑盒將輕鏈可變區(qū)插入pcDNA3-κ載體，構(gòu)建為4個(gè)pcDNA3-L-N2-1、pcDNA3-L-N5-4、pcDNA3-L-N6-3、pcDNA3-L-N8-3。
(4)人源EGFR單克隆抗體重鏈的制備IgG1 Fc基因的PCR產(chǎn)物分別用Eco52 I和Xho I(TaKaRa)酶切，在30μl體系中加入3μl 10×H buffer，IgG1 Fc PCR純化產(chǎn)物20μl，Xho I 2μl，37℃酶切1h。酶切產(chǎn)物使用promega Wizard SV Gel and PCR clean-up System純化試劑盒進(jìn)行純化，再使用Eco52 I(TaKaRa)酶切，酶切體系為在在30μl體系中加入3μl 10×Basal buffer，IgG1 Fc Xho I酶切產(chǎn)物20μl，0.1％BSA 5μl，Eco52 I 2μl，37℃酶切1h。pcDNA3載體也用Eco52 I和Xho I雙酶切，方法同上。用TaKaRa的DNA Ligation Kit Ver.2.1試劑盒將IgG1 Fc插入到pcDNA3中，構(gòu)建為pcDNA3-IgG1 Fc。
N2-1、N5-4、N6-3、N8-3重鏈可變區(qū)合成基因和pcDNA3-IgG1 Fc分別用EcoR V(TaKaRa)酶切，酶切體系為在50μl體系中加入5μl 10×H buffer，重鏈可變區(qū)合成基因30μl或pcDNA3-IgG1 Fc 10μ，EcoR V 3μl，37℃酶切1h。酶切產(chǎn)物使用promega的Wizard SV Gel and PCR clean-up System純化試劑盒進(jìn)行純化，再分別使用Nhe I(TaKaRa)酶切，酶切體系為在50μl體系中加入5μl10×K buffer，重鏈可變區(qū)合成基因EcoR V酶切產(chǎn)物30μl或pcDNA3-IgG1 FcEcoR V酶切產(chǎn)物30μl，Nhe I 3μl，37℃酶切1h。膠回收420bp左右的輕鏈可變區(qū)EcoR V和Nhe I酶切產(chǎn)物，并用TaKaRa的DNA Ligation Kit Ver.2.1試劑盒將輕鏈可變區(qū)插入pcDNA3-IgG1 Fc載體，構(gòu)建為pcDNA3-H-N2-1、pcDNA3-H-N5-4、pcDNA3-H-N6-3、pcDNA3-H-N8-3。
實(shí)施例三、人源EGFR單克隆抗體高效表達(dá)載體的構(gòu)建人源抗EGFR單克隆抗體基因可在多個(gè)有效的表達(dá)載體中表達(dá)，這些載體都含有信號(hào)序列，復(fù)制起點(diǎn)，1個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因，增強(qiáng)子序列，啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止序列。本發(fā)明采用商品化的pIRESneo3(Clontech)為基礎(chǔ)，使neo標(biāo)記基因弱化，從而篩選人源抗EGFR單克隆抗體高表達(dá)的細(xì)胞克隆。
采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)，將N2-1、N5-4、N6-3、N8-3的重鏈插入到本公司制備的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pIRESneo3d(通過在pIRESneo3中插入dhfr基因表達(dá)盒獲得)多克隆位點(diǎn)區(qū)中。具體操作為pIRESneo3d經(jīng)EcoR V和BamH I(TaKaRa)雙酶切，酶切體系為50μl體系中加入5μl 10×K buffer，pIRESneo3d 15μl，EcoR V 3μl，BamH I 3μl，37℃酶切1h。pcDNA3-H-N2-1、pcDNA3-H-N5-4、pcDNA3-H-N6-3、pcDNA3-H-N8-3載體經(jīng)EcoR V和BamH I雙酶切后膠回收1.4Kb的酶切片段，酶切系統(tǒng)同上。用TaKaRa的DNA Ligation Kit Ver.2.1試劑盒將重鏈片段與pIRESneo3d載體進(jìn)行粘端連接。獲得的重組表達(dá)質(zhì)粒pIRESneo3d-H轉(zhuǎn)化DH5α細(xì)菌后保存。
再將N2-1、N5-4、N6-3、N8-3的輕鏈插入到pIRESneo3d-H載體中。具體操作為pIRESneo3d-H載體經(jīng)Nru I單酶切，酶切體系為在50μl體系中加入5μl10×basal buffer，pIRESneo3d-H 15μl，0.1％BSA 0.5μl，Nru I 3μl，37℃酶切1h。酶切產(chǎn)物使用promega的Wizard SV Gel and PCR clean-up System純化試劑盒進(jìn)行純化，再用CIAP酶(TaKaRa)去磷酸化，在50ul體系中10×AlkalinePhosphatase Buffer 5μl，CIAP 2μl，pIRESneo3d-H Nru I酶切產(chǎn)物43μl，50℃反應(yīng)30min，65℃加熱處理30min以上使CIAP酶失活。pcDNA3-L-N2-1、pcDNA3-L-N5-4、pcDNA3-L-N6-3、pcDNA3-L-N8-3用Nru I和Nae I(TaKaRa)分別酶切，酶切體系為在50μl體系中加入5μl 10×basal buffer，pcDNA3-L 30μl，0.1％BSA 0.5μl，Nru I 3μl，37℃酶切1h。酶切產(chǎn)物使用promega的Wizard SVGel and PCR clean-up System純化試劑盒進(jìn)行純化，再用Nae I進(jìn)行酶切，酶切體系為50μl體系中加入5μl 10×L buffer，pcDNA3-L-N2-1、pcDNA3-L-N5-4、pcDNA3-L-N6-3、pcDNA3-L-N8-3 Nru I酶切產(chǎn)物30μl，Nae I 3μl，37℃酶切1h。膠回收含輕鏈表達(dá)盒的1.8kb的Nru I～Nae I片段，并用TaKaRa的DNALigation Kit Ver.2.1試劑盒將輕鏈表達(dá)盒與pIRESneo3d-H載體進(jìn)行粘端連接。獲得N2-1、N5-4、N6-3、N8-3完整抗體的重組表達(dá)質(zhì)粒pIRESneo3d-anti-EGFR轉(zhuǎn)化DH5α細(xì)菌后保存。人源EGFR單克隆抗體的表達(dá)載體結(jié)構(gòu)見圖3。
實(shí)施例四、人源EGFR單克隆抗體重組CHO細(xì)胞的高水平表達(dá)表達(dá)糖基化的抗CD20單克隆抗體的宿主細(xì)胞可來源于多種組織，但優(yōu)選脊椎動(dòng)物細(xì)胞?？捎玫募?xì)胞系有SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CV1細(xì)胞系(ATCC CRL 1651)，人胚胎腎細(xì)胞(293或懸浮培養(yǎng)的293)Graham et al.，J.Gen Virol.1977 3659，嬰幼倉鼠腎細(xì)胞(BHK-21 ATCC CCL 10)，中國(guó)倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO/dhfr-ATCCCRL 9096)，猴腎細(xì)胞(CV1 ATCC CRL90)，非洲綠猴腎細(xì)胞(VERO-76 ATCCCRL 1587)，人子宮癌細(xì)胞(HELA ATCC CCL 2)，犬腎細(xì)胞(MDCK，ATCC CCL34)，人肺細(xì)胞(W138，ATCC CCL95)，人肝細(xì)胞(Hep G2，HB 8065)等。優(yōu)選表達(dá)抗CD20單克隆抗體的宿主細(xì)胞為CHO/dhfr-和HEK-293細(xì)胞。
本發(fā)明中，產(chǎn)生抗CD20單克隆抗體的細(xì)胞，如CHO細(xì)胞可培養(yǎng)于多種培養(yǎng)基中。商業(yè)化的培養(yǎng)基如DMEM，MEM，Ham’s F12，RPMI-1640(Gibco)都可用于宿主細(xì)胞的培養(yǎng)。此外，Ham et al.，Meth.Enz.1979 5844；Barnes et al.，Anal.Biochem.1980 102255；U.S.Pat.Nos.4,767,707；4,657,866；4,927,762中的培養(yǎng)基均可用于培養(yǎng)宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞的培養(yǎng)條件，如溫度，pH值等也是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)條件。
人源EGFR單克隆抗體轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主細(xì)胞為CHO/dhfr-細(xì)胞時(shí)，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法有磷酸鈣共沉淀法Jordan et al.，Nucleic Acids Res.1996 244，脂質(zhì)體包裝法(如lipofectamine 2000)Audouy S.et al.，Mol Membr Biol.2001 18(2)129，電穿孔法和顯微注射法Morrison et al.，Science 1985 2291202。我們采用lipofectamine2000(invitrogen)轉(zhuǎn)染法，按其使用說明，4種N2-1、N5-4、N6-3、N8-3完整抗體序列的表達(dá)載體pIRESneo3d-anti-EGFR各制備1.5μg質(zhì)粒和4.5μllipofectamine 2000的混合物，共轉(zhuǎn)染6孔板的一個(gè)孔中6×105個(gè)細(xì)胞，過夜轉(zhuǎn)染后，將細(xì)胞平均分配到1塊96孔板中。
4種N2-1、N5-4、N6-3、N8-3完整抗體轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞在DMEM+5％dFBS+1.0mg/ml G418下進(jìn)行篩選，每2-3天更換篩選培養(yǎng)基，培養(yǎng)2-3周各獲得20多個(gè)篩選細(xì)胞克隆。將細(xì)胞按相同的密度傳至24孔板中，在0.5ml DMEM+5％dFBS培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天，ELISA檢測(cè)培養(yǎng)基上清液中人源EGFR單克隆抗體的表達(dá)量，各種抗體細(xì)胞最高表達(dá)株的結(jié)果見表3。
表3

為了使G418篩選的人源EGFR單克隆抗體細(xì)胞更高效的表達(dá)，4種抗體各選最高表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行MTX擴(kuò)增表達(dá)。具體操作為，重組CHO細(xì)胞在DMEM+5％dFBS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并在培養(yǎng)過程中加入逐步增加的MTX濃度，培養(yǎng)過程中持續(xù)監(jiān)測(cè)抗體的表達(dá)水平，當(dāng)MTX濃度增加到細(xì)胞生長(zhǎng)無法耐受時(shí)停止增加MTX濃度，在T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)五天后ELISA檢測(cè)培養(yǎng)基清液中人源EGFR單克隆抗體的表達(dá)量，結(jié)果見表3。
實(shí)施例五、人源抗EGFR單克隆抗體的活性分析(1)人源EGFR單克隆抗體的ELISA定量檢測(cè)采用夾心法進(jìn)行ELISA檢測(cè)。包被液為50μl的1μg/ml的山羊抗人IgG(Fc)多克隆抗體(KPL)，封閉液為2％BSA，室溫下封閉3h，標(biāo)準(zhǔn)品為Human IgG1，KAPPA(Sigma)，室溫放置4h，第二抗體為50μl 1∶2000稀釋的辣根酶標(biāo)記山羊抗人IgG(H+L)(北京中杉金橋有限公司)，37℃下溫育2h，TMB顯色。OD450下讀值。
(2)人源EGFR單克隆抗體的純化及SDS-PAGE分析細(xì)胞培養(yǎng)上清液經(jīng)過Prostak切向流系統(tǒng)0.45μm過濾。澄清的培養(yǎng)液上樣Protein A Sepharose FF.柱進(jìn)行親和純化Lindmark et al.，J.Immunol.Meth.1983621，用0.1M pH2.7檸檬酸緩沖液洗脫。親和層析洗脫峰用1M Tris pH9.0調(diào)pH3.5，室溫孵育1h后再將樣品用1M Tris pH9.0調(diào)pH為7.8，上樣DEAESepharose FF柱分離，用20mM Na3PO4/150mM NaCl pH 7.4液洗脫。AIEX洗脫峰中加入固體NaCl至終濃度1.2M，0.45μm濾膜過濾后進(jìn)Butyl Sepharose HS分離，20mM Na3PO4，5％ glycerol，pH 7.4洗脫液洗脫。最終產(chǎn)品0.22μm濾膜過濾后凍干保存。終產(chǎn)品經(jīng)HP-SEC檢測(cè)純度97％以上，13％SDS-PAGE電泳可見清晰的重鏈和輕鏈條帶(圖4)。
(3)人源抗EGFR型抗體的A431細(xì)胞增值活性檢測(cè)及親和力分析將100μl DMEM/F12梯度系列稀釋親和純化后的Ab-N2-1、Ab-N5-4、Ab-N6-3、Ab-N8-3抗體加入96孔板中，并以本公司表達(dá)的SCT400 IgG1型抗體和無抗體的DMEM/F12+10％FBS培養(yǎng)基為對(duì)照。均加入100μl 2×103個(gè)A431細(xì)胞的DMEM/F12+10％FBS培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)4天后每孔加入10μl WST-8(南京旋光科技有限公司)，繼續(xù)培養(yǎng)3h，450nm測(cè)定光吸收。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在的4個(gè)IgG1抗體中，Ab-N5-4(圖6a和6b)、Ab-N6-3(圖7a和7b)的抗A431細(xì)胞的增殖效果較Ab-N2-1和Ab-N8-3的明顯，能夠明顯抑制A431細(xì)胞的正常增殖，并誘發(fā)細(xì)胞的凋亡，結(jié)果見圖5。
對(duì)Ab-N2-1、Ab-N5-4、Ab-N6-3、Ab-N8-34個(gè)克隆的完整IgG1型抗體進(jìn)行親和性分析。我們用競(jìng)爭(zhēng)ELISA法進(jìn)行抗體親和力檢測(cè)，該技術(shù)為本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員所熟知的方法。100μl 20μg/ml純化的EGFR ECD重組蛋白4℃過夜包被96孔板，再加入3％脫脂牛奶室溫下封閉1h，TBS/Tween洗液清洗三次，在離心管中建立終濃度為0.1nM-1μM的EGFR ECD抗原系列稀釋度和終濃度為1nM的完整IgG1抗體，室溫下孵育30min后，加入到EGFR ECD重組蛋白包被的96孔板中，室溫下競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合5-10min，TBS/Tween洗液充分清洗96孔酶標(biāo)板，加入1∶2000倍稀釋的HRP-兔抗M13(法瑪西亞)室溫下結(jié)合2h，TMB顯色，最強(qiáng)信號(hào)的一半的抗原濃度視為抗體的解離常數(shù)KD，結(jié)果見表2。
實(shí)施例六、N5和N6組scFv的進(jìn)一步分析scFv的親和性和活性分析結(jié)果和重構(gòu)后的Ab-N5-4、Ab-N6-3的證明，來自N5(9個(gè)相似克隆)和N6組(13個(gè)相似克隆)的克隆具有較好的潛在篩選價(jià)值，序列的相似性也說明這些克隆針對(duì)的可能是相似的抗原決定簇，篩選的參數(shù)僅限于抗體親和力。因此我們又針對(duì)N5組剩余的8個(gè)克隆和N6組的12個(gè)克隆進(jìn)行了抗體親和力的篩選，可溶性的scFv經(jīng)過表達(dá)，進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)，方法同上面的親和力測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)N5-7(圖8a和8b)kD＝0.6×10-9和N6-9(圖9a和9b)kD＝0.8×10-9，該兩個(gè)克隆對(duì)EGFR ECD具有很高的親和性。
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人神州細(xì)胞工程有限公司(ii)發(fā)明名稱人源抗體及其表達(dá)(iii)序列數(shù)目25(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度120(B)類型氨基酸(ii)分子類型蛋白(A)描述N5-4-VH(iii)序列描述SEQ ID NO1EVQLLQSGPG LVKPSETLSL TCTVSGGSVS SGDYYWSWIR QPPGKGLEWI GHIYYSGSTN60YNPSLKSRVT ISLDTSKNQF SLKLSSVTAA DTAVYYCARD FLTGSFFDYW GQGTLVTVSS120(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度108(B)類型氨基酸(ii)分子類型蛋白(A)描述N5-4-VH(iii)序列描述SEQ ID NO2DIQMTQSPST LSASVGDRVT ITCQASQDIN NYLNWYQQKP GKAPKVLIHD ASNLETGGPS60RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYYCQQ YESLPLTFGQ GTKVEIKR 108(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度119(B)類型氨基酸(ii)分子類型蛋白(A)描述N6-3-VH(iii)序列描述SEQ ID NO3QVQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGGSVS SGDYYWTWIR QSPGKGLEWI GHIYYSGNTN60
YNPSLKSRLT ISIDTSKTQF SLKLSSVTAA DTAIYYCVRD RVTGAFDIWG QGTMVTVSS 119(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度108(B)類型氨基酸(ii)分子類型蛋白(A)描述N6-3-VH(iii)序列描述SEQ ID NO4DIQMTQSPST LSASVGDRVT ITCQASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKLLIYD ASNLETGVPS 60RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQH FDHLPLAFGG GTKVEIKR 108(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度120(B)類型氨基酸(ii)分子類型蛋白(A)描述N5-7-VH(iii)序列描述SEQ ID NO5EVQLLQSGPG LVKPSETLSL TCTVSGGSIN SGDYYWSWIR QHPGKGLEWI GYIYYSGNTY 60YNPSLKSRVT MSIDPSKNQF SLKLISVTAA DTAVYYCATS LYYGGGMDVW GQGTLVTVSS 120(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度108(B)類型氨基酸(ii)分子類型蛋白(A)描述N5-7-VH(iii)序列描述SEQ ID NO6DIQMTQSPST LSASVGDRVT ITCQASQDIN NYLNWYQQRP GNAPKLLIYD ASNLETGVPS 60RFSGSGSGTD FTFTINSLQP EDIATYFCQH YDHLPWTFGQ GTKVEIKR 108(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度119(B)類型氨基酸
(ii)分子類型蛋白(A)描述N5-9-VH(iii)序列描述SEQ ID NO7QVQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGGSVS SGDYYWSWIR QPPGKGLEWI GHIYYSGSTN60YNPSLKSRVT ISVDTSKNQF SLKLSSVTAA DTAVYYCARD SILGATNYWG QGTMVTVSS 119(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度108(B)類型氨基酸(ii)分子類型蛋白(A)描述N6-9-VH(iii)序列描述SEQ ID NO8DIQMTQSPST LSASVGDRVT ITCQASQDIN NYLNWYQQKP GKAPKLLISD ASNLETGVPS60RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYHCQQ YDSLPLTFGG GTKVEIKR 108(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度360(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(A)描述N5-4-VH(iii)序列描述SEQ ID NO9GAGGTGCAGC TGTTGCAGTC TGGCCCAGGC CTGGTGAAGC CCTCTGAGAC CCTGTCCCTG60ACCTGCACTG TCTCTGGTGG CTCCGTCAGC AGTGGTGATT ACTACTGGAG CTGGATCCGG120CAGCCCCCAG GGAAGGGACT GGAGTGGATT GGACATATCT ATTACAGTGG GAGCACCAAC180TACAACCCCT CCCTCAAGAG TCGAGTCACC ATATCATTAG ACACGTCCAA GAACCAGTTC240TCCCTGAAGC TGAGCTCTGT GACCGCTGCG GACACGGCCG TGTATTACTG TGCGAGAGAT300TTTTTGACTG GTTCCTTCTT TGACTACTGG GGCCAGGGAA CCCTGGTCAC CGTCTCCTCA360(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度324(B)類型核苷酸
(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(A)描述N5-4-VH(iii)序列描述SEQ ID NO10GACATCGTGA TGACCCAGTC TCCCAGCACC CTGTCCGCCT CTGTGGGCGA CCGGGTGACC60ATCACTTGCC AGGCGAGTCA GGACATTAAC AACTATTTAA ATTGGTATCA GCAGAAACCA120GGGAAAGCCC CTAAGGTCCT GATCCACGAT GCATCCAATT TGGAAACAGG GGGCCCATCA180AGGTTCAGTG GAAGTGGATC TGGGACAGAT TTTACTTTCA CCATCAGCAG CCTGCAGCCT240GAAGACATTG CAACATATTA TTGTCAACAG TATGAAAGTC TCCCACTCAC TTTCGGCGGG300GGGACCAAGG TGGAGATCAA ACGA 324(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度357(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(A)描述N6-3-VH(iii)序列描述SEQ ID NO11CAGGTGCAGC TGCAGGAGTC GGGCCCAGGC CTGGTGAAGC CCTCTGAGAC CCTGTCCCTG60ACCTGCACTG TCTCTGGTGG CTCCGTCAGC AGTGGTGATT ACTACTGGAG CTGGATCCGG120CAGTCCCCAG GGAAGGGACT GGAGTGGATT GGACACATCT ATTACAGTGG GAACACCAAT180TATAACCCCT CCCTCAAGAG TCGACTCACC ATATCAATTG ACACGTCCAA GAACCAGTTC240TCCCTGAAGC TGAGTTCTGT GACCGCTGCG GACACGGCCA TTTATTACTG TGTGCGAGAT300CGAGTGACTG GTGCTTTTGA TATCTGGGGC CAAGGGACAA TGGTCACCGT CTCTTCA 357(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度324(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(A)描述N6-3-VH
(iii)序列描述SEQ ID NO12GACATCGTGA TGACCCAGTC TCCCAGCACC CTGTCCGCCT CTGTGGGCGA CCGGGTGACC60ATCACTTGCC AGGCGAGTCA GGACATCAGC AACTATTTAA ATTGGTATCA GCAGAAACCA120GGGAAAGCCC CTAAACTCCT GATCTACGAT GCATCCTCCT TGGAAACAGG GGTCCCATCA180AGGTTCAGTG GAAGTGGATC TGGGACAGAT TTTACTTTCA CCATCAGCGG CCTGCAGCCT240GAAGATATTG CAACATATTT CTGTCAACAC TTTGATCATC TCCCGCTCGC TTTCGGCGGA300GGGACCAAGG TGGAGATCAA ACGA 324(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度360(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(A)描述N5-7-VH(iii)序列描述SEQ ID NO13GAGGTGCAGC TGTTGCAGTC TGGCCCAGGC CTGGTGAAGC CCTCTGAGAC CCTGTCCCTG60ACCTGCACTG TCTCTGGTGG CTCCATCAAC AGTGGTGATT ACTACTGGAG CTGGATCCGC120CAACACCCAG GGAAGGGCCT GGAGTGGATT GGGTACATCT ATTACAGTGG GAACACCTAC180TACAACCCGT CCCTCAAGAG TCGAGTTACC ATGTCAATAG ACCCGTCTAA GAACCAGTTC240TCCCTGAAAC TGATCTCTGT GACTGCCGCG GACACGGCCG TTTATTACTG TGCGACNTCC300CTTTACTATG GCGGGGGTAT GGACGTCTGG GGCCAAGGGA CCCTGGTCAC CGTCTCCTCA360(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度324(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(A)描述N5-7-VH(iii)序列描述SEQ ID NO14GACATCGTGA TGACCCAGTC TCCCAGCACC CTGTCCGCCT CTGTGGGCGA CCGGGTGACC60ATCACTTGCC AGGCGAGTCA GGACATTAAC AACTATTTGA ATTGGTATCA GCAGAGGCCA120GGGAACGCCC CTAAACTCCT GATCTACGAT GCATCCAATT TGGAAACAGG GGTCCCATCA180
AGGTTCAGTG GAAGTGGATC TGGGACAGAT TTTACTTTCA CCATCAACAG CCTGCAGCCT240GAAGATATTG CGACATATTT CTGTCAACAC TATGATCATC TCCCGTGGAC GTTCGGCCAA300GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGA 324(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度357(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(A)描述N5-9-VH(iii)序列描述SEQ ID NO15CAGGTGCAGC TGCAGGAGTC GGGCCCAGGC CTGGTGAAGC CCTCTGAGAC CCTGTCCCTG60ACCTGCACTG TGTCTGGTGG CTCCGTCAGC AGTGGTGATT ACTACTGGAG CTGGATCCGG120CAGCCCCCCG GGAAGGGACT GGAGTGGATT GGGCACATCT ATTACAGTGG GAGCACCAAT180TACAATCCCT CCCTCAAGAG TCGAGTCACC ATATCAGTAG ACACGTCCAA GAACCAGTTC240TCCCTGAAGC TGAGCTCTGT GACCGCTGCG GACACGGCCG TGTATTACTG TGCGAGAGAC300TCCATACTGG GAGCTACCAA CTACTGGGGC CAGGGAACCA TGGTCACCGT CTCCTCA 357(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度324(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(A)描述N6-9-VH(iii)序列描述SEQ ID NO16GACATCGTGA TGACCCAGTC TCCCAGCACC CTGTCCGCCT CTGTGGGCGA CCGGGTGACC60ATCACTTGCC AGGCGAGTCA GGACATTAAT AACTATTTAA ATTGGTATCA GCAGAAACCA120GGGAAAGCCC CTAAACTCCT GATCTCCGAT GCATCCAATT TAGAAACAGG GGTCCCATCG180AGGTTCAGTG GAAGTGGATC TGGGACAGAT TTTACTTTCA CCATCAGCAG CCTGCAGCCT240GAAGATATTG CNACATATCA CTGTCAACAG TATGATAGTC TCCCGCTCAC TTTCGGCGGA300GGGACCAAGG TAGAGATCAA ACGA 324
(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(A)描述合成引物(iii)序列描述SEQ ID NO17AGCGCTAGCG GGAGCAGCGA 20(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(A)描述合成引物(iii)序列描述SEQ ID NO18GGTCAGAGCT CCCTGCCCTA GAATC25(2)SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度30(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(A)描述合成引物(iii)序列描述SEQ ID NO19TCCTCGCAAC TGCGGCCCAG CCGGCCATGG 30(2)SEQ ID NO20的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度38
(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(A)描述合成引物(iii)序列描述SEQ ID NO20ATGATGATGA TGATGACGTT TRATHTCCAS YYKKGTCC 38(2)SEQ ID NO21的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度32(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(A)描述合成引物(iii)序列描述SEQ ID NO21GCGGCGGCCG CATGATGATG ATGATGATGA CG 32(2)SEQ ID NO22的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度30(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(A)描述合成引物(iii)序列描述SEQ ID NO22GCGGGATCCC GTACGGTGGC TGCACCATCT30(2)SEQ ID NO23的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度34(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型DNA(A)描述合成引物(iii)序列描述SEQ ID NO23GCGCTCGAGC TAACACTCTC CCCTGTTGAA GCTC34(2)SEQ ID NO24的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度31(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(A)描述合成引物(iii)序列描述SEQ ID NO24GCGCGGCCGG CTAGCACCAA GGGCCCATCG G 31(2)SEQ ID NO25的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度40(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(A)描述合成引物(iii)序列描述SEQ ID NO25GCGCTCGAGG ATCCTCATTT ACCCGGAGAC AGGGAGAGGC 40
權(quán)利要求
1.四個(gè)新的全人單鏈抗體，其特征在于a)其中一個(gè)單鏈抗體包含SEQ ID NO1所示的重鏈可變區(qū)氨基酸序列和SEQ ID NO2所示的κ輕鏈可變區(qū)氨基酸序列；b)其中另一個(gè)單鏈抗體包含SEQ ID NO3所示的重鏈可變區(qū)氨基酸序列和SEQ ID NO4所示的κ輕鏈可變區(qū)氨基酸序列；c)其中另一個(gè)單鏈抗體包含SEQ ID NO5所示的重鏈可變區(qū)氨基酸序列和SEQ ID NO6所示的κ輕鏈可變區(qū)氨基酸序列；d)其中另一個(gè)單鏈抗體包含SEQ ID NO7所示的重鏈可變區(qū)氨基酸序列和SEQ ID NO8所示的κ輕鏈可變區(qū)氨基酸序列。
2.四個(gè)新的全人抗體，其特征在于a)其中一個(gè)抗體包含SEQ ID NO1所示的重鏈可變區(qū)氨基酸序列和SEQ ID NO2所示的κ輕鏈可變區(qū)氨基酸序列；b)其中另一個(gè)抗體包含SEQ ID NO3所示的重鏈可變區(qū)氨基酸序列和SEQ ID NO4所示的κ輕鏈可變區(qū)氨基酸序列；c)其中另一個(gè)抗體包含SEQ ID NO5所示的重鏈可變區(qū)氨基酸序列和SEQ ID NO6所示的κ輕鏈可變區(qū)氨基酸序列；d)其中另一個(gè)抗體包含SEQ ID NO7所示的重鏈可變區(qū)氨基酸序列和SEQ ID NO8所示的κ輕鏈可變區(qū)氨基酸序列。
3.權(quán)利要求2所述的四個(gè)抗體，其特征在于抗體的輕鏈恒定區(qū)為κ，重鏈恒定區(qū)可為IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgM，IgA1，IgA2，IgD和IgE。
4.權(quán)利要求2所述的四個(gè)抗體，其特征在于抗體的輕鏈恒定區(qū)為κ，重鏈恒定區(qū)為IgG1時(shí)具有針對(duì)表達(dá)EGFR受體細(xì)胞的ADCC和CDCC活性。
5.權(quán)利要求2所述的四個(gè)抗體，其特征在于a)其中一個(gè)抗體的重鏈可變區(qū)的DNA分子為SEQ ID NO9，輕鏈可變區(qū)的DNA分子為SEQ ID NO10；b)其中另一個(gè)抗體的重鏈可變區(qū)的DNA分子為SEQ ID NO11，輕鏈可變區(qū)的DNA分子為SEQ ID NO12；c)其中另一個(gè)抗體的重鏈可變區(qū)的DNA分子為SEQ ID NO13，輕鏈可變區(qū)的DNA分子為SEQ ID NO14；d)其中另一個(gè)抗體的重鏈可變區(qū)的DNA分子為SEQ ID NO15，輕鏈可變區(qū)的DNA分子為SEQ ID NO16。
6.一種優(yōu)化的抗體蛋白表達(dá)載體，其特征在于，它包含權(quán)利要求5中所述的DNA分子。
7.一種抗體表達(dá)方法，其特征在于用權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體在中國(guó)倉鼠卵巢細(xì)胞CHO中表達(dá)抗體蛋白。
全文摘要
本發(fā)明提供了全人抗EGFR的scFv抗體片段及完整抗體，包括抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸分子，以及完整抗體在CHO細(xì)胞中高效表達(dá)的方法。
文檔編號(hào)C12N15/63GK101058609SQ20061001200
公開日2007年10月24日 申請(qǐng)日期2006年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月26日
發(fā)明者孫春昀, 李因傳, 康平 申請(qǐng)人:神州細(xì)胞工程有限公司