專利名稱：一種預(yù)測達(dá)菲類藥物用藥安全性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種預(yù)測達(dá)菲類藥物用藥安全性的方法，特別涉及通過測定功能基因的單核苷酸多態(tài)性來預(yù)測個體對達(dá)菲類藥物副作用的敏感性。
背景技術(shù)：
達(dá)菲(Tamiflu)的活性成分為oseltamivir phosphate(磷酸奧司他為)，進(jìn)入體內(nèi)后被代謝為oseltamivir carboxylate(奧司他為羧酸鹽)。該藥被認(rèn)為是目前對人體最有效的抵抗高致病性禽流感病毒H5N1的特效藥(Butler，D.Wartime tactic doubles power of scarcebird-fu drug.Nature 2005；4386.)。目前已有很多國家在大規(guī)模囤積Tamiflu，用來應(yīng)對潛在的人群中的禽流感威脅。然而，據(jù)報道Tamiflu的使用可能會導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用，包括皮膚反應(yīng)以及一些神經(jīng)方面的疾病。據(jù)日本官方報道(FDA)，發(fā)生在日本的兩起自殺事件和64例神經(jīng)方面的不良反應(yīng)(抽搐，精神狂亂等)可能是由Tamiflu的副作用引起的(http://www.fda.gov/cder/drug/infopage/tamiflu/QA20051117.htm)，其它國家(如澳大利亞)也對Tamiflu可能存在的副作用進(jìn)行了詳細(xì)的報道。然而，Tamiflu為何會對某些人群(個體)引起嚴(yán)重的副作用，目前還沒有詳細(xì)的機(jī)制報道，達(dá)菲類藥物的用藥安全性則需要引起人們足夠的重視。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的原理一、唾液酸酶結(jié)構(gòu)分析人體的唾液酸酶(sialidase)蛋白家族包括Neu1-Neu4四種蛋白，目前只有定位于胞漿的Neu2的晶體結(jié)構(gòu)在2004年1月被解析出來(Chavas，L.M.et al.Crystal structure of thehuman cytosolic sialidase Neu2.Evidence for the dynamic nature of substrate recognition.J BiolChem 2005；280469-75.)。Neu2的結(jié)構(gòu)與病毒的唾液酸酶類似，并含有類似的活性中心。本發(fā)明的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)Neu2的217位亮氨酸距離活性中心較近，它可以為達(dá)菲的活性形式奧司他為羧酸鹽(oseltamivir carboxylate)C6位的疏水基團(tuán)提供一個較好的局部環(huán)境，從而促進(jìn)oseltamivir carboxylate的結(jié)合。然而，Neu241位的精氨酸可以排斥oseltamivircarboxylate的C4基團(tuán)，這種排斥作用大大減弱了oseltamivir carboxylate對Neu2的結(jié)合能力?？傊?，定位于胞漿的Neu2可以結(jié)合oseltamivir carboxylate，但結(jié)合作用并不強(qiáng)。通過多序列比對和同源建模分析，本發(fā)明相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)人體所含另外三種唾液酸酶也具有類似的結(jié)構(gòu)(如圖1所示)，推測oseltamivir carboxylate對它們也具有類似的抑制作用。目前已有多篇文獻(xiàn)報道，對人體唾液酸酶微弱的抑制就會引發(fā)嚴(yán)重的疾病，包括癲癇和精神性疾病等(Seyrantepe，V.et al.Molecular pathology of NEU1 gene in sialidosis.Hum Mutat2003，22343-52.；Boyzo，A.，Ayala，J.，Gutierrez，R.& Hernandez，R.J.Neuraminidaseactivity in different regions of the seizing epileptic and non-epileptic brain.Brain Res 2003，964211-7.)。而這些疾病的若干癥狀恰好與目前報道的Tamiflu副作用相符，由此推斷Tamiflu可能通過抑制人體唾液酸酶引發(fā)嚴(yán)重的副作用。
二、對Neu2的單核苷酸多態(tài)性分析通過檢索NCBI的單核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(dbSNP)，發(fā)現(xiàn)Neu2的41位精氨酸處存在著一個導(dǎo)致非同義突變的SNP(SNP IDrs2233385)。該SNP導(dǎo)致這個位點(diǎn)的精氨酸突變?yōu)樘於０罚碦41Q。通過對蛋白活性位點(diǎn)的深入分析，本發(fā)明的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，由于該突變位點(diǎn)緊靠Neu2的催化位點(diǎn)，這個突變會在較大程度上增強(qiáng)oseltamivir carboxylate與Neu2的結(jié)合能力。由此推測具有Gln41突變型的個體對Tamiflu的副作用表現(xiàn)得更為敏感。
三、Neu2的野生型和R41Q突變型對oseltamivir carboxylate結(jié)合能力的仿真分析本發(fā)明的相關(guān)研究使用權(quán)威的分子模擬軟件InsightII對Neu2的野生型和R41Q突變型與oseltamivir carboxylate結(jié)合的能力進(jìn)行仿真分析，結(jié)果如圖2所示。圖2a是野生型Neu2與oseltamivir carboxylate結(jié)合的示意圖，圖2b是R41Q突變型與oseltamivir carboxylate結(jié)合的示意圖，圖中間的六元環(huán)化合物為oseltamivir carboxylate，41位的精氨酸或天冬酰胺用粗線條突出出來，可以看出41位的精氨酸排斥oseltamivir carboxylate的C4基團(tuán)，R41Q突變型對oseltamivir carboxylate結(jié)合能力較之野生型Neu2有了顯著增強(qiáng)，這意味著具有Gln41突變型的個體可能對Tamiflu的副作用表現(xiàn)得更為敏感。
四、Neu2的野生型和R41Q突變型對oseltamivir carboxylate結(jié)合能力的實(shí)驗(yàn)分析為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述的假設(shè)，本發(fā)明相關(guān)的研究對Neu2野生型和R41Q突變型進(jìn)行了表達(dá)純化，一共表達(dá)出2.92mgNeu2和2.09mg R41Q。隨后，設(shè)計了測定唾液酸酶的酶活體系對oseltamivir carboxylate針對Neu2野生型和R41Q突變型的結(jié)合能力分別進(jìn)行了定量測定。
反應(yīng)體系如下所示
緩沖液0.1M pH5.6的檸檬酸鈉/磷酸緩沖液(0.1M Na citrate/phosphate pH5.6)；底物0.286M的4MU-NANA；酶Neu22.42mg/mL，每次用量15μL，或R41Q 0.61mg/mL，每次25μL；抑制劑oseltamivir carboxylate。
檢測條件溫度37℃，檢測波長為340nm。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。可以看出，R41Q突變型對oseltamivir carboxylate結(jié)合能力較之Neu2野生型有了顯著增強(qiáng)，導(dǎo)致酶活下降更為顯著。這意味著具有Gln41突變型的個體對Tamiflu的副作用表現(xiàn)得更為敏感。
五、該SNP的人口分布分析從上述分析可知，由SNP導(dǎo)致的Arg41→Gln41替換會顯著增強(qiáng)Tamiflu的活性形式oseltamivir carboxylate對Neu2的結(jié)合能力，從而引起類似唾液酸酶被抑制的疾病相關(guān)的癥狀，進(jìn)一步的，本發(fā)明相關(guān)研究對該位點(diǎn)SNP的人口分布進(jìn)行了統(tǒng)計分析。根據(jù)NCBI的單核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(dbSNP)記錄，該位點(diǎn)突變體在亞洲出現(xiàn)的概率為9.29％，在撒哈拉沙漠以南的非洲地區(qū)出現(xiàn)的概率為0.55％，而在歐洲和美洲出現(xiàn)的概率為0，即亞洲國家相對于其他國家和地區(qū)更容易出現(xiàn)Tamiflu副作用的案例，而目前副作用報道主要發(fā)生在日本，即目前已知的該位點(diǎn)的SNP分布表明數(shù)據(jù)與副作用報告案例的地域分布恰好相符。
六、其它的抗感冒病毒藥物通過對其他類似藥物的比較發(fā)現(xiàn)，藥物分子C4位置為氨基的達(dá)菲類六元環(huán)抗感冒病毒藥物，同樣會由于該SNP的存在而增強(qiáng)與Neu2蛋白的親和力，從而引起潛在的副作用。如結(jié)構(gòu)為下列式1～7的可作為抗感冒病毒藥物的化合物，均為感冒病毒的神經(jīng)酰胺酶抑制劑(influenza neuraminidase inhibitors)(Varghese，J.N.et al.Drug design against a shiftingtargeta structural basis for resistance to inhibitors in a variant of influenza virus neuraminidase.Structure 1998；6735-46.)。其中，式7為Tamiflu的活性形式。通過運(yùn)用InsightII軟件對這些藥物與Neu2結(jié)合能力的仿真分析發(fā)現(xiàn)，與Tamiflu的活性形式結(jié)構(gòu)類似的式3～6化合物(C4位置為氨基)都可以較好地與Arg41Gln突變型的Neu2結(jié)合。
式1式2式3 式4 式5 式6 式7本發(fā)明的目的在于提供一種預(yù)測個體使用達(dá)菲類藥物安全性的方法，該方法通過測定受試者功能基因的單核苷酸多態(tài)性來預(yù)測其對達(dá)菲類藥物副作用的敏感性。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下通過測定受試者唾液酸酶(sialidase)蛋白家族Neu2蛋白基因Arg41Gln單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)(SNP IDrs2233385)的基因型，預(yù)測受試者對達(dá)菲類藥物副作用的敏感性對于該SNP位點(diǎn)的基因型為A/A的個體，達(dá)菲類藥物會引起副作用；對于基因型為A/G的個體，使用達(dá)菲類藥物存在一定的風(fēng)險性；對于基因型為G/G的個體，使用達(dá)菲類藥物是安全的。
其中，測定Neu2蛋白基因Arg41Gln SNP位點(diǎn)基因型的方法有很多種，比較簡單快捷的方法有針對該SNP位點(diǎn)通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增Neu2蛋白基因片斷，然后利用特定的限制性核酸內(nèi)切酶消化、凝膠電泳檢測分析該SNP位點(diǎn)的基因型；直接對PCR擴(kuò)增出來的含該SNP位點(diǎn)的Neu2蛋白基因片斷進(jìn)行DNA測序；制備R41Q突變型Neu2的特異抗體，通過ELISA(酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn))反應(yīng)來確定該SNP位點(diǎn)的基因型。此外，還可以使用其它常見的SNP測定方法，例如通過設(shè)計核苷酸探針與目的片斷進(jìn)行雜交，根據(jù)雜交復(fù)合體的穩(wěn)定性檢測SNP位點(diǎn)；通過分子信標(biāo)(molecular beacons)(Mhlanga，M.M.，Malmberg，L.，Using molecular beacons to detect single-nucleotide polymorphisms withreal-time PCR.Methods.2001 Dec，25(4)463-71.)、蝎狀探針(scorpion primer)(Whitcombe，D.，Theaker，J.，Guy，S.P.，Brown，T.，Little，S.，Detection of PCR products using self-probingamplicons and fluorescence.Nat Biotechnol.1999 Aug，17(8)804-7.)等基于雜交和熒光共振原理的方法檢測SNP位點(diǎn)。
上述使用限制性核酸內(nèi)切酶測定Neu2蛋白基因Arg41Gln SNP位點(diǎn)基因型的方法包括以下步驟1.提取宿主細(xì)胞的基因組DNA；2.應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增含Arg41Gln SNP位點(diǎn)的Neu2蛋白基因片斷；3.限制性核酸內(nèi)切酶消化；4.電泳檢測以確定Neu2蛋白基因Arg41Gln SNP位點(diǎn)的基因型。
上述步驟2可使用如下序列的引物上游引物5’-GGTGAGCACCACCTGTCT-3’(SEQ ID No.1)下游引物5’-GGTCCAGGGAACCATTAG-3’(SEQ ID No.2)PCR反應(yīng)最好選用高保真耐熱DNA聚合酶Pfu，反應(yīng)條件可設(shè)定為 PCR產(chǎn)物大小466bp上述步驟3所使用的限制性核酸內(nèi)切酶可選擇MspA1I核酸內(nèi)切酶，該酶的酶切位點(diǎn)是CMGCKG，其中M表示A或C，K表示G或T。當(dāng)最后的G突變?yōu)锳后，該酶將不能識別這段核酸序列，而Neu2野生型在所述SNP處序列為CAGCGG，R41Q突變型序列為CAGCGA。對于使用上述引物擴(kuò)增得到的Neu2蛋白基因片斷，經(jīng)該酶酶切后，使用瓊脂糖凝膠電泳分析，若表現(xiàn)為在220bp處有一條帶，表明該個體在這個SNP位點(diǎn)的基因型為G/G，達(dá)菲類藥物對該個體是安全的；若表現(xiàn)為在220bp和460bp處各有一條帶，表明該個體在這個SNP位點(diǎn)的基因型為A/G，使用達(dá)菲類藥物存在一定的風(fēng)險性；若表現(xiàn)為在460bp處有一條帶，表明該個體在這個SNP位點(diǎn)的基因型為A/A，應(yīng)慎重考慮是否使用其它藥物代替達(dá)菲類藥物。
上述直接測定Neu2蛋白基因片斷序列的方法包括以下步驟1.提取宿主細(xì)胞的基因組DNA；2.PCR擴(kuò)增含Arg41Gln SNP位點(diǎn)的Neu2蛋白基因片斷；3.對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序確定所述SNP位點(diǎn)的基因型。
上述步驟2的PCR反應(yīng)可使用如下序列的引物上游引物5’-CGGAATTCATGGCGTCCCTTCCTGTCCTG-3’(SEQ ID No.3)下游引物5’-CTGAACCTGGTGGGTGGGTGC-3’(SEQ ID No.4)最好采用高保真耐熱DNA聚合酶Pfu進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件可設(shè)定為 PCR產(chǎn)物大小220bp上述通過ELISA反應(yīng)來確定所述SNP位點(diǎn)的基因型的方法包括以下步驟1.利用Neu2蛋白基因Arg41Gln突變位點(diǎn)附近的氨基酸序列設(shè)計并獲取R41Q免疫抗體；2.用上述R41Q免疫抗體包被反應(yīng)板，洗滌除去未結(jié)合的抗體；3.在反應(yīng)孔中加入待測樣品，溫育后形成免疫復(fù)合物，然后洗滌除去未結(jié)合的物質(zhì)，同時做空白對照、陰性對照和陽性對照；4.在各反應(yīng)孔中加入酶標(biāo)抗體，溫育后洗滌除去未結(jié)合的酶標(biāo)抗體；5.加底物液顯色；6.一定時間后加終止液終止反應(yīng)；7.肉眼直接觀察反應(yīng)孔內(nèi)溶液的顏色或用檢測儀測定其OD值，與陰性和陽性對照對比確定待測樣品的所述SNP位點(diǎn)的基因型。
上述步驟1所述的氨基酸序列可為llafaeqQaskkdeh(SEQ ID No.6)，其中大寫的Q為41位的天冬酰胺。通常將設(shè)計并合成的多肽免疫兔子獲得R41Q免疫抗體。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種簡便易行的預(yù)測個體使用達(dá)菲類藥物安全性的試劑盒，包括A液四種脫氧三磷酸單核苷酸(dNTP)，高保真耐熱DNA聚合酶及其反應(yīng)緩沖液；上述DNA聚合物最好選用Pfu(Pfu DNA Polymerase)，其2×反應(yīng)緩沖液成份為200mM Tris-HCl，100mM KCl，100mM(NH4)2SO4，20mM MgSO4，1.0％Triton X-100和1mg/ml BSA，保存溫度為-20℃；B液PCR引物，由寡核苷酸合成儀合成；C液限制性核酸內(nèi)切酶MspA1I，保存溫度為-20℃；D液限制性核酸內(nèi)切酶MspA1I的反應(yīng)緩沖液；可選用NEB公司提供的MspA1I的10×反應(yīng)緩沖液，其成份為NEBuffer 4+BSA 50mM KAc，20mM Tris-Ac，10mM Mg(Ac)2，1mM DTT。
該試劑盒的PCR引物序列可以如下所示上游引物5’-GGTGAGCACCACCTGTCT-3’(SEQ ID No.1)下游引物5’-GGTCCAGGGAACCATTAG-3’(SEQ ID No.2)本發(fā)明的積極效果根據(jù)已知NCBI dbSNP數(shù)據(jù)，該SNP的突變型在日本和中國的出現(xiàn)的比例分別為8.7％和9.1％。據(jù)日本官方報道(FDA)，發(fā)生在日本的兩起自殺事件和64例神經(jīng)方面的不良反應(yīng)(抽搐，精神狂亂等)可能是由Tamiflu的副作用引起的。雖然中國沒有像日本一樣大規(guī)模使用Tamiflu，我們預(yù)測如果大量使用Tamiflu，副作用可能會頻繁地在中國出現(xiàn)，這一點(diǎn)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。如何針對亞洲約10％的個體設(shè)計特異性的、低副作用的抗禽流感藥物是今后應(yīng)努力的方向，而在使用Tamiflu一類抗流感藥物前進(jìn)行個體基因型的檢測是必要的。


圖1是人體所含的四種唾液酸酶序列比對圖。
圖2a是野生型Neu2與oseltamivir carboxylate結(jié)合的示意圖；圖2b是R41Q突變型Neu2與oseltamivir carboxylate結(jié)合的示意圖。
圖3是Neu2的野生型和R41Q突變型對oseltamivir carboxylate結(jié)合能力的比較圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一使用酶切試劑盒預(yù)測個體使用Tamiflu類藥物的安全性一種預(yù)測個體使用Tamiflu類藥物的安全性的試劑盒，該試劑盒包括A液脫氧三磷酸單核苷酸(dNTP)，高保真耐熱DNA聚合酶Pfu(Pfu DNA Polymerase)及其2×反應(yīng)緩沖液；上述緩沖液成份可為200mM Tris-HCl，100mM KCl，100mM(NH4)2SO4，20mMMgSO4，1.0％ Triton X-100和1mg/ml BSA，保存溫度為-20℃；B液含有用于擴(kuò)增含Arg41Gln SNP位點(diǎn)的Neu2蛋白基因片斷的PCR引物，由寡核苷酸合成儀合成；C液限制性核酸內(nèi)切酶MspA1I，保存溫度為-20℃；D液限制性核酸內(nèi)切酶MspA1I的10×反應(yīng)緩沖液；可選用NEB公司提供的MspA1I的10×反應(yīng)緩沖液，其成份為NEBuffer 4+BSA 50mM KAc，20mM Tris-Ac，10mM Mg(Ac)2，1mM DTT。
該試劑盒的PCR引物序列為上游序列5’-GGTGAGCACCACCTGTCT-3’(SEQ ID No.1)下游序列5’-GGTCCAGGGAACCATTAG-3’(SEQ ID No.2)使用本試劑盒預(yù)測個體使用Tamiflu類藥物的安全性的步驟如下[1]取個體血樣，提取個體的基因組DNA(使用promega公司提供的基因組提取試劑盒)；[2]以上述個體基因組為模版(template)，PCR擴(kuò)增目的基因片段25μL PCR反應(yīng)體系中加入基因組DNA 1μL，A液12.5μL，B液2μL，ddH2O 9.5μL，按以下條件進(jìn)行PCR反應(yīng) PCR產(chǎn)物大小466bp[3]限制性內(nèi)切酶消化MspA1I核酸內(nèi)切酶處理25μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，C液1μL，D液5μL，加ddH2O至50μL，37℃溫育一小時。
電泳檢測Neu2R41Q多態(tài)性位點(diǎn)基因型MspA1I核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)是CMGCKG，其中M表示A或C，K表示G或T。當(dāng)最后的G突變?yōu)锳后，該酶將不能識別這段核酸序列，而Neu2野生型在所述SNP處序列為CAGCGG，R41Q突變型序列為CAGCGA。使用3％瓊脂糖凝膠電泳分析酶切產(chǎn)物，使用100bp ladder標(biāo)示產(chǎn)物片段大小。若酶切產(chǎn)物僅在凝膠220bp處呈現(xiàn)條帶，表明該個體在這個SNP位點(diǎn)的基因型為G/G；若在凝膠220bp處和460處均呈現(xiàn)條帶，表明該個體在這個SNP位點(diǎn)的基因型為A/G；若僅在凝膠460bp處呈現(xiàn)條帶，表明該個體在這個SNP位點(diǎn)的基因型為A/A。
推斷個體使用Tamiflu類藥物的安全性根據(jù)上一步的檢測結(jié)果，如果個體在這個SNP位點(diǎn)的基因型為G/G，Tamiflu類藥物對該個體是安全的；若個體在這個SNP位點(diǎn)的基因型為A/G，使用Tamiflu類藥物存在一定的風(fēng)險性；若個體在這個SNP位點(diǎn)的基因型為A/A，則應(yīng)慎重考慮是否使用其它抗禽流感病毒藥物代替Tamiflu。
實(shí)施例二用ELISA方法預(yù)測個體使用Tamiflu類藥物的安全性ELISA(酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn))是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對底物的高效催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗(yàn)技術(shù)。由于抗原、抗體的反應(yīng)在一種固相載體——聚苯乙烯微量滴定板的孔中進(jìn)行，每加入一種試劑孵育后，可通過洗滌除去多余的游離反應(yīng)物，從而保證試驗(yàn)結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性。使用ELISA預(yù)測個體使用Tamiflu類藥物的安全性的實(shí)驗(yàn)步驟如下[1]利用R41Q位點(diǎn)附近的15個氨基酸llafaeqQaskkdeh(SEQ ID No.6)設(shè)計并獲取R41Q兔源抗體。
包被用0.05M pH9.6的碳酸鹽緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg/mL。在每個聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1mL，4℃過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘(簡稱洗滌，下同)。
加樣加一定稀釋的待檢樣品0.1mL于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37℃孵育1小時，然后洗滌，同時做空白孔、陰性對照孔及陽性對照孔。
加酶標(biāo)抗體于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體0.1mL，37℃孵育0.5～1小時，洗滌。
加底物液顯色于各反應(yīng)孔中加入臨時配制的TMB(四甲基聯(lián)苯胺)底物溶液0.1ml，37C孵育10～30分鐘。
終止反應(yīng)于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。
結(jié)果判定可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無色；也可測OD值在ELISA檢測儀上，于450nm處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性，表示個體在這個SNP位點(diǎn)的基因型為A/A或A/G。
推斷個體使用Tamiflu類藥物的安全性根據(jù)上一步的檢測結(jié)果，如果個體在這個SNP位點(diǎn)的基因型為G/G，我們認(rèn)為Tamiflu類藥物對該個體是安全的；若在個體在這個SNP位點(diǎn)的基因型為A/G或A/A，則建議應(yīng)慎重考慮是否使用其它抗禽流感病毒藥物代替Tamiflu。
實(shí)施例三.基于直接測序的方法預(yù)測個體使用Tamiflu類藥物的安全性PCR反應(yīng)溶液A液脫氧三磷酸單核苷酸(dNTP)，高保真耐熱DNA聚合酶Pfu(Pfu DNAPolymerase)及其2×反應(yīng)緩沖液；上述緩沖液成份可為200mM Tris-HCl，100mM KCl，100mM(NH4)2SO4，20mMMgSO4，1.0％ Triton X-100和1mg/ml BSA，保存溫度為-20℃；B液PCR引物，由寡核苷酸合成儀合成，其序列如下上游引物5’-CGGAATTCATGGCGTCCCTTCCTGTCCTG-3’下游引物5’-CTGAACCTGGTGGGTGGGTGC-3’實(shí)驗(yàn)步驟如下[1]取個體血樣，提取個體的基因組DNA(使用promega公司提供的基因組提取試劑盒)；[2]以上述個體基因組為模版(template)，PCR擴(kuò)增目的基因片段25μL PCR反應(yīng)體系中加入基因組DNA 1μL，A液12.5μL，B液2μL，ddH2O 9.5μL，按以下條件進(jìn)行PCR反應(yīng) PCR產(chǎn)物大小220bp[3]凝膠回收上述PCR產(chǎn)物并用測序儀測序，下面的序列(SEQ ID No.5)是一名歐洲個體的測序結(jié)果，用邊框突出的“G”即為該SNP位點(diǎn)。...GAATTCATGGCGTCCCTTCCTGTCCTGCAGAAGGAGAGCGTGTTCCAGTCGGGAGCCCATGCCTACAGAATCCCTGCCCTGCTCTACCTGCCTGGGCAGCAGTCCCTGCTGGCCTTCGCGGAACAGCG GCAAGCAAGAAGGATGAGCACGCAGAGCTGATTGTCCTGCGCAGAGGAGACTACGACGCACCCACCCACCAGGTTCAG... 從測序結(jié)果推斷個體使用Tamiflu類藥物的安全性根據(jù)上一步的檢測結(jié)果，如果個體在這個SNP位點(diǎn)的基因型為G/G，Tamiflu對該個體是安全的；若在個體在這個SNP位點(diǎn)的基因型為A/G或A/A，則建議應(yīng)慎重考慮是否使用其它抗禽流感病毒藥物代替Tamiflu。
序列表(SEQUENCE LISTING)<110>北京大學(xué)<120>一種預(yù)測達(dá)菲類藥物用藥安全性的方法<130>JSP060004<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>1ggtgagcacc acctgtct 18<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>2ggtccaggga accattag 18
<210>3<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>3cggaattcat ggcgtccctt cctgtcctg 29<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>4ctgaacctgg tgggtgggtg c 21<210>5<211>207<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>5gaattcatgg cgtcccttcc tgtcctgcag aaggagagcg tgttccagtc gggagcccat60gcctacagaa tccctgccct gctctacctg cctgggcagc agtccctgct ggccttcgcg120gaacagcggg caagcaagaa ggatgagcac gcagagctga ttgtcctgcg cagaggagac180tacgacgcac ccacccacca ggttcag207<210>6<211>15<212>PRT<213>人工序列<400>6Leu Leu Ala Phe Ala Glu Gln Gln Ala Ser Lys Lys Asp Glu His1 5 10 1權(quán)利要求
1.一種預(yù)測達(dá)菲類藥物用藥安全性的方法，通過測定受試者唾液酸酶蛋白家族Neu2蛋白基因的Arg41Gln單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因型，預(yù)測受試者對達(dá)菲類藥物副作用的敏感性對于該單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因型為A/A的個體，達(dá)菲類藥物會引起副作用；對于基因型為A/G的個體，使用達(dá)菲類藥物存在一定的風(fēng)險性；對于基因型為G/G的個體，使用達(dá)菲類藥物是安全的。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，使用限制性核酸內(nèi)切酶測定所述Neu2蛋白基因Arg41Gln單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因型，包括以下步驟(1)提取宿主細(xì)胞的基因組DNA；(2)應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增含Arg41Gln單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的Neu2蛋白基因片斷；(3)限制性核酸內(nèi)切酶消化；(4)電泳檢測以確定所述單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因型。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)所用的引物序列為上游引物5’-GGTGAGCACCACCTGTCT-3’；下游引物5’-GGTCCAGGGAACCATTAG-3’。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)的限制性核酸內(nèi)切酶為MspA1I。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，通過直接測序的方法來測定所述單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因型，包括以下步驟(1)提取宿主細(xì)胞的基因組DNA；(2)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增含Arg41Gln單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的Neu2蛋白基因片斷；(3)對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序確定所述單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因型。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)所用的引物序列為上游引物5’-CGGAATTCATGGCGTCCCTTCCTGTCCTG-3’；下游引物5’-CTGAACCTGGTGGGTGGGTGC-3’。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，通過ELISA反應(yīng)來確定所述單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因型，包括以下步驟(1)利用Neu2蛋白基因Arg41Gln突變位點(diǎn)附近的氨基酸序列設(shè)計并獲取R41Q免疫抗體；(2)用所述R41Q免疫抗體包被反應(yīng)板，洗滌除去未結(jié)合的抗體；(3)在反應(yīng)孔中加入待測樣品，溫育后形成免疫復(fù)合物，然后洗滌除去未結(jié)合的物質(zhì)，同時做空白對照、陰性對照和陽性對照；(4)在各反應(yīng)孔中加入酶標(biāo)抗體，溫育后洗滌除去未結(jié)合的酶標(biāo)抗體；(5)加底物液顯色；(6)一定時間后加終止液終止反應(yīng)；(7)肉眼直接觀察反應(yīng)孔內(nèi)溶液的顏色或用檢測儀測定其OD值，與陰性和陽性對照對比確定待測樣品的所述單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因型。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中的氨基酸序列為llafaeqQaskkdeh。
9.一種預(yù)測個體使用達(dá)菲類藥物安全性的試劑盒，包括A液四種脫氧三磷酸單核苷酸，高保真耐熱DNA聚合酶及其反應(yīng)緩沖液，保存溫度為-20℃；B液含有用于擴(kuò)增含Arg41Gln單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的Neu2蛋白基因片斷的PCR引物；C液限制性核酸內(nèi)切酶MspA1I，保存溫度為-20℃；D液限制性核酸內(nèi)切酶MspA1I的反應(yīng)緩沖液。
10.如權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述PCR引物序列為上游引物5’-GGTGAGCACCACCTGTCT-3’；下游引物5’-GGTCCAGGGAACCATTAG-3’。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種預(yù)測達(dá)菲類藥物用藥安全性的方法通過測定受試者唾液酸酶蛋白家族Neu2蛋白基因Arg41Gln單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因型，預(yù)測受試者對達(dá)菲類藥物副作用的敏感性對于該SNP位點(diǎn)的基因型為A/A的個體，達(dá)菲類藥物會引起副作用；對于基因型為A/G的個體，使用達(dá)菲類藥物存在一定的風(fēng)險性；對于基因型為G/G的個體，使用達(dá)菲類藥物是安全的。本發(fā)明還提供了一種簡便易行的預(yù)測個體使用達(dá)菲類藥物安全性的試劑盒。由于達(dá)菲的使用可能會導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用，包括皮膚反應(yīng)以及一些神經(jīng)方面的疾病，在該SNP突變型出現(xiàn)概率近10％的亞洲地區(qū)，在使用達(dá)菲類抗流感藥物前進(jìn)行個體基因型的檢測是必要的。
文檔編號C12Q1/68GK1858247SQ200610011569
公開日2006年11月8日 申請日期2006年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月28日
發(fā)明者魏麗萍, 李川昀, 葉志強(qiáng), 賀權(quán)源, 于泉, 張武學(xué), 孫穎, 羅靜初, 顧孝誠, 鄭曉峰 申請人:北京大學(xué)