專利名稱：：核酸檢測(cè)系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及通過利用側(cè)流(lateralflow)核酸^f企測(cè)系統(tǒng)的高敏感性(靈敏度)地檢測(cè)核酸分子的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：被部署到熱帶區(qū)域或亞熱帶區(qū)域時(shí)的蚊々某登革熱(mosquito-bornedenguefever)。然而，盡管在現(xiàn)場(chǎng)采取了預(yù)防措施，但是部分軍人"f乃,然感染登革^;或更嚴(yán)重的登革出血玄A(denguehemorrhagicfever)/登革休克綜合征(dengueshocksyndrome)(DHF/DSS)。疾病的快速現(xiàn)場(chǎng)水平(field-level)一全測(cè)對(duì)于及時(shí)治療和預(yù)防進(jìn)一步的大量*(殖來i兌是關(guān)4建的。黃病毒科(familyFlaviviridae)包含幾乎70種病毒，其中包括-引起黃熱病、登革熱、西尼羅河熱以及日本腦炎的那些病毒。由于全球旅游的增長，這些病毒的大量繁殖已開始更加頻繁地在熱帶地區(qū)以外出現(xiàn)。在美國大陸，圣^各易腦炎病毒的大量繁殖以及最近開始于紐約并擴(kuò)展到美國的整個(gè)東海岸的西尼羅河病毒的大量繁殖。此夕卜，在美國是存在兩種帶菌蚊，埃及《尹蟲丈(v4ec/My^gv^")和白蚊〃f尹蚊("/Zw/,'"ws),并且在某些環(huán)境下，每種蚊可以傳染登革熱病毒。根據(jù)CDC，這種類型的傳染已在得克薩斯州南部于1980年、1986年以及1995年^皮;險(xiǎn)測(cè)到，并且與墨西哥北部的登革熱流行病有關(guān)。登革熱和DHF/DSS已形成為人類最重要的節(jié)肢動(dòng)物傳染的病毒性疾病(GublerandClark,InfectDis.1995Apr-Jun;1(2):55-7)。有四種不同的登革熱病毒類型(DEN-1、DEN-2、DEN-3、以及DEN-4),每種類型都能夠引起人類疾病。四種登革熱病毒血清型的保守3'-非編碼序列已成功地被用來開發(fā)基于TaqMan的RT-PCR(2002年至2003年，由MIDRPSTOA/L資助)以定量地鑒定(識(shí)別)來自世界不同地區(qū)的登革熱病毒。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)提供了準(zhǔn)確的病原體鑒定，但需要嚴(yán)格的試樣制備、有限貯藏壽命的復(fù)雜反應(yīng)組分、精確的溫度調(diào)節(jié)、繁雜的石更件、復(fù)雜的4全測(cè)過禾呈、以及經(jīng)i咅訓(xùn)的工作人員，所有這些在現(xiàn)場(chǎng)或在"實(shí)時(shí)，，條件下如在生物恐怖攻擊的情況下都難以保證。這適于實(shí)馬全室i貪斷，^f旦在"實(shí)時(shí)(real-time)"現(xiàn)場(chǎng)條件下的利用則有限，在"實(shí)時(shí)"現(xiàn)場(chǎng)條件下，快速評(píng)估生物污染的性質(zhì)和存在是將其影響降低至最低程度的關(guān)鍵。用作蛋白質(zhì)檢測(cè)方法的層析側(cè)向才全觀'J(chromatographiclateralassay)原J里可以開發(fā)為DNA4全測(cè)系統(tǒng)。在大多凄t才企測(cè)系統(tǒng)中，關(guān)4建環(huán)節(jié)是獲4尋獨(dú)特的、可才企測(cè)的信號(hào)，該信號(hào)是借助于基于非聚合酶鏈反應(yīng)核酸的方法對(duì)特定耙序列(來自存在的生物病原體)的響應(yīng)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及信號(hào)放大系統(tǒng)，如連同層析側(cè)流檢測(cè)的銪包膠的微粒和/或電導(dǎo)率。這種系統(tǒng)是一種改進(jìn)的核酸;f企測(cè)系統(tǒng)，其保留傳統(tǒng)免疫層沖斤一企測(cè)的所有伊乙點(diǎn)l)一個(gè)步-驟；2)可iE見場(chǎng)-使用；3)利用穩(wěn)定的試劑；4)沒有特別的貯存要求；5)快速的結(jié)果。放大的信號(hào)通過較小的便攜式讀出器加以檢測(cè)，得到定量或定性的結(jié)果。本發(fā)明涉及按比例增加用于血清型特異性靶核酸檢測(cè)的熒光核酸試劑盒的生產(chǎn)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及冷凍干燥的試劑盒組成，其是敏感的、特異性的以及穩(wěn)定的。可以檢測(cè)各種濃度的培養(yǎng)病原體，如包4舌登革熱病毒或登革熱病毒cDNA的病毒。在一種具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的系統(tǒng)采用用于基因擴(kuò)增的現(xiàn)成可用的凍干試劑墊(試劑片，reagentpad)。反應(yīng)基質(zhì)可以包括緩沖液、dNTP、RNA酶抑制劑、反轉(zhuǎn)錄酶、標(biāo)記特異性引物如登革熱病毒血清型特異性引物(DEN-1、-2、-3、-4)、下游引物、生物素dUTP、Taq聚合酶、內(nèi)部對(duì)照mRNA、以及控制mRNA特異性引物。加入生物素dUTP以標(biāo)記核酸擴(kuò)增產(chǎn)物，以Y更利用側(cè)流;險(xiǎn)測(cè)技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)和放大指示信號(hào)。當(dāng)被結(jié)合到雙鏈PCR產(chǎn)物中時(shí)，熒光引物用來增力口它們的熒光強(qiáng)度(Nazarenkoetal.，NucleicAcidRes.2002May1;30(9):e37)以及將PCR產(chǎn)物用于側(cè)流免疫層析法4全測(cè)以鑒定登革熱血清型。在本發(fā)明的優(yōu)選系統(tǒng)中，4吏用了時(shí)間分辨熒光技術(shù)(time-resolvedfluorescencetechnology),<尤選這才羊的系纟克，其基于7配合有抗半抗原抗體的銪嵌入(埋置)微粒和用于信號(hào)檢測(cè)的時(shí)間分辨共焦掃描裝置。這種特征為檢測(cè)提供了另外的敏感性。這種高度敏感的層析側(cè)流信號(hào)放大系統(tǒng)比熒光檢測(cè)系統(tǒng)需要更少的閾循環(huán)凄t(thresholdcyclenumber)(Cl)。本發(fā)明的PCR產(chǎn)物才企測(cè)系統(tǒng)是快速的(<30min)、一步形式、以及穩(wěn)、定的(在〈30。C下貝i存1年以上)。該檢測(cè)容易操作、便宜、方便、使用熱穩(wěn)定試劑、并且沒有特別的貯存要求。這些特4正1"吏其成為在實(shí)時(shí)條件下可由未經(jīng)培訓(xùn)的人員使用的快速和容易的、立即可用的RT-PCR試劑盒。本發(fā)明的4全測(cè)系統(tǒng)還可以用來檢測(cè)任何生物體，包括但不限于病原體如軍事上有意義的病毒，包括黃病毒屬，如日本腦炎病毒、黃熱病病毒、西尼羅河病毒、天花等。其它病原體包纟舌細(xì)菌，如炭癥才干菌(5"c/〃wsaw/Z^(3c/s)。本發(fā)明還涉及通過利用基于銪和/或基于電導(dǎo)率的耙核酸才僉測(cè)方法的基于非基因擴(kuò)增的靶核酸檢測(cè)。本發(fā)明的基于核酸的檢測(cè)系統(tǒng)放大了來自低濃度特異性基因組的DNA序列(來自生物病原體)的信號(hào)，而無需嚴(yán)4各的樣品制備、有限貯藏壽命的復(fù)雜反應(yīng)組分、繁雜的硬件、復(fù)雜的檢測(cè)過程、或經(jīng)培訓(xùn)的工作人員。這種方法也是獨(dú)特的、特異性的、簡(jiǎn)單的，并且該;改大系統(tǒng)容易以現(xiàn)場(chǎng)可采用的(field-deployable)才莫塊的方式進(jìn)行操作。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，本發(fā)明涉及將基于登革熱3'-非編碼區(qū)的實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)的檢測(cè)系統(tǒng)改進(jìn)成立即可用(現(xiàn)成可〗吏用，ready-to-use)的登革熱病毒4僉測(cè)和^t斷系統(tǒng)。示出了利用側(cè)流免疫層析檢測(cè)的現(xiàn)場(chǎng)可采用的和用戶友好的診斷裝置，其具有和沒有實(shí)時(shí)熒光熱循環(huán)器(thermalcycler)。本發(fā)明可以^又重地應(yīng)用于實(shí)時(shí)PCR和/或傳統(tǒng)的PCR。本發(fā)明進(jìn)一步涉及連同有RT反應(yīng)的血清型特異性信息的詳細(xì)分析結(jié)果。多元PCR反應(yīng)可以在單個(gè)試管中進(jìn)4亍(圖4)。所有用于RT反應(yīng)和PCR反應(yīng)的反應(yīng)組分都被冷凍干燥在具有適當(dāng)配方設(shè)計(jì)的基質(zhì)中。力口入生物素dUTP或標(biāo)記的寡核苷酸引物以及熒光標(biāo)記信標(biāo)引物(beaconprimer)用來標(biāo)記PCR產(chǎn)物和利用實(shí)時(shí)熒光熱循環(huán)器或側(cè)流檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。在單個(gè)PCR反應(yīng)中可以鑒定登革熱病毒的四種血清型。這種反應(yīng)試劑盒可以在室溫下貯存1年以上。應(yīng)當(dāng)理解，可以使用任何適宜的檢測(cè)系統(tǒng)，包括基于熒光、化學(xué)發(fā)光、酶或任何其它染料的系統(tǒng)，只要利用本發(fā)明的側(cè)流系統(tǒng)可檢測(cè)地檢測(cè)探針與樣品中的靶核酸的結(jié)合。這樣的染料系統(tǒng)可以包4舌具有基于熒光素標(biāo)記的分子信標(biāo)型系統(tǒng)，或它可以包含其它標(biāo)記々口具有月交體金配合的4元生物素蛋白或^t生蛋白嗜連菌素配體或4壬^T其它可才企測(cè)的可配合的化學(xué)物質(zhì)如鑭系元素(如銪)的生物素標(biāo)記。其它類型的4企測(cè)標(biāo)記和方法屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及自進(jìn)行(自執(zhí)行，self-performing)的裝置。這種快速核酸4全測(cè)系統(tǒng)包含以精確量的所有試劑和組分以在樣品加入后產(chǎn)生測(cè)試結(jié)果。該系統(tǒng)還可以具有內(nèi)置加熱墊(heatingpad)以精確匹配基于探針寡核苷酸組成的核苷酸靶序列鑒定。才羊品中生物病原體的輩巴DNA可以和銪顆4立標(biāo)i己的寡沖亥苷酉交、銪顆粒標(biāo)記的肽核酸(PNA)發(fā)生反應(yīng)，其具有光尋址直4妄電子讀出器(LightaddressableDirectElectricalReadout,LADER)、或電導(dǎo)率。與膠體金樣i粒相比，這種連同側(cè)流檢測(cè)系統(tǒng)一起工作的銪標(biāo)記寡聚體和電導(dǎo)率沖僉測(cè)方法可以增加10至1,000倍的敏感性(圖5)。這兩種信號(hào)力文大系統(tǒng)可以增加每文感性高于103個(gè)革巴/100)al(=10aM)。另夕卜，與平4軒氺反才企觀'J(equilibriumplateassay)相比，這些才企測(cè)系統(tǒng)與層析側(cè)流4企測(cè)的結(jié)合可以使敏感性增加10倍以上(HampIetal.AnalBiochem2001;176-187)。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于檢測(cè)耙核酸的側(cè)流裝置，該裝置包4舌4諸存區(qū)(reservoirarea)、染泮牛區(qū)(dyearea)以及i式'弓全區(qū)(-險(xiǎn)測(cè)區(qū)，testarea),其中儲(chǔ)存區(qū)包括立即可用的核酸擴(kuò)增混合物，而該核酸擴(kuò)增混合物包4舌用半抗原標(biāo)^己的引物和/或用半抗原標(biāo)i己的dNTP;染料區(qū)包括連接報(bào)道染料(reporterdye)的第一類型半抗原的凈爭(zhēng)異性結(jié)合配體(specificbindingpartner);以及i式'3企區(qū)包4舌第二類型半抗原的特異性結(jié)合配體。該裝置可以包括具有一種以上的不同的第二類型半抗原的儲(chǔ)存器(儲(chǔ)罐，reservoir),在其中檢測(cè)多種形式的把核酸。第一類型的半抗原可以是生物素(biotin),并且其特異性結(jié)合配體可以是抗生蛋白4連菌素(streptavidin),并且才艮道染4'牛可以是銪或金。此外，第二類型的半抗原可以是生物素、焚光團(tuán)(fluorophore)、或寡肽，并且如果檢測(cè)單一形式的耙核酸，則其特異性結(jié)合配體可以是抗生蛋白鏈菌素或?qū)晒鈭F(tuán)或寡肽是特異性的抗體。此外，第二類型的半抗原可以是多種類型的熒光團(tuán)或寡肽，并且其特異性結(jié)合配體可以是對(duì)每種類型的熒光團(tuán)或寡肽是特異性的抗體。把核酸的來源可以是病原體，其可以是病毒如登革熱病毒，并且該登革熱病毒顆粒的血清型可以利用不同的第二類型的半抗原加以才僉測(cè)。同樣，引物可以是分子信標(biāo)類型。本發(fā)明還涉及用于檢測(cè)樣品中存在靶核酸的方法，該方法包括將樣品接觸根據(jù)以上所述的裝置的儲(chǔ)存區(qū)，其中如果在樣品中存在草巴核酸，則對(duì)輩巴核酸進(jìn)4于擴(kuò)增并用至少兩種類型的半抗原進(jìn)4亍標(biāo)記，然后被輸送到染料區(qū)，在其中第一半抗原結(jié)合至其特異性結(jié)合配體(其連接于纟艮道染料)，然后通過毛細(xì)作用一皮進(jìn)一步輸送通過試驗(yàn)區(qū)，并結(jié)合至在試-瞼區(qū)上的第二類型半抗原-特異性結(jié)合配體，其檢測(cè)表明在樣品中存在靶核酸。儲(chǔ)存器可以包括一種以上的不同的第二類型半抗原，其中^^測(cè)多種形式的靶核酸。第一類型半抗原可以是生物素，而其特異性結(jié)合配體可以是抗生蛋白鏈菌素，并且報(bào)道染料可以是銪或金。第二類型半抗原可以是生物素、熒光團(tuán)、或寡肽，并且如果4企測(cè)單一形式的靶核酸，則其特異性結(jié)合配體可以是抗生蛋白鏈菌素或?qū)晒鈭F(tuán)或寡肽是特異性的抗體。第二類型半抗原可以是多種類型的熒光團(tuán)或多種類型的寡肽，并且它們的特異性結(jié)合配體可以是對(duì)每種類型的熒光團(tuán)或寡肽是特異性的抗體。革巴核酸的來源可以是病原體。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于纟企測(cè)樣品中存在耙核酸的方法，該方法包括將樣品接觸側(cè)流裝置的儲(chǔ)存區(qū)，其中如果在樣品中存在靶核酸，則將輩巴核酸進(jìn)^于擴(kuò)增并用至少一種類型的半抗原進(jìn)^于標(biāo)記，然后被輸送到染料區(qū)，在其中半抗原結(jié)合至其特異性結(jié)合配體(其連接于報(bào)道染料)，然后通過毛細(xì)管作用一皮進(jìn)一步輸送通過試驗(yàn)區(qū)，并在試驗(yàn)區(qū)中結(jié)合至的靶特異性寡核苷酸，其檢測(cè)表明在樣品中存在靶核酸，其中檢測(cè)是通過光尋址直接電子讀出器或通過檢測(cè)報(bào)道染泮牛完成的。試'驗(yàn)區(qū)中的雜交(hybridization)可以通過側(cè)流裝置中的內(nèi)置加熱墊加以控制。半抗原可以是生物素，并且其特異性結(jié)合配體是抗生蛋白鏈菌素，并且凈艮道染料可以是銪或金。本發(fā)明還涉及用于4全測(cè)才羊品中存在革巴一亥S臾的方法'該方法包括「將樣品接觸側(cè)流裝置的儲(chǔ)存區(qū)，其中如果在樣品中存在靶核酸，則通過毛細(xì)管作用爿夸輩巴核酸車lr送通過試-驗(yàn)區(qū)并結(jié)合至用銪標(biāo)i己的草巴特異性寡核香酸。此外，在被輸送到試驗(yàn)區(qū)之前可以擴(kuò)增靶核酸。如果用作同樣每文感的4僉測(cè)，則可以不需要進(jìn)行擴(kuò)增，其中使用電導(dǎo)率和銪檢測(cè)。才艮據(jù)以下的詳細(xì)描述以及附圖可以更充分地理解本發(fā)明，其中附圖僅是說明性的而不是對(duì)本發(fā)明的限制，并且其中圖1A示出了經(jīng)^修飾的血清型特異性上游引物而圖1B示出了利用這些引物制成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。圖2示出了分子信標(biāo)登革熱病毒血清型特異性上游引物的結(jié)構(gòu)。圖3示出了用于PCR反義引物和RT反應(yīng)引物的下游引物。圖4是多重PCR擴(kuò)增的示意圖。圖5A-5B示出了本發(fā)明的檢測(cè)系統(tǒng)。圖5(A)示出了試驗(yàn)前的系統(tǒng)的試驗(yàn)(測(cè)試)裝置。該裝置具有至少兩個(gè)主要部分在裝置底部的樣品孔以及在裝置中部的結(jié)果讀數(shù)窗。圖5(B)示出了檢測(cè)后的試馬全結(jié)果。兩條線表示正的(陽性的，positive)而一條線表示負(fù)的(陰性的，negative)。對(duì)照線用作內(nèi)部?jī)?nèi)置(built-in)對(duì)照。如果正確進(jìn)4亍4企測(cè)，則其應(yīng)當(dāng)出現(xiàn)。圖6示出了多重PCR產(chǎn)物鑒定4全測(cè)。圖7示出了PCR產(chǎn)物鑒定裝置的圖片。圖8示出了側(cè)流裝置的構(gòu)造。圖9示出了連接2型正向引物的5'氨基修飾因子的結(jié)構(gòu)。的結(jié)構(gòu)(條才各式(stripformat))。的構(gòu)造(裝置格式(deviceformat))。圖12示出了5'生物素化正向引物的結(jié)構(gòu)。12圖13示出了5'若丹明紅(rhodaminered)標(biāo)記的反向引物的結(jié)構(gòu)。圖14示出了5'合成寡肽標(biāo)記的正向引物的結(jié)構(gòu)。圖15示出了用于條i式-驗(yàn)(striptest)的測(cè)定步-驟。圖16示出了用于裝置格式檢測(cè)的測(cè)定步驟。圖17示出了用于登革熱病毒血清型1(serotype1)一全測(cè)的實(shí)時(shí)PCR和快速PCR產(chǎn)物分析試劑盒的比較結(jié)果。兩種測(cè)試都是用1.5mM的MgCl2進(jìn)行。A道(lane):4,340,000個(gè)拷貝/試驗(yàn)，B道868,000個(gè)拷貝/試驗(yàn)，C道173,600個(gè)拷貝/試驗(yàn)，D道34,720個(gè)拷貝/試驗(yàn)，E道6,944個(gè)拷貝/試驗(yàn)，F(xiàn)道1,388個(gè)拷貝/試驗(yàn)，G道277個(gè)拷貝/試驗(yàn)，H道55個(gè)拷貝/試驗(yàn)，I道沒有模板。圖18示出了用于登革熱病毒血清型2沖企測(cè)的實(shí)時(shí)PCR和快速PCR產(chǎn)物分析試劑盒的比較結(jié)果。A道3,720,000個(gè)拷貝/試驗(yàn)，B道1,240,000個(gè)拷貝/試驗(yàn)，C道413,000個(gè)拷貝/試驗(yàn)，D道138,000個(gè)拷貝/試驗(yàn)，E道45,900個(gè)拷貝/試驗(yàn)，F(xiàn)道15,300個(gè)拷貝/試驗(yàn)，G道5,100個(gè)拷貝/試驗(yàn)，H道1,700個(gè)拷貝/試-驗(yàn)，I道567個(gè)拷貝/試驗(yàn)，J道189個(gè)拷貝/試驗(yàn)，K道63個(gè)拷貝/試驗(yàn)，L道21個(gè)拷貝/試驗(yàn)，M道沒有模板。圖19示出了用于登革熱病毒血清型34全測(cè)的實(shí)時(shí)PCR和快速PCR產(chǎn)物分析試劑盒的比較結(jié)果。兩種試驗(yàn)都是用1.5mM的MgCl2進(jìn)4亍。A道5,090,000個(gè)拷貝/試-驗(yàn)，B道1,018,000個(gè)拷貝/試-驗(yàn)，C道203,600個(gè)拷貝/試驗(yàn)，D道40,720個(gè)拷貝/試驗(yàn)，E道8,144個(gè)拷貝/試驗(yàn)，F(xiàn)道1,628個(gè)拷貝/試驗(yàn)，G道325個(gè)拷貝/試驗(yàn)，H道65個(gè)拷貝/試驗(yàn)，I道沒有模板。圖20示出了光尋址直4妄電子讀出器(LADER)的原理。圖21說明讀數(shù)裝置的示意圖以及用于CBT芯片(以EDDA格式)的接觸頭的放大圖。圖22示出了在與匹配輩巴(其本身用鐵4市(FcAc)標(biāo)記加以+務(wù)飾)雜交前后，用20個(gè)核苷酸的長捕獲探針(captureprobe)加以修飾并共價(jià)連接Os標(biāo)記的電極的電化學(xué)行為。圖23示出了利用電導(dǎo)率才企測(cè)的自進(jìn)^f亍快速核酸才全測(cè)系統(tǒng)的構(gòu)造。圖24示出了利用時(shí)間分辨熒光發(fā)射和/或電導(dǎo)率變化檢測(cè)來檢測(cè)生物病原體特異性DNA序列的纟企測(cè)原理的示意圖。圖25A-25C示出了用于力口熱系t^的構(gòu)造。圖26A和B示出了用于加熱系統(tǒng)的構(gòu)造。圖27A和圖27B示出了用于力o熱系統(tǒng)的構(gòu)造。圖28示出了具有用于儀器連接器的位置(空間)的試驗(yàn)裝置的示意圖。圖29示出了基因玉見^^企馬全(基因即日寸沖企馬全，genepointofcaretesting,GPOCT)裝置，其是一種集成的DNA采樣器。圖30示出了GPOCT裝置的一種詳細(xì)的具體實(shí)施方式。圖31示出了GPOCT裝置的一種詳細(xì)的具體實(shí)施方式。在本申請(qǐng)中，"一"用來指單個(gè)和多個(gè)對(duì)象。如在本文中所使用的，"多種形式的靶核酸，，是指多種同種型或血清型的靶核酸，如登革熱病毒，其可以具有四種血清型。如在本文中所使用的，當(dāng)用于探針裝置時(shí)，術(shù)語"核酸，，或"寡核苷酸"是指任何核苷酸串。因而，包括DNA、RNA或PNA。如在本文中所使用的，"核酸擴(kuò)增"是指聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、QP復(fù)制酶、《連替代才金觀'j(stranddisplacementassay,SDA)、基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)、或級(jí)聯(lián)滾動(dòng)循環(huán)擴(kuò)增(cascaderollingcycleamplification,CRCA)。如在本文中所^吏用的，在核酸擴(kuò)增范圍內(nèi)的"立即可用(readytouse)"是指在與包括靶核酸的樣品接觸以后進(jìn)行耙核酸擴(kuò)增所需要的所有纟式劑和酶。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及增強(qiáng)用于核酸4全測(cè)的信號(hào)。該方法可以包括利用各種標(biāo)記或半抗原以敏感地檢測(cè)該信號(hào)。在本發(fā)明的一個(gè)方面，立即可用的核酸擴(kuò)增預(yù)混合物可以包含在一個(gè)容器中?？梢詫悠芳尤腩A(yù)混合物，然后進(jìn)行核酸擴(kuò)增。預(yù)混合物可以包括用于核酸擴(kuò)增的試劑，其中包括在5'和/或3'端有差另iji也力口以標(biāo)"i己的引物。只于于實(shí)時(shí)PCR應(yīng)用，單個(gè)引物的5'和3'端可以以分子〗言標(biāo)方式有差別i也加以才示i己，其中焚光團(tuán)在一端而猝滅劑在另一端。這些標(biāo)記的每一種可以:〖人為是半抗原，因?yàn)榭梢垣@4尋并且可以產(chǎn)生相對(duì)于這些標(biāo)記的抗體。此外，擴(kuò)增產(chǎn)物的主體可以可選地用半抗原標(biāo)記dNTP(如生物素)力卩以標(biāo)記。預(yù)混合物可以#皮干燥或冷凍干燥，并且通過等溫?cái)U(kuò)增PCR和/或?qū)崟r(shí)PCR，預(yù)混合物可以適用于擴(kuò)增。對(duì)于伯'J流片企測(cè)，半抗原化的或標(biāo)記的擴(kuò)增核酸或非擴(kuò)增基因組DNA(包含能夠流動(dòng)到染料區(qū)的靶核酸(通常用切割))在儲(chǔ)存區(qū)接觸側(cè)流檢測(cè)裝置，其中儲(chǔ)存區(qū)包含適合于雜交條件或抗體/抗原結(jié)合條件或其它特異性結(jié)合對(duì)條件的試劑。然后核酸可以輸送到染料區(qū)，該區(qū)包含核酸的靶核酸復(fù)合物的特異性結(jié)合配體以及連4妄至核酸的半抗原。因此，特異性結(jié)合配體可以是耙特異性寡核苷酸、半抗原之一的抗體或高親合性配體如抗生蛋白鏈菌素，其高親和性地結(jié)合于生物素。特異性結(jié)合抗生蛋白4連菌素配體可以連4妾或配合于染^",優(yōu)選高度敏感的染津+,如銪或金以形成耙核酸特異性結(jié)合配體-染料的復(fù)合物。可替換地，特異性結(jié)合配體可以用一種不同的標(biāo)記進(jìn)一步加以半抗原化。此外，對(duì)于寡核苷酸特異性結(jié)合配體，標(biāo)記可以是銪、熒光團(tuán)、FITC、生物素、寡肽等，只要該標(biāo)記可以通過任何方式加以沖金測(cè)。當(dāng)復(fù)合物移動(dòng)到試-驗(yàn)區(qū)時(shí)，可以用其它半抗原之一的另一特異性結(jié)合配體來固定試-驗(yàn)區(qū)，其中上述其它半抗原是在耙核酸復(fù)合物如對(duì)靶核酸是特異性的寡核普酸中，因此復(fù)合物與試驗(yàn)區(qū)上的不同特異性結(jié)合配體的結(jié)合表明存在靶核酸。在染料區(qū)使用并在試驗(yàn)區(qū)固定的寡核苷酸可以是肽核酸或RNA。在固定在試一驗(yàn)區(qū)上的DNA寡核普酸的情況下，靶核酸復(fù)合物與在試驗(yàn)區(qū)上的寡核苷酸的雜交作用產(chǎn)生電導(dǎo)率信號(hào)，其可以通過高度4文感的LADER4金測(cè)法加以檢測(cè)。此外，當(dāng)銪標(biāo)記的寡核苷酸被雜交于固定在試驗(yàn)區(qū)上的寡核香酸或PNA時(shí)，可以進(jìn)4亍結(jié)合了LADER纟全測(cè)法和銪一企測(cè)法的壽文感性的高度敏感測(cè)定。例如，如果銪標(biāo)記部分一致地被結(jié)合那么銪將產(chǎn)生強(qiáng)信號(hào)。如果銪標(biāo)記區(qū)未被結(jié)合于固定的核酸，而僅是核酸的16非銪標(biāo)記部分被結(jié)合，那么可使用LADER電導(dǎo)率作為一種可替換的測(cè)定。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，試-驗(yàn)區(qū)可以用靶特異性寡核苷酸和/或用于半抗原之一的至少一種其它的特異性結(jié)合配體加以固定，以進(jìn)一步區(qū)別和確定革巴核酸。因此，在一種具體實(shí)施方式中，耙核酸(如對(duì)5'標(biāo)記或3'標(biāo)記是特異性的)上的半抗原之一的特異性結(jié)合配體可以被固定在試驗(yàn)區(qū)，并且用于靶核酸的寡核苷酸探針也可以被固定，以便可以在具有更大特異性的情況下對(duì)靶核酸進(jìn)行檢測(cè)。以下描述示例性地/說明利用PCR的核酸擴(kuò)增方法來一全測(cè)登革熱病毒，然而，應(yīng)當(dāng)理解，利用任何化學(xué)驅(qū)動(dòng)的核酸擴(kuò)增方法(如PCR、LCR、NASBA等)可以才企測(cè)4壬4可病原體。反轉(zhuǎn)錄酶聚合S^1^應(yīng)(RT-PCR)反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)提供精確的病毒性病原體鑒定，但如目前常規(guī)使用的，需要嚴(yán)格的樣品制備、有限貯藏壽命的復(fù)雜反應(yīng)組分、精確的溫度調(diào)控、繁雜的硬件、復(fù)雜的4企測(cè)過程、以及經(jīng)培訓(xùn)的工作人員。這適用于實(shí)驗(yàn)室診斷，但在"實(shí)時(shí)"現(xiàn)場(chǎng)條Y牛下的應(yīng)用有限。本發(fā)明的系統(tǒng)可優(yōu)化和4姿比例增加用于一^:的和血清型特異性樣t生物4金測(cè)(包4舌登革熱病毒一企測(cè))的RT-PCR試劑盒的生產(chǎn)。開發(fā)了專用的冷凍干燥方案以產(chǎn)生干燥的和立即可用的登革熱檢測(cè)試劑盒，其包含所有用于在單個(gè)試管中的RT反應(yīng)多重PCR反應(yīng)的組分。試劑盒可以用于一^:的熱-f盾環(huán)器(thermalcycler)或?qū)崟r(shí)PCR熱循環(huán)器如熒光PCR熱循環(huán)器。病毒RNA的H取才艮才居QiAampViralRNAHandbook(QiagenInc.Valencia,CA91355)，病毒RNA是一是取自病毒感染的血清如登革熱感染的血清的病毒懸浮液。分子信標(biāo)血清型特異性？1物的設(shè)計(jì)合成分子信標(biāo)是形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)并具有內(nèi)部報(bào)道信號(hào)的"發(fā)夾"寡核普酸，如熒光報(bào)道分子和猝滅劑分子。當(dāng)它們形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)時(shí)，熒光報(bào)道分子和猝滅劑分子會(huì)靠近在一起，并且熒光被抑制。當(dāng)它們結(jié)合至互#卜輩巴序列時(shí)，它們經(jīng)歷接通它們的熒光的構(gòu)象轉(zhuǎn)換(Bonnetetal.,ProcNatlAcadSciUSA.1999May25;96(11):6171-6.)。發(fā)夾分子信標(biāo)可以用作熒光PCR引物或熒光探針。當(dāng)寡核苷酸引物被修飾以形成具有熒光團(tuán)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)時(shí)，這種引物可以提供該引物的較1氐初始熒光，其在形成PCR產(chǎn)物以后可增加至8^f咅(Nazarenkoetal.,NucleicAcidsRes.2002May1;30(9):e37)。發(fā)夾寡核苷酸可以和直鏈引物一樣有效并且通過防止引物-二聚體和引物錯(cuò)配(mispriming)而可向PCR提供另外的特異性?；谶@種先前的研究，可以對(duì)上游引物進(jìn)行修飾以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)(圖l)。為了制成發(fā)夾引物，5'尾被伸展的，其互補(bǔ)于引物的3'端。5'尾在低于其解鏈的溫度下形成平端(blunt-end)發(fā)夾結(jié)構(gòu)。將才艮道熒光素(6-FAMTM(520nm)、HEXTM(556nm)、TexasRed(603nm)、Bodipsy(640nm)等)標(biāo)記到自3'端的第三或第四石威基(T)。將猝滅劑熒光素(Iowablack,猝滅范圍為520nm至700mn)標(biāo)記到伸展的的5'端(3'端的互補(bǔ)序列)。所有報(bào)道染料和猝滅劑可獲自IntegratedDNATechnology,Inc.(Coralville，IA)和MolecularProbes,Inc.(Eugene,OR)。預(yù)計(jì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和熒光標(biāo)記位置示在圖2中。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，熒光素還起半抗原抗原的作用以和抗半抗原抗體起反應(yīng)，從而利用側(cè)流快速一步鑒定測(cè)試試劑盒鑒定血清型特異性PCR產(chǎn)物。反義引物和RT引物的設(shè)計(jì)合成在登革熱1-3的3'-非編碼序列之間具有良好同源性的一般反義引物DV-Ll(4亥苦酉臾殘基368-388):故指定為用于這些病毒的RT引物。雖然登革熱4基因組與DV-L1序列享有顯著的同源性，但如圖3所示，在DV-L1引物內(nèi)存在5個(gè)核苷酸4晉配。因此，分開的反義引物DV-L2專一地用于登革熱4病毒4企測(cè)的RT反應(yīng)。這兩種反義引物(DV-Ll和DV-L2)用作一4殳的RT引物組(primerset),以轉(zhuǎn)錄用于所有四種登革熱病毒血清型的RNA(Houngetal.，2001J.Virol.Meth.95:24-35)。在單個(gè)試管中的多重RT-PCR反應(yīng)RT反應(yīng)和多重PCR反應(yīng)可以在單個(gè)i式管中進(jìn)4亍(圖4)。用于RT反應(yīng)和PCR反應(yīng)的所有反應(yīng)組分一皮冷凍干燥在具有適當(dāng)配方設(shè)計(jì)的基質(zhì)中。加入生物素dUTP和標(biāo)記的寡核苷酸引物以及熒光標(biāo)記的信標(biāo)引物以標(biāo)記PCR產(chǎn)物并利用實(shí)時(shí)熒光熱循環(huán)器或側(cè)流抬r測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。在單一PCR反應(yīng)中可以鑒定登革熱病毒的四種血清型。這種反應(yīng)試劑盒可以在室溫下儲(chǔ)存1年以上。PCR結(jié)果鑒定商業(yè)上可獲得的實(shí)時(shí)熒光PCR系統(tǒng)可以用于這種立即可用的試劑盒。耳又決于熒光才全測(cè)系統(tǒng)，立即可用的試劑盒可以按用戶專用化加以調(diào)整。此外，這種試劑盒可以在沒有實(shí)時(shí)熱循環(huán)器的非理想實(shí)驗(yàn)室條件下使用。側(cè)流免疫層沖斤檢測(cè)是鑒定擴(kuò)增PCR產(chǎn)物的一種可4齊:換系統(tǒng)。這種方法是獨(dú)特的、特異性的，并且易于在現(xiàn)場(chǎng)可采用的系統(tǒng)中進(jìn)行才喿作。這種系統(tǒng)可用于實(shí)際上所有生物病原體和病毒，并且在現(xiàn)場(chǎng)或在"實(shí)時(shí)"條件下(如在美國軍人部署于登革熱流行區(qū)域的情況下)可提供可靠的結(jié)果。非PCR側(cè);充核^^r測(cè)快速、自進(jìn)行核酸檢測(cè)系統(tǒng)的構(gòu)造示于圖23中，其包含所有以精確量的試劑和組分以在樣品加入后產(chǎn)生試-瞼結(jié)果。該系統(tǒng)還具有內(nèi)置加熱墊以精確匹配基于4冢針寡核香酸組成(組合物)的核普酸靶序列鑒定。檢測(cè)原理描述在示意圖中(圖24)。樣品首先通過儲(chǔ)存墊(儲(chǔ)存片，reservoirpad)，其包含優(yōu)化樣品pH的》爰沖液、懸浮樣品中所有組分的去污劑、以及產(chǎn)生通過裝置的適當(dāng)流動(dòng)的多孔過濾材料。樣品其后通過毛細(xì)管作用流動(dòng)到染料區(qū)，在其中樣品中的生物病原體的耙DNA與銪顆粒標(biāo)記的寡核苷酸或肽核酸(PNA)起反應(yīng)。如此形成的反應(yīng)復(fù)合物然后遷移通過芯吸膜(毛細(xì)作用膜，wickingmembrane),在其中捕獲埋置在導(dǎo)電試驗(yàn)區(qū)和對(duì)照區(qū)的寡核苦酸。最初的銪標(biāo)記探針反應(yīng)使得可以打開把核苷酸序列。利用時(shí)間分辨熒光的側(cè)流檢測(cè)超敏感時(shí)間分辨熒光(TRF)染料用于側(cè)流檢測(cè)4各式。這可以確l呆改善的敏感性同時(shí)^呆持側(cè)流;險(xiǎn)測(cè)的有益方面。納米鄉(xiāng)及的TRF染料包含由(3-二酮誘捕的30,000-2,000,000個(gè)銪分子，其具有最高量子產(chǎn)率的已殺口4闌系元素螯合沖勿的一種(Harma,TechnologyReview126/2002,TEKES，NationalTechnologyAgency,Helsinki2002)。這種包月交(包封，encapsulation)基本上對(duì)染#+的熒光效率沒有影響。對(duì)于典型的100nm大小的銪顆粒，熒光產(chǎn)量相當(dāng)于大約3,000個(gè)熒光素分子。通過比4交，藻膽蛋白(phycobiliprotein)B-PE(也許是已知的最大熒光的物質(zhì))具有相當(dāng)于大約30個(gè)熒光素分子的熒光產(chǎn)量。因?yàn)?00nm的顆粒是藻膽蛋白B-PE直徑的約10倍并且在體積/質(zhì)量方面大上千倍，所以Seradyn銪顆粒的熒光基于摩爾比B隱PE大100倍，4旦基于體積/質(zhì)量<又為10%(Seradyn，Color-RichTMDyedandFluoro-MaxTMFlorescentMicroparticlesTechnicalBulletins1999)。利用這種TRF染料顆粒的側(cè)流4全測(cè)可以增加沖僉測(cè)每文感性高達(dá)pg/ml的水平，這意味著閾循環(huán)數(shù)(Ct)可以;故降低達(dá)10個(gè)循環(huán)。這種特征可提供另外的特異性。該系統(tǒng)需要簡(jiǎn)單和自進(jìn)行的一步方法，該方法不需要復(fù)雜的和昂貴的自動(dòng)化儀器。在圖5中示出了較小的塑料片(包括本發(fā)明的自進(jìn)4于一全測(cè)條以及其測(cè)試結(jié)果)的實(shí)例。借助于本文提供的檢測(cè)系統(tǒng)，可以在單次耳又樣并且沒有進(jìn)一步的過程步驟的情況下檢測(cè)多種被分析物。免疫層析檢測(cè)系統(tǒng)是優(yōu)選的。如果各種抗體-染辨-4厄合物一皮i里置在染3牛墊區(qū)(dyepadarea)并且對(duì)每種報(bào)道染料是特異性的抗體被分別固定在膜上的分離區(qū)中，則每個(gè)一企測(cè)線(試-驗(yàn)線，testline)將纟是供關(guān)于每種特異性登革熱血清型的區(qū)別性信息(圖6)?，F(xiàn)場(chǎng)可采用的檢測(cè)系統(tǒng)可以i殳想現(xiàn)場(chǎng)可采用的一企測(cè)系統(tǒng)。條形讀ft器可以用來4全測(cè)樣品的存在。例如，可以使用用于測(cè)量時(shí)間分辨鑭系元素發(fā)射的儀器，其裝備有氮激光器、衍射光柵分光計(jì)、電荷耦合器件(CCD)以及用于日寸閘(timegating)的才幾才戒壽斤〉皮器(mechanicalchopper)。本發(fā)明的范圍并不限于本文描述的具體實(shí)施方式。事實(shí)上，除本文描述的之外，根據(jù)以上的描述和附圖，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來i兌本發(fā)明的各種更改將是顯而易見的。這些更改屬于所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。以下給出的實(shí)施例僅用來說明本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明。實(shí)施例以下是逐步過程，其說明用于陽性對(duì)照的登革熱病毒cDNA以及用于內(nèi)部對(duì)照的兔i朱蛋白mRNA。描述了擴(kuò)增PCR產(chǎn)物鑒定系統(tǒng)的整個(gè)i殳計(jì)。實(shí)施例1分子信標(biāo)引物的設(shè)計(jì)利用BeaconDesigner2(Bio-Rad)引物和^笨針i殳計(jì)軟件設(shè)計(jì)了分子信標(biāo)引物。雙重標(biāo)記分子信標(biāo)引物的制備將各種才艮道熒光素(OregonGreen(517nm)、6-FAMTM(520謹(jǐn))、HEX(556腿)、TAMRA丁M(573廳)、TexasRed(603腿)、Bodipsy(640nm)等)才示記到自3'端的第三或第四》咸基(T)。將猝滅劑熒光素(Iowablack,猝滅范圍520nm至700nm)標(biāo)記到伸展的5'端(3'端的互補(bǔ)序列)。所有報(bào)道染料和猝滅劑可獲自IntegratedDNATechnology,Inc.(Coralville,IA)和MolecularProbes,Inc.(Eugene,OR)。內(nèi)部質(zhì)量對(duì)照系統(tǒng)立即可用的i式劑盒包含作為內(nèi)部反應(yīng)只于照的1ng兔^求蛋白mRNA以及兩種王求蛋白特異性PCR引物的每一種。在只寸照區(qū)通過22側(cè)流鑒定試劑盒對(duì)兔球蛋白mRNA的PCR產(chǎn)物進(jìn)行4企測(cè)。這個(gè)對(duì)照區(qū)強(qiáng)度可以用作半定量結(jié)果的參考。立即可用的RT-PCR^—應(yīng)試劑盒評(píng)價(jià)了各種基體介質(zhì)如纖維素、玻璃纖維、聚合物或人造纖維等。以下列出的配制組分在冷凍干燥器中、在恒定真空下加以干燥。相對(duì)于最佳試劑重新組成和RT-PCR反應(yīng)來選纟,基質(zhì)。配制組分的列表RT-PCR緩沖液，適當(dāng)濃度的MgCl2dNTP生物素dUTP(生物素-16-dUTP或生物素-21-dUTP)RNA酶抑制劑反轉(zhuǎn)錄酶標(biāo)記登革熱病毒血清型特異性引物(1、2、3、4型)才示i己下〖誇引#勿兔3求蛋白mRNA兩種j求蛋白特異性PCR引物Taq聚合酶穩(wěn)定劑(沒有BSA和糖類的RNA酶/DNA酶等)。這個(gè)步驟的主要目的是找到最佳冷凍干燥和關(guān)鍵組分(主要組分)的4諸存條件(結(jié)合有在RT-PCR反應(yīng)下所有組分的釋力文和重新組成)。試驗(yàn)了各種化學(xué)物質(zhì)(如但不限于緩沖液、去污劑、糖類和聚合物以及生物材并牛如蛋白質(zhì)和其它生物聚合物)的各種組合以找到最佳條件。用iCyclerIQTM(BioRAD)和ABI7700實(shí)時(shí)熒光基因熱循環(huán)器試驗(yàn)了立即可用的RT-PCR試劑盒。對(duì)于成功的側(cè)流4全測(cè)來說，MgCl2的濃度是一個(gè)重要因素。MgCl2濃度的優(yōu)選范圍是不高于約1.5mM,因?yàn)楦哂谝欢康腗gCl2就可以看到引物二聚體和々i正性的(falsepositive)結(jié)果。生物素dUTP的加入增加壽丈感性，這或者由于更大的捕獲能力或者由于更大的指示劑結(jié)合能力(表1)。通過控制標(biāo)記和未標(biāo)記比率以及使用過多的捕獲和指示劑量來克月良底物抑制。表1示出了在用于登革熱病毒血清型24僉測(cè)的具有標(biāo)記引物的擴(kuò)增PCR結(jié)果和具有標(biāo)i己引物以及生物素dUTP加入的擴(kuò)增PCR結(jié)果之間的比較數(shù)據(jù)。表1登革熱病毒擴(kuò)增PCR結(jié)果之間的比較數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>實(shí)施例2側(cè)流快速PCR產(chǎn)物鑒定試劑盒試驗(yàn)的構(gòu)造本發(fā)明的試-驗(yàn)試劑盒一皮設(shè)計(jì)成自進(jìn)4亍裝置。諸如圖7中描述的側(cè)流快速PCR產(chǎn)物鑒定試-驗(yàn)試劑盒在儲(chǔ)存墊處包含所有以精確量的試劑和組分以在樣品加入后產(chǎn)生試驗(yàn)結(jié)果。在圖8中描述了檢測(cè)原理和構(gòu)造。樣品首先通過儲(chǔ)塊，其包含優(yōu)化樣品pH的緩沖液、懸浮樣品中所有組分的去污劑、分離未反應(yīng)基質(zhì)(如標(biāo)記引物和生物素化dUTP)的分離柱材料(如瓊脂糖珠粒等)、以及產(chǎn)生通過裝置的適當(dāng)流動(dòng)的多孔儲(chǔ)存器。樣品隨后在毛細(xì)管作用流動(dòng)到染利-區(qū)，在其中樣品中的登革熱病毒DNA的血清型特異性PCR產(chǎn)物與銪顆粒標(biāo)記的抗生蛋白鏈菌素起反應(yīng)。然后如此形成的反應(yīng)復(fù)合物遷移通過埋置有抗熒光染庫?？贵w試-驗(yàn)區(qū)以及乂于照區(qū)的芯吸膜。該試驗(yàn)可以由受過最低程度培訓(xùn)的人員在現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行，并在將一滴或兩滴DNA才是取才羊品力o到可4地棄型(可處理的，disposal)才企測(cè)卡(testcard)以后的10分鐘內(nèi)可獲得快速的結(jié)果。標(biāo)記抗生蛋白鏈菌素和耙DNA復(fù)合物被試驗(yàn)區(qū)和對(duì)照區(qū)捕獲。試驗(yàn)區(qū)可區(qū)別每一血清型特異性PCR產(chǎn)物，并且當(dāng)銪用作信號(hào)^f企測(cè)標(biāo)記時(shí)，該區(qū)可以通過裝備有時(shí)間分辨熒光掃描裝置的讀數(shù)器來檢測(cè)。作為內(nèi)部質(zhì)量對(duì)照系統(tǒng)，分開的對(duì)照區(qū)可才企測(cè)^f壬何擴(kuò)增PCR產(chǎn)物。這個(gè)對(duì)照區(qū)反應(yīng)確保關(guān)鍵試驗(yàn)組分正確地起作用。捕獲抗染料抗體固定化的制備熒光染料的抗體為信號(hào)增強(qiáng)和二次4企測(cè)用熒光染料標(biāo)記的PCR產(chǎn)物提供了獨(dú)特的機(jī)會(huì)。各種抗熒光團(tuán)抗體可獲自MolecularProbes，Inc.(Eugene,OR)。在0.5和2mg/ml之間的不同濃度下利用印刷機(jī)(BioDotCorp.)印刷每種抗體，其厚度為0.5至1mm。用Ponceau方法可以檢查可見波段(visibleband)的質(zhì)量和抗體的結(jié)合特性(Hassan，J.,etal，J.Clin.Lab.Immunol"24:104,1987)?？拱肟乖贵w輒合孩M立的制備銪顆粒各種粒徑(50nm-300nm)的銪顆粒購買自Seradyn(Indianapolis,Indiana)禾口MolecularProbes(Eugene,Oregon)。用10mmol/L的N-(3-二曱基氨基丙基)-N，-乙基碳二亞胺以及100mmol/L的N-羥基磺基琥珀酰亞胺活化銪螯合納米顆粒的羧基30分鐘。用50mMMES緩沖液(pH為6.1)洗滌活化的顆粒一次。加入5mg/L的抗體或抗生25蛋白鏈菌素。保溫2小時(shí)以后，用50mMMES緩沖液(pH為6.1)洗滌抗體或抗生蛋白鏈菌素涂#1的顆粒三次。金顆粒各種粒徑(20nm-200nm)的金顆粒購買自BritishBiocellInternational(UK)。為了獲得最佳的扼合，將膠體金溶液的pH調(diào)節(jié)到6.5。加入5mg/L的抗體或抗生蛋白鏈菌素。保溫15分鐘以后，加入2g/L的牛血清清蛋白。用10mM磷酸鹽緩沖液(pH為7.4)洗滌抗體或抗生蛋白鏈菌素涂敷的顆粒兩次。輒合于抗生蛋白鏈菌素的微粒的最優(yōu)化在各種條件下檢測(cè)了抗生蛋白鏈菌素濃度的影響(抑制軛合物組成(組合物)和扼合物的儲(chǔ)存)。還確定了共i^介交4關(guān)。在選沖奪和優(yōu)化的系統(tǒng)中共扼產(chǎn)率和按比例增加的可行性是重要的決定因素。輒合于抗半抗原抗體的孩i粒的最優(yōu)化在各種條件下一全測(cè)了抗半抗原抗體濃度的影響(抑制軛合物組成(組合物)和扼合物的^諸存)。還確定了共^f介交聯(lián)。在選4奪和優(yōu)化的系統(tǒng)中共輒產(chǎn)率和按比例增加的可行性是重要的決定因素。試劑盒組成(kitformulation)染料區(qū)這個(gè)步驟的主要目的是找到最佳染料-抗生蛋白鏈菌素或半抗蛋白鏈菌素或抗體)。試驗(yàn)了各種化學(xué)物質(zhì)(如但不限于緩沖液、去污劑、糖類和聚合物以及生物材料如蛋白質(zhì)和其它生物聚合物)的各種組合以找到最佳條件。儲(chǔ)存區(qū)由于樣品被施加到儲(chǔ)存區(qū)，所以利用化學(xué)物質(zhì)和生物材料的各種組合將樣品調(diào)節(jié)到用于#企測(cè)的最佳條件。芯吸膜由于這個(gè)組分可促進(jìn)核酸樣品的毛細(xì)遷移，所以它應(yīng)有效地流動(dòng)核酸、4吏得在結(jié)合于捕獲抗生蛋白鏈菌素的標(biāo)記耙核酸之間可以進(jìn)^f亍免疫反應(yīng)并4是供長時(shí)間的強(qiáng)毛細(xì)管作用。找到具有適當(dāng)穩(wěn)定劑的去污劑的最佳濃度也很重要。這種系統(tǒng)的構(gòu)造類似于抗原-抗體免疫層初"險(xiǎn)測(cè)，4旦抗生蛋白4連菌素被軛合于膠體金顆粒，并且可以通過抗生蛋白鏈菌素-生物素相互作用來產(chǎn)生信號(hào)。用熒光半抗原如若丹明紅來標(biāo)記血清型2特異性引物。抗若丹明紅抗體被固定在硝化纖維素膜上。樣品首先通過儲(chǔ)塊然后通過毛細(xì)管作用流動(dòng)到染料區(qū)，在其中(那里)登革熱病毒的血清型特異性PCR產(chǎn)物與膠體金軛合的抗生蛋白鏈菌素起反應(yīng)。然后如此形成的反應(yīng)復(fù)合物遷移通過芯吸膜，在其中是嵌入試馬全區(qū)和只寸照區(qū)的4元焚光染剩-4元體。側(cè)流登革熱病毒血清型2試—驗(yàn)成功用來4企測(cè)和鑒定登革熱病毒血清型2特異性PCR擴(kuò)增。登革熱病毒血清型2試驗(yàn)的檢出限是〈100pg/試驗(yàn)，其相應(yīng)于<1毫微微摩爾/試驗(yàn)。理論上，這種敏感性足以檢測(cè)來自登革熱病毒cDNA的單數(shù)位(singledigit)拷貝的擴(kuò)增PCR產(chǎn)物。所報(bào)道的登革熱病毒血清型2試驗(yàn)可由受過最低程度培訓(xùn)的人員在現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行，并在將PCR產(chǎn)物加到可拋棄型的檢測(cè)卡以后的10分鐘內(nèi)可獲得快速的結(jié)果。同時(shí)，這種系統(tǒng)是不需要復(fù)雜和昂貴實(shí)驗(yàn)室條件的簡(jiǎn)單和自進(jìn)行的一步方法。實(shí)施例3熒光素異石克氰酸鹽(isothiocyanate)(FITC)扼合寡核脊酸的制備熒光素異碌L氰酸鹽(FITC)購買自Sigma。為了輒合，用12碳鏈(C12)氨基修飾連接子(modifierlinker)修飾登革熱病毒2型正向引物的5'端(圖9)。利用常規(guī)方法，將FITC連接到經(jīng)修飾的寡聚體。側(cè)流驗(yàn)測(cè)物的制備將抗生蛋白《連菌素軛合于月交體金顆粒，然后可以通過抗原-抗體反應(yīng)來產(chǎn)生信號(hào)。將生物素分子扼合在反向引物(DV.L1)的5'端。將FITC分子軛合在正向引物(DV2.U)的5'端。具有那些{奮飾的正向和反向引物的擴(kuò)增PCR產(chǎn)物包含生物素和FITC分子。在PCR擴(kuò)增期間組合生物素dUTP。當(dāng)將這個(gè)樣品施加至試驗(yàn)條時(shí)，擴(kuò)增PCR產(chǎn)物的生物素標(biāo)簽與用抗生蛋白鏈菌素軛合的膠體金起反應(yīng)。然后PCR產(chǎn)物-金4厄合物復(fù)合物4昔助于層一斤毛細(xì)力(chromatographiccapillarypower)遷移通過硝化纖維素膜。該復(fù)合物被固定的抗-FITC抗體捕獲。取決于捕獲的金或銪顆粒的量，產(chǎn)生可見信號(hào)(圖10)。裝置格式構(gòu)成示于圖11中。l型、2型、以及3型的生物素才示i己正向引物的制備將生物素分子軛合在登革熱病毒正向引物(DV1.U、DV2.U、以及DV3.U)的5'端。在5'端用6碳鏈(C6)連接子^f資飾每種正向引物(圖12)。若丹明紅標(biāo)記反向引物(DV丄1)的制備用軛合在反向引物(DV丄1)的5'端的若丹明紅分子修飾反向引物(圖13)。寡肽標(biāo)記反向引物(DV2.U)的制備用輒合在引物(DV2.U)的5'端的合成寡肽分子修飾正向引物(圖14)。用于條格式檢測(cè)的測(cè)定步驟(圖15)1)樣品施力口將各種模板濃度的擴(kuò)增PCR產(chǎn)物、金或銪輒合物以及緩沖液進(jìn)行混和，然后4妻觸地加到硝化纖維素膜上。2)一企測(cè)纟爰沖液按照常規(guī)方法制備包含去污劑的PBS。3)觀'J定在lO分鐘以后讀出試-驗(yàn)結(jié)果用于裝置格式檢測(cè)的測(cè)定方法(圖16)1)樣品施力口將各種模板濃度的擴(kuò)增PCR產(chǎn)物(如2jud的PCR產(chǎn)物)加入樣品孑L。2)檢測(cè)緩沖液利用常規(guī)方法制備包含去污劑的PBS,然后將特定用于信號(hào)檢測(cè)標(biāo)記的兩滴顯影液與硝化纖維上的裝置進(jìn)行接觸。3)觀'J定在10分鐘以后讀出試-瞼結(jié)果圖17、圖18、以及圖19l會(huì)出用于登革熱血清型1、2、以及3的實(shí)時(shí)PCR和快速PCR產(chǎn)物分析試劑盒的比較結(jié)果。實(shí)施例4利用電導(dǎo)率和銪標(biāo)記寡核香酸的側(cè);;fU^測(cè)光尋址直接電子讀出(LADER)的原理是基于單鏈("絕緣的")和雙鏈("導(dǎo)電的")形式的寡核苷酸的電導(dǎo)率差異。這個(gè)電導(dǎo)率差異可以被認(rèn)為是開關(guān)。通過將捕獲探針連接于電極、連接電子供體/電子受體復(fù)合物(DA)以及加入溶解的活性組分就可構(gòu)建分子電^^。電子供體/電子受體復(fù)合物充當(dāng)另外的、光誘導(dǎo)開關(guān)。如果探針-故雜交的話，入射光可i秀導(dǎo)電荷乂人D轉(zhuǎn)移到A并且電子可以,人這里被傳送到電極。通過活性組分的DA復(fù)合物的電荷再充裝(chargerefilling)可閉合電^各，而連續(xù)循環(huán)產(chǎn)生高度方文大的讀出4言號(hào)。LADER原理描述在EP1144685Bl中，其描述1M呆護(hù)光合反應(yīng)中心和類似的作為用于LADER技術(shù)的電化學(xué)復(fù)合物的系統(tǒng)，而DE論及電導(dǎo)率技術(shù)的操作。供體/受體復(fù)合物很好地適用于顏料/蛋白質(zhì)復(fù)合物(已知其在光合成作用中是反應(yīng)中心)，能夠在光誘導(dǎo)后的lOOps內(nèi)將電子從卟啉供體傳遞到醌受體(chinon-acceptor)。這種顏料/蛋白質(zhì)復(fù)合物可以容易地^皮分成醌受體和剩余的(脫輔基)蛋白質(zhì)。以下面的方式i奮飾醌受體一方面它可以共價(jià)連4妄于寡核苷酸捕獲纟笨針并且在另一方面可在(脫輔基)蛋白質(zhì)重新組成至纟笨針結(jié)合醌受體以后連才妻于(脫輔基)蛋白質(zhì)。該方式描述在圖20的反應(yīng)圖解中。將耗盡光合成反應(yīng)中心的輔酶Q(UQ)進(jìn)行重組并交4關(guān)至結(jié)合于雙《連DNA的UQ。供體由外啉系統(tǒng)P表示而輔酶Q部分形成受體A。第一步驟(l)中的照射產(chǎn)生激發(fā)態(tài)P*-UQ，其在進(jìn)一步的步驟(2)中進(jìn)行到暫時(shí)穩(wěn)定的電荷分離狀態(tài)P+-UQ-。在這種狀態(tài)電子從DNA(3)吸引到電極(4)，從而將？+-1;(7氧化成？+-1;0并產(chǎn)生可測(cè)量的陽極光電流。回到初始狀態(tài)的循環(huán)通過還原劑細(xì)胞色素c2+(X)來閉合，而還原劑本身通過還原(5)體系而^皮氧化為P-UQ。通過在每個(gè)獨(dú)立斑點(diǎn)的參考和測(cè)量信號(hào)之間的自動(dòng)比較，可以讀出和解釋讀數(shù)并進(jìn)行定性和定量鑒定。圖21圖解i兌明了讀數(shù)裝置的簡(jiǎn)圖以及用于CBT芯片(以EDDA格式)的接觸頭的放大示圖。讀數(shù)器4皮部分開發(fā)并且能夠?qū)νㄟ^簡(jiǎn)單的"壓底(pressbottom)"方式進(jìn)行所必要的所有液體處理步驟。將條形碼芯片的參考測(cè)量數(shù)據(jù)(雜交前)存儲(chǔ)在內(nèi)部緩沖器中，并與雜交后的實(shí)際測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)4亍比4交。每個(gè)電才及的差佳j皮顯示在外部計(jì)算才幾屏幕上并可以進(jìn)一步力口以處理。利用電化學(xué)阻抗光譜術(shù)，通過確定用于變化長度的DNA單鏈和雙鏈的電子轉(zhuǎn)移速率常數(shù)進(jìn)一步探測(cè)了雙鏈DNA與單鏈DNA的電導(dǎo)率以及沖目關(guān)的P逸道參凄丈(tunnellingparameter)f3。圖22示出了在與匹配草巴(其本身用鐵鈰(FcAc)標(biāo)記加以修飾)進(jìn)行雜交作用的前后，用20個(gè)核普酸長的捕獲揮:針加以^修飾并共Y介連接于Os標(biāo)記的電極的電化學(xué)性能。如所預(yù)期的，在單鏈情況下，存在電化學(xué)響應(yīng)，其可歸因于在捕獲揮:針遠(yuǎn)端的Os-標(biāo)記。在雜交后出現(xiàn)另外的峰，其由于4失4市標(biāo)記(FcAc-峰)。這不4又i正明可以電化學(xué)地掃描在捕獲探針遠(yuǎn)端的Os-標(biāo)記，而且證明雜交的效率接近100%(代表捕獲探針和靶的標(biāo)記的兩個(gè)峰的高度幾乎相同)。利用電導(dǎo)率檢測(cè)器的層析檢測(cè)自進(jìn)行快速核酸檢測(cè)系統(tǒng)的構(gòu)造(圖23)包括以精確量的所有試劑和組分以在加入樣品后產(chǎn)生試驗(yàn)結(jié)果。該系統(tǒng)還具有內(nèi)置加熱墊以精確匹配基于探針寡核苷酸組成的核苷酸靶序列鑒定。檢測(cè)原理描述在圖24的示意圖中。樣品首先通過儲(chǔ)存墊，其包含優(yōu)化樣品pH的纟爰沖液，懸浮樣品中所有組分的去污劑，以及產(chǎn)生通過裝置的適當(dāng)流動(dòng)的多孔過濾材3阡。樣品其后通過毛細(xì)管作用流動(dòng)到染料區(qū)，在其中樣品中生物病原體的靶DNA與銪顆粒標(biāo)記的寡核普酸起反應(yīng)。然后如此形成的反應(yīng)復(fù)合物遷移通過芯吸膜，在其中埋置有捕獲寡核苷酸，適用于導(dǎo)電試-驗(yàn)和對(duì)照區(qū)。最初的銪標(biāo)記探針反應(yīng)使得可以打開靶核苷酸序列。提出的試驗(yàn)可以由受過最低程度培訓(xùn)的人員在現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行，并在將一滴或兩滴DNA提取樣品加到可拋棄型檢測(cè)卡以后的30分鐘內(nèi)可獲得快速的結(jié)果。標(biāo)記寡核苷酸t(yī)笨針和耙DNA復(fù)合物由電導(dǎo)率標(biāo)記的試驗(yàn)區(qū)和對(duì)照區(qū)捕獲。試驗(yàn)區(qū)顯示耙序列，并且該區(qū)可以通過裝備有時(shí)間分辨熒光掃描裝置和/或電導(dǎo)率讀數(shù)器的讀數(shù)器來檢測(cè)。分開的對(duì)照區(qū)顯示銪標(biāo)記寡核普酸的反寡核苷酸序列。該對(duì)照區(qū)反應(yīng)確-沐關(guān)4建試-驗(yàn)《且分正確;t也起作用。層析側(cè)流檢測(cè)是一種放大系統(tǒng)。當(dāng)液體樣品中的靶DNA借助毛細(xì)力通過膜時(shí)，透明通過電親合力不斷地集中到膜上的帶電荷試32驗(yàn)區(qū)。甚至在分子的濃度非常低的情況下，在試驗(yàn)區(qū)中的實(shí)際分子濃度也比樣品中的分子濃度高得多。內(nèi)置加熱墊(builtinheatingpad)側(cè)流一金測(cè)物可以安裝在加熱PCB/PCP(印刷電3各紙)上，其在基線板(baseboard)上印刷的高電阻金屬(例如，鎳/4各合金可用于加熱目的)。該系統(tǒng)可以具有相對(duì)4青確的溫度監(jiān)測(cè)器以及^f氐成本控制。才羊品構(gòu)造示在圖25A-25C、圖26A-26B、以及圖27A-27B中。試驗(yàn)裝置的示意圖試-驗(yàn)試劑盒(testkit)由具有兩個(gè)窗口的可處理的塑沖牛殼(塑料盒，plasticcase)制成，其中一個(gè)窗口用來7見察對(duì)照區(qū)和試-瞼區(qū)，而另一個(gè)窗口提供接收樣品的孔，如圖28所示。在裝置內(nèi)部是具有兩個(gè)墊片的試驗(yàn)條。第一個(gè)墊片包含確保一致試驗(yàn)結(jié)果的緩沖液、去污劑、以及化學(xué)物質(zhì)，同時(shí)它還包含在特定配制的緩沖系統(tǒng)中的靶寡核苷酸軛合銪顆粒。第二個(gè)墊片用于除去已通過反應(yīng)膜的過量液體。將兩種類型的寡核苷酸作為細(xì)線(thinline)分別固定在硝化纖維素膜的試驗(yàn)區(qū)和對(duì)照區(qū)。將對(duì)于靶生物病原體特異性的寡核苷酸固定在試驗(yàn)區(qū)，同時(shí)將對(duì)銪標(biāo)記探針特異性的另一種寡核芬酸固定在對(duì)照區(qū)。還包括4義器連4妾器，以使用來測(cè)量時(shí)間分辨熒光或電導(dǎo)率(在使用電導(dǎo)率標(biāo)記的情況下)的儀器可以連接于裝置。實(shí)施例5利用銪標(biāo)記肽核酸(PNA)的電導(dǎo)率的側(cè)流檢測(cè)說明書第30/34頁在實(shí)施例4(將核酸用作檢測(cè)革巴DNA的探針)中描述的所有方法和步驟也適用于使用肽核酸作為纟笨針，包括:使用其中所描述的各種加熱墊和試一驗(yàn)裝置。實(shí)施例6HLA-DQa序列多形態(tài)'性的檢測(cè)HLA-DQa2遺傳基因座(geneticlocus)可以作為遺傳標(biāo)記(geneticmarker)用于個(gè)體鑒定的法醫(yī)沖企定法。各種各4羊的分沖斤技術(shù)已用來檢測(cè)PCR擴(kuò)增DNA中的遺傳變異?？梢栽谝锖?罙4十處標(biāo)記各種半抗原或熒光半抗原。因此，各種序列和大小的寡肽可以用作半抗原；可以作為抗原決定基(表位，epitope)的其它小分子可以用作半抗原，并且可以〗吏用各種熒光半抗原如那些列在表2中的半抗原。表2報(bào)道染料的發(fā)射最大值OregonGreen488-X(517讓)G-FAM熒光素(520應(yīng))RhodamineGreenTM-X(527賺)OregonGreen514(530膽)TETTM(536腿)JOE(547腿)HEX(556nm)Cy3(563膽)TAMRA(573腿)RhodamineRed-X(580應(yīng))ROXTM(602麵)TexasRed-X(603賺)Bodipy630/650-X(640腿)Bodipy650/665-X+(660應(yīng))Cy5TM(662讓)Cy5.5TM(707膽)34抗半抗原抗體用作上述半抗原的配對(duì)物(counterpart)。許多抗半4元原4元體可商業(yè)上獲自這才羊的/>司^口MolecularProbes，Inc。it匕外，可以將抗半抗原抗體固定在固體基質(zhì)上或扼合于各種顆粒。"各種顆粒"是指膠體金、膠乳顆粒、磁性或順磁性顆粒、銪嵌入膠乳顆粒等。實(shí)施例7基因現(xiàn)場(chǎng)檢驗(yàn)在本發(fā)明的另一種具體實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及基因現(xiàn)場(chǎng)斗全-瞼裝置(GPOCT),其目的是提供一步或簡(jiǎn)單步驟組合的基因分析系統(tǒng)。吸收墊(absorbentpad)連4妄于基質(zhì)(連4妻于反應(yīng)墊(reaction檢驗(yàn)裝置的線或點(diǎn)側(cè)流檢測(cè)。在反應(yīng)墊上是試劑區(qū)，其中施加反應(yīng)樣品(擴(kuò)增樣品)然后反應(yīng)纟羊品遷移到下一種介質(zhì)。具體實(shí)施方式l-^品爽取,秀^。參照?qǐng)D29，一種^是耳又系統(tǒng)的非限制性實(shí)例可以包^^:用來除去溶液的儲(chǔ)存系統(tǒng)和用來濃縮DNA或RNA樣品的緩沖組分，并且可以包括經(jīng)特殊處理的多層吸收劑，以及包含^旦不限于去污劑和堿性緩沖液的提取溶液。這種緩沖液可以破壞細(xì)胞壁或細(xì)胞膜并將基因樣品如DNA或RNA暴露在溶液中。可以設(shè)想，可以加入蛋白酶以除去組蛋白類蛋白質(zhì)和細(xì)月包壁?？商鎿Q地，可以4吏用分開的溶液型^皮膜(solutioncapsule)或多層膜。另外，可以使用各種儲(chǔ)存器、活性炭過濾器、離子交換過濾器。此夕卜，過濾器可以是分子截?cái)喾秶鸀?0,000至300,000D或更高的半透膜以及可以是非粘性涂布的。該過濾器系統(tǒng)除去所有潛在的抑制劑、小分子、離子、以及蛋白質(zhì)。因此，樣品可以乂人最初的^是耳又溶液凈皮濃縮10至1000倍。具體實(shí)施方式2-^^V衛(wèi)^^品減提取DA^一f品的桌成,系鍵如圖29所示，集成系統(tǒng)包括樣品輸入?yún)^(qū)，其連接于多層過濾器系統(tǒng)，其中過濾器單元吸收大多數(shù)離子和小分子以及蛋白質(zhì)。這部分相當(dāng)于功能性過濾和濃縮器。過濾器系統(tǒng)進(jìn)一步連接于非常細(xì)的用于快速熱傳遞的管，正如毛細(xì)管一樣。為了容易和快速控制溫度，印刷在管表面上的內(nèi)置金屬可以起加熱線圈的作用。在細(xì)管內(nèi)可以是用于放置某些埋置在固體基質(zhì)中并被冷凍干燥的組分的區(qū)域。細(xì)管連接于反應(yīng)墊，其進(jìn)一步連接于硝化纖維素膜，并且其進(jìn)一步連4妻于吸收墊。具體實(shí)施方式3_,乂f^^會(huì)^/部為V統(tǒng)迷。施加純化樣品，而在一種可^齊換的具體實(shí)施方式中，施加樣品并通過滾柱系統(tǒng)(rollersystem),其控制樣品的流動(dòng)速率。然后樣品通過熱傳感器和熱控制電^各，并通過擴(kuò)增室，其可以由下述組成1)包含所有所需試劑的墊片；2)冷凍干燥的預(yù)配制試劑墊；以及3)PCR反應(yīng)。該室(墊)包含Taq聚合酶、dNTP、引物(標(biāo)記的)、其它標(biāo)記單體等等。當(dāng)才羊品/人擴(kuò)增室出來時(shí)，它與側(cè)流4企測(cè)的反應(yīng)墊4妻觸。在進(jìn)4亍側(cè)流4企測(cè)的同時(shí)，樣品流過結(jié)果窗，其中結(jié)果可以用斑點(diǎn)或線或任何種類的可一企測(cè)信號(hào)來顯示，然后流到吸收墊上。下文詳細(xì)描述本發(fā)明的裝置的部件。1.熱傳感器和熱控制電路單元。各種導(dǎo)電墨料(conductiveink)可以在柔性基質(zhì)(如聚酯、聚石友酸酯或聚苯乙烯)的表面上印刷出來。可替換地，可以將各種導(dǎo)電墨料，如碳、碳/銀混合物、銀、銀/氯化銀、金、鈾、紫外線固化電介質(zhì)、熱固化電介質(zhì)的導(dǎo)電墨料，印刷在基質(zhì)上并產(chǎn)生適當(dāng)?shù)臒崃恳赃M(jìn)4亍溫度變化范圍為30。C至IO(TC的熱循環(huán)。因此，通過檢測(cè)和控制它們的電流和電阻就可以實(shí)^見溫度〗專感器和溫度纟空制?？梢酝ㄟ^i殳置兩個(gè)或三個(gè)不同的溫度并在該溫度下重復(fù)4盾環(huán)20-40次來實(shí)現(xiàn)熱循環(huán)。熱循環(huán)條件需要被優(yōu)化，這取決于它們的引物序列。2.擴(kuò)增墊(amplificationpad)擴(kuò)增墊包含用于等溫?cái)U(kuò)增如PCR或RFPCR的所有試劑?？梢詫⑺性噭┻M(jìn)行預(yù)混合并最佳地進(jìn)行配制和冷凍干燥。所有試劑，是指用于擴(kuò)增反應(yīng)的基本組分。這樣的試劑可以包含1"旦不限于下述組分反轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶、Taq聚合酶、PNA引物、標(biāo)記引物、dNTP、標(biāo)i己dUTP、纟爰沖液、以及穩(wěn)定劑如蛋白質(zhì)、BSA(牛血清清蛋白)、以及EDTA。擴(kuò)增墊可以進(jìn)一步4昔助于施加特定容積的才羊品來重新組成?？梢杂貌Ａе榛蚰z乳^朱粒來固定引物以增強(qiáng)擴(kuò)增反應(yīng)并阻止底物抑制。"底物抑制，，是指未反應(yīng)的引物可以抑制抗標(biāo)記抗體(anti-tagantibody)和聚合的引物之間的反應(yīng)。"引物"是指寡核香酸或PNA(肽核酸)以及寡核苷酸雜交物。"玻璃珠，，或"膠乳珠"是指微顆粒?？梢垣@得直徑大小范圍為0.01-10.0pm的微顆粒。優(yōu)選地，用于本發(fā)明的這個(gè)具體實(shí)施方式的直徑可以在0.1-10.0|um的范圍內(nèi)。美國專利第6,153,425號(hào)4皮露了一種才企測(cè)系統(tǒng)，然而，該'425，專利沒有披露或提示在擴(kuò)增墊中的微粒可以用于防止底物抑制?；蛐酒诨颥F(xiàn)場(chǎng)檢驗(yàn)裝置的另一方面，本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)芯片和基因芯片。關(guān)于基因芯片，在描述基因現(xiàn)場(chǎng)沖企驗(yàn)裝置時(shí)已描述了的具體實(shí)施方式。在一種優(yōu)選的具體實(shí)施方式中，該裝置可以包括連接于DNA或RNA純化室的核酸提取器，其進(jìn)一步連接于擴(kuò)增或雜交室，而擴(kuò)增或雜交室連接于結(jié)果窗以觀察產(chǎn)生的信號(hào)(圖30)?；颥F(xiàn)場(chǎng)才企-驗(yàn)裝置可以組合以上描述的試-驗(yàn)條。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，將樣品加入到提取緩沖液容器中?？梢詫是耳又的DNA樣品進(jìn)一步加到GenePOCT,然后可以在30分鐘內(nèi)通過肉眼或信號(hào)讀出器讀出結(jié)果(圖31)。GenePOCT方法是快速和高度敏感的。本領(lǐng)域技術(shù)人員將i人識(shí)到、或^f又利用常*見實(shí)-驗(yàn)就能夠確定本文具體描述的本發(fā)明的特定具體實(shí)施方式的許多等效變換。這樣的等效變換也包括在所附4又利要求書的范圍內(nèi)。權(quán)利要求1.一種用于檢測(cè)靶核酸的系統(tǒng)，包括容器，包括核酸擴(kuò)增混合物，其包括在其5′和3′端用不同半抗原標(biāo)記的引物，和可選的用半抗原標(biāo)記的dNTP以形成核酸復(fù)合物；以及側(cè)流試驗(yàn)裝置，所述裝置包括儲(chǔ)存區(qū)，其包括適合于特異性結(jié)合配體與所述核酸復(fù)合物進(jìn)行結(jié)合的試劑條件；染料區(qū)，其包括所述核酸復(fù)合物的特異性結(jié)合配體，其中所述特異性結(jié)合配體被連接或軛合至報(bào)道染料或另一種半抗原；以及試驗(yàn)區(qū)，其包括對(duì)所述核酸復(fù)合物的不同部分是特異性的不同特異性結(jié)合配體。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其中，所述核酸擴(kuò)增混合物被干燥或冷凍干燥，并且適合于等溫?cái)U(kuò)增、PCR和/或?qū)崟r(shí)PCR。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其中，所述預(yù)混合物包括多種類型的半抗原，其中多種形式的所述革巴核S臾一皮才全測(cè)。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其中，所述用于特異性結(jié)合的核酸復(fù)合物包括在所述核酸上的半抗原或所述核酸。5.才艮據(jù)—又利要求4所述的系統(tǒng)，其中，所述半抗原是生物素、熒光團(tuán)或寡狀。6.才艮據(jù)權(quán)利要求5所述的系統(tǒng)，其中，所述特異性結(jié)合配體是抗生蛋白鏈菌素、半抗原特異性抗體或與所述輩巴核酸互補(bǔ)的寡核香酸。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的系統(tǒng)，其中，所述報(bào)道染料是銪、金或熒光團(tuán)。,其中，所述多種類型的半抗原是,其中，固定在所述試-驗(yàn)區(qū)的是與根據(jù)權(quán)利要求9所述的系統(tǒng)，其中，固定在所述試驗(yàn)區(qū)的所述特異性配體是半抗原的抗體和/或與所述耙核酸互補(bǔ)的寡核苷酸或PNA。8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的系統(tǒng)多種類型的熒光團(tuán)或寡肽。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)10.11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的系統(tǒng)，所述特異性結(jié)合配體是DNA。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的系統(tǒng)，接器。其中，固定在所述試—驗(yàn)區(qū)上的包括用于電導(dǎo)率檢測(cè)讀數(shù)的連13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其中，所述輩巴核酸的來源是病原體。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的系統(tǒng)，其中，所述病原體是屬于黃病毒科的病毒。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的系統(tǒng)，其中，所述病毒是登革熱病毒。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的系統(tǒng)，其中，所述登革熱病毒顆粒的血清型通過為了區(qū)別它們而用多種不同的半抗原標(biāo)記的引物力口以才企觀'J。17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其中，所述引物在一端用焚光團(tuán)進(jìn)4亍標(biāo)記而在另一端用猝滅劑進(jìn)4亍標(biāo)記，以及所述可選的標(biāo)i己dNTP用生物素力口以標(biāo)記。18.—種用于4企測(cè)樣品中存在把核酸的方法，包括4吏所述樣品接觸包含預(yù)混合物的容器，其中所述預(yù)混合物包括耙核酸特異性標(biāo)記的引物和根據(jù)權(quán)利要求1所述的可選標(biāo)記dNTP;使由此獲得的所述擴(kuò)增核酸-接觸所述側(cè)流裝置的所述儲(chǔ)存區(qū)；以及才全的結(jié)合。19.一種用于檢測(cè)樣品中存在靶核酸的方法，包括使所述樣品接觸根據(jù)權(quán)利要求1所述的側(cè)流裝置的所述儲(chǔ)存區(qū)，其中所述染料區(qū)包括用才艮道染4'+標(biāo)記的靶核酸特異性寡核苷酸，并且所述標(biāo)記的寡核苷酸結(jié)合于形成核酸復(fù)合物的所述靶核酸，并且其中所述核酸復(fù)合物流動(dòng)到所述試-驗(yàn)區(qū)，其中所述試-驗(yàn)區(qū)固定寡核苷酸，其中所述標(biāo)記的寡核苷酸與固定的寡核苷酸的結(jié)合產(chǎn)生用于所述輩巴核酸存在的正〗言號(hào)20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中，所述信號(hào)通過報(bào)道染料或電導(dǎo)率讀出。全文摘要本申請(qǐng)披露了一種用于檢測(cè)靶核酸的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括包含核酸擴(kuò)增混合物的容器，其中核酸擴(kuò)增混合物包括在5′和3′端用不同半抗原標(biāo)記的引物，和可選的用半抗原標(biāo)記的dNTP以形成核酸復(fù)合物；以及側(cè)流試驗(yàn)裝置，該裝置包括儲(chǔ)存區(qū)，該儲(chǔ)存區(qū)包括適合于特異性(專一性)結(jié)合配體與核酸復(fù)合物進(jìn)行結(jié)合的試劑條件；染料區(qū)，該染料區(qū)包括核酸復(fù)合物的特異性結(jié)合配體，其中特異性結(jié)合配體被連接或軛合至報(bào)道染料或另一種半抗原；以及試驗(yàn)區(qū)，該試驗(yàn)區(qū)包括對(duì)所述核酸復(fù)合物的不同部分是特異性的不同特異性結(jié)合配體。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101426931SQ200580016495公開日2009年5月6日申請(qǐng)日期2005年4月7日優(yōu)先權(quán)日2004年4月7日發(fā)明者崔永鎬,鄭宰安,金榮善申請(qǐng)人:安克塞斯生物公司