專利名稱：核酸恒溫同步放大檢測方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測技術(shù)，具體涉及將核酸的恒溫放大與檢測同步進行的檢驗方 法，及其在臨床檢驗、血液篩查、食品安全檢査及環(huán)境監(jiān)測中的核酸檢測中的應(yīng)用。
技術(shù)背景在核酸檢測過程中，多數(shù)情況下樣品中的核酸含量較低，為了使檢測達到一定的靈敏度和準確度，需要對樣品中的待檢核酸片段進行擴增。1985年，聚合酶鏈反應(yīng) (Polymerase Chain Reaction,簡稱PCR)技術(shù)的產(chǎn)生推動了核酸檢測技術(shù)的發(fā)展，該 技術(shù)已成為核酸檢測技術(shù)中的重要手段。隨后，又衍生出諸如逆轉(zhuǎn)錄酶一聚合酶鏈反 應(yīng)(Reverse Transcriptase—PCR，簡稱RT—PCR)、實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real Time Fluorescent Quantified PCR， Real-time FQ PCR)，基于轉(zhuǎn)錄的擴增(Transcription Mediated Amplification, TMA) ， Nucleic Acid Sequence Based Amplification ( NASBA)等一系列核酸擴增檢測方法，均可用于DNA樣品或RNA樣 品的擴增及定性、定量檢測中。目前，除實時熒光定量PCR外，其余的核酸檢測方法 都是采用"基因擴增+擴增子檢測"的操作模式。目前，終點PCR或終點TMA/NASBA 檢測方法還被廣泛應(yīng)用。由于這些方法在實際應(yīng)用中易引起擴增物的污染，因此常造 成實驗結(jié)果的假陽性或假陰性現(xiàn)象，從而使得該技術(shù)的實際應(yīng)用尤其是臨床檢測具有 很大的局限性。實時熒光定量PCR雖然在技術(shù)上解決了上述難題，但設(shè)備昂貴、操作 復(fù)雜，阻礙了其在發(fā)展中國家的大規(guī)模推廣使用。1991年，Corapton發(fā)明了基于核酸序列的擴增技術(shù)(Nucleic Acid Sequence Based Amplification,簡稱NASBA) (Nature, 350 (6313): 91-2,1991)。該技術(shù)是以RNA分 子的逆轉(zhuǎn)錄一轉(zhuǎn)錄為技術(shù)主線，無需進行類似于PCR過程的溫度循環(huán)，可在恒定的溫 度下，短時間內(nèi)進行RNA擴增。但擴增產(chǎn)物常采用電泳、探針雜交、點雜交或化學(xué)發(fā) 光等方法來完成定性檢測。此外，Gen—Probe公司也發(fā)明了與基于核酸序列擴增原理 完全類似的轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增技術(shù)(Transcript ion Mediated Amplification簡稱 TMA) (Journal of clinical Microbiology, 35 (3) ， 676—8， 1997)，其與NASBA的核 酸擴增方法幾乎完全相同，只不過用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶替代雄V逆轉(zhuǎn)錄酶。TMA的擴增結(jié) 果是通過雜交保護測定(Hybridization Protection Assay,簡稱HPA)技術(shù)進行定性 檢測的。其它恒溫擴增技術(shù)，如鏈置換擴增(SDA)、基于螺旋酶的擴增(HDA)等都是類似的等溫擴增技術(shù)，這些技術(shù)所需的酶成本高昂，引物設(shè)計復(fù)雜，技術(shù)要求更高，相對應(yīng)的，其反應(yīng)檢測成本也很高。因此，在目前的實驗室研究及臨床檢測中所使用的核酸定量擴增檢測方法主要以實時熒光定量PCR為主。該方法是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個反應(yīng)進程，最后通過標準曲線進行定量分析。其熒光檢測模式分為 TaqMan熒光探針、TaqMan MGB熒光探針(在熒光探針分子3'端連接非熒光淬滅劑及 MGB基團(Minor Groove Binder),亦稱為MGB探針)、SYBR Green熒光染料、分子信 標(Molecular Beacon)探針禾口焚光共振能量轉(zhuǎn)移 (Fluorescence Resonance Energy Transfer,簡稱FRET)探針等。雖然實時熒光定量PCR方法的靈敏度和準確度較高， 但檢測成本相對昂貴，且檢測過程還需依賴特殊設(shè)備，因此，該技術(shù)在操作方法和檢 測成本上都有很大的局限性。如果待測樣品是RNA，還需將其利用反轉(zhuǎn)錄技術(shù)轉(zhuǎn)z變成 cDNA才能進行后續(xù)的PCR反應(yīng)，其試劑成本、技術(shù)要求和檢測時間等都大大地提高或 延長，靈敏度也不如DNA樣本檢測高。所以，RT—PCR雖然是目前最常見的用于RNA 樣本檢測的技術(shù)，但大規(guī)模檢測的推廣困難很大。國內(nèi)杜蓬(專利申請?zhí)?00410025890.8)等人于2004年提出了將等溫放大與 TaqMan熒光探針或TaqMan MGB熒光探針結(jié)合的方法(QD1A)，但其提出的檢測方法 依然使用終端檢測，雖然整個過程中無須打開反應(yīng)管，解決了其它方法所可能引起的 污染問題，但與實時熒光定量PCR相比，依然有很大的差距，而且該專利所提出的使 用TaqMan或TaqMan MGB作熒光探針，此類探針的設(shè)計需要特殊的軟件和很高的專業(yè) 知識，該專利申請并沒有提出具體的設(shè)計方法和探針序列實例。另外，該專利提出用 逆轉(zhuǎn)錄酶的外切酶酶活性來降解TaqMan熒光探針以產(chǎn)生熒光信號。但國內(nèi)外的文獻 中沒有有關(guān)這方面的報道，也沒有基于TaqMan或TaqMan MGB探針的利用恒溫放大技 術(shù)的產(chǎn)品或文獻報導(dǎo)。這是一個全新的思路。目前，在核酸診斷領(lǐng)域，還沒有將等溫 放大與檢測同步進行的相關(guān)技術(shù)報道或發(fā)明。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種將核酸的恒溫放大與檢測同步進行的檢驗方法。 本發(fā)明所提供的核酸恒溫同步放大檢測方法，可包括以下步驟 1)將含有下列組分的反應(yīng)物混合a. 待測核酸樣品；b. 引物l:該引物的3'端可與待測核酸樣品的3'端或靠近3'端處雜交， 5'端為啟動子序列；C.引物2:該引物可與待測核酸樣品負(一)鏈的3'端雜交；d. —種或多種熒光探針；e. 至少一種RNA依賴的DNA聚合酶(即反轉(zhuǎn)錄酶)；f. 至少一種可以識別所述啟動子序列的RNA聚合酶；2)將反應(yīng)物混合后，在密閉容器中進行恒溫放大反應(yīng)，并用檢測儀同步檢測反應(yīng)體系中熒光信號的變化，根據(jù)熒光信號變化的時間和強度對核酸樣品進行定量或定 性檢測。在上述核酸樣品的恒溫同步放大檢測方法中，步驟l)中的待測核酸樣品為RNA (包括mRNA、 rRNA等)或DNA樣品。所述啟動子序列為T7啟動子序列、T3啟動子序列、M13啟動子序列或SP6啟動 子序列。若待測核酸樣品為RNA,所述待測核酸樣品的(一)鏈由反應(yīng)中產(chǎn)生；若待測核 酸樣品為雙鏈DNA，所述待測核酸樣品的(一)鏈己存在于待測核酸樣品中，該(一) 鏈也可由反應(yīng)中產(chǎn)生。所述熒光探針可根據(jù)已有的技術(shù)知識和實驗條件選自以下一種或幾種類型探針 的任意組合分子信標(MolecularBeacon)、熒光共振(iFret)、蝎子探針(scorpin probe)、熒光放大(Amplafluor)和分子火炬(molecular torch)。所述探針序列 可以根據(jù)待測核酸樣品和按照本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法進行設(shè)計。所述RNA依賴的DNA聚合酶(即反轉(zhuǎn)錄酶)，具休來講可為畫LV逆轉(zhuǎn)錄酶或旭V 逆轉(zhuǎn)錄酶。所述RNA聚合酶為T7、 T3、 M13或SP6 RNA聚合酶。所用的RNA聚合酶是與所述 啟動子序列相對應(yīng)的RNA聚合酶。所述反應(yīng)物可分為第一階段反應(yīng)物(除了e和f反應(yīng)酶之外的所有組分)和第二 階段酶反應(yīng)物(包含e和f反應(yīng)酶)，所述第一階段反應(yīng)物中還可包含有Tris、 KC1、 MgCl2、NTPS、dNTPs、甘油和DMS0，所述第一階段反應(yīng)物的組分具體可為10-50mM Tris， 20-90mM KC1， 10-50mM MgCl2， 0. 1-lOmM NTPS，。.卜10mM dNTPs， 5-40% (V/V)甘 油(Glycerol) ， 0-25% (V/V) DMS0， 0.1-2uM引物1， 0. l-2uM引物2， 0.1-2 yM熒光探針；所述第二階段酶反應(yīng)物中還可包含有Tris、 Triton X-100、 KC1、 EDTA、 DTT和甘油，所述第二階段酶反應(yīng)物的組分具體可為100-9000U RNA依賴的DNA聚 合酶(即反轉(zhuǎn)錄酶)，100-5000URNA聚合酶，20-lOOmMTris， 0. 1-1% (V/V) Triton X-100， 30-300rnM KC1， 0. 01-0. 5mM EDTA， 0.卜2mM DTT， 20-50% (V/V) 甘油。步驟2)中的恒溫放大反應(yīng)條件可為先將除e和f反應(yīng)酶外的第一階段反應(yīng)物 充分混合，在55-9(TC下溫育2-30分鐘后，再在42-55'C下溫育2-30分鐘，在此過程中加入第二階段酶反應(yīng)物，由此開始在42-55'C下繼續(xù)溫育30-120分鐘，用檢^J儀 同步記錄熒光信號的變化，根據(jù)熒光信號產(chǎn)生的時間和強度對待測樣品進行定量或定 性檢測；所述第一階段反應(yīng)物與第二階段酶反應(yīng)物的體積比可為1-50: 1。所述用于檢測熒光信號的檢測儀的選擇是多種多樣的，優(yōu)選為AB1 7000、 7300、 7500、 7700、 7900系列，Stratagen MPX3000系列和Bio-Rad IQ系列等。本發(fā)明的另一個目的是提供一種核酸恒溫同步放大檢測試劑盒。本發(fā)明的試劑盒，可包括以下作為反應(yīng)物的組分a. 待測核酸樣品；b. 引物l:該引物的3'端可與待測核酸樣品的3'端或靠近3'端處雜交， 5'端為啟動子序列；C.引物2:該引物可與待測核酸樣品負(_)鏈的3'端雜交；d. —種或多種熒光探針；e. 至少一種RNA依賴的DNA聚合酶(即反轉(zhuǎn)錄酶)；f. 至少一種可以識別所述啟動子序列的RNA聚合酶。在上述試劑盒中，所述反應(yīng)物組分可分為第一階段反應(yīng)物(除了e和f反應(yīng)酶之 外的所有組分)和第二階段酶反應(yīng)物(包含e和f反應(yīng)酶)，所述第一階段反應(yīng)物中 還可包含有Tris、 KC1、 MgCl2、 NTPS、 dNTPs、甘油和DMS0，所述第一階段反應(yīng)物的 組分具體可為10-50mMTris， 20-90mMKCl， 10_50mMMgCl2， 0. 1-10mMNTPS， 0. 1-10mM dNTPs， 5—40% (V/V)甘油(Glycerol) ， 0-25% (V/V) DMS0， 0.1-2uM引物1， 0. 1-2uM引物2， 0. l-2uM熒光探針；所述第二階段酶反應(yīng)物中還可包含有Tris、 Triton X-100、 KC1、 EDTA、 DTT和甘油，所述第二階段酶反應(yīng)物的組分具體可為 100-9000URNA依賴的DNA聚合酶(即反轉(zhuǎn)錄酶)，100-5000U RNA聚合酶，20-100禮 Tris， 0.1-1% (V/V) TritonX-100， 30-300mMKCl， 0. Ol-O. 5mMEDTA， 0. l-2mMDTT， 20-50% (V/V) 甘油。本發(fā)明提供一種核酸的恒溫同歩放大檢測方法，是一種新的核酸同步等溫擴增 (Simultaneous Amplification and Testing, 簡稱SAT)方法。該方法采用反轉(zhuǎn)錄 酶和RNA聚合酶與分子信標(molecular Beacon)、熒光共振(iFret， Fret)，蝎 子探針(Scorpion probe)、熒光放大(A即lifluor)或分于火炬技術(shù)(Molecular Torch) 等熒光檢測技術(shù)相結(jié)合，將待測樣品、兩種引物、反轉(zhuǎn)錄酶、RNA聚合酶以及一種或 組合熒光探針混合共同反應(yīng)，并在核酸恒溫放大的同時，實現(xiàn)對核酸樣本的同步定性 或定量檢測。該方法的檢測原理如圖l所示，即將第一引物與待測核酸的3'端雜交， 第一引物的5'端含有RNA聚合酶啟動子序列；第二引物與待測核酸樣品的互補鏈(由第一引物利用待測核酸為模板，經(jīng)過引物延伸而產(chǎn)生)雜交，利用該互補鏈為模t及進 行新一輪引物延伸，從而產(chǎn)生一條帶有雙鏈DNA順序的啟動子序列，以此為模板，由 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄更多的與第二引物互補的RNA產(chǎn)物，第二引物再以此為模板，經(jīng)由第 二引物延伸產(chǎn)生與之互補的cDNA鏈；隨后，第一引物再以此cDNA為模板進行新一輪 的引物延伸而形成帶有啟動子的雙鏈DNA序列；然后，再以所產(chǎn)生的新的雙鏈DNA為 模板進行新一輪轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，產(chǎn)生更多的負鏈RNA。在反應(yīng)體系中，同時含有與此負鏈 RNA互補的熒光探針(如分子信標等)；隨著負鏈RNA的增加，與之雜交的熒光探針 的數(shù)量也隨之增加；最后，通過檢測熒光量的變化，達到實時檢測的目的，所有反應(yīng) 在同一體系中、同一溫度下同步進行。本發(fā)明的核酸檢測方法明顯優(yōu)于現(xiàn)有的核酸檢 測技術(shù)，主要優(yōu)點如下-1. 低污染由于采用封閉式的恒溫放大檢測系統(tǒng)，整個過程中無須打開反應(yīng)體 系，因而避免了擴增子的污染；2. 多種檢測方法可供選擇現(xiàn)有的熒光檢測技術(shù)均適合于本發(fā)明的檢測方法， 使用者可以根據(jù)自己的經(jīng)驗或已有的技術(shù)知識和實驗條件，從多種熒光信號的檢測方 法中任意選擇；3. 快速檢測將核酸的擴增與檢測在同一封閉體系中同步進行，而且整個過程 中沒有溫度的升降溫循環(huán)，因而所需時間大大縮短；4. 設(shè)備簡單與實時熒光定量PCR相比，本發(fā)明所用的儀器無須升降溫循環(huán)， 因而設(shè)計和生產(chǎn)成本大幅降低.綜上所述，本發(fā)明的方法具有污染低、反應(yīng)過程溫度恒定、檢測靈敏度高、檢測 速度快、對儀器設(shè)備要求低和成本低的優(yōu)點，適用于臨床檢驗、血液篩査、食品安全 檢査及環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域中的核酸檢驗，適合大面積推廣和應(yīng)用。下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。 說明書附1為本發(fā)明核酸的恒溫同步放大檢測方法的原理圖 圖2為用本發(fā)明的方法對淋球菌RNA的檢測結(jié)果 圖3為用本發(fā)明的方法對艾滋病毒(HIV-1) RNA的檢測結(jié)果 圖4為用本發(fā)明的方法對乙肝病毒(HBV) DNA的檢測結(jié)果具體實施方式
下述實施例中所用試劑和方法如無特別說明均為常規(guī)試劑和方法。所有引物、分 子信標及熒光探針序列均由美國ValueGene，BioNeer和Allele Biotech公司合成。 實施例1、細菌RNA的檢測以淋球菌RNA的檢測為例，用本發(fā)明的方法對細菌RNA進行定量檢測，具體方法 包括以下步驟-一、 淋球菌RNA的提取取淋球菌(ATCCNO. 19424)的過夜(12-24小時)培養(yǎng)物，用Invitrogen公司 的Trizol試劑盒提取淋球菌RNA。二、 引物l、引物2及分子信標的設(shè)計根據(jù)淋球菌U^'"eria w/ orr/ oa3e)的16s rRNA序列(LOCUS #X07714，序列 表中的序列l(wèi))設(shè)計了一個5'端為T7啟動子序列的引物1和不帶啟動子的引物2， 以及分子信標的序列，序列如下引物1: 5' — AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGATCTCAGACCCGCTACTGATCGTCGCCTTG一 3 ， (帶下劃線堿基為T7啟動子序列，可更換為T3啟動子序列、M13啟動子序列或SP6 啟動子序列，相應(yīng)地下述第二階段酶反應(yīng)物組分中的RNA聚合酶也應(yīng)更換為T3 RNA 聚合酶、M13 RNA聚合酶或SP6 RNA聚合酶)； 引物2: 5， — CCTTCGGGCCTTGCGCTATCCGAG—3，;分子信標5， 一GCACCGGCCGAUAUa]GAUUAGCUGGUUGGCGGUGC—3' ， 5，端標記的熒光 基團為(F雄6-羧基熒光素(6-carboxyfluorescein) ) ， 3'端標記的淬滅基團為 Dabcy]4 (4-甲基氨基苯基偶氮)-苯甲酸(非熒光基團)。三、 反應(yīng)體系第一階段反應(yīng)物的組分50raMTris， 35mMKCl， 20mMMgCl2, 4mMNTPS， lmMdNTPs， 10% (V/V)甘油，5% (V/V) DMS0， 0.5uM引物1， 0.5uM引物2， 0.5wM分子信標。第二階段酶反應(yīng)物的組分2000U麗LV反轉(zhuǎn)錄酶(美國RD Biosciences公司)， 2000U T7 RNA聚合酶(美國RD Biosciences公司)，20mMTris， 0.5% (V/V) Triton X-100， 30rnM KC1， 0. lmM EDTA， 0. 3mM DTT， 25% (V/V) 甘油。四、 檢測先將除反應(yīng)酶外的第一階段反應(yīng)物充分混合，再將50 u 1第一階段反應(yīng)物混合液 加入到200ul的PCR反應(yīng)管(平行做四管)中，然后按設(shè)計稀釋度分別加入不同量的 淋球菌RNA (lug、 10ng、 100fg、不加RNA(O))充分混合，在6(TC (55-9Q。C均可) 下溫育5min (2-30min均可)后，再在42°C (42-55。C下)下溫育5min (2-30min)， 在此過程中加入10ul第二階段酶反應(yīng)物，由此開始在42'C (42-55"C均可)下繼續(xù)溫 育60min (30-120min均可)，用上海宏石實時熒光定量PCR (Slan)儀同步檢測，熒 光信號每隔1分鐘收集一次，記錄熒光信號的變化量。五、結(jié)果熒光信號的檢測結(jié)果如圖2所示(橫坐標為反應(yīng)時間，縱坐標為相對熒光吸收值)，加入不同濃度的淋球菌RNA在不同時間(Ct)產(chǎn)生高于背景的熒光信號，稀釋度越高(濃 度越低)，則產(chǎn)生高于背景的熒光信號所需反應(yīng)時間(Ct)越長，即待測樣本的濃度與 Ct(產(chǎn)生高于背景的熒光信號所需的反應(yīng)時間)成反比。未加入淋球菌RNA的樣品(陰性 對照)在反應(yīng)結(jié)束時(Ct〉60分鐘)，沒有產(chǎn)生高于背景的熒光信號,只有背景熒光〗言號。 上述檢測結(jié)果表明本發(fā)明的方法可用于細菌RNA的擴增與定性或定量的同步檢測。實施例2、病毒RNA的檢測以艾滋病毒(HIV-1) RNA的檢測為例，用本發(fā)明的方法對病毒RNA進行定量檢測， 具體方法包括以下步驟一、 艾滋病毒(HIV-1) RNA的獲得提純的艾滋病(H工V-1)病原體RNA的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物由美國RD Biosciences公司 提供，其產(chǎn)品說明書同時提供了RNA的含量和序列。二、 引物l、引物2及熒光探針的設(shè)計根據(jù)艾滋病病原體(HIV-1) RNA的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物序列設(shè)計了一個5'端含有T7 啟動子序列的引物1和不帶啟動子的引物2，以及熒光探針的序列，序列如下 引物l: 5' — AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGACCATCTGTTTTCCATAATCCCTAATGATC—3， (帶下劃線堿基為T7啟動子序列，可更換為T3啟動子序列、M13啟動子序列或SP6 啟動子序列，相應(yīng)地下述第二階段酶反應(yīng)物組分中的RNA聚合酶也應(yīng)更換為T3 RNA 聚合酶、M13 RNA聚合酶或SP6 RNA聚合酶)； 引物2: 5， 一ACAGAGATCCACTTTGGAAAGG—3，；熒光探針5' Fara-GCACCAAACUACUCUGGAAAGGUGAAGGUGC-Dabcyl-3， ， 5， 端標記的 熒光標記基團為6-羧基熒光素(6-carboxyfluorescein， 6-FAM) ， 3，端標記有 Dabcyl(即4(4-甲基氨基苯基偶氮)-苯甲酸(非熒光基團)。三、 反應(yīng)體系第一階段反應(yīng)物的組分25fflMTris, 20mMKCl， 10mMMgCl2， 5mMNTPS， lmMdNTPs， 5% (V/V)甘油，0. lyM引物l， 0. luM引物2， 0. lyM分子信標。第二階段酶反應(yīng)物的組分2000U應(yīng)LV反轉(zhuǎn)錄酶(美國RD Biosciences公司)， 2000U T7 RNA聚合酶(美國RD Biosciences公司)，20raMTris， 0.1% (V/V) Triton X-100， 30rnM KC1， 0. OlmM EDTA， 0. lmM DTT， 50% (V/V) 甘油。四、檢測先將除反應(yīng)酶外的第一階段反應(yīng)物充分混合，再將30 H 1第一階段反應(yīng)物混合液 加入到200ul的PCR反應(yīng)管(平行做四管)中，然后按設(shè)計稀釋度分別加入不同量的 艾滋病病原體UIIV-1) RNA的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(lug、 10ng、 100fg、不加RM(O))充 分混合，在55。C (55-90'C均可)下溫育30min (2-30min均可)后，再在42°C (42-55 。C下)下溫育30min (2-30min)，在此過程中加入10ul第二階段酶反應(yīng)物，由此開 始在42。C (42-55。C均可)下繼續(xù)溫育120min (30-120min均可)，用AB1 7500實時 熒光定量PCR儀同步檢測，熒光信號每隔1分鐘收集一次，記錄熒光信號的變化量。 五、結(jié)果熒光信號的檢測結(jié)果如圖3所示(橫坐標為反應(yīng)時間，縱坐標為相對熒光吸收《直)， 加入不同濃度的艾滋病病原體(HIV-1) RNA的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在不同時間(Ct)產(chǎn)生高 于背景的熒光信號，稀釋度越高(濃度越低)，則產(chǎn)生高于背景的熒光信號所需反應(yīng) 時間(Ct)越長，即待測樣本的濃度與Ct(產(chǎn)生高于背景的熒光信號所需的反應(yīng)時間) 成反比。未加入艾滋病病原體(HIV-1) RNA的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(陰性對照)的樣品在反 應(yīng)結(jié)束時(Ct〉60分鐘)，只有背景熒光信號。上述檢測結(jié)果表明本發(fā)明的方法可用于 病毒RNA核酸的擴增與定性或定量的同步檢測中。實施例3、 DNA的檢測以乙肝(HBV)病毒DNA的檢測為例，用本發(fā)明的方法對DNA進行定量檢測，具 體方法包括以下步驟一、 HBV病毒DNA的獲得帶有克隆的HBV病毒DNA的質(zhì)粒由美國RD Biosciences公司提供，其產(chǎn)品說明 書同時提供了質(zhì)粒DNA的含量和克隆的HBV病毒DNA序列(序列表中的序列3)。二、 引物l、引物2及熒光探針的設(shè)計根據(jù)HBV病毒的DNA序列設(shè)計了一個5'端為T7啟動子序列的引物1和不帶啟動 子的引物2，以及熒光探針的序列，序列如下-引物1: 5' — AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCACGTGTCCTGGCCAAAATTCGCA一 3 ， (帶下劃線堿基為T7啟動子序列，可更換為T3啟動子序列、M13啟動子序列或SP6 啟動子序列，相應(yīng)地下述第二階段酶反應(yīng)物組分中的RNA聚合酶也應(yīng)更換為T3 RNA 聚合酶、M13 RNA聚合酶或SP6 RNA聚合酶)； 引物2: 5， 一CAGCGATAGCCAGGACAAATTGGAGGAC—3';熒光探針5， Fam-GCACCAAGAGGUUGGUGAGUGAUUGGAGGUUGGUGC-Dabcyl-3' ， 5' 端標記的熒光標記基團為6-羧基熒光素(6-carboxyfluorescein， 6-FAM) ， 3'端標記有 Dabcyl(即4(4-甲基氨基苯基偶氮)-苯甲酸(非熒光基團)。三、 反應(yīng)體系第一階段反應(yīng)物的組分30mMTris， 50mMKCl， 50mMMgCl2, lmMNTPS， 10mMdNTPs， 40% (V/V)甘油，1.5nM引物l， 1.5uM引物2， 0. 5uM分子信標。第二階段酶反應(yīng)物的組分9000U麗LV反轉(zhuǎn)錄酶(美國RD Biosciences公司)， 5000U T7 RNA聚合酶(美國RD Biosciences公司)，100mMTris， 1% (V/V) Triton X-100， lOOmM KC1， 0. 5 mM EDTA， 2mM DTT, 50% (V/V) 甘油。四、 檢測先將除反應(yīng)酶外的第一階段反應(yīng)物充分混合，再將40ii 1第一階段反應(yīng)物混合液 加入到200ul的PCR反應(yīng)管(平行做四管)中，然后按設(shè)計稀釋度分別加入不同量的 HBV病毒DNA (lug、 10ng、 100fg、不加薩(O))充分混合，在90。C (55-9(TC均可) 下溫育2min (2-30min均可)后，再在55°C (42-55。C下)下溫育2min (2-30min)， 在此過程中加入10ul第二階段酶反應(yīng)物，由此開始在55'C (42-55'C均可)下繼續(xù)溫 育30min (30-120min均可)，用ABI 7500實時熒光定量PCR儀同步檢測，熒光信號 每隔1分鐘收集一次，記錄熒光信號的變化量。 五、結(jié)果熒光信號的檢測結(jié)果如圖4所示(橫坐標為反應(yīng)時間，縱坐標為相對熒光吸收值)， 加入不同濃度的HBV病毒DNA在不同時間(Ct)產(chǎn)生高于背景的熒光信號，稀釋度越 高(濃度越低)，則產(chǎn)生高于背景的熒光信號所需反應(yīng)時間(Ct)越長，即待測樣本的 濃度與Ct (產(chǎn)生高于背景的熒光信號所需的反應(yīng)時間)成反比。未加入HBV病毒DNA(陰 性對照)的樣品在反應(yīng)結(jié)束時(Ct〉60分鐘)，只有背景熒光信號。上述檢測結(jié)果表明 本發(fā)明的方法可用于DNA耙標的擴增與定性或定量的同步檢測中。序列表<160〉 3〈210〉 1<211〉 1544〈212〉 腿<213〉 淋球菌(Afej.weWs ^o"orr力oese)〈400〉 1ugaacmiaagaguuugauccuggcucagau卿acgcuggcggcaugcuuuaca^caugca60agucggacggcagcacaggg犯gcuugcuucucggguggcg卿ggcgaacggguga,gtm120已canaucggaacgimccggg卿cgggggau肌cugaucga^agaucagc180uacgucuugagaggga犯gccgggccuugcgcuauccgagcggccgauan240cugauua.gcugguuggcgggguaaaggcccaccaeiggcgacgaucaguagcggguc卿g300已gg肌gauccgccacacugggscugagacacggcccagacuccimcgggaggcagcagug360ggg纖u皿gg3camigggcgcaagccugauccagccmigccgcgugucug犯g肌ggcc420uucggguuguaaaggacuuuuguc鄉(xiāng)ga^gaaaaggcuguugccaaimucggcggccga480ugacgguaccgcaccggcuaacimcgugccagcagccgcg540gggugcg,gUU犯UCgg3auuacugggcguaaagcgggcgcagacgguuscuuaagca.600uccccgggcuca^cccggg3MUgCgUUCUg犯cugggugacucgagugu660guc卿gg印gguggaauuccacguguagc3gugaaaugcguagagauguggaggaauac720ggcagccucccugacguucauguccga^agcguggguagc780aaax:agg8uuagauacccuggimguccacgcccima^cgaugucaammgc卿ugggca8403cuugaxmg-cuuggimgcguagcuaacgcgugaaauugaccgccuggggsguacggucgc900cucaaaggaauugacggggacccgcacaagcggugg肌gauguggaim犯960uucgaugcaacgcgaag￡Laccuimccugguuuugacaugugcggaauccuccgg卿cgg10203gg卿gCCUucgggagccgua^cacaggugcugcauggcugucgucagcUCgUgllCgllg1080卿uguuggguua^gucccgcaacgagcgc3acccuuguca皿aguugccaucauucggu1140ugggc已cucuaaugagacugccggugaca3gccggagg犯acgucaeigiic1200cucauggcccuuaugdcca.gggcuucacacggucgguacagaggg卿cc1260aagccgcgaggcggagccaaccgancguaguccggauugcscucugcaax:.1320ucg3gugcaugaagucggsaucgcuaguaaucgcaggucagcauacugcggugaaimcgu1380ucccgggucuuguacacaccgcccgucacaccaugggaguggggg扁ccagaaguaggu1440鄉(xiāng)gu獄cgca^ggaguccgcuuaccacggimugcuuca卿cuggggugaagucguaa1500c犯gguagccgusgggg認cugcggcuggauc3ccuccuuucu1544<211> 9732<212〉 RNA<213〉艾滋病毒(HIV-1)〈400〉 2ugg卿ggcu^gaganccc卿腦g卿60cuc犯ggcuucuucccugaAiuggC3aaacugccagggacc8g3UUCCC3C120uguguuuuggauggugcuucaagcuagU6iccaguugaucc鄉(xiāng)卿ggua180aa3caacugccuguuac3ccccmigagccagcmigg肌imgajjgacaeicg240gcugaugugg肌guuugacagcucccuagcaxmgcccgag300aacugcguccaa^gscugc,ugacasag犯guuucimacimggacuuccgc360uggggac週uccaggggagguguggccgggg郷卿ugggg卿ggcua6LCCCUC8Lgmi420agcagccgcuuuucgcuuguacugggucucucuuggu已gaccaggucgag480cccgggagcucucuggcuagca^ggg犯cccscugcuua33gccucaauaaagcuugccu540ugcccgucugUgUU3gg3CUcuagua^cim印gaiicccuc600agacc3cucugcaguggcgcccg,鄉(xiāng)gacuugaaagc660aagcg犯aguuccagagdaguucucucgacgcuggacucg720gcuugc,gguacacacagca卿ggcgagagcggcgaacuggimaguacgccsammu780ugetcuagc3gaagcii3ga^ggag卿g肌gggugcg卿gcguc8guaxiu犯guggggga840aamiimgaugaainicgguuacggccaggaggaaagaaaaB900a^caimuagimugggcaagcagagaguuaCgCUim￡LCCCuggccucuua960gaaacagcagaaggaugucagaacaguuacaguca^cucucaag8cagg31020ucagaagaacguaguaacccucuggugcguacaccaaagg1080a^gac8cca^ggaagcuucaaggaaguaca犯agaagagc1140cacagcaggcagcagcuggcaca.ggaagcagcagcaaagucagcceiaaau1200acaagggcaamigguacauc鄧ccuuuauc￡LCCU￡Lg￡iaCU1260cugaangcaAigggu,aguaguagaggaaa^gguuuuaacccagaagu6tmmccc3ug1320iiLicucaigcaiiu肌c卿ggg3gCC3CCCC3anaugaugcuaaauauagug1380ggggg織ccaggcagcaaugcagauguuaaaag肌dccauc已migaggaagcugcagaa1440ugggau鄉(xiāng)uimcacccaguacaugcaggaccuauuccaccaggccagaugaagcggcaa1500cc肌gggg犯gugacauagc6Lgg犯CUaCUagu&cccuuc1560C3ccuauccc聊ggg卿cgguggaimmiCCUggg3LUlg1620uagcccuguuggcmniuugg1680gagcccuuc已agacagguuuumi atacticucagagcggaacaagcuacs1740caggaggu犯aaaacuggaugac已gaaaccuuguuaguccuccagacugu1800aaguccamiuaggaac鄉(xiāng)agcuacaiumgaagaaaugai1gacagcaugc函caggg卿ggccauaaggca鄧ggu謂ggcugaggca^ug恥ccauguu1920auauaaugaugcagagaggc肌uuuu肌gguccagaaaagaa皿aagugc1980Lmcaacuguggc肌卿aggacaccuagccagaaauugcdgggccccuag2040gugggca卿3ggacmica^augaaagacugcacugggag^caggcu犯u2100uuuuimggcauuccsacaagggaaggcc已gggamiuuuccucagagcaga2160acagagccaacagcccc8ccuggggg肌ggggg卿卿u^ccuccuuc2220cugaagcaggagcagaaagacaaggagcanccugcuccuucaguuucccuca肌ucacuc2280uuuggcaacga^ccccuuguuua_gg￡igg3ca_guuaaBa^agcucuauimg2340auacaggagcagaugaimcagccaggaaaauggaaaccaa2400aaauganaggggga醒ggagguuuuancaagguaaggcaauaugaucagaxiacuugusg2460daauuuguggaaaaaaggcuauagguacag￡tCCUaC￡LCCU2520uugga^cga^L3imuguug￡tcuC3ganugguuguacuuuaaauuucccaguuaguccuauug25803cacuguaccaguaa^axiuaa^gccaggaauggaugg已cccaguggccau2640ugacag肌g3a^miuugua^ag3gaugga^gaggaaggaa27003a^uuuca￡igaauugggccugaggmiccauac肌imcuccaaumiuugcu2760aggscagcacaaauuaguagauuucagagagcucaau3a^agaacucagg2820eicuuuugggaaguucaauuaggaaueiccgcauccagcagg2880uaaca^guacu聊UgUggg3gaugeauauuUUUCElgUUCCuuuagaugaggacuuuagaa29403gu肌ax:ugcacaaugagacaccaggaaucagmiaucagu3000ac犯ugugcuaccucagggaugga卿g肌C3ccagcaauamiccagaguagcaugacaa30603amicuuagagcccuauagaumicuancaauacauggaug3120auuuguuggu3ggaucugacuueLga^aimggacagcacaga^gca肌a^uagagg已gcuaa3180gagcucaucu肌ugagcuggaaggaaccuc3240cmiuccuuugga^cuccmiccug3C3gaiigccuaua^gasc3300ugccagaa犯agacagcuggacugucaanga皿aguggga3360肌uuuaugc3ggg謹肌ggua肌gca^cuguguaaacuc置郷ggag3420aacagacguaguaccacugacugaag犯gcuuggc卿ga3480acaggg卿uucusaaaa^ccccugugcaugugacccauca3540gggcaggacc犯uggacaxmcaagagccau3600gaa犯aggucugcuca_c￡tcuaanganguaa3660gscaacuaaca,g犯guggugccacag肌ggcaimguamia_ugggg犯,3720uag3cuacccaaacauggg3a_acaiuggugg3780ggc鄉(xiāng)cimccuggauuccuga^uggg卿uuguuaaimccccuccucua3840ggimcc肌uugagcag卿cuuucuaugu3g肌ggggcau3900gcagu鄉(xiāng)gaggimugucaccga^ag8ggaagacaaaagg3960imguuucccuaacugagacaacaaauc犯a3gacugaamiacaugca^uccmiuu3gccu4020UgC3gg￡LUUC3ggaucaga^giiga_ax^ua_guimgg犯uc34080uucmigcaca已ccagacagg3gugaauc3ga^gu￡igucaagagg鄉(xiāng)u犯4140aa犯gucuaccuguca,ugggugccagcacac卿ggg肌uggaggaaaug4200imamiuggucucagg肌ggugcuguucuua4260auaaggcucaetgaagaacauga^ag已imucacagc肌uuggagaacaauggcuaguga皿4320uaguagccaacugugau犯auguca^cuaa4380aaggggaagcaaugcanggac犯guaggcuguaguccagga^umiggca^皿agauugca4440CacaUCUSg6taggaaaagucaUCCUggUELgcaguccacguggccaguggauanauagaag4500C6ig^guumicccagcagaaacaggacaggaa￡icagca.uaCUUUCUgCU￡L8a^uu3gcag4560<formula>formula see original document page 16</formula>cugagaaAicu uciuguac uguucuanag gaacaguaug agacaauagu miugu卿gg gaaccaugga ggauguggca guaimucaag aaaccuuc8g miaaaguagu uggaimga.ga c鄉(xiāng)aggcac cuggimuagu ugcaacuc3ccuaaiigugcc ugacaugggugggcaagucu uaaugauagu au已gag而ag aacccgac鄧 ugcgauuagu ucagcimcca gcaagggacu gggggc郷a cgggguggac U3ccimga^g cgaagaguag cagcaacaga guaguaaim.ucuuuug肌cu aga肌agaca ggcaaaacua agcuaguacc ugmmcsccc 8guuug已cag 犯gacugcugguggccggggC8gacccucc 肌caggagac gaauga^cu cuuuca^cc3 gg肌uuuuuc ggggcuuaau gg卿usggaaccaggaggaaa^aagagca umigggcgca gcaacagcaa agucuggggc uca^gguuc cuggaacucc 卿gugggag gcagaaccag guggaauugggcagggmmc acccgaagga gagcggauuc ccgcuugaga g卿cggggg卿uaggguu aaucagacag caaaguagga agg卿agga gaaAiaaugcu cuuuccagucU￡LgCUUCUUUag3gmiccuu cacaccaggg aguugaucuaCELUgagCC3gcucccimgca ac犯agaaguagg卿uggg肌aacaggag uua肌gceigg cccucaggag imuugc肌usccacuaggaa gugggacuag gcgucaaima dacgammgccuaggacuuu acuuggaguacagga已a犯a uuugacmiau anagguuuaaUC3CCUUUgUaucga^g犯g uuagcucuug gacuucaucu 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3ctccaca^cattccaccaagct.ctgctagatcctgctggtggctccagttccggaacagt60aaaccctgttccgactactgcctcacccatatcgtcetatcttctcgaggactggggaccc120tgcaccgaacatgg卿gc3attcctaagacccctgctcgtgttacaggc180ggggtttttcttgttgacaa^gaatcctcacaataccacagagtctagactcgtggtggac240ttctctcaattttct郷gggagcacccacgtgtcctggccaa肌ttcgcagtccccaac300ctccaatcactcaccaacctcttgtcctccaatttgtcctggctatcgctggatgtgtct360gcggcgttUatcatattcctcttcatcctgctgctatgcctcatcttct"tgttggttct420tctggactaccaaggtatgttgcccgtttgtcctctacttccaggaacatcaactaccag480cacgggaccatgcaagacctgC3Cg6LttCCtgctcaaggaacctctatgtttccctcttg540ttgctgtacaa,aaccttcggacgga^ctgcacttgtattcccatcccatcatcctgggc600tttcgca犯attcctatgggagtgggcctcagtccgtttctcctggctcagtttactagt660gccatttgttcagtggttcgcagggctttcccccactgtctggctttcagttatattgat720g3tgtggt3ttgggggCCMcatcttgagtccctttttacctxtattacc780aattttcttttgtctttgggtatacatttgaaccctaatattggggctac840tcccttaacttcatgggatatgtaM"tgga已gttggggtactttaccacaggaacatatt■ttaagcaatgttttcgg犯actgcctgtaatgattggaaa960gt已tgtc肌ag犯ttgtgggtcttttgggctttgctgccccttttacacastgtggctal1020cctgccttgatgcctt.tatatgcatgtataca&tctaaacaggccttcactttctcgcca1080acttacaaggcctttctgtg"t 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1、核酸的恒溫同步放大檢測方法，包括以下步驟1)將含有下列組分的反應(yīng)物混合a.待測核酸樣品；b.引物1該引物的3’端可與待測核酸樣品的3’端或靠近3’端處雜交，5’端為啟動子序列；c.引物2該引物可與待測核酸樣品負鏈的5’端雜交；d.一種或多種熒光探針；e.RNA依賴的DNA聚合酶；f.至少一種可以識別所述啟動子序列的RNA聚合酶；2)將反應(yīng)物混合后，在密閉容器中進行恒溫放大反應(yīng)，并用檢測儀同步檢測反應(yīng)體系中熒光信號的變化，根據(jù)熒光信號產(chǎn)生的時間和強度對樣品進行定量或定性檢測.。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟l)中的待測核酸樣品為RNA或DNA。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟l)中的啟動子序列為T7啟動子序列、T3啟動子序列、M13啟動子序列或SP6啟動子序列。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟l)中的熒光探針選自以下一種或幾種類型探針的任意組合分子信標、熒光共振、蝎子探針、熒光放大和分子火炬。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟l)中的所述RNA依賴的 DNA聚合酶為麗LV逆轉(zhuǎn)錄酶或AMV逆轉(zhuǎn)錄酶。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟l)中的RNA聚合酶為 T7、 T3、 M13或SP6 RNA聚合酶。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1一6任一項所述的方法，其特征在于所述步驟l)中的反應(yīng) 物分為第一階段反應(yīng)物和第二階段酶反應(yīng)物，所述第一階段反應(yīng)物中還包含有Tris、 KC1、 MgCl2、 NTPS、 dNTPs、甘油和DMS0，所述第一階段反應(yīng)物的組分具體為10_50mM Tris， 20-90mM KC1， 10-50mM MgCl" 0. 1-10函NTPS， 0. 1-IO慮dNTPs， 5-40%甘 油，0-25% DMSO， 0. l-2nM引物1， 0.卜2yM引物2， 0. l-2 y M熒光探針；所述 第二階段酶反應(yīng)物中還包含有Tris、 Triton X-100、 KC1、 EDTA、 DTT和甘油，所述 第二階段酶反應(yīng)物的組分具體為100-9000U RNA依賴的DNA聚合酶，100-5000U RNA聚合酶，20-100mM Tris， 0.1-1% Triton X-100， 30-300rnM KC1， 0. 01-0. 5mM EDTA， 0. 1-2mM DTT， 20-50%甘油。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述步驟2)中的恒溫放大反應(yīng)條 件為先將第一階段反應(yīng)物充分混合，在55-9(TC下溫育2-30分鐘后，再在42-55'C 下溫育2-30分鐘，在此過程中加入第二階段酶反應(yīng)物，由此開始在42-55'C下繼續(xù)溫 育30-120分鐘，用檢測儀同步記錄熒光信號的變化，根據(jù)熒光信號產(chǎn)生的時間和強 度對待測樣品進行定量或定性檢測；所述第一階段反應(yīng)物與第二階段酶反應(yīng)物的體積 比為1-50: 1。
9、 根據(jù)權(quán)利要求1 —6任一項所述的方法，其特征在于所述檢測儀為AB1 7000、 7300、 7500、 7700、 7900系列，Stratagen MPX3000系列或Barad iQ系列。
10、 權(quán)利要求1一9任一項所述的方法在臨床檢驗、血液篩查、食品安全檢查及 環(huán)境監(jiān)測中的核酸檢測中的應(yīng)用。
11、 一種核酸恒溫同步放大檢測試劑盒，包括以下作為反應(yīng)物的組分a. 待測核酸樣品；b. 引物l:該引物的3'端可與待測核酸樣品的3'端或靠近3'端處雜交， 5'端為啟動子序列；C.引物2:該引物可與待測核酸樣品負(一)鏈的3'端雜交；d. —種或多種熒光探針；e. 至少一種RNA依賴的DNA聚合酶(即反轉(zhuǎn)錄酶)；f. 至少一種可以識別所述啟動子序列的RNA聚合酶。
12、 根據(jù)權(quán)利要求ll所述的試劑盒，其特征在于所述反應(yīng)物組分分為第一階 段反應(yīng)物和第二階段酶反應(yīng)物，所述第一階段反應(yīng)物中還包含有Tris、 KC1、 MgCl2、 NTPS、 dNTPs、甘油和匿SO,所述第一階段反應(yīng)物的組分具體為10-50raM Tris， 20-90mM KC1， 10-50mMMgCl2， 0. 1-lOmMNTPS， 0. 1-lOmM dNTPs， 5-40%甘油，0-25% DMSO， 0. l-2uM引物l， 0. l-2uM引物2， 0. 1-2uM熒光探針；所述第二階段酶反應(yīng)物中 還包含有Tris、 Triton X-100、 KC1、 EDTA、 DTT和甘油，所述第二階段酶反應(yīng)物的 組分具體為100-9000U RNA依賴的DNA聚合酶，100-5000U RNA聚合酶，20-100mM Tris， 0. 1-1% TritonX-100， 30-300慮KC1， 0. Ol-O. 5raMEDTA， 0. 1-2mMDTT， 20-50%甘 油。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種核酸的恒溫同步放大檢測方法及其應(yīng)用。該方法包括以下步驟1)將含有下列組分的反應(yīng)物混合a.待測核酸樣品；b.引物1該引物的3’端可與待測核酸樣品的3’端或靠近3’端處雜交，5’端為啟動子序列；c.引物2該引物可與待測核酸樣品負鏈的5’端雜交；d.一種或多種熒光探針；e.至少一種RNA依賴的DNA聚合酶；f.至少一種可以識別所述啟動子序列的RNA聚合酶；2)將反應(yīng)物混合后，在密閉容器中進行恒溫放大反應(yīng)，并用檢測儀同步檢測反應(yīng)體系中熒光信號的變化，根據(jù)熒光信號變化的時間和強度對核酸樣品進行定量或定性檢測。本發(fā)明具有污染低、反應(yīng)過程溫度恒定、檢測靈敏度高、檢測速度快、對儀器設(shè)備要求低和成本低的優(yōu)點，適用于臨床檢驗、血液篩查等領(lǐng)域中的核酸檢驗。
文檔編號C12Q1/68GK101333565SQ200810111479
公開日2008年12月31日 申請日期2008年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月27日
發(fā)明者張常娥 申請人:上海仁度生物科技有限公司