專利名稱：從蓮(荷)植株中提取抗微生物和消炎活性成份的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及天然物質(zhì)的生物活性成分，具體而言涉及從蓮(荷)植株 (包括荷葉、荷莖、荷根和蓮蓬殼)中提取具有抗微生物和消炎的活性物質(zhì) 的方法。
背景技術(shù)：
蓮(荷)0Ve〗〃歷Zw/ "ci/er、 yVe2i/巡力o〗〃tea)，禾斗屬睡蓮禾斗、蓮屬。多 年生水生植物，草本植物。葉圓形，高出水面，有長荷莖，具剌，成盾狀著 生。根莖(藕)肥大多節(jié)，橫生于水底泥中。葉盾狀圓形，表面深綠色，被 蠟質(zhì)白粉背面灰綠色，全緣并呈波狀?；▎紊诨üｍ敹?、高托水面之上。 果實(shí)部分為堅(jiān)果，橢圓形或卵形，俗稱蓮子，長1.5 2.5厘米。蓮(荷)全 身是寶，藕、葉、荷莖、蓮蕊、蓮房(花托)入藥，能清熱止血。蓮(荷) 主要栽培在中國的廣西北部，在湖南、湖北、江西、福建以及其它許多地區(qū) 都有分布，己有300多年的種植、應(yīng)用歷史。
通常在夏末采摘蓮子，其根莖(藕)可以食用，也可入藥。與此同時(shí)，荷 葉、荷莖、荷根和蓮蓬殼被丟棄。目前人們對(duì)蓮子植株的非果實(shí)部分幾乎沒 有多少研究，其荷葉、荷莖、荷根和蓮蓬殼也從未加以利用，對(duì)于其蓮子植 株非果實(shí)部分的生物活性及利用人們知之甚少，幾乎沒有從其中得到的任何 有活性的提取物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種從蓮(荷)植株(包括荷葉、荷莖、荷根和蓮 蓬殼，下略)中提取具有抗微生物和消炎活性物質(zhì)的方法。
本發(fā)明通過研究用以下技術(shù)路線首次從蓮(荷)植株中分離得到了具有很 強(qiáng)的抗微生物和消炎活性的有效組分。這是第一個(gè)對(duì)蓮(荷)植株的具有很 強(qiáng)的抗微生物和消炎作用活性的研究與開發(fā)。本發(fā)明覆蓋了蓮子非果實(shí)部分 的具有抗微生物和消炎作用活性成份。
發(fā)明人在蓮(荷)植株中發(fā)現(xiàn)了具有抗微生物和消炎活性有效成分，最強(qiáng) 的具有抗微生物和消炎作用活性部位依次為蓮(荷)的荷葉、荷莖、荷根和 蓮蓬殼。這些生物活性主要表現(xiàn)在抗微生物和消炎上，發(fā)明人預(yù)測(cè)到蓮子的抗微生物和消炎活性可利用來制備食物添加物、保健品和藥物，這將會(huì)有很 大的實(shí)用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
為了將這一發(fā)現(xiàn)造福于人類，發(fā)明人對(duì)從蓮(荷)植株中提取的抗微生物 和消炎活性有效成分的工藝進(jìn)行了探索。經(jīng)過反復(fù)研究、試驗(yàn)，發(fā)明了從蓮 (荷)的荷葉、荷莖、荷根和蓮蓬殼中提取、分離、純化抗微生物和消炎活 性物質(zhì)的方法。所發(fā)明的方法是從蓮(荷)植株中用實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)化生產(chǎn)的 技術(shù)方法，該方法通過柱層析的步驟提取具有抗微生物、消炎活性物質(zhì)。其 具體方法包括
① 將曬干的蓮(荷)植株或者其中的部分如荷葉、荷莖、荷根、蓮蓬殼 進(jìn)行機(jī)械粉碎得到粗粉，或?qū)⑿迈r的蓮(荷)植株或者其中的部分如荷葉、 荷莖、荷根和蓮蓬殼壓碎得到濕的碎塊，用清水、或乙醇水溶液浸泡所述粗 粉或碎塊，并加熱到至少35'C，進(jìn)行20分鐘以上的提取，或者將以上粗粉或 碎塊在水中煮沸進(jìn)行提取，得到粗提取物；
② 將提取混合物過濾，濾液在室溫下通過大孔吸附樹脂以層析方法進(jìn)行 分離，大孔吸附樹脂柱在預(yù)先經(jīng)水洗去未吸附的物質(zhì)后用乙醇水溶液梯度洗
脫，收集乙醇水溶液的洗脫液，即得到所需的活性部分；
③ 以中等極性溶劑進(jìn)行萃取除去雜質(zhì)，或用TLC和HPLC分離活性部分中 的更純的組分;干燥得到活性物質(zhì)。
上述用來進(jìn)行分離的大孔吸附樹脂和硅膠包括市售的各種孔徑和型號(hào)的 樹脂和硅膠，如Amberlite XAD系列及山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司的DM系列 的大孔吸附樹脂等。
本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)并提供了從蓮(荷)植株中提取、分離、純化具有抗微生 物、消炎活性物質(zhì)的方法，由于蓮子的非果實(shí)部分過去是廢棄的從未加以利 用，因此利用來制備抗微生物、消炎的提取物，并使之應(yīng)用于藥物及功能性 食品和飲料、保健品、日用品及食品添加劑等將會(huì)有很大的實(shí)用價(jià)值和經(jīng)濟(jì) 價(jià)值。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1將曬干的100克蓮(荷)植株研磨粉碎后得到粗粉，用1000 毫升清水或50%的乙醇水溶液浸泡所述粗粉，并加熱到至少35°C，進(jìn)行20 分鐘以上的提取，得到粗提取物；干燥得到約7克的活性提取物。實(shí)施例2將曬干的100克蓮(荷)植株研磨粉碎后得到粗粉，在500毫 升水中煮沸15分鐘以上進(jìn)行提取，此過程重復(fù)2次。將提取液過濾得到濾液 約1000毫升。濾液通過100毫升已進(jìn)行過水平衡的非極性的大孔吸附樹脂 Amberlite XAD柱；用1000ml水洗以移去未吸附的物質(zhì)。再用乙醇進(jìn)行梯度 洗脫；收集20%以上的洗脫液，干燥得到約2.5克的活性提取物。
實(shí)施例3 將曬干的100克蓮(荷)植株研磨粉碎后得到粗粉，在500 毫升水中煮沸15分鐘以上進(jìn)行提取，此過程重復(fù)2次;將提取液過濾得到濾 液約1000毫升；濃縮濾液，用中等極性溶劑進(jìn)行20分鐘以上的萃取，重復(fù)2 次，得到有機(jī)層和水層；將水層萃取重復(fù)2次，分離有機(jī)層和水層；合并水 層，將其干燥得到約5克活性物質(zhì)。
實(shí)施例4將曬干的100克荷葉研磨粉碎后在500毫升水中煮沸15分鐘以 上進(jìn)行提取，提取重復(fù)2次;將提取液過濾得到濾液約1000毫升；濃縮濾液， 用中等極性溶劑進(jìn)行20分鐘以上的萃取，重復(fù)2次，得到有機(jī)層和水層；將水 層萃取重復(fù)2次，分離有機(jī)層和水層；合并水層，將其通過100毫升已進(jìn)行過水 平衡的非極性的Amberlite XAD離子交換柱；用1000毫升水洗以移去未吸附的 物質(zhì)；再用乙醇進(jìn)行梯度洗脫，收集20%以上的洗脫液，干燥得到約2.5克的 活性提取物。
實(shí)施例5將曬干的100克荷莖研磨粉碎后在500毫升水中煮沸15分鐘 以上進(jìn)行提取，此過程重復(fù)2次；將提取液過濾得到濾液約IOOO毫升；濾液 通過100毫升已進(jìn)行過水平衡的非極性的Amberlite XAD柱。用1000毫升水 洗以移去未吸附的物質(zhì)；再用乙醇進(jìn)行梯度洗脫；收集20%以上的洗脫液， 干燥得到約2. 5克的活性提取物。
實(shí)施例6將曬干的100克蓮蓬殼研磨粉碎后在500毫升水中煮沸15分鐘 以上進(jìn)行提取，此過程重復(fù)2次;將提取液過濾得到濾液約1000毫升；濃縮 濾液，用中等極性溶劑進(jìn)行20分鐘以上的萃取，重復(fù)2次，得到有機(jī)層和水 層；將水層萃取重復(fù)2次，分離有機(jī)層和水層；合并水層，將其干燥得到約 L5克活性物質(zhì)。
實(shí)施例7將新鮮的300克蓮(荷)植株(非果實(shí)部分)壓碎得到濕的碎 塊，用2000毫升清水或50%的乙醇水溶液浸泡碎塊，并加熱到至少35。C， 進(jìn)行20分鐘以上的提取，得到粗提取物；干燥得到約7克的活性提取物。實(shí)施例8將新鮮的300克蓮(荷)植株(非果實(shí)部分)壓碎得到濕的碎 塊，在1000毫升水中煮沸15分鐘以上進(jìn)行提取，此過程重復(fù)2次;將提取液過 濾得到濾液約2000毫升；濃縮濾液，用中等極性溶劑進(jìn)行20分鐘以上的萃取， 重復(fù)2次，得到有機(jī)層和水層；將水層萃取重復(fù)2次，分離有機(jī)層和水層；合 并水層，將其通過100毫升已進(jìn)行過水平衡的非極性的Amberlite XAD離子交 換柱；用1000毫升水洗以移去未吸附的物質(zhì)；再用乙醇進(jìn)行梯度洗脫，收集 20%以上的洗脫液，干燥得到約2. 5克的活性提取物。
實(shí)施例9將新鮮的300克蓮(荷)葉壓碎得到濕的碎塊，在1000毫升 水中煮沸15分鐘以上進(jìn)行提取，此過程重復(fù)2次。將提取液過濾得到濾液約 2000毫升。濾液通過100毫升已進(jìn)行過水平衡的非極性的大孔吸附樹脂 Amberlite XAD柱；用1000ml水洗以移去未吸附的物質(zhì)。再用乙醇進(jìn)行梯度 洗脫；收集20%以上的洗脫液，干燥得到約2.5克的活性提取物。
實(shí)施例10將新鮮的300克蓮(荷)葉壓碎得到濕的碎塊，在1000毫升 水中煮沸15分鐘以上進(jìn)行提取，此過程重復(fù)2次;將提取液過濾得到濾液約 2000毫升；濃縮濾液，用中等極性溶劑例如乙酸乙酯進(jìn)行20分鐘以上的萃取， 重復(fù)2次，得到有機(jī)層和水層；將水層萃取重復(fù)2次，分離有機(jī)層和水層；合 并水層，將其干燥得到約2.5克活性提取物。
實(shí)施例ll將新鮮的300克荷莖壓碎得到濕的碎塊，在1000毫升水中煮 沸15分鐘進(jìn)行提取，此過程重復(fù)2次。將提取液過濾得到濾液約2000毫升； 濃縮濾液，用中等極性溶劑進(jìn)行20分鐘以上的萃取，重復(fù)2次，得到有機(jī)層 和水層；將水層萃取重復(fù)2次，分離有機(jī)層和水層；合并水層，將其干燥得 到約2.5克活性提取物。
實(shí)施例12將新鮮的300克荷根壓碎得到濕的碎塊，在1000毫升水中煮 沸15分鐘以上進(jìn)行提取，此過程重復(fù)2次。將提取液過濾得到濾液約2000 毫升；濾液通過100毫升已進(jìn)行過水平衡的非極性的Amberlite XAD離子交 換柱；用IOOO毫升水洗以移去未吸附的物質(zhì)；再用乙醇進(jìn)行梯度洗脫，收集 20%以上的洗脫液，干燥得到約1克的活性提取物。
實(shí)施例13取蓮(荷)植株(非果實(shí)部分)中提取物1微升(終濃度為1 毫克/毫升)和5微升(終濃度為5毫克/毫升)的溶液加入100微升的牙齦卟 啉單胞菌Porphyromonas gingivalis的培養(yǎng)液中于37。C培養(yǎng)過夜。將此培養(yǎng)液稀釋l: 10， 000。取5微升稀釋過的培養(yǎng)液涂于血液瓊脂盤上培養(yǎng)過夜。計(jì) 算盤上的克隆數(shù)，對(duì)照對(duì)比計(jì)算蓮(荷)植株的抑菌活性(如圖4)，結(jié)果表明 蓮(荷)植株的提取物具有很好的抗菌活性。終濃度5毫克/毫升的提取物能夠 抑制牙齦卟啉單胞菌Porphyromonas gingivalis的生長，終濃度1毫克/毫升 的提取物能夠抑制牙齦卟啉單胞菌Porphyromonas gingivalis的生長。更多的
稀釋研究表明蓮(荷)植株提取物的IC5。約為10毫克/毫升。
實(shí)施例14將各種蓮(荷)植株(非果實(shí)部分)的提取物，通過ELISA化驗(yàn)， 測(cè)試其在人口腔牙齦的纖維細(xì)胞，上皮細(xì)胞，和THP-1單細(xì)胞以及BF24巨噬細(xì) 胞中抑制細(xì)胞原漿的炎癥(對(duì)于導(dǎo)致炎癥性的細(xì)胞因子IL-6， IL-8， TNF-ct，和 MCP-l產(chǎn)品的抑制)的作用。ELISA設(shè)備是從R&D系統(tǒng)購買，按照R&D系統(tǒng)的要 求進(jìn)行化驗(yàn)。所有的提取物的毒理是通過檢測(cè)的，認(rèn)為對(duì)于ELISA化驗(yàn)前的細(xì) 胞是無毒性的。簡(jiǎn)而言之，BF-24和THP-1細(xì)胞是生長在RPMT介質(zhì)中。48孔 的托盤中每孔的100， 000個(gè)牙齦細(xì)胞使用每孔500 A的介質(zhì)。每孔用4叱的 口腔細(xì)菌/^7pArr，o朋s gii^7'rah's培養(yǎng)，提取物的濃縮范圍從0. 5叱到2叱。 在這個(gè)化驗(yàn)過程中，將抗體稀釋到PBS中的4 ng/mL，每個(gè)微盤上涂有100 "L 每孔的抗體。將托盤微熱一晚。第二天，將托盤用400 uL的清洗液洗凈將 清洗液在盤中滯留一分鐘，然后沖洗干凈。將此過程重復(fù)5遍。然后，用blocking buffer注入每孔中，并托盤在室溫中放置1小時(shí)。隨后，重復(fù)清洗工作。接下 來，將100 u L的七標(biāo)準(zhǔn)和100u tx L的樣品裝到每個(gè)孔中并在室溫中放置2小 時(shí)。重復(fù)清洗的過程，并將抗體稀釋到適當(dāng)?shù)?0ng/mL濃度，并將100 u L的 抗休放入每個(gè)孔中并放置2小時(shí)。
重復(fù)清洗過程并二級(jí)抗體稀釋到適當(dāng)?shù)臐舛取?00 yL濃度的二級(jí)抗體放入 每個(gè)孔中。蓋上托盤以避免光線直射，放置在室溫中39分鐘。重復(fù)清洗過程， 將100uL的培養(yǎng)基溶液添加到每孔中。將托盤蓋上在室溫中放置20分鐘。再 將50 uL的stop溶液加入每個(gè)孔中，每孔的optical濃度由使用的微盤讀取機(jī) 設(shè)備取450 nm確定IL-8。蓮(荷)植株提取物擁有很強(qiáng)的IL-8抑制功能。IL-6, IL-12， TNF-a的濃度TNF-a .測(cè)試使用相同的過程。
權(quán)利要求
1一種從蓮(荷)植株(包括荷葉、荷莖、荷根和蓮蓬殼)提取抗微生物、消炎的生物活性物質(zhì)的方法，其特征包括①將曬干的蓮(荷)植株或者其中的一部分如荷葉、荷莖、荷根、蓮蓬殼進(jìn)行機(jī)械粉碎得到粗粉，或?qū)⑿迈r的蓮(荷)植株或者其中的一部分如荷葉、荷莖、荷根、蓮蓬殼壓碎得到濕的碎塊，用清水或50％的乙醇水溶液浸泡所述粗粉和碎塊，并加熱到至少35℃，進(jìn)行20分鐘以上的提??；或者將以上粗粉或碎塊在水中煮沸進(jìn)行提取，得到粗提取物；②將提取混合物過濾，濾液在室溫下通過大孔吸附樹脂以層析方法進(jìn)行分離，大孔吸附樹脂柱在經(jīng)水洗去未吸附的物質(zhì)后用乙醇水溶液洗脫，收集20％以上的洗脫液，即得到所需的活性部分；將其干燥得到具有生物活性的物質(zhì)。③或?qū)⑻崛』旌衔镞^濾，用中等溶劑例如乙酸乙酯進(jìn)行20分鐘以上的萃取濾液，將水層萃取重復(fù)2次，分離有機(jī)層和水層；合并水層，將其干燥得到具有生物活性物質(zhì)。
2.按照權(quán)利要求1所述從蓮子植株提取抗微生物、消炎物質(zhì)的提取方法， 其特征在于所述用來進(jìn)行分離的大孔吸附樹脂和硅膠包括市售的各種孔徑和 型號(hào)的樹脂和硅膠，如Amberlite XAD系列或山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司的 DM系列的大孔吸附樹脂。
全文摘要
本發(fā)明公開了從蓮(荷)植株(荷葉、荷莖、荷根和蓮蓬殼，下略)提取抗微生物和消炎活性成份的提取方法。本發(fā)明在蓮(荷)的荷葉、荷莖、荷根和蓮蓬殼中發(fā)現(xiàn)具有很強(qiáng)的抗微生物、消炎活性的有效部位，發(fā)明了提取、分離并純化具有抗微生物、消炎活性物質(zhì)的方法，利用此方法來制備抗微生物和消炎的提取物，有很大的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)并提供了從蓮(荷)植株中提取、分離、純化具有抗微生物和消炎的方法。由于蓮(荷)植株是很便宜且目前未發(fā)現(xiàn)其應(yīng)用價(jià)值，因此利用其非果實(shí)部分來制備抗微生物的提取物和藥物及功能性食品、日用品及食品添加劑等將會(huì)有很大的價(jià)值(包括經(jīng)濟(jì)價(jià)值)。
文檔編號(hào)A23L1/30GK101606981SQ200810110949
公開日2009年12月23日 申請(qǐng)日期2008年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月18日
發(fā)明者波 余, 平 王, 黃赤夫 申請(qǐng)人:湖北匯特生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司