專利名稱：癌癥特異性啟動(dòng)子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、癌癥生物學(xué)和藥物領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及癌癥特異性調(diào)控序列，以調(diào)控可用于癌癥治療的治療性多核苷酸的表達(dá)。
背景技術(shù)：
能夠控制基因轉(zhuǎn)移的特定多核苷酸的表達(dá)是一種非常有用的功能，特別是用于需要特異性定位活性時(shí)。癌癥就屬于這種情況，對癌癥應(yīng)謹(jǐn)慎地將破壞性或致死性基因產(chǎn)物限制在癌細(xì)胞中同時(shí)至少部分阻止正常細(xì)胞中這些基因的活性。
乳腺癌組織特異性表達(dá)當(dāng)前的乳腺癌治療，如化療(CT)和放療，對腫瘤細(xì)胞的選擇性低，且對正常組織有副作用。為了將副作用降至最低，這些治療通常以間斷性方式給予，允許正常細(xì)胞在各輪治療之間恢復(fù)。然而，在恢復(fù)期，一些存活的癌細(xì)胞因?yàn)榛蛲蛔兌鴮χ委煾呖剐?。因此，癌癥可能會(huì)復(fù)發(fā)或進(jìn)展。靶向腫瘤的基因療法通過作用于腫瘤特異性信號(hào)途徑，將治療的副作用和癌癥產(chǎn)生抗性的風(fēng)險(xiǎn)降至最低。
本文所述的一種乳腺癌特異性啟動(dòng)子包含拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα基因的所選部分。雖然拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα基因的5’側(cè)翼區(qū)域已經(jīng)知曉了一段時(shí)間(Hochhauser等，1992)，但沒能證明本文所述的具體活性區(qū)域可用于乳腺癌組織，甚至當(dāng)其連接于巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子時(shí)(Mo等，1998)。
本文所述的另外一種乳腺癌特異性啟動(dòng)子包含轉(zhuǎn)鐵蛋白受體啟動(dòng)子的所選部分。轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的表達(dá)已被定位在乳腺組織(Fuemkranz等，1991；Shterman等，1991)和乳腺癌(Bauman等，1997；Shindelman等，1981)中，但是提供這種活性的具體區(qū)域沒有被揭示。
前列腺癌組織特異性表達(dá)近年來已開發(fā)出前列腺特異性啟動(dòng)子，如PSA、probasin和hK2。這些啟動(dòng)子的活性是雄激素依賴性的，利用雄激素反應(yīng)性載體來指導(dǎo)治療性基因在前列腺組織中表達(dá)對于很多疾病階段有幫助。雖然本發(fā)明人(Xie等，Cancer Res2001)和其它一些(研究)小組(Zhang等，Mol Endocrinol 2000)已開發(fā)出這些響應(yīng)于雄激素受體的前列腺特異性啟動(dòng)子，但是這些雄激素依賴性啟動(dòng)子在去雄治療或雄激素去除治療以后其活性會(huì)降低，而去雄治療或雄激素去除治療是進(jìn)行前列腺癌治療的主要方式。用含有這些啟動(dòng)子的組合物治療的患者可能沒有效果，而死于復(fù)發(fā)的雄激素非依賴性前列腺癌(AIPC)。對于前列腺癌基因療法，本領(lǐng)域中缺乏在ADPC和AIPC二者中都有活性以治療轉(zhuǎn)移性和復(fù)發(fā)性激素難治前列腺癌的新型啟動(dòng)子。
胰腺癌組織特異性表達(dá)胰腺癌是最具攻擊性的人惡性腫瘤之一，是第五大癌癥死因，目前還沒有有效的治療方法。本發(fā)明通過提供有效調(diào)控在胰腺癌細(xì)胞中特異性表達(dá)的治療性多核苷酸的啟動(dòng)子而解決了這種需要。
發(fā)明概述本發(fā)明提供新型的組織特異性啟動(dòng)子，用于調(diào)控治療性多核苷酸的表達(dá)。利用所述啟動(dòng)子的治療性組合物和方法可用于癌癥治療，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，在抗擊癌癥的武器庫中加入新的方法將有益于公眾健康。
具體地說，本發(fā)明提供組合物，如治療性組合物，以及使用這些組合物的方法，涉及在癌癥基因療法中調(diào)節(jié)治療性多核苷酸的癌癥特異性表達(dá)，例如至少在卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌。
因此，本發(fā)明總體涉及抑制癌細(xì)胞和/或腫瘤細(xì)胞增殖的方法，該方法包括利用癌癥特異性啟動(dòng)子(如上述之一)使所述細(xì)胞有效量的治療性多肽接觸以抑制細(xì)胞增殖。例如，在示范性實(shí)施例中，以下現(xiàn)象可表明癌細(xì)胞增殖受到抑制細(xì)胞培養(yǎng)物中細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)，癌細(xì)胞系生長的抑制，腫瘤大小的減少，和/或存活率的增加。更優(yōu)選的，在一些實(shí)施方式中，所要抑制其增殖的細(xì)胞是活有機(jī)體例如人中的細(xì)胞。抑制這種細(xì)胞轉(zhuǎn)化在預(yù)防和/或治療(細(xì)胞)轉(zhuǎn)化所致活動(dòng)如癌癥、腫瘤發(fā)生和/或腫瘤轉(zhuǎn)移具有重要應(yīng)用。
本發(fā)明包括多核苷酸構(gòu)建物，所述構(gòu)建物包含指導(dǎo)治療性多核苷酸在特定組織和/或類型的細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)控序列。所述多核苷酸可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方式中的任一種與細(xì)胞接觸或?qū)爰?xì)胞?？赏ㄟ^將多核苷酸直接導(dǎo)入感興趣的細(xì)胞或組織來導(dǎo)入所述治療性多核苷酸。這種情況下，可用本領(lǐng)域已知的任何方法來獲得治療性多核苷酸。
在本發(fā)明的具體方面，可用本領(lǐng)域已知的任何方法將包含治療性多核苷酸的RNA或DNA導(dǎo)入細(xì)胞中。在某些優(yōu)選實(shí)施方式中，通過導(dǎo)入編碼治療性基因產(chǎn)物的DNA區(qū)段將治療性多核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞。在一些此類的實(shí)施方式中，考慮將包含治療性多核苷酸的DNA區(qū)段與本發(fā)明的調(diào)控序列操作性連接。這些基因/調(diào)控序列DNA構(gòu)建物的構(gòu)建是本領(lǐng)域熟知的，并且在本文中有詳細(xì)描述。
在導(dǎo)入治療性多核苷酸的某些實(shí)施方式中，DNA區(qū)段可位于載體上，例如，質(zhì)粒載體或病毒載體。病毒載體可以是，例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、單純皰疹病毒、牛痘病毒和腺病毒相關(guān)病毒?？捎门c本發(fā)明相關(guān)的各種方法來利用所述DNA區(qū)段。在本發(fā)明基因療法的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，可用所述載體將突變型bik多核苷酸遞送到細(xì)胞中。這些載體也可用于轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的細(xì)胞，這些培養(yǎng)的細(xì)胞可用于突變型Bik的體外表達(dá)等用途。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，本發(fā)明的啟動(dòng)子可用于任何情況，包括非癌性細(xì)胞特異性表達(dá)或甚至是其本質(zhì)不是細(xì)胞特異性或組織特異性的多核苷酸的表達(dá)。
在
具體實(shí)施例方式
中，治療性基因產(chǎn)物分別對于乳腺癌、胰腺癌或前列腺癌組織有效。在示例性實(shí)施方式中，本發(fā)明可用于遞送基因構(gòu)建物，所述基因構(gòu)建物用于治療，例如，雌激素受體陽性的癌癥、EGF受體過量表達(dá)性癌癥、Her2/neu-過量表達(dá)性癌癥、Her-2/neu-非過量表達(dá)性癌癥、Akt過量表達(dá)性癌癥、雄激素依賴性癌癥、和/或雄激素非依賴性癌癥。也就是說，所述治療性基因產(chǎn)物對各種癌細(xì)胞是有效的，而不管這些癌細(xì)胞是否處于癌基因例如Her-2/neu、EGFR、AKT過量表達(dá)的狀態(tài)，或不管這些癌細(xì)胞的生長是否是激素依賴性(例如MCF-7)或不依賴性的(例如PC3)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知道可提供治療性多核苷酸序列的公共數(shù)據(jù)庫，例如國家生物技術(shù)信息中心的GenBank數(shù)據(jù)庫或通過商業(yè)途徑獲得的數(shù)據(jù)庫，如從CeleraGenomics，Inc.(Rockville，MD)獲得的數(shù)據(jù)庫。有非常多的已知治療性多核苷酸后來發(fā)現(xiàn)可用于本發(fā)明，其中的一些例子包括細(xì)胞增殖抑制劑、程序性細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)劑、腫瘤抑制劑和細(xì)胞增殖誘導(dǎo)劑的反義序列。
治療性多核苷酸可編碼例如小干擾RNA或反義序列。具體作為示范的治療性多核苷酸包括編碼例如突變型Bik、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、Blk、IL-12、IL-10、FN-a、胞嘧啶脫氨酶、GM-CSF、E1A、p53和其它促調(diào)亡蛋白的多核苷酸。構(gòu)建物也可包含這些治療性多核苷酸，如TNFα或p53，或凋亡誘導(dǎo)劑，包括但不限于，Bik、p53、Bax、Bak、Bcl-x、Bad、Bim、Bok、Bid、Harakiri、Ad ElB、Bad和ICE-CED3蛋白酶。在本發(fā)明的具體方面，采用編碼在蘇氨酸33或絲氨酸35位或在兩個(gè)位置有氨基酸取代的突變型Bik多核苷酸。在這些實(shí)施方式的具體方面，突變型Bik多肽的氨基酸被天冬氨酸取代。在其它具體方面，一個(gè)或多個(gè)磷酸化位點(diǎn)在突變型Bik中缺失。在另外的實(shí)施方式中，突變型Bik保持了抗細(xì)胞增生和/或促調(diào)亡活性。
在
具體實(shí)施例方式
中，將含有本發(fā)明治療性多核苷酸和各癌癥特異性調(diào)控序列的構(gòu)建物導(dǎo)入人細(xì)胞。在很多實(shí)施方式中，該細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。在提供的一些優(yōu)選實(shí)施方式中，腫瘤細(xì)胞是乳腺腫瘤細(xì)胞、卵巢腫瘤細(xì)胞、前列腺腫瘤細(xì)胞，或胰腺腫瘤細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，通過注射導(dǎo)入含有治療性多核苷酸和各癌癥特異性調(diào)控序列的構(gòu)建物。在具體實(shí)施方式
中，包含治療性多核苷酸和各癌癥特異性調(diào)控序列的構(gòu)建物包裹在脂質(zhì)體中。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，包含治療性多核苷酸和各癌癥特異性調(diào)控序列的構(gòu)建物與其它抗轉(zhuǎn)化/抗癌治療聯(lián)合使用。這些其它的治療可以是本申請申請日時(shí)已知的，或者是本申請申請日后才知曉的。包含治療性多核苷酸和各癌癥特異性調(diào)控序列的構(gòu)建物可與例如其它治療性多肽、編碼其它治療性多肽的多核苷酸、化療劑、手術(shù)方法或放射等聯(lián)合使用。
包含治療性多核苷酸和各癌癥特異性調(diào)控序列的構(gòu)建物可與任何合適的化療劑聯(lián)用。在一個(gè)代表性實(shí)施方式中，化療劑是紅豆杉醇(Taxol)。包含治療性多核苷酸和各癌癥特異性調(diào)控序列的構(gòu)建物可與放射治療聯(lián)用。構(gòu)成放射療法的電離放射的類型可包括例如x-射線、γ-射線和微波。在某些實(shí)施方式中，可通過外線束照射或給予放射性核素來遞送電離放射治療。癌癥特異性調(diào)控序列調(diào)控的治療性基因產(chǎn)物還可與其它基因療法方案聯(lián)用。在具體實(shí)施方式
中，包含治療性多核苷酸和各癌癥特異性調(diào)控序列的構(gòu)建物被導(dǎo)入腫瘤中。腫瘤可以在動(dòng)物中，具體說可以在哺乳動(dòng)物如人中。
可用任何合適的方法來導(dǎo)入具有本發(fā)明組織特異性啟動(dòng)子(調(diào)控治療性基因產(chǎn)物)和本發(fā)明多核苷酸的構(gòu)建物。導(dǎo)入的“合適方法”是這樣一種方法，即將治療性基因產(chǎn)物置于可減少(優(yōu)選在感興趣的組織或細(xì)胞中)腫瘤細(xì)胞增殖和/或緩解至少一種癌癥癥狀的位置。例如，可用注射、口服、吸入等方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定某情況下合適的導(dǎo)入方法，本發(fā)明的組織特異性調(diào)控序列指導(dǎo)治療性多核苷酸至少主要地在感興趣的組織或細(xì)胞中表達(dá)。在采用注射的實(shí)施方式中，注射可以是例如靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、瘤內(nèi)或胸膜內(nèi)注射，或其它合適的形式。
本發(fā)明的某些其它方面提供治療性藥盒，該藥盒包括裝在合適容器中的構(gòu)建物的藥物制劑，所述構(gòu)建物含有本發(fā)明的調(diào)控序列。在其它方面，包含本發(fā)明調(diào)控序列的多核苷酸含有一個(gè)或多個(gè)克隆位點(diǎn)，從而所需的多核苷酸、如感興趣的多核苷酸等，可被克隆入這些位點(diǎn)。
具體實(shí)施方式
中，在多核苷酸的5’-3’方向中，一個(gè)或多個(gè)克隆位點(diǎn)可位于調(diào)控序列的5’端或調(diào)控序列的3’端。在其它方面，藥盒中還包括一種或多種治療性多核苷酸，如與本發(fā)明的調(diào)控序列相同的核酸分子上。所述藥盒還可包含治療性多肽、編碼治療性多肽的多核苷酸、和/或化療劑的藥物制劑。
治療性多核苷酸的基因產(chǎn)物提供的抗腫瘤活性、抗細(xì)胞增殖活性和/或促調(diào)亡活性可用于與衍生治療性多核苷酸的生物體不同的生物體。例如，鼠治療性多核苷酸也可用于人類治療，或同時(shí)用于鼠和人類的治療。
因此，本發(fā)明提供癌癥特異性調(diào)控序列，用于治療性多核苷酸的靶向表達(dá)，因此，本發(fā)明涉及對細(xì)胞生長控制(包括細(xì)胞增殖的抑制和/或細(xì)胞死亡的促進(jìn))的整個(gè)領(lǐng)域的新改進(jìn)。在具體實(shí)施方式
中，細(xì)胞增殖的抑制包括其增殖率的延遲、增殖的總細(xì)胞數(shù)目的延遲，或二者。
在本發(fā)明的另一目的中，提供一種防止個(gè)體中細(xì)胞生長的方法，該方法包括以下步驟給予所述個(gè)體包含癌癥特異性調(diào)控序列的構(gòu)建物，其中癌癥特異性調(diào)控序列調(diào)控治療性多核苷酸的表達(dá)。在其它具體實(shí)施方式
中，通過脂質(zhì)體給予包含本發(fā)明調(diào)控序列的構(gòu)建物。
在本發(fā)明其它目的中，提供一種防止個(gè)體中細(xì)胞生長的方法，該方法包括以下步驟給予個(gè)體包含本發(fā)明所述組織特異性調(diào)控序列的核酸。在其它具體實(shí)施方式
中，通過選自下組的載體給予所述核酸質(zhì)粒、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺病毒相關(guān)病毒載體、脂質(zhì)體，及它們的組合。包含核酸的組合物可分散在藥學(xué)上可接受的賦形劑中，可將該組合物給予患有細(xì)胞增殖性疾病的動(dòng)物。
在本發(fā)明的另一個(gè)目的中，治療性多核苷酸被組織特異性啟動(dòng)子如靶向癌性組織的啟動(dòng)子調(diào)控。雖然任何啟動(dòng)子靶向癌性組織宜優(yōu)于非癌性組織，，但在具體實(shí)施方式
中，癌癥特異性啟動(dòng)子是例如乳腺癌特異性啟動(dòng)子、前列腺癌特異性啟動(dòng)子、或胰腺特異性啟動(dòng)子。
在
具體實(shí)施例方式
中，乳腺癌特異性啟動(dòng)子包含乳腺癌特異性序列，在其它實(shí)施方式中，還包含增強(qiáng)組織特異性序列的表達(dá)例如增強(qiáng)表達(dá)水平的增強(qiáng)子序列。在具體實(shí)施方式
中，CMV啟動(dòng)子增強(qiáng)子序列與示例性拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα(topoIIα)啟動(dòng)子或示例性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體啟動(dòng)子的乳腺癌特異性區(qū)段連接。本發(fā)明人在本文中表明，這兩種復(fù)合啟動(dòng)子都驅(qū)動(dòng)基因在乳腺癌細(xì)胞中的選擇性表達(dá)，并且具有和CMV啟動(dòng)子相當(dāng)?shù)幕钚?。它們可用于基因打靶以靶向和治療原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性乳腺癌，而對正常組織的毒性較小。
在其它實(shí)施方式中，治療性多核苷酸的表達(dá)受胰腺癌特異性啟動(dòng)子的調(diào)控。在具體實(shí)施方式
中，使用了新的胰腺癌特異性啟動(dòng)子，如本文稱為CTP的啟動(dòng)子，其包含最小的膽囊收縮素A受體(CCKAR，-726至+1核苷酸)和土撥鼠肝炎病毒(WPRE)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件。這種經(jīng)工程化的構(gòu)建物具有強(qiáng)啟動(dòng)子活性，并在體外和體內(nèi)顯示出對胰腺癌細(xì)胞的特異性。
在本發(fā)明的其它具體實(shí)施方式
中，前列腺癌特異性啟動(dòng)子調(diào)控治療性多核苷酸的表達(dá)。在具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明采用新型前列腺癌特異性啟動(dòng)子，如本文稱為ATTP的啟動(dòng)子，其包含最小的人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子(hTert)、土撥鼠肝炎病毒(WPRE)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件、以及衍生自質(zhì)粒ARR2PB的ARR2元件，該啟動(dòng)子響應(yīng)于雄激素刺激。這種經(jīng)工程化的構(gòu)建物具有強(qiáng)啟動(dòng)子活性，并在體外顯示出對雄激素依賴性和雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞的特異性。該啟動(dòng)子可用于體外特異性驅(qū)動(dòng)治療性多核苷酸在前列腺癌中的基因表達(dá)。
在本發(fā)明的一個(gè)目的中，提供一種多核苷酸構(gòu)建物，其包含乳腺癌特異性調(diào)控序列，所述調(diào)控序列包含拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα啟動(dòng)子的所選部分和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體啟動(dòng)子的所選部分。具體地，所述調(diào)控序列包含拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα啟動(dòng)子的所選部分，如包含SEQ ID NO12。所述調(diào)控序列還可包含轉(zhuǎn)鐵蛋白受體啟動(dòng)子的所選部分，如包含SEQ ID NO13。
在
具體實(shí)施例方式
中，本發(fā)明的構(gòu)建物包含增強(qiáng)子，如巨細(xì)胞病毒(CMV)增強(qiáng)子、甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動(dòng)子(GAPDH)或β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。該構(gòu)建物還可包含轉(zhuǎn)錄后調(diào)控序列，如土撥鼠肝炎病毒(WPRE)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(WPRE)。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明的構(gòu)建物包含兩步轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增(TSTA)序列，其中TSTA序列包括DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，如Gal1、Gal4或LexA，以及活化結(jié)構(gòu)域，如VP2或VP16。
在其它
具體實(shí)施例方式
中，調(diào)控序列可操作性連接于編碼治療性基因產(chǎn)物的多核苷酸，所述基因產(chǎn)物例如是細(xì)胞增殖抑制劑、程序性細(xì)胞死亡調(diào)控劑、或腫瘤抑制劑、或包括這些活性中的兩種或多種的治療性基因產(chǎn)物。本發(fā)明的構(gòu)建物可包裹在脂質(zhì)體中。
在本發(fā)明的其它目的中，多核苷酸構(gòu)建物包含前列腺癌特異性調(diào)控序列，所述前列腺癌特異性調(diào)控序列含有下列序列的至少兩種前列腺組織特異性調(diào)控序列；癌癥特異性控制序列；兩步轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增(TSTA)序列，所述TSTA序列包括DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和活化結(jié)構(gòu)域。在具體實(shí)施方式
中，前列腺特異性調(diào)控序列包含SEQ IDNO17。在具體實(shí)施方式
中，癌癥特異性調(diào)控序列包含SEQ ID NO18。同樣，TSTA序列的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以是Gal1、Gal4或LexA，活化結(jié)構(gòu)域可以是VP2或VP16。具體地，TSTA序列是GAL4-VP2或GAL4-VP16。
在本發(fā)明的具體方面，包含前列腺癌特異性調(diào)控序列的多核苷酸構(gòu)建物還包含轉(zhuǎn)錄后調(diào)控序列，如土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(WPRE)序列。所述調(diào)控序列與編碼治療性基因產(chǎn)物的多核苷酸可操作性連接，在某些實(shí)施方式中，所述治療性基因產(chǎn)物是細(xì)胞增殖抑制劑、程序性細(xì)胞死亡調(diào)控劑、或腫瘤抑制劑、或包括這些活性中的兩種或多種的基因產(chǎn)物。包含前列腺癌特異性調(diào)控序列的多核苷酸構(gòu)建物可包裹在脂質(zhì)體中。
在本發(fā)明另外的目的中，提供包含胰腺癌特異性調(diào)控序列的多核苷酸構(gòu)建物，所述胰腺癌特異性調(diào)控序列包含胰腺組織特異性調(diào)控序列，例如包含SEQ IDNO14；以及兩步轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增(TSTA)序列，所述TSTA序列包含DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和活化結(jié)構(gòu)域。在包含胰腺癌特異性調(diào)控序列的多核苷酸構(gòu)建物中，TSTA的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以是Gal1、Gal4或LexA，TSTA的活化結(jié)構(gòu)域可以是VP2或VP16。具體地，TSTA序列是GAL4-VP2或GAL4-VP16。
具體地說，所述構(gòu)建物可包含轉(zhuǎn)錄后調(diào)控序列，如土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(WPRE)。所述調(diào)控序列可與編碼治療性基因產(chǎn)物的多核苷酸可操作性連接，所述治療性基因產(chǎn)物是例如細(xì)胞增殖抑制劑、程序性細(xì)胞死亡調(diào)控劑、或腫瘤抑制劑、或包括這些活性中的兩種或多種的基因產(chǎn)物。這些構(gòu)建物可包裹在脂質(zhì)體中。
在本發(fā)明的其它方面，提供抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的方法，所述方法包括使乳腺癌細(xì)胞與有效量的多核苷酸構(gòu)建物接觸，所述多核苷酸構(gòu)建物包含拓?fù)洚悩?gòu)酶IIa啟動(dòng)子的所選部分或轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的所選部分，其中所選部分可操作性連接于編碼有效抑制細(xì)胞增殖的基因產(chǎn)物的多核苷酸。拓?fù)洚悩?gòu)酶IIa啟動(dòng)子的所選部分可包含，例如SEQ ID NO12。轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的所選部分可包含例如SEQ ID NO13。在本發(fā)明的具體方面，所述構(gòu)建物還包含增強(qiáng)子，如CMV、甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動(dòng)子(GAPDH)或β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。
在本發(fā)明的其它目的中，提供一種抑制前列腺癌細(xì)胞增殖的方法，所述方法包括使前列腺癌細(xì)胞與有效量的多核苷酸構(gòu)建物接觸，所述多核苷酸構(gòu)建物具有下列序列的至少兩種前列腺細(xì)胞特異性調(diào)控序列；兩步轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增序列；和癌細(xì)胞特異性序列，其中所述序列可操作性連接于編碼有效抑制前列腺癌細(xì)胞增殖的基因產(chǎn)物的多核苷酸。所述構(gòu)建物還可包含轉(zhuǎn)錄后調(diào)控序列，如WPRE序列，其可操作性連接于編碼有效抑制前列腺癌細(xì)胞增殖的基因產(chǎn)物的多核苷酸。
在本發(fā)明的其它目的中，提供一種抑制胰腺癌細(xì)胞增殖的方法，所述方法包括使胰腺癌細(xì)胞與有效量的多核苷酸構(gòu)建物接觸，所述多核苷酸構(gòu)建物含有胰腺細(xì)胞特異性序列和兩步擴(kuò)增序列，這二序列均可操作性連接于編碼有效抑制細(xì)胞增殖的基因產(chǎn)物的多核苷酸。所述構(gòu)建物還可包含轉(zhuǎn)錄后調(diào)控序列，如WPRE序列，其可操作性連接于編碼有效抑制細(xì)胞增殖的基因產(chǎn)物的多核苷酸。
在本發(fā)明的其它目的中，提供一種治療患有癌癥的個(gè)體的乳腺癌的方法，所述方法包括使個(gè)體的至少一種乳腺癌細(xì)胞與治療有效量的多核苷酸構(gòu)建物接觸，所述多核苷酸構(gòu)建物含有拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα啟動(dòng)子的所選部分和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的所選部分，其中所選部分可操作性連接于編碼有效治療乳腺癌的基因產(chǎn)物的多核苷酸。所述構(gòu)建物可包含拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα啟動(dòng)子的所選部分，如包含SEQ ID NO12的所選部分。所述構(gòu)建物可包含轉(zhuǎn)鐵蛋白受體啟動(dòng)子的所選部分，如包含SEQ ID NO13的所選部分。所述構(gòu)建物還可包含增強(qiáng)子，如CMV增強(qiáng)子，并且多核苷酸可包裹在脂質(zhì)體中。
在本發(fā)明的另一個(gè)目的中，提供一種治療患有癌癥的個(gè)體的前列腺癌的方法，所述方法包括使個(gè)體的至少一種前列腺癌細(xì)胞與治療有效量的多核苷酸構(gòu)建物接觸，所述多核苷酸構(gòu)建物包含下列序列的至少兩種前列腺細(xì)胞特異性調(diào)控序列；癌細(xì)胞特異性調(diào)控序列；和兩步轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增序列，其中這些序列可操作性連接于編碼有效治療前列腺癌的基因產(chǎn)物的多核苷酸。所述多核苷酸構(gòu)建物還可包含轉(zhuǎn)錄后調(diào)控序列，如WPRE序列，多核苷酸可包裹在脂質(zhì)體中。
在本發(fā)明的另一個(gè)目的中，提供一種治療患有癌癥的個(gè)體的胰腺癌的方法，所述方法包括使個(gè)體的至少一種胰腺癌細(xì)胞與治療有效量的多核苷酸構(gòu)建物接觸，所述多核苷酸構(gòu)建物包含胰腺癌細(xì)胞特異性調(diào)控序列和兩步轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增序列，這兩種序列均可操作性連接于編碼有效治療胰腺癌的基因產(chǎn)物的多核苷酸。所述構(gòu)建物還可包含轉(zhuǎn)錄后調(diào)控序列，如WPRE序列，多核苷酸可包裹在脂質(zhì)體中。
上面已相當(dāng)廣泛地列出了本發(fā)明的特征和技術(shù)優(yōu)點(diǎn)，以使下文對本發(fā)明的詳細(xì)描述更易理解。下面將描述本發(fā)明的其余特征和優(yōu)點(diǎn)，這些構(gòu)成了本發(fā)明權(quán)利要求的主題。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，本文揭示的概念和具體實(shí)施方式
可作為基礎(chǔ)，用于改進(jìn)或設(shè)計(jì)其它結(jié)構(gòu)來實(shí)施與本發(fā)明相同的目的。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，這些等價(jià)結(jié)構(gòu)未脫離本發(fā)明所述權(quán)利要求的精神和范圍。結(jié)合附圖，通過下面的描述，本發(fā)明的新特點(diǎn)(據(jù)信為本發(fā)明的特征)，包括其構(gòu)成和實(shí)施方法，以及本發(fā)明的其它目的和優(yōu)點(diǎn)能夠被更好的理解。然而，可清楚的一點(diǎn)是，提供的每一幅附圖僅用于闡釋和描述的目的，而不用于限制本發(fā)明。
附圖簡述為了更完全的理解本發(fā)明，現(xiàn)在結(jié)合附圖來參考下面的描述

圖1表示正常乳腺表皮細(xì)胞(184A1)、正常肝細(xì)胞(Chang Liver)、成纖維細(xì)胞(WI38)，肺癌細(xì)胞(A549)、胰腺癌細(xì)胞(CAPAN-1)、卵巢癌細(xì)胞(iP-1)和乳腺癌細(xì)胞(MD-MBA-231、MD-MBA-468、MD-MBA-453、SKBR3、T47D、MCF-7)等細(xì)胞系中進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)時(shí)全長(FL)拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα啟動(dòng)子的活性。
圖2表示在圖10所述的細(xì)胞系中進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)測得的全長(FL)拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα啟動(dòng)子的活性。
圖3表示在經(jīng)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的不同細(xì)胞系CT572和CT90之間的體外熒光素酶表達(dá)，％表示CMV-PGL3載體在各細(xì)胞系中的熒光素酶活性比較。
圖4表示在荷有MDA-MB-231腫瘤的小鼠組織中CT90啟動(dòng)子相對于CMV啟動(dòng)子(CT90/CMV)的活性。各組織中的啟動(dòng)子活性用文中所述的熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)所測定。
圖5表示不同細(xì)胞系中CT90BikDD和CMV-BikDD的體外殺傷試驗(yàn)。Y軸的值表示處理后存活細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。
圖6表示CT90-BikDD基因治療的體內(nèi)抗腫瘤作用。每只小鼠接種2.5×106個(gè)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231，用脂質(zhì)體復(fù)合的CT0-BikDD、CMV-BikDD、空載體pGL3和葡萄糖緩沖液D5W(作為未處理對照)每周處理小鼠一次。在處理過程中每周檢測腫瘤大小(Y軸的值)兩次，并示于圖中。X軸表示治療天數(shù)。
圖7表示各細(xì)胞系中TR缺失突變體的啟動(dòng)子活性，用CMV啟動(dòng)子活性標(biāo)準(zhǔn)化。Y軸的百分?jǐn)?shù)表示各細(xì)胞系中TfR啟動(dòng)子相對CMV啟動(dòng)子的比率。
圖8表示在含氧量正常和含氧量低的情況下乳腺癌細(xì)胞系中CTR116的啟動(dòng)子活性(用CMV啟動(dòng)子標(biāo)準(zhǔn)化)。Y軸的百分?jǐn)?shù)表示TfR116相對CMV啟動(dòng)子的比率。
圖9A和9B表示胰腺特異性啟動(dòng)子構(gòu)建物(圖9A)及各自的熒光素酶試驗(yàn)(圖9B)。數(shù)據(jù)代表四次獨(dú)立試驗(yàn)的平均值；標(biāo)桿，標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖10A是基于CCKAR和基于CMV的構(gòu)建物的示意圖，所述構(gòu)建物含有處于最小的CCKAR啟動(dòng)子(有或沒有WPRE)、或CCKAR/TSTA(有或沒有WPRE)、或CMV增強(qiáng)子/啟動(dòng)子控制之下的螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因。圖10B表示瞬時(shí)轉(zhuǎn)化入AsPC-1和PANC-1胰腺癌細(xì)胞中的構(gòu)建物的活性。圖10C表示基于CCKAR的啟動(dòng)子復(fù)合物的組織特異性。數(shù)據(jù)代表四次獨(dú)立試驗(yàn)的平均值；標(biāo)桿，標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖11表示系統(tǒng)性遞送CTP-Luc和CMV-Luc質(zhì)粒DNA后，AsPC細(xì)胞的常位腫瘤模型中的體內(nèi)轉(zhuǎn)基因表達(dá)。圖11A表示小鼠的體內(nèi)成像。顯示了小鼠的代表性成像。圖11B表示組織提取物中的螢火蟲熒光素酶活性用發(fā)光測量計(jì)定量并表示為每毫克總蛋白的相對熒光素酶單位。通過比較CTP小鼠與CMV小鼠的熒光素酶活性水平來計(jì)算比率。
圖12表示CMV增強(qiáng)子/啟動(dòng)子或基于hTERTp的啟動(dòng)子復(fù)合物的控制下的螢火蟲熒光素酶活性的比較。檢測在LNCaP細(xì)胞(圖12A)、PC-3前列腺癌細(xì)胞(圖12B)或WI38細(xì)胞(圖12C)中螢火蟲熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒構(gòu)建物，該構(gòu)建物包含CMV增強(qiáng)子/啟動(dòng)子或hTERTp(有或沒有WPRE)，或hTERTp/TSTA(有或沒有WPRE)。數(shù)據(jù)代表四次獨(dú)立試驗(yàn)的平均值；標(biāo)桿，標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖13表示響應(yīng)于雄激素的基于hTERTp的啟動(dòng)子復(fù)合物活性的增加。圖13A表示雄激素響應(yīng)性元件ARR2置于hTERTp-TSTA-Luc或hTERTp-TSTA-Luc-WPRE復(fù)合物的hTERTp的上游。ARR2PB驅(qū)動(dòng)的Luc作為對照。圖13B表示前列腺細(xì)胞中基于hTERTp的啟動(dòng)子的活性。數(shù)據(jù)代表四次獨(dú)立試驗(yàn)的平均值；標(biāo)桿，標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖14表示CT90啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)BikDD的表達(dá)，其表達(dá)水平與CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)水平相當(dāng)。利用電穿孔法將MCF7細(xì)胞用CMV-BikDD和CT90-BikDD轉(zhuǎn)染。24小時(shí)后，收獲各試驗(yàn)中的細(xì)胞，并裂解用于Western印跡試驗(yàn)。
圖15表示基因療法治療過程中腫瘤的生長。帶有MDA-MB-231(15A)或MDA-MB-468(15B)乳腺癌異種移植物的小鼠通過靜脈內(nèi)注射接受15μg溶于水中的CT90-BikDD、CMV-BikDD、空載體pGL3或5％葡萄糖的脂質(zhì)體復(fù)合物的處理。各處理組有10只小鼠。小鼠每周處理一次(QW)共處理8周，每周兩次測定腫瘤大小。
圖16提供了荷有MDA-MB-231乳腺腫瘤的小鼠的存活記錄。在第8周停止處理，小鼠保持存活直至出現(xiàn)疾病狀態(tài)(由學(xué)院規(guī)則所定義)。記錄每周的存活數(shù)目并示于上欄。得自于卡普蘭-邁耶分析和秩序檢驗(yàn)(log-rank test)的平均存活時(shí)間和統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性示于下欄。N.S.，無顯著性。
圖17顯示CT90-BikDD指導(dǎo)的Bik在體內(nèi)乳腺癌細(xì)胞中的選擇性表達(dá)。將CT90-BikDD或CMV-BikDD脂質(zhì)復(fù)合物注射入荷有MDA-MB-468乳腺癌異種移植物的小鼠。注射后72小時(shí)處死小鼠，取出腫瘤和心臟并固定。在組織切片上如材料和方法部分所述進(jìn)行原位雜交檢測BikDD mRNA的表達(dá)。圖中所示為心臟和腫瘤的代表性切片。圖17A中，在CMV-BikDD-和CT90-BikDD-處理的小鼠(分別為左欄和右欄)心臟組織中有BikDD的表達(dá)。上欄的樣品用反義BikDD探針染色，深褐色表示陽性信號(hào)。下欄表示用正義BikDD探針染色的陰性對照試驗(yàn)。圖17B中，在CMV-BikDD-和CT90-BikDD-處理的小鼠(分別為左欄和右欄)腫瘤組織中有BikDD的表達(dá)。上欄的樣品用反義BikDD探針染色，箭頭表示陽性細(xì)胞。下欄表示用正義BikDD探針染色的陰性對照試驗(yàn)。圖17C中，CT90啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)BikDD的表達(dá)，其表達(dá)水平與CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)水平相當(dāng)。利用電穿孔法將MCF7細(xì)胞用CMV-BikDD和CT90-BikDD轉(zhuǎn)染。24小時(shí)后，收獲各試驗(yàn)中的細(xì)胞，并裂解用于Western印跡試驗(yàn)。
圖18表示人膽囊收縮素A型受體(CCKAR)啟動(dòng)子可能具有胰腺癌特異性。圖18A中顯示胰腺癌特異性啟動(dòng)子候選物的構(gòu)建物。用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增CCKAR、孤兒G蛋白偶聯(lián)受體(RDC1)、尿激酶型纖維蛋白酶原激活劑受體(uPAR)和胰凝乳蛋白酶原B1(CTRB1)并亞克隆入報(bào)告質(zhì)粒pGL3-基礎(chǔ)(basic)(驅(qū)動(dòng)螢火蟲熒光素酶基因)。圖18B中，用所示質(zhì)粒DNA和pRL-TK瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染PANC-1和AsPC-1細(xì)胞。48小時(shí)后，檢測二熒光素酶比率并表示為相對光單位(RLU)(用Renilla熒光素酶對照標(biāo)準(zhǔn)化)。數(shù)據(jù)代表四次獨(dú)立試驗(yàn)的平均值；標(biāo)桿，標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖19表示基于分子工程化的膽囊收縮素A型受體(CCKAR)的啟動(dòng)子的活性更高，并且保持了胰腺癌特異性。圖19A中是基于CCKAR的工程化構(gòu)建物的示意圖，包括pGL3-CCKAR-Luc-WPRE(CCKAR-P-Luc))、pGL3-CCKAR-TSTA-Luc(CCKAR-T-Luc)和pGL3-CCKAR-TSTA-Luc-WPRE(CTP-Luc)。圖19B中，基于CCKAR的啟動(dòng)子在胰腺癌細(xì)胞中的活性。用質(zhì)粒DNA和pRL-TK瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染AsPC-1、PANC-1和PanO2細(xì)胞。48小時(shí)后檢測二熒光素酶比率。顯示了與CMV啟動(dòng)子的相對活性百分?jǐn)?shù)。數(shù)據(jù)代表四次獨(dú)立試驗(yàn)的平均值。圖19C中顯示基于CCKAR的啟動(dòng)子復(fù)合物的組織特異性。用所示的質(zhì)粒和pRL-TK瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染非-胰腺癌(LNCaP、PC-3、SKOV3.ipl、MDA-MB-468和HeLa)細(xì)胞系、以及正常和永生化的細(xì)胞系(WI-38、184Al和E6E7)。48小時(shí)后檢測二熒光素酶比率。顯示了與AsPC-1細(xì)胞中的活性相比的相對活性百分?jǐn)?shù)。數(shù)據(jù)代表四次獨(dú)立試驗(yàn)的平均值。RLU，相對光單位。
圖20表示在常位動(dòng)物模型中，膽囊收縮素A型受體(CCKAR)-兩步轉(zhuǎn)錄活化序列(TSTA)-土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(WPRE)的復(fù)合物，CTP具有很強(qiáng)的活性和胰腺癌特異性。通過尾靜脈給予荷有常位AsPC-1腫瘤的裸鼠50μgDNA(在DNA脂質(zhì)體復(fù)合物中)，每天一次，連續(xù)3天。圖20A中顯示小鼠的體內(nèi)成像。腹膜內(nèi)注射D-熒光素10分鐘后，麻醉小鼠，用IVIS成像系統(tǒng)成像5分鐘。圖20B中顯示熒光素酶表達(dá)的組織分布。分離所示的腫瘤和器官的組織樣品，用發(fā)光測量計(jì)檢測熒光素酶活性。數(shù)據(jù)表示為每毫克總蛋白的相對熒光素酶單位。CMV，pGL3-CMV-Luc；CTP，pGL3-CTP-Luc；標(biāo)桿，標(biāo)準(zhǔn)誤差；RLU，相對光單位；n＝每組4只小鼠。
圖21表明CTP驅(qū)動(dòng)的Bik突變體(BikDD)的表達(dá)選擇性和特異性殺傷胰腺癌細(xì)胞。圖21A是pUK21骨架；CMV-BikDD、pUK21-CMV-BikDD；CTP-BikDD，pUK21-CTP-BikDD中表達(dá)構(gòu)建物的示意圖。圖21B表示CMV或CVP驅(qū)動(dòng)的BikDD的殺傷效果。用2μg pUK21(陰性對照)、pUK21-CMV-BikDD(陽性對照)或pUK21-CTP-BikDD加上100ng pGL3-CMV-Luc共轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞系(AsPC-1，PANC-1，MDA-Panc28和PanO2)、永生化的人胰腺表皮E6E7細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，細(xì)胞與5ng/ml D-熒光素孵育5分鐘后用IVIS成像系統(tǒng)將熒光素酶活性成像2分鐘。代表性圖像示于上欄。計(jì)算了信號(hào)百分?jǐn)?shù)(與陰性對照相比，陰性對照設(shè)為100％)(下欄)。數(shù)據(jù)代表三個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的平均值。1，pUK21；2，CMV-BikDD；3，CTP-BikDD；標(biāo)桿，標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖22表示CMV啟動(dòng)子和基于hTERTp的啟動(dòng)子復(fù)合物控制下的螢火蟲熒光素酶活性比較。圖22A是報(bào)告構(gòu)建物的示意圖。圖22B中，用報(bào)告質(zhì)粒DNA和內(nèi)部控制載體pRL-TK瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞系LNCaP和PC-3，以及正常人成纖維細(xì)胞系WI-38。48小時(shí)后檢測二熒光素酶比率。所示為相對于CMV啟動(dòng)子(設(shè)為1)的熒光素酶活性(倍數(shù))。
圖23表示順式作用元件ARR2響應(yīng)于雄激素刺激進(jìn)一步增強(qiáng)了TSTA-和/或WPRE修飾的hTERTp。圖23A為報(bào)告構(gòu)建物的示意圖。圖23B中，用報(bào)告質(zhì)粒DNA和內(nèi)部控制載體pRL-TK瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。與R1881孵育48小時(shí)后，檢測二熒光素酶比率。所示為相對于CMV啟動(dòng)子(設(shè)為1)的熒光素酶活性(倍數(shù))。
圖24表示全身性遞送質(zhì)粒DNA后，LNCaP和PC-3異種移植物中熒光素酶的體內(nèi)表達(dá)。用DNA(CMV-Luc或ATTP-Luc)脂質(zhì)體復(fù)合物靜脈內(nèi)注射荷有s.cLNCaP腫瘤的雄性裸鼠。靜脈注射D熒光素后，麻醉小鼠，并用IVISTM成像系統(tǒng)成像2分鐘。所示圖像為末次注射后24小時(shí)。圖24A中，將小鼠立即解剖并離體成像2分鐘。圖24B中，切下的腫瘤立即成像10分鐘(圖24C)。圖24D中，全身性遞送CMV-Luc或TTP-Luc質(zhì)粒DNA到荷有PC-3腫瘤的小鼠中后，將離體的PC-3腫瘤成像(如C所示)。顯示了定量的(熒光)信號(hào)(右)。圖24E中，在LNCaP腫瘤模型中熒光素酶表達(dá)的體內(nèi)生物分布。然后對所示腫瘤和器官的組織樣品進(jìn)行切片，用發(fā)光測量計(jì)檢測熒光素酶活性。
圖25表示ICB介導(dǎo)乳腺癌特異性信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。圖25A中，顯性失活的Cdk2突變體(Cdk2-dn)阻抑拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα啟動(dòng)子在乳腺癌細(xì)胞中的活性。將對照載體或Cdk2-dn表達(dá)載體與拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα-pGL3報(bào)告載體共轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，然后用熒光素酶試驗(yàn)測定拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα啟動(dòng)子活性。顯示了Cdk2-dn組與對照組拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα啟動(dòng)子活性的比率。所用細(xì)胞系如上所述。BC，乳腺癌細(xì)胞。圖25B中，細(xì)胞周期蛋白A活化乳腺癌細(xì)胞中的拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα啟動(dòng)子。將對照或細(xì)胞周期蛋白A(CCNA)表達(dá)載體與拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα-pGL3報(bào)告載體共轉(zhuǎn)染入SKBR3細(xì)胞，然后用熒光素酶試驗(yàn)測定拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα啟動(dòng)子活性。顯示了Cdk2-dn組與對照組拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα啟動(dòng)子活性的比率。圖25C所示為拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα啟動(dòng)子缺失突變體(-572，-182，-90，-60)和ICB1突變的拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα啟動(dòng)子(mICB1)的設(shè)計(jì)。有圓圈的x表示在ICB1位點(diǎn)的突變。圖25D中，在乳腺癌細(xì)胞中ICB1可介導(dǎo)細(xì)胞周期蛋白A/cdk2信號(hào)對拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα啟動(dòng)子的活化。左欄，將拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα啟動(dòng)子缺失突變體與細(xì)胞周期蛋白A表達(dá)載體或?qū)φ蛰d體共轉(zhuǎn)染入各種細(xì)胞系，用熒光素酶試驗(yàn)測定它們的活性。顯示了細(xì)胞周期蛋白A組與對照組(CCNA/Ctrl)的啟動(dòng)子活性比率。右欄，如材料和方法部分所述，拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα啟動(dòng)子的ICB1位點(diǎn)發(fā)生突變。將ICB1-突變的啟動(dòng)子(mICB1-T2A)與細(xì)胞周期蛋白A表達(dá)載體或?qū)φ蛰d體共轉(zhuǎn)染入各種細(xì)胞系，如上所述測定它們的活性。圖25E中，撲異構(gòu)酶IIα啟動(dòng)子的-90缺失突變體保留了乳腺癌特異性活性。上欄，將T2A90-pGL3轉(zhuǎn)染入各細(xì)胞系中，用二熒光素酶試驗(yàn)測定其啟動(dòng)子活性。BE，正常乳腺表皮細(xì)胞；BC，乳腺癌細(xì)胞；LF，正常肺成纖維細(xì)胞系；HC，正常肝細(xì)胞；PC，胰腺癌細(xì)胞；OC，卵巢癌細(xì)胞。下欄，各種細(xì)胞系中T2A-90啟動(dòng)子相對于CMV啟動(dòng)子的活性。如25B所述計(jì)算各細(xì)胞中T2A-90相對CMV(拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα/CMV)的啟動(dòng)子活性比率。
圖26說明CMV啟動(dòng)子的增強(qiáng)子序列特異性強(qiáng)化了-90拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα啟動(dòng)子在乳腺癌細(xì)胞中的活性。圖26A提供了CT572、CT182和CT90的設(shè)計(jì)。用PCR從pCDNA3.1載體擴(kuò)增CMV啟動(dòng)子增強(qiáng)子序列并分別克隆到pGL3報(bào)告構(gòu)建物中拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα-182或-90啟動(dòng)子上游，形成融合啟動(dòng)子CT572、CT182和CT90。圖26B中，CT572、CT182和CT90在各細(xì)胞系中有活性。如上所述測定各細(xì)胞系中的啟動(dòng)子活性。圖26C顯示各細(xì)胞系中CT572、CT182和CT90相對于CMV啟動(dòng)子的活性。如上所述測定各細(xì)胞系中CT572相對于CMV(CT572/CMV)、CT182相對于CMV(CT182/CMV)和CT90相對于CMV(CT90/CMV)的啟動(dòng)子活性。圖26D顯示MDA-MB-231常位乳腺癌異種移植物小鼠模型中CT90的體內(nèi)活性。將由CT90(CT90-luc)或CMV啟動(dòng)子(CMV-luc)控制的脂質(zhì)體復(fù)合的熒光素酶報(bào)告構(gòu)建物通過尾靜脈注射入荷有腫瘤的小鼠中。注射后48小時(shí)，處死小鼠以取出腫瘤和主要器官。上欄，腫瘤和正常器官中CMV和CT90啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光素酶活性的絕對值。下欄，CT90啟動(dòng)子相對于CMV啟動(dòng)子(CT90/CMV)的活性比率。如前圖25B所述計(jì)算所有的數(shù)值。圖26E顯示瘤內(nèi)注射的MDA-MB-231乳腺癌異種移植物小鼠中的CT90活性。將與DOTAPChol脂質(zhì)體復(fù)合的CT90-luc或CMV-luc構(gòu)建物注射入小鼠的MDA-MB-231腫瘤中。注射后48小時(shí)，殺死小鼠以摘除腫瘤和主要器官。左欄，腫瘤和正常器官中CMV和CT90啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光素酶活性的絕對值。右欄，CT90啟動(dòng)子相對于CMV啟動(dòng)子(CT90/CMV)的活性比率。如前圖25B所述計(jì)算所有的數(shù)值。
發(fā)明詳述如本說明書中所用，“一(a)”或“一個(gè)(an)”可意為一個(gè)或者多個(gè)。如本發(fā)明的權(quán)利要求中所用，當(dāng)與“包含(comprising)”連用時(shí)，“一”或“一個(gè)”可意為一個(gè)或者多于一個(gè)。如本文所用，“另一(another)”可意為至少第二個(gè)或者更多。在具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的某些方面可例如“基本由本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)序列組成”。
在某些實(shí)施方式中，通過例如病毒或非病毒遞送系統(tǒng)將包含本發(fā)明調(diào)控序列的多核苷酸遞送到合適的接收者動(dòng)物中以抑制腫瘤生長和發(fā)展。在本發(fā)明一個(gè)示例性實(shí)施方式中，遞送的治療性基因產(chǎn)物通過凋亡機(jī)制來抑制腫瘤生長和發(fā)展。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，將包含在組織特異性調(diào)控序列構(gòu)建物中的治療性多肽以多核苷酸形式給藥，靶向例如乳腺癌、胰腺癌或前列腺癌中的表達(dá)。在本發(fā)明的某些方面，乳腺癌特異性啟動(dòng)子控制治療性多核苷酸的表達(dá)。如本文所用，術(shù)語“治療性多核苷酸”指編碼治療性基因產(chǎn)物(例如可以是RNA、蛋白質(zhì)、多肽或肽)的多核苷酸。
在
具體實(shí)施例方式
中，本發(fā)明的調(diào)控序列包含組合(嵌合)啟動(dòng)子。例如，可使用含有CMV啟動(dòng)子增強(qiáng)子序列的乳腺癌特異性啟動(dòng)子，所述CMV啟動(dòng)子增強(qiáng)子序列與拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα啟動(dòng)子(稱為CT90)或轉(zhuǎn)鐵蛋白受體啟動(dòng)子(稱為CTR116)中的乳腺癌特異性區(qū)段相連。這兩個(gè)嵌合啟動(dòng)子都選擇性驅(qū)動(dòng)基因在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)并具有與CMV啟動(dòng)子相當(dāng)?shù)幕钚运健＠肅T90或CTR116嵌合啟動(dòng)子的構(gòu)建物用于基因轉(zhuǎn)移中，以靶向和治療原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性乳腺癌，而對正常組織的毒性較小(優(yōu)選通過選擇性殺傷乳腺癌細(xì)胞和/或顯著減少乳腺腫瘤生長和/或生長速率)。
在本發(fā)明的其它方面，前列腺癌特異性或胰腺癌特異性啟動(dòng)子控制治療性多核苷酸的表達(dá)。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，提供復(fù)合性前列腺癌特異性或胰腺癌特異性啟動(dòng)子。例如，前列腺癌特異性啟動(dòng)子可包含ARR2調(diào)控序列，而胰腺癌特異性啟動(dòng)子可包含CCKAR調(diào)控序列。
用于調(diào)控治療性多核苷酸表達(dá)的任何啟動(dòng)子或調(diào)控序列都可利用(例如)增強(qiáng)表達(dá)和/或轉(zhuǎn)錄后加工的特異性調(diào)控序列。具體但示例性的序列包括增強(qiáng)子、兩步轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增系統(tǒng)、調(diào)節(jié)RNA聚腺苷酸化的元件、調(diào)節(jié)半衰期的元件等，例如WPRE和/或本領(lǐng)域中其它的序列。
在本發(fā)明其它實(shí)施方式中，提供防止個(gè)體中細(xì)胞生長的方法，所述方法包括給予所述個(gè)體本發(fā)明的構(gòu)建物。在具體實(shí)施方式
中，所述構(gòu)建物以脂質(zhì)體給藥，和/或治療性基因產(chǎn)物還可包含蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(Schwarze等，1999)，如HIV Tat或侵入素(penetratin)。治療性多核苷酸可在載體中給藥，載體例如質(zhì)粒、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺病毒相關(guān)病毒載體、脂質(zhì)體，或它們的組合。
I.基于核酸的表達(dá)系統(tǒng)本發(fā)明在某些實(shí)施方式中，采用了專門用于癌癥治療的表達(dá)治療性多核苷酸的系統(tǒng)。本文闡述了這些多核苷酸的具體代表性方面。
A.載體術(shù)語“載體”指用于運(yùn)載的核酸分子，可將核酸序列插入該運(yùn)載分子中，而將該核酸序列導(dǎo)入細(xì)胞，且該運(yùn)載分子能在細(xì)胞中復(fù)制。核酸序列可以是“外源性的”，意味著它相對于載體所導(dǎo)入的細(xì)胞是異物，或者此核酸序列與細(xì)胞中某序列同源但其在宿主細(xì)胞核酸中的某一位置上是通常是沒有的。載體包括質(zhì)粒、粘粒、病毒(噬菌體、動(dòng)物病毒和植物病毒)和人造染色體(如YAC)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能通過標(biāo)準(zhǔn)的重組技術(shù)(見Maniatis等，1988和Ausubel等，1994，兩者均作為參考納入本文)熟練地構(gòu)建載體。
術(shù)語“表達(dá)載體”指含有編碼能被轉(zhuǎn)錄的基因產(chǎn)物至少一部分的核酸序列的載體。在某些情況下，RNA分子隨后被翻譯成蛋白質(zhì)、多肽或肽。而在其它情況下，這些序列不被翻譯，例如在產(chǎn)生反義分子或核酶的情況下。表達(dá)載體可含有各種“調(diào)控序列”，指在特定宿主生物體中，對與之操作性連接的編碼序列的轉(zhuǎn)錄和可能的翻譯所必需的核酸序列。除了控制轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)控序列外，載體和表達(dá)載體可包含還具有其它功能的核酸序列，描述如下。
1.啟動(dòng)子和增強(qiáng)子“啟動(dòng)子”是一種調(diào)控序列，它是一種控制轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)和轉(zhuǎn)錄速度的核酸序列區(qū)域。在某一具體實(shí)施例中，調(diào)控序列(如啟動(dòng)子)，調(diào)控表達(dá)該核酸序列的組織的組織特異性。啟動(dòng)子或調(diào)控序列可含有可以與調(diào)控蛋白和分子相結(jié)合的遺傳元件，如結(jié)合RNA聚合酶和其它轉(zhuǎn)錄因子。短語“操作性位于(operativelypositioned)”、“操作性連接于(operativelylinked)”、“在控制下(undercontrol)”和“在轉(zhuǎn)錄控制下(under transcriptional control)”指處在相對于核酸序列的正確功能位置和/或方向，以控制該核酸序列轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)和/或表達(dá)的啟動(dòng)子或其它調(diào)控序列。啟動(dòng)子可與或可不與“增強(qiáng)子”連接，增強(qiáng)子指參與核酸序列轉(zhuǎn)錄活化的順式作用調(diào)控序列。
啟動(dòng)子可以天然地與某基因或序列相連，如可以通過分離位于編碼片段和/或外顯子上游的5’非編碼序列而得到。這種啟動(dòng)子可稱為“內(nèi)源性的”。相似地，增強(qiáng)子可以天然地與某核酸序列相連，位于該序列下游或上游?；蛘?，可通過將編碼核酸片段置于重組或異源性啟動(dòng)子的控制下而獲益，重組或異源啟動(dòng)子指在天然情況下通常不與該核酸序列相連的啟動(dòng)子。重組或異源增強(qiáng)子也指在其天然情況下通常不與該核酸序列相連的增強(qiáng)子。這類啟動(dòng)子或增強(qiáng)子可包括其它基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子，和從其它原核細(xì)胞、病毒或真核細(xì)胞分離得到的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子；以及“天然不產(chǎn)生的”啟動(dòng)子或增強(qiáng)子，即含有不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的不同元件和/或含有改變表達(dá)的突變。除了用合成方法產(chǎn)生啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的核酸序列外，也可采用重組克隆技術(shù)和/或核酸擴(kuò)增技術(shù)，包括PCRTM，與本文所述組合物結(jié)合來產(chǎn)生這些序列(見美國專利4,683,202、5,928,906，分別納入本文作參考)。另外，考慮也可采用能指導(dǎo)序列在核外細(xì)胞器，如線粒體、葉綠體等中轉(zhuǎn)錄和/或表達(dá)的調(diào)控序列。
當(dāng)然，重要的是采用能有效指導(dǎo)DNA片段在被選擇用于表達(dá)的細(xì)胞類型、細(xì)胞器和生物體中表達(dá)的啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子。分子生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員通常知道蛋白質(zhì)表達(dá)所用的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和細(xì)胞類型組合，例如，參見Sambrook等(1989)，納入本文參考文獻(xiàn)。所用的啟動(dòng)子可以是組成型的、組織特異性的、可誘導(dǎo)的、和/或能在適當(dāng)條件下用于指導(dǎo)導(dǎo)入DNA片段高水平表達(dá)的，這樣，在大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白和/或肽時(shí)具有優(yōu)越性。該啟動(dòng)子可以是異源的或內(nèi)源的。
組織特異性啟動(dòng)子或元件的鑒定及其活性特征的表征試驗(yàn)，為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。用于調(diào)控治療性基因產(chǎn)物表達(dá)的靶向和/或水平的組織特異性啟動(dòng)子可包括野生型核酸序列、突變型核酸序列或合成的核酸序列，只要治療性多核苷酸的表達(dá)能優(yōu)先保留在一或多個(gè)目的組織中(相對不是所需靶組織而言)。調(diào)控序列，如啟動(dòng)子，可以是復(fù)合序列，其中多個(gè)區(qū)域衍生自不同來源。合成的調(diào)控序列可進(jìn)一步定義為復(fù)合啟動(dòng)子，其中至少兩個(gè)獨(dú)立區(qū)域來源于不同的內(nèi)源和/或合成啟動(dòng)子，但這兩個(gè)獨(dú)立區(qū)域可操作性連接以調(diào)控治療性多核苷酸的表達(dá)。在某一具體實(shí)施方式
中，該組織特異性指針對癌組織的特異性，而與之相反的是非癌組織。本文中的術(shù)語“癌組織”指至少含有一個(gè)癌細(xì)胞的組織。
a.乳腺癌癥組織特異性啟動(dòng)子目前，在癌癥基因治療中所用的大部分啟動(dòng)子具有很強(qiáng)的活性但對正常和腫瘤細(xì)胞無選擇性(如CMV和β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子)。因此，在本發(fā)明的某些方面，將乳腺組織特異性啟動(dòng)子用于本發(fā)明，如用于控制治療性多核苷酸的表達(dá)所述治療性多核苷酸包括Bik的突變形式，例如代表性的BikT33D、BikS35D和Bik T33DS35D突變體。這些Bik突變體在本文中有描述，但在Mien-Chie Hung、Yah Li、和Yong Wen的題目為“突變型Bik的抗腫瘤效果”的美國非臨時(shí)專利申請10/816,698(全文納入本文作為參考)中有更詳細(xì)的描述。在本發(fā)明的一個(gè)具體方面，本發(fā)明的乳腺癌特異性啟動(dòng)子靶向多核苷酸的表達(dá)，所述多核苷酸編碼乳腺癌組織特異性的治療性基因產(chǎn)物。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，使用了復(fù)合啟動(dòng)子，該復(fù)合啟動(dòng)子采用了拓樸異構(gòu)酶IIα(topoIIα)或轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)乳腺癌特異性調(diào)控序列。用例如SAGE分析和cDNA微陣列法測定，乳腺癌中拓樸異構(gòu)酶IIα(topoIIα)和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)的水平提高。本發(fā)明的發(fā)明人在topollα和TfR啟動(dòng)子的5’端分別鑒定到一個(gè)90堿基對的片段(SEQID NO12)和一個(gè)116堿基對的片段(SEQID NO13)，作為所需的最小乳腺癌特異性調(diào)控序列。如本文實(shí)施例所述，通過將這兩段短啟動(dòng)子與增強(qiáng)子序列(如巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子增強(qiáng)子序列(SEQID NO11))連接，增強(qiáng)了啟動(dòng)子活性；這些嵌合性啟動(dòng)子在本文中分別稱為CT90和CTR116。全長的CT90啟動(dòng)子包含于SEQ ID NO23中，而全長CTR116啟動(dòng)子包含于SEQID NO24中。
在乳腺癌細(xì)胞系和/或異種移植物小鼠模型中進(jìn)行的CT90和CRT116報(bào)告物試驗(yàn)證明了這兩個(gè)啟動(dòng)子不但具有強(qiáng)活性，而且對乳腺癌組織和其中的細(xì)胞具有特異性。在具體實(shí)施方式
中，細(xì)胞中CRT116的啟動(dòng)子活性在低氧含量條件下進(jìn)一步增強(qiáng)，這種增強(qiáng)通常發(fā)生在實(shí)體瘤內(nèi)。為了證明其在癌癥基因治療中的用途，本發(fā)明的發(fā)明人用CT90構(gòu)建的一種DNA構(gòu)建物能驅(qū)動(dòng)凋亡基因的表達(dá)。將這一構(gòu)建體轉(zhuǎn)染入細(xì)胞系后，其可選擇性地殺傷乳腺癌細(xì)胞。此外，本發(fā)明的發(fā)明人證明用代表性的非病毒遞送系統(tǒng)通過靜脈注射的方式給小鼠施用該構(gòu)建體，其對小鼠內(nèi)的乳腺癌腫瘤異種移植物具有抗腫瘤效果。這表明CT90可驅(qū)動(dòng)治療基因(如突變型Bik)在乳腺癌細(xì)胞中的選擇性表達(dá)。
關(guān)于腫瘤特異性，多數(shù)現(xiàn)有的癌癥特異性啟動(dòng)子的活性很低(相對于CMV啟動(dòng)子)(例如，Anderson等，2000；Katabi等，1999；Lu等，2002；Maeda等.，2001)或腫瘤特異性不夠(例如CMV-增強(qiáng)的GAPDH(Qiao等，2002))，所以這些啟動(dòng)子沒有應(yīng)用于臨床。相反，CT90和低氧誘導(dǎo)的CRT116啟動(dòng)子的活性與CMV啟動(dòng)子相當(dāng)(約為0.5-2倍)，而對乳腺癌細(xì)胞具有特異性。因此，本發(fā)明包括的乳腺癌特異性啟動(dòng)子可用于控制突變型Bik靶向乳腺癌細(xì)胞的表達(dá)來治療乳腺癌，而對正常組織的毒性低或無毒性。
b.胰腺癌組織特異性啟動(dòng)子胰腺特異性啟動(dòng)子可用于靶向胰腺癌細(xì)胞但不影響胰腺的非癌性細(xì)胞。本發(fā)明人開發(fā)出了活性強(qiáng)的胰腺癌特異性啟動(dòng)子，用于編碼治療性基因產(chǎn)物的多核苷酸的靶向表達(dá)，所述基因產(chǎn)物包括突變型Bik，如代表性的BikT33D、BikS35D和Bik T33DS35D突變體。這些Bik突變體在本文中有描述，但在Mien-Chie Hung、Yan Li、和Yong Wen的題目為“突變型Bik的抗腫瘤效果”的美國非臨時(shí)專利申請10/816,698(全文納入本文作為參考)中有更詳細(xì)的描述。
本發(fā)明人用以下方法開發(fā)出了胰腺癌特異性啟動(dòng)子。根據(jù)國家生物信息中心基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫的序列分析和文獻(xiàn)，本發(fā)明人先篩選了一系列使基因在人胰腺癌中過量靶向表達(dá)的啟動(dòng)子，例如包括膽囊收縮素A受體(CCKAR)、孤兒G蛋白偶聯(lián)的受體(RDC1)、尿激酶型纖維蛋白酶原激活劑受體(uPAR)，羧肽酶A1(CPA1)和胰凝乳蛋白酶原B1(CTRB1)。在胰腺癌細(xì)胞和永生化的正常細(xì)胞中用熒光素酶活性試驗(yàn)檢測這些啟動(dòng)子控制螢火蟲熒光素酶表達(dá)的情況。在這些啟動(dòng)子中鑒定出CCKAR啟動(dòng)子從nt-726到+1(SEQ ID NO14)的區(qū)域具有最佳活性和特異性。然而，這個(gè)最小CCKAR啟動(dòng)子的活性比常用的CMV增強(qiáng)子/啟動(dòng)子的活性低得多。然后，本發(fā)明人基于CCKAR啟動(dòng)子用示范性GAL4-VP16或GAL4-VP2融合蛋白(稱為兩步轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增(TSTA)系統(tǒng)(Iyer等，2001；Zhang等，2002；Sato等，2003；及其中引用的文獻(xiàn)))構(gòu)建了一系列復(fù)合物，來增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性；利用土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(WPRE)(SEQID NO15)改變RNA聚腺苷化信號(hào)、RNA出核和/或RNA翻譯。熟練的技術(shù)人員可認(rèn)識(shí)到術(shù)語“兩步轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增(TSTA)系統(tǒng)”也同樣可稱作“兩步轉(zhuǎn)錄活化(TSTA)系統(tǒng)”或“重組轉(zhuǎn)錄活化途徑”(Nettelbeck等，2000)。在具體方面，采用了該CCKAR-TSTA-WPRE(CTP)啟動(dòng)子，而這種復(fù)合啟動(dòng)子的一個(gè)例子包含于SEQ IDNO20中。因此，該分子工程化的CTP啟動(dòng)子用作胰腺癌基因治療的有效治療方式。
WPRE和TSTA分別提高了CCKAR啟動(dòng)子的活性3.9倍和820倍。令人吃驚的是，對于組合的TSTA和WPRE，CCAKAR-TSTA-WPRE(CTP)的活性在PANC-1細(xì)胞中為CMV啟動(dòng)子的0.7倍，在AsPC-1細(xì)胞中甚至為2.8倍，保持了對胰腺癌的嚴(yán)格特異性。另外，為了確定CTP在全身性遞送后是否在體內(nèi)具有高活性和嚴(yán)格的特異性，用CTP-Luc或CMC-Luc質(zhì)粒DNA-DOTOPChol復(fù)合物尾靜脈注射荷有皮下(s.c)或常位(o.t)AsPC-1胰腺腫瘤細(xì)胞的nu/nu裸鼠，每天一次，連續(xù)3天，用非侵入性IVISTM成像系統(tǒng)獲得體內(nèi)和離體生物發(fā)光圖像。生物發(fā)光圖像顯示CMV-Luc注射的胸腔區(qū)域(肺/心臟)很亮，但CTP-Luc注射的小鼠中幾乎沒有捕獲到生物發(fā)光。用發(fā)光測量計(jì)檢測到的熒光素酶活性說明，在o.t.腫瘤和s.c.腫瘤中活性分別增加了1.4倍和2.0倍。在o.t.模型中，胰腺、肺、心臟、肝、脾和腎中CTP熒光素酶的表達(dá)水平與CMV熒光素酶表達(dá)水平的比例分別為0.37、0.006、0.04、0.37、0.63和0.19，表明組織特異性的增加。綜上，分子工程化的CTP啟動(dòng)子在體外和體內(nèi)胰腺癌細(xì)胞中的活性超過了CMV增強(qiáng)子/啟動(dòng)子，同時(shí)保持了特異性，從而提供了一種胰腺癌基因治療的更為安全和有效的治療方式。
c.前列腺癌組織特異性啟動(dòng)子前列腺癌組織特異性啟動(dòng)子可用于控制編碼治療性基因產(chǎn)物(包括突變型Bik)的多核苷酸表達(dá)。這些Bik突變體在本文中有描述，但在Mien-Chie Hung、Yan Li、和Yong Wen的題目為“突變型Bik的抗腫瘤效果”的美國非臨時(shí)專利申請10/816,698(全文納入本文作為參考)中有更詳細(xì)的描述。這些啟動(dòng)子的活性是雄激素依賴性的。對于許多疾病階段，患者是雄激素依賴性的(ADPC)，允許使用雄激素響應(yīng)性載體以指導(dǎo)治療性基因在胰腺組織中表達(dá)。雖然本發(fā)明的發(fā)明人(Xie等，Cancer Res2001)和其它研究小組(Zhang等，Mol Endocrinol2000)已開發(fā)出這些響應(yīng)于雄激素受體的前列腺特異性啟動(dòng)子，但是這些雄激素依賴性啟動(dòng)子在去雄治療或雄激素去除治療以后其活性會(huì)降低，而去雄治療或雄激素去除治療是進(jìn)展性前列腺癌治療的主要方式。用含有這些啟動(dòng)子的組合物治療的患者可能沒有效果而死于復(fù)發(fā)的雄激素非依賴性前列腺癌(AIPC)。
本發(fā)明人已開發(fā)出用于基因治療的新型啟動(dòng)子，其在ADPC和AIPC中都有活性以治療轉(zhuǎn)移性和復(fù)發(fā)性激素難治的前列腺癌。該啟動(dòng)子，本文稱為ATTP，至少包含前列腺細(xì)胞特異性調(diào)控序列，如示范性ARR2基因的ARR2調(diào)控序列(SEQ IDNO17)。該啟動(dòng)子還可至少包含人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)(SEQ ID NO18)的最小啟動(dòng)子片段(hTERTp)，其可操作性連接于兩步轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增(TSTA)系統(tǒng)，如示范性的GAL4-VP16或GAL4-VP2(GAL4-VP2的兩個(gè)例子包含在SEQ ID NO16或SEQ ID NO19中)融合蛋白編碼序列。治療性多核苷酸也可以操作性連接于轉(zhuǎn)錄后調(diào)控序列，如土撥鼠肝炎病毒的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控序列(WPRE)，以改變RNA聚腺苷化信號(hào)、RNA出核和/或RNA翻譯。這些調(diào)控序列在ADPC和AIPC細(xì)胞系中都有效。在復(fù)發(fā)性前列腺癌的大多數(shù)病例中，AR基因發(fā)生擴(kuò)增和/或AR過量表達(dá)，因此該特定啟動(dòng)子大大提高了用雄激素來刺激該系統(tǒng)的活性的實(shí)施方式的效應(yīng)指數(shù)。在具體實(shí)施方式
中，采用TSTA-hTERT-ARR2和WPRE元件作為前列腺癌特異性調(diào)控序列，在特異性實(shí)施方式中，該控制序列包含于SEQ ID NO21。
關(guān)于該啟動(dòng)子的產(chǎn)生，從LNCaP細(xì)胞的DNA提取物中PCR擴(kuò)增人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)(SEQ ID NO18)的最小啟動(dòng)子片段(hTERTp)，并在熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)中檢測其活性。HTERTp在LNCaP和PC-3細(xì)胞中都有活性，但其活性相對于CMV增強(qiáng)子/啟動(dòng)子很低。然后，基于hTERTp啟動(dòng)子用示范性GAL4-VP16或GAL4-VP2融合蛋白通過兩步轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增(TSTA)系統(tǒng)構(gòu)建了一系列復(fù)合物，來增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性，并利用土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(WPRE)來改變RNA聚腺苷化信號(hào)、RNA出核和/或RNA翻譯。示范性GAL4-VP2融合蛋白由包含SEQ ID NO16或SEQ ID NO19的多核苷酸編碼。
WPRE增加了該啟動(dòng)子的活性約2倍。令人吃驚的是，TSTA系統(tǒng)所增強(qiáng)的活性在LNCaP細(xì)胞中可高達(dá)67％(相對于CMV的活性)，在PC-3細(xì)胞中為90％。當(dāng)TSTA系統(tǒng)與WPRE聯(lián)用時(shí)，啟動(dòng)子的活性在PC-3中與CMV相當(dāng)，在LNCaP細(xì)胞中甚至高出CMV1.5倍。相反，其活性在肺成纖維細(xì)胞WI-38中保持沉默。這表明，hTERTp-TSTA-WPRE系統(tǒng)在ADPC和AIPC細(xì)胞系中都有效。在復(fù)發(fā)性前列腺癌的大多數(shù)病例中，AR基因發(fā)生擴(kuò)增和/或AR過量表達(dá)，因此在具體實(shí)施方式
中，如果能用雄激素刺激該系統(tǒng)的活性，則大大提高了該啟動(dòng)子效應(yīng)指數(shù)。
為了實(shí)現(xiàn)這個(gè)目標(biāo)，將衍生自質(zhì)粒ARR2PB的ARR2元件(SEQ ID NO17)與phTERTp-TSTA-Luc和phTERTp-TSTA-Luc-WPRE的hTERTp啟動(dòng)子融合，以產(chǎn)生質(zhì)粒pARR2.hTERTp-TSTA-Luc和pARR2.hTERTp-TSTA-Luc-WPRE(ATTP-Luc)。如所預(yù)期的，ARR2.hTERTp-TSTA和ARR2.hTERTp-TSTA-WPRE復(fù)合物的活性以雄激素依賴性方式增強(qiáng)，在LNCaP中10nm雄激素類似物R1881比CMC的活性分別增加15倍和24倍，在PC-3細(xì)胞中沒有顯著增加。
因此，本發(fā)明人已開發(fā)了一種新型的前列腺癌特異性調(diào)控系統(tǒng)，它將編碼治療性基因產(chǎn)物的多核苷酸靶向ADPC和AIPC。
2.啟動(dòng)信號(hào)和內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)編碼序列的有效翻譯還可能需要特異性啟動(dòng)信號(hào)。這些信號(hào)包括ATG啟動(dòng)密碼子或毗連序列?？赡苄枰峁┩庠葱苑g調(diào)控信號(hào)包括ATG啟動(dòng)密碼子。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員不難確定這一點(diǎn)并提供必須的信號(hào)。眾所周知啟動(dòng)密碼子必須在“框內(nèi)”，即與所需編碼序列同處讀框內(nèi)以保證整個(gè)插入物的翻譯。外源性翻譯控制信號(hào)和啟動(dòng)密碼子可以是天然的或合成的。加入合適的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子元件可提高表達(dá)序列。
在本發(fā)明某些實(shí)施方式中，采用內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)元件來產(chǎn)生多個(gè)基因或多順反子信使。IRES元件能繞過5’甲基化加帽(Cap)依賴性翻譯的核糖體掃描模式，在內(nèi)部位點(diǎn)開始翻譯(Pelletier和Sonenberg，1988)。已報(bào)道了小RNA病毒家族二成員(脊髓灰質(zhì)炎和腦脊髓炎)的IRES元件(Pelletier和Sonenberg，1988)，及哺乳動(dòng)物信使的IRES(Macejak和Sarnow，1991)?？蓪RES元件連接到異源性開放讀框內(nèi)?？梢黄疝D(zhuǎn)錄各自被IRES分開的多個(gè)開放讀框，產(chǎn)生多順反子信使。借助IRES元件各開放讀框能進(jìn)入核糖體得到有效翻譯。采用一個(gè)啟動(dòng)子/增強(qiáng)子轉(zhuǎn)錄一個(gè)信使，能有效表達(dá)多個(gè)基因(見美國專利5,925,565和5,935,819，納入本文作參考)。
3.多克隆位點(diǎn)載體可含有多個(gè)克隆位點(diǎn)(MCS)，該位點(diǎn)是含有多個(gè)限制性酶切位點(diǎn)的核酸區(qū)域，可采用任一區(qū)域與標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)結(jié)合來消化該載體(見Carbonelli等，1999；Levenson等，1998；Cocea，1997，納入本文作參考)?！跋拗菩悦赶敝覆捎弥辉诤怂岱肿犹囟ㄎ恢闷鹱饔玫拿复呋懈詈怂岱肿印？蓮氖袌錾腺徺I到許多這些限制性酶。這類酶的用途廣為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。通常，采用能在MCS內(nèi)切割的限制性酶使載體線性化或片段化，以保證外源序列連接入該載體?！斑B接”指在兩個(gè)核酸片段之間形成磷酸二酯鍵，二片段彼此可毗連或不毗連。涉及限制性酶和連接反應(yīng)的技術(shù)是重組技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
4.剪接位點(diǎn)大多數(shù)轉(zhuǎn)錄的真核RNA分子將經(jīng)歷RNA剪接以去除原初轉(zhuǎn)錄物中的內(nèi)含子。含真核基因組序列的載體可能需要供體和/或受體剪接位點(diǎn)，以確保轉(zhuǎn)錄物的正確加工而表達(dá)蛋白質(zhì)(見Chandler等，1997納入本文作參考)。
5.聚腺苷酸信號(hào)表達(dá)時(shí)，通常要有一聚腺苷酸信號(hào)來行使轉(zhuǎn)錄物的正確聚腺苷酸化。不認(rèn)為聚腺苷酸信號(hào)的性質(zhì)對成功實(shí)施本發(fā)明是關(guān)鍵性的，和/或可采用任何這類序列。優(yōu)選例包括SV40聚腺苷酸信號(hào)和/或牛生長激素聚腺苷酸信號(hào)，能方便地和/或已知能在各種靶細(xì)胞中很好發(fā)揮功能的聚腺苷酸信號(hào)。還考慮可采用轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)作為表達(dá)盒中的元件。這些元件的作用是提高信使水平和/或盡量減少從盒中通讀到其它序列中。
6.復(fù)制起始位點(diǎn)為了在宿主細(xì)胞中擴(kuò)增載體，其可含有一個(gè)或多個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)(常稱為“ori”)，此位點(diǎn)是一種能啟動(dòng)復(fù)制的特定核酸序列。此外，如果宿主細(xì)胞是酵母菌，可采用自主復(fù)制序列(ARS)。
7.可選擇性和可篩選性標(biāo)記本發(fā)明某些實(shí)施方式中，可通過在表達(dá)載體中含有一標(biāo)記，而在體外或體內(nèi)鑒定含有本發(fā)明核酸結(jié)構(gòu)的細(xì)胞。這種標(biāo)記可賦予細(xì)胞一種可鑒定的變化，有易于鑒定含有該表達(dá)載體的細(xì)胞。通常，可選擇標(biāo)記是可使其被選擇出來的標(biāo)記。陽性選擇標(biāo)記是存在此標(biāo)記時(shí)而得以選出的標(biāo)記，而陰性可選擇標(biāo)記是該標(biāo)記存在時(shí)阻止其選擇的標(biāo)記。陽性可選擇標(biāo)記的一個(gè)例子是抗藥性標(biāo)記。
通常包含藥物選擇性標(biāo)記有助于轉(zhuǎn)化子的克隆和鑒定，例如，能賦予對新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、零霉素和組氨醇抗性的基因可用作可選擇標(biāo)記。除了能賦予表型而得以區(qū)分實(shí)施本發(fā)明而建立的轉(zhuǎn)化子的標(biāo)記外，也考慮其它類型的標(biāo)記，包括諸如基于比色分析的GFP等可篩選標(biāo)記?；蛘?，可采用可篩選酶，如單純皰疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)。本領(lǐng)域技術(shù)人員也知道可能在FACS分析時(shí)如何利用免疫標(biāo)記。不認(rèn)為所用標(biāo)記很重要，只要其能與編碼基因產(chǎn)物的核酸同時(shí)被表達(dá)?？蛇x擇和可篩選標(biāo)記的其它例子是該領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
B.宿主細(xì)胞本發(fā)明的啟動(dòng)子可以任何方式應(yīng)用，只要它們調(diào)控特定多核苷酸的表達(dá)。雖然它們可用于組織特異性表達(dá)，但它們本質(zhì)上是啟動(dòng)子/調(diào)控序列，因此它們也可用于任何細(xì)胞環(huán)境中以表達(dá)任何多核苷酸。
術(shù)語“細(xì)胞”、“細(xì)胞系”和“細(xì)胞培養(yǎng)物”本文中可互換使用。所有這些術(shù)語也包括其子代，即任何和所有的后代?？衫斫馑凶哟捎诠室饣蚍枪室獾耐蛔兌豢赡芟嗤?。在表達(dá)異源性核酸序列的段落中，“宿主細(xì)胞”指原核或真核細(xì)胞，包括能復(fù)制載體，和/或表達(dá)載體編碼的異源基因的任何可轉(zhuǎn)化生物體。宿主細(xì)胞可以和已經(jīng)被用作載體的受體。宿主細(xì)胞可被“轉(zhuǎn)染”或“轉(zhuǎn)化”，指外源性核酸轉(zhuǎn)移到或?qū)氲剿拗骷?xì)胞中的過程。轉(zhuǎn)化細(xì)胞包括原代目標(biāo)細(xì)胞及其子代。
宿主細(xì)胞可衍生自原核或真核細(xì)胞，取決于所需結(jié)果是該載體的復(fù)制，還是部分或全部表達(dá)載體編碼的核酸序列。可購得許多細(xì)胞系和培養(yǎng)物用作宿主細(xì)胞，可從美國典型培養(yǎng)物收藏中心(ATCC)獲得它們，ATCC是活培養(yǎng)物和基因材料檔案保管服務(wù)機(jī)構(gòu)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能根據(jù)載體的骨架和需要的結(jié)果確定合適的宿主。例如，可將質(zhì)?；蛘沉?dǎo)入原核宿主細(xì)胞復(fù)制出許多載體?？捎米魉拗骷?xì)胞進(jìn)行載體復(fù)制和/或表達(dá)的細(xì)菌細(xì)胞包括DH5α，JM109和KC8，以及許多可從市場購買到的細(xì)菌宿主，如SURE感受態(tài)細(xì)胞和SolopackTMGold細(xì)胞(Stratagene，La Jolla)。另外，細(xì)菌細(xì)胞如大腸桿菌LE392可用作噬菌體病毒的宿主細(xì)胞。
用于載體復(fù)制和/或表達(dá)的真核宿主細(xì)胞包括HeLa、NIH3T3、Jurkat、293、Cos、CHO、Saos和PC12。本領(lǐng)域技術(shù)人員可購得和知道各種細(xì)胞類型的許多宿主細(xì)胞。相似地，病毒載體可用于真核或原核宿主細(xì)胞，特別是允許載體復(fù)制或表達(dá)的那些細(xì)胞。
某些載體可采用使其能在原核和真核二種細(xì)胞中均能復(fù)制和/或表達(dá)的調(diào)控序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員還知道培養(yǎng)上述宿主細(xì)胞維持它們并使載體復(fù)制的條件。也了解和知道大規(guī)模生產(chǎn)載體及生產(chǎn)載體編碼的核酸和它們的同源多肽、蛋白質(zhì)或肽的技術(shù)和條件。
C.表達(dá)系統(tǒng)已存在含有上述至少部分或所有組成的許多表達(dá)系統(tǒng)。原核和/或真核系統(tǒng)可用于本發(fā)明來產(chǎn)生核酸序列，或它們的同源多肽、蛋白質(zhì)和肽。許多這類系統(tǒng)可從市場和廣泛來源購得。雖然本發(fā)明的啟動(dòng)子可用于組織特異性表達(dá)，但它們本質(zhì)上是啟動(dòng)子/調(diào)控序列，因此它們也可用于任何表達(dá)系統(tǒng)中，只要它們調(diào)控特定多核苷酸的表達(dá)。
昆蟲細(xì)胞/桿狀病毒系統(tǒng)可產(chǎn)生高水平異源核酸區(qū)段的蛋白質(zhì)表達(dá)，見美國專利No.5,871,986；4,879,236所述，二者納入本文參考，可從Invitrogen和BacPackTMBaculovirus Expression System From Clontech，以MaxBac2.0名稱買到。
表達(dá)系統(tǒng)的其它例子包括Stratagene’s complete ControlTM的可誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)，其包括合成的蛻皮激素-可誘導(dǎo)受體，或其pET表達(dá)系統(tǒng)，一種大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。可誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的另一個(gè)例子可從Invitrogen購買到，它攜帶有T-RexTM(四環(huán)素調(diào)節(jié)的表達(dá))系統(tǒng)，一種采用全長CMV啟動(dòng)子的可誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)。Invitrogen也提供酵母菌表達(dá)系統(tǒng)，稱為畢赤嗜甲醇表達(dá)系統(tǒng)，設(shè)計(jì)用于在嗜甲醇畢赤酵母菌中高水平生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道怎樣表達(dá)載體(如表達(dá)構(gòu)建物)來生產(chǎn)核酸序列或其同源的多肽、蛋白質(zhì)或肽。
II.核酸組合物在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建物及其應(yīng)用中利用了具體的序列。雖然熟練的技術(shù)人員知道可以利用完全如本文所提供的這些序列，但在其它實(shí)施方案中，與本文所提供的示范性序列相似的序列至少也可部分用于組織特異性癌癥調(diào)節(jié)序列。
本發(fā)明的某些實(shí)施方案涉及組織特異性調(diào)節(jié)核酸(可與術(shù)語“多核苷酸”互換使用)。在其它方面，表達(dá)構(gòu)建物核酸包含示范性的SEQ ID NO12、SEQ IDNO13、SEQ ID NO17、SEQ ID NO18所示核酸區(qū)段，或其生物學(xué)功能等價(jià)物。
術(shù)語“核酸”是本領(lǐng)域所熟知的。本文所用的“核酸”一般指包含核堿基(nucleobase)的DNA、RNA分子(即，一條鏈)，或其衍生物或類似物。核堿基包括，例如在DNA中發(fā)現(xiàn)的天然存在的嘌呤或嘧啶堿基(例如，腺嘌呤“A”、鳥嘌呤“G”、胸腺嘧啶“T”或胞嘧啶“C”)或在RNA中發(fā)現(xiàn)的天然存在的嘌呤或嘧啶堿基(例如，A、G、尿嘧啶“U”或C)。術(shù)語“核酸”包括術(shù)語“寡核苷酸”和“多核苷酸”，二者均是術(shù)語“核酸”的亞屬。術(shù)語“寡核苷酸”指長度在約3和100個(gè)核堿基之間的分子。術(shù)語“多核苷酸”指長度至少大于約100個(gè)核堿基的分子。
這些定義一般指單鏈分子，但在具體實(shí)施方案中也可包括與該單鏈分子部分、基本上或完全互補(bǔ)的附加鏈。因此，核酸可包括含有一條或多條互補(bǔ)鏈或包含某分子的具體序列的“互補(bǔ)體”的雙鏈分子或三鏈分子。本文所用的單鏈核酸可以前綴“ss”表示，雙鏈核酸可以前綴“ds”表示，三鏈核酸可以前綴“ts”表示。
1.核堿基本文所用的“核堿基”指雜環(huán)堿基，例如在至少一種天然存在的核酸(即，DNA和RNA)中發(fā)現(xiàn)的天然存在的核堿基(即，A、T、G、C或U)，和這種核堿基的天然或非天然存在的衍生物和類似物。核堿基一般可以取代天然存在的核堿基對的方式與至少一個(gè)天然存在的核堿基形成一個(gè)或多個(gè)氫鍵(“退火”或“雜交”)(例如，A和T、G和C以及A和U之間的氫鍵)。
“嘌呤”和/或“嘧啶”核堿基包括天然存在的嘌呤和/或嘧啶核堿基與它們的衍生物和類似物，包括但不限于被一個(gè)或多個(gè)烷基、羧基烷基(caboxyalkyl)、氨基、羥基、鹵素(即，氟、氯、溴或碘)、巰基或烷硫基部分取代的嘌呤或嘧啶。優(yōu)選的烷基(即，烷基、羧基烷基等)部分包含約1、約2、約3、約4、約4、約5到約6個(gè)碳原子。嘌呤或嘧啶的其它非限制性例子包括脫氮嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、5-氟尿嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、8-溴鳥嘌呤，、8-氯鳥嘌呤、溴胸腺嘧啶、8-氨基鳥嘌呤、8-羥基鳥嘌呤、8-甲基鳥嘌呤、8-硫鳥嘌呤、氮雜鳥嘌呤、2-氨基嘌呤、5-乙基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-乙基尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-丙基尿嘧啶、硫尿嘧啶、2-甲基腺嘌呤、甲硫基腺嘌呤、N，N-二甲基腺嘌呤(diemethyladenine)、氮雜腺嘌呤、8-溴腺嘌呤、8-羥基腺嘌呤、6-羥基氨基嘌呤、6-硫嘌呤、4-(6-氨基己基/胞嘧啶)等。
可利用本文所述或本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何化學(xué)或天然合成方法將核堿基包含在核苷或核苷酸內(nèi)。
2.核苷本文所用的“核苷”指含有與核堿基接頭部分共價(jià)相連的核堿基的單個(gè)化學(xué)單元。“核堿基接頭部分”的非限制性例子是含有5個(gè)碳原子的糖(即，“5-碳糖”)，包括但不限于脫氧核糖、核糖、阿拉伯糖或5-碳糖的衍生物或類似物。5-碳糖的衍生物或類似物的非限制性例子包括2’-氟-2’-脫氧核糖或糖環(huán)中的碳被氧原子取代的碳環(huán)糖。
本領(lǐng)域已知核堿基與核堿基接頭部分的不同類型的共價(jià)連接方式。非限制性例子包括含有嘌呤(即，A或G)或7-脫氮嘌呤核堿基的核苷通常在嘌呤或7-脫氮嘌呤的9位與5-碳糖的1’位共價(jià)相連。在另一非限制性例子中，含有嘧啶核堿基(即，C、T或U)的核苷通常在嘧啶的1位與5-碳糖的1’位共價(jià)相連(Komberg和Baker，1992)。
3.核苷酸本文所用的“核苷酸”指還含有“骨架部分”的核苷。骨架部分通常將一核苷酸與含有某核苷酸的另一分子或與另一核苷酸共價(jià)相連從而形成核酸。天然存在的核苷酸的“骨架部分”通常包含與5-碳糖共價(jià)相連的磷酸部分。骨架部分的連接通常發(fā)生在5-碳糖的3’-或5’位。然而本領(lǐng)域已知其它連接類型，特別是當(dāng)核苷酸包含天然存在的5-碳糖或磷酸部分的衍生物或類似物時(shí)。
4.核酸類似物核酸可含有核堿基的衍生物或類似物、天然存在的核酸中存在的核堿基接頭部分和/或骨架部分，或完全由這些物質(zhì)構(gòu)成。本文所用的“衍生物”指天然存在分子的化學(xué)修飾或改變形式，而術(shù)語“模擬物”或“類似物”指結(jié)構(gòu)與天然存在分子或部分相似或不相似，但具有相似功能的分子。本文所用的“部分”通常指較大化學(xué)或分子結(jié)構(gòu)中的較小化學(xué)或分子組分。核堿基、核苷與核苷酸類似物或衍生物為本領(lǐng)域所熟知且已見描述(參見，例如納入本文作為參考的Scheit，1980)。
包含5-碳糖和/或骨架部分衍生物或類似物的核苷、核苷酸或核酸的其它非限制性例子見美國專利5,681,947所描述的含有與dsDNA形成三螺旋和/或防止dsDNA表達(dá)的嘌呤衍生物的寡核苷酸；美國專利5,652,099和5,763,167所述特別可用作熒光核酸探針的核酸，該核酸摻有DNA或RNA中所發(fā)現(xiàn)核苷的熒光類似物；美國專利5,614,617所描述的在嘧啶環(huán)上有取代從而提高了核酶穩(wěn)定性的寡核苷酸類似物；美國專利5,670,663、5,872,232和5,859,221所描述的用于核酸檢測的具有修飾的5-碳糖(即，修飾的2’-脫氧呋喃糖基部分)的寡核苷酸類似物；美國專利5,446,137所述，用于雜交試驗(yàn)的含有在4位用除氫以外的取代基取代的至少一個(gè)5-碳糖部分的寡核苷酸；美國專利5,886,165描述的包含含有3′-5′核苷酸間連鍵的脫氧核糖核苷酸和2’-5’核苷酸間連鍵的核糖核苷酸的寡核苷酸；美國專利5,714,606描述的3’位氧被碳取代從而提高了核酸的核酶耐受性的修飾的核苷酸間連鍵；美國專利5,672,697描述的含有一個(gè)或多個(gè)5’膦酸亞甲酯核苷酸間連鍵從而提高了核酶耐受性的寡核苷酸；美國專利5,466,786和5,792,847描述了將含有藥物或標(biāo)記的取代基部分連接到寡核苷酸的2’碳從而提高了核酶穩(wěn)定性和遞送藥物或檢測部分的能力的連接；美國專利5,223,618描述了具有連接毗鄰5-碳糖部分的4’位和3’位的2或3碳骨架連鍵從而提高了細(xì)胞攝入、核酶耐受性和對靶RNA的雜交能力的寡核苷酸類似物；美國專利5,470,967描述了可用作核酸雜交探針，含有至少一種氨基磺酸酯或硫酰胺核苷酸間連鍵的寡核苷酸；美國專利5,378,825，5,777,092，5,623,070，5,610,289和5,602,240描述了具有取代磷酸二酯骨架部分的3或4個(gè)原子的接頭部分，用于提高核酶耐受性、細(xì)胞攝入和調(diào)節(jié)RNA表達(dá)的寡核苷酸；美國專利5,858,988描述了在寡核苷酸的2′-O位置連接從而提高了其膜滲透性和穩(wěn)定性的疏水運(yùn)載體；美國專利5,214,136描述在5’末端偶聯(lián)有蒽醌從而提高了對DNA或RNA的雜交能力和對核酶穩(wěn)定性的寡核苷酸；美國專利5,700,922描述了PNA-DNA-PNA嵌合體，其中的DNA含有用于提高核酶耐受性、結(jié)合親和力與激活RNA酶H的2′-脫氧-紅-呋喃戊糖基核苷酸(2′-deoxy-erythro-pentofuranosyl nucleotide)；和美國專利5,708,154描述了與DNA相連形成DNA-RNA雜交體的RNA。
5.核酸的制備可通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何技術(shù)，例如化學(xué)合成、酶法生產(chǎn)或生物法生產(chǎn)來制備核酸。合成核酸(例如，合成的寡核苷酸)的非限制性例子包括利用磷酸三酯、亞磷酸酯或亞磷酰胺化學(xué)和固相技術(shù)(例如納入本文作為參考的EP266,032所述)，或如Froehler等，1986和美國專利系列號(hào)5,705,629(每篇均納入本文作為參考)所述經(jīng)脫氧核苷H-膦酸酯中間體在體外化學(xué)合成制備的核酸。本發(fā)明的方法可使用一種或多種寡核苷酸。各種不同的寡核苷酸合成機(jī)理公開于，例如美國專利4,659,774；4,816,571；5,141,813；5,264,566；4,959,463；5,428,148；5,554,744；5,574,146；5,602,244(每篇均納入本文作為參考)。
酶法產(chǎn)生的核酸的非限制性例子包括在擴(kuò)增反應(yīng)，例如PCRTM(參見例如，美國專利4,683,202和美國專利4,682,195，每篇均納入本文作為參考)中利用酶產(chǎn)生的核酸或如納入本文作為參考的美國專利5,645,897所述的寡核苷酸合成所產(chǎn)生的核酸。生物法產(chǎn)生的核酸的非限制性例子包括在活細(xì)胞中產(chǎn)生(即，復(fù)制)的重組核酸，例如在細(xì)菌中復(fù)制的重組DNA載體(參見例如，納入本文作為參考的Sambrook等，1989)。
6.核酸的純化可通過聚丙烯酰胺凝膠、氯化銫梯度離心或本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何其它方法來純化核酸(參見例如，納入本文作為參考的Sambrook等，1989)。
在某些方面，本發(fā)明涉及的核酸是分離的核酸。本文所用的術(shù)語“分離的核酸”指分離掉，或者不帶有一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的大多數(shù)總基因組和所轉(zhuǎn)錄核酸的核酸分子(例如，RNA或DNA分子)。在某些實(shí)施方案中，“分離的核酸”指分離掉，或者不帶有大多數(shù)細(xì)胞組分或體外反應(yīng)組分(例如大分子，如脂質(zhì)或蛋白質(zhì)，小生物分子等)的核酸分子。
7.核酸區(qū)段在某些實(shí)施方案中，所述核酸是核酸區(qū)段。本文所用的術(shù)語“核酸區(qū)段”是較小的核酸片段，非限制性的例子有只含有對給定多核苷酸的一部分調(diào)節(jié)序列的片段。
8.互補(bǔ)核酸本發(fā)明也包括與本發(fā)明的核酸互補(bǔ)的核酸。例如，在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，包括與SEQ ID NO12、SEQ ID NO13、SEQ ID NO17和SEQ ID NO18所示序列互補(bǔ)的核酸或核酸區(qū)段。當(dāng)核酸能按照標(biāo)準(zhǔn)的Watson-Crick、Hoogsteen或反向Hoogsteen結(jié)合互補(bǔ)規(guī)則與另一核酸進(jìn)行堿基配對時(shí)，該核酸是另一核酸的“互補(bǔ)體”或與其“互補(bǔ)”。本文所用的“另一核酸”可以指分離的分子或同一分子的空間上分離的序列。
本文所用的術(shù)語“互補(bǔ)”或“互補(bǔ)體”也指含有能與另一核酸鏈或雙螺旋雜交的連續(xù)核堿基或半連續(xù)核堿基(例如，一個(gè)或多個(gè)核堿基部分不存在于分子中)序列的核酸，即使不是所有的核堿基都與對應(yīng)的核堿基配對。在某些實(shí)施方案中，“互補(bǔ)的”核酸所含序列中約70％、約71％、約72％、約73％、約74％、約75％、約76％、約77％、約77％、約78％、約79％、約80％、約81％、約82％、約83％、約84％、約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％到約100％和可從上述范圍中衍生的任何范圍的核堿基序列能在雜交過程中與單鏈或雙鏈核酸分子堿基配對。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)理解，在某些實(shí)施方案中，術(shù)語“互補(bǔ)的”指可在嚴(yán)緊條件下與另一核酸鏈或雙螺旋雜交的核酸。
在某些實(shí)施方案中，“部分互補(bǔ)”的核酸含有可在低嚴(yán)緊條件下與單鏈或雙鏈核酸雜交的序列，或者含有其中少于約70％的核堿基序列能在雜交過程中與單鏈或雙鏈核酸分子堿基配對的序列。
9.雜交本文使用的“雜交”、“進(jìn)行雜交”或“能雜交”應(yīng)理解為指形成雙鏈或三鏈分子或具有部分雙鏈或三鏈特征的分子。本文所用的術(shù)語“退火”與“雜交”同義。術(shù)語“雜交”、“進(jìn)行雜交”或“能雜交”包括術(shù)語“嚴(yán)緊條件”或“高嚴(yán)緊性”和術(shù)語“低嚴(yán)緊性”或“低嚴(yán)緊條件”。
本文所用的“嚴(yán)緊條件”或“高嚴(yán)緊性”是允許在含有互補(bǔ)序列的一條或多條核酸鏈之間或在其中進(jìn)行雜交，但排除了隨機(jī)序列雜交的條件。嚴(yán)緊條件允許核酸和靶鏈之間有少許(如果有的話)錯(cuò)配。這些條件為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知，對需要高度選擇性的應(yīng)用而言是優(yōu)選的。所述應(yīng)用的非限制性例子包括分離核酸，例如基因或其核酸區(qū)段，或檢測至少一種特異性mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或其核酸區(qū)段等。
嚴(yán)緊條件可包括低鹽和/或高溫條件，例如約0.02M到約0.15M的NaCl，溫度為約50℃到70℃。應(yīng)該理解的是所需嚴(yán)緊性的溫度和離子強(qiáng)度部分取決于具體核酸的長度、靶序列的長度與核堿基含量、核酸的電荷組成和雜交混合物中是否存在甲酰胺、氯化四甲銨或其它溶劑或它們的濃度。
也應(yīng)理解雜交的這些范圍、組成和條件只是非限制性例子，具體雜交反應(yīng)所需的嚴(yán)緊性往往通過與一種或多種陽性或陰性對照相比較從而憑經(jīng)驗(yàn)確定。根據(jù)所設(shè)想的應(yīng)用，優(yōu)選利用不同的雜交條件來實(shí)現(xiàn)核酸對靶序列不同程度的選擇性。在一非限制性例子中，可通過在低溫和/或高離子強(qiáng)度時(shí)進(jìn)行雜交來鑒定或分離在嚴(yán)緊條件下不與核酸雜交的相關(guān)靶核酸。這種條件稱為“低嚴(yán)緊性”或“低嚴(yán)緊條件”，低嚴(yán)緊性的非限制性例子包括在約0.15M到約0.9M的NaCl，約20℃到約50℃的溫度時(shí)進(jìn)行雜交。本領(lǐng)域的技術(shù)人員當(dāng)然還能改進(jìn)低或高嚴(yán)緊性條件以適合于具體應(yīng)用。
本發(fā)明的核酸(無論其自身長度)可與其它核酸序列，包括但不限于啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、聚腺苷酸化信號(hào)、限制性酶切位點(diǎn)、多克隆位點(diǎn)、編碼區(qū)段等結(jié)合以產(chǎn)生一種或多種核酸構(gòu)建物。本文所用的“核酸構(gòu)建物”是通過人工進(jìn)行工程改造或改變的核酸，通常含有人工組織起來的一種或多種核酸序列。
例如，在一非限制性例子中，可將一個(gè)或多個(gè)核酸構(gòu)建物制備為包含有與SEQ ID NO12、SEQ ID NO13、SEQ ID NO17或SEQ ID NO18所示序列相同或互補(bǔ)的核苷酸毗連延伸段。核酸構(gòu)建物可以長約3、約5、約8、約10到約14、或者約15、約20、約30、約40、約50、約100、約200、約500、約1,000、約2,000、約3,000、約5,000、約10,000、約15,000、約20,000、約30,000、約50,000、約100,000、約250,000、約500,000、約750,000到約1,000,000個(gè)核苷酸，并且倘若出現(xiàn)(giventhe advent of)例如酵母人工染色體的核酸構(gòu)建物，則本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可知達(dá)到和包括染色體大小(包括所有中間長度和中間范圍)的體積更大的構(gòu)建物。不難理解本文所用的“中間長度”和“中間范圍”指包括所例舉數(shù)值或在其之間的任何長度和范圍(即，包括這種數(shù)值或在其之間的所有整數(shù))。中間長度的非限制性例子包括約11、約12、約13、約16、約17、約18、約19等；約21、約22、約23等；約31、約32等；約51、約52、約53等；約101、約102、約103等；約151、約152、約153等；約1,001、約1002等；約50,001、約50,002等；約750,001、約750,002等；約1,000,001、約1,000,002等。中間范圍的非限制性例子包括約3到約32、約150到約500,001、約3,032到約7,145、約5,000到約15,000、約20,007到約1,000,003等。
諸如“基本上如SEQ ID NO12所示的序列”或“基本上如SEQ ID NO13所示的序列”的術(shù)語指該序列基本上對應(yīng)于SEQ ID NO12和SEQ ID NO13所示部分并且具有較少的核苷酸與SEQ ID NO12和/或SEQ ID NO13各自所示核苷酸不同，或具有這些核苷酸的生物學(xué)功能等價(jià)物。因此，“基本上如SEQ IDNO12所示的序列”或“基本上如SEQ ID NO13所示的序列”包括含有部分或全部SEQ ID NO12和/或SEQ ID NO13所示核酸序列的核酸、核酸區(qū)段和基因。
本領(lǐng)域熟知術(shù)語“生物學(xué)功能等價(jià)物”，本文對它進(jìn)行了更詳細(xì)的定義。相應(yīng)而言，具有約70％和約80％之間；或更優(yōu)選約81％和約90％之間；或甚至更優(yōu)選約91％和約99％之間的核苷酸與本文所述序列，例如示范性的SEQ IDNO12、SEQ ID NO13、SEQ ID NO17或SEQ ID NO18的核苷酸相同或功能等價(jià)的序列分別為“基本上如SEQ ID NO12、SEQ ID NO13、SEQ ID NO17或SEQ ID NO18所示”的序列，只要該序列的生物學(xué)活性得以保留。
在某些其它實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及至少一種在其序列中包含有基本上如SEQ ID NO12、SEQ ID NO13、SEQ ID NO17或SEQ ID NO18所示核酸序列的重組載體。
III.治療性多核苷酸本發(fā)明包括的其表達(dá)受本發(fā)明控制序列所控制的治療性多核苷酸可以是任何種類，只要其所編碼的基因產(chǎn)物能產(chǎn)生抗癌癥作用?？拱┌Y作用包括誘導(dǎo)至少一種癌細(xì)胞凋亡，抑制至少一種癌細(xì)胞增殖，緩解個(gè)體中至少一次癌癥癥狀等。在具體的實(shí)施方案中，治療性多核苷酸編碼Bik的突變形式，包括全文納入本文作為參考的美國專利申請?zhí)?0/816,698所述的示范性BikT33D、BikS35D和BikT33DS35D突變體。
治療性多核苷酸可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知或以后發(fā)現(xiàn)的任何種類。在具體的實(shí)施方案中，它們編碼細(xì)胞增殖抑制劑、程序性細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)劑、腫瘤抑制劑和/或細(xì)胞增殖誘導(dǎo)物的反義序列。治療性多核苷酸可以編碼小干擾RNA或反義序列。治療性多核苷酸的例子包括編碼TNFα或p53的多核苷酸，或編碼凋亡的多肽誘導(dǎo)物，包括但不限于Bik、p53、Bax、Bak、Bcl-x、Bad、Bim、Bok、Bid、Harakiri、Ad E1B、Bad和ICE-CED3蛋白酶的多核苷酸。例如，其它示范性治療性多核苷酸包括編碼成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤(蛋白)、Blk、IL-12、IL-10、IFN-a、胞嘧啶脫氨酶、GM-CSF、E1A和其它促凋亡蛋白質(zhì)的多核苷酸。也可利用編碼蘇氨酸33、絲氨酸35處或兩處均有氨基酸取代的突變Bik的多核苷酸。在這些實(shí)施方案的具體方面，用天冬氨酸取代突變Bik多肽的所述氨基酸。在其它具體方面，突變Bik中的一個(gè)或多個(gè)磷酸化位點(diǎn)有缺陷。其它治療性多核苷酸包括TNFα或p53，或凋亡誘導(dǎo)物，包括但不限于Bik、p53、Bax、Bak、Bcl-x、Bad、Bim、Bok、Bid、Harakiri、Ad E1B、Bad和ICE-CED3蛋白酶。
IV.核酸遞送本發(fā)明諸方面的總體方法涉及上述組合物和/或治療劑，其提供含有編碼特定的和/或所需突變型Bik蛋白、多肽和肽的基因構(gòu)建物，從而允許這些蛋白質(zhì)、多肽或肽發(fā)揮所需要的活性。雖然認(rèn)為該基因構(gòu)建物和/或蛋白質(zhì)可被直接輸送，但優(yōu)選實(shí)施方式包括向細(xì)胞提供特定和所需蛋白質(zhì)、多肽和肽的編碼核酸。這樣提供后，細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯機(jī)制能合成蛋白性組合物，及該表達(dá)構(gòu)建物可提供的任何組分。提供反義物、核酶和其它抑制劑時(shí)，優(yōu)選的方式也是向細(xì)胞提供編碼該構(gòu)建物的核酸。
在本發(fā)明某些實(shí)施方式中，可將編碼該基因的核酸穩(wěn)定整合入細(xì)胞的基因組中。其它實(shí)施方式中，此核酸可作為DNA的分離的游離體區(qū)段穩(wěn)定維持在細(xì)胞中。這類核酸區(qū)段和“游離體”編碼的序列在宿主細(xì)胞周期同步過程中，能充分保留和獨(dú)立復(fù)制。表達(dá)構(gòu)建物如何被輸送給細(xì)胞，和/或在細(xì)胞中核酸如何保留取決于所用的表達(dá)構(gòu)建物的類型。
A.利用病毒載體輸送DNA某些病毒能感染細(xì)胞并通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞機(jī)制進(jìn)入細(xì)胞整合到宿主細(xì)胞基因組中，和/或穩(wěn)定和/或有效地表達(dá)病毒基因，從而使它們成為外源基因轉(zhuǎn)移到哺乳動(dòng)物的有吸引力的候選者。本發(fā)明優(yōu)選的基因治療載體通常是病毒載體。
雖然某些病毒能接受異源遺傳物質(zhì)，但受到它們可容納的核苷酸數(shù)量的限制，和/或它們可感染的細(xì)胞范圍限制，已證明這些病毒成功地進(jìn)行了基因表達(dá)。然而，腺病毒不能將其遺傳物質(zhì)整合入宿主基因組中，和/或因而基因表達(dá)不需要宿主復(fù)制機(jī)制，使其非常適合快速有效的異源基因表達(dá)。制備復(fù)制缺陷性感染病毒的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。
當(dāng)然，采用病毒輸送系統(tǒng)，需要充分純化病毒粒子，使其基本上沒有不良污染物，如缺陷性干擾性病毒顆粒、內(nèi)毒素和其它熱原質(zhì)，從而不會(huì)在接受該載體構(gòu)建物的細(xì)胞、動(dòng)物和個(gè)體中引起任何不良反應(yīng)。純化載體的優(yōu)選方法包括采用浮力密度梯度離心，如氯化銫梯度離心。
1.腺病毒載體輸送表達(dá)構(gòu)建物的具體方法包括利用腺病毒表達(dá)載體。雖然已知腺病毒載體整合入基因組DNA的能力低，但這些載體賦予的高效基因轉(zhuǎn)移抵消了此缺點(diǎn)?！跋俨《颈磉_(dá)載體”意味著包括含有腺病毒序列的那些構(gòu)建物，能(a)支持該構(gòu)建物的包裝和/或(b)能最終克隆到其中的組織和/或細(xì)胞特異性結(jié)構(gòu)中表達(dá)。
該表達(dá)載體含有經(jīng)基因工程改造形式的腺病毒。已知腺病毒的基因組成是36kb的線性雙鏈DNA病毒，允許用長達(dá)7kb的外源序列置換腺病毒DNA的大片段(Grunhaus和Horwitz，1992)。與逆轉(zhuǎn)錄病毒相反，腺病毒感染宿主細(xì)胞不會(huì)導(dǎo)致染色體整合，因?yàn)橄俨《綝NA能以游離體方式復(fù)制而無潛在的基因毒性。還有，腺病毒結(jié)構(gòu)上穩(wěn)定，和/或大量擴(kuò)增后未測到基因組重排。
腺病毒特別適合用作基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，因?yàn)槠浠蚪M大小適中，易操作，效價(jià)高，靶細(xì)胞范圍廣泛和/或感染力高。該病毒基因組二端含有100-200個(gè)堿基對的反向重復(fù)序列(ITR)，它們是病毒DNA復(fù)制和/或包裝所必須的順式元件。其基因組的早期(E)和/或晚期(L)區(qū)域含有受病毒DNA復(fù)制驅(qū)動(dòng)的不同轉(zhuǎn)錄單位。其E1區(qū)(E1A和/或E1B)編碼負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)病毒基因組和/或幾種細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)。E2區(qū)(E2A和E2B)表達(dá)導(dǎo)致合成病毒DNA復(fù)制的蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)參與DNA復(fù)制、后期基因表達(dá)和/或宿主細(xì)胞關(guān)閉(Renan，1990)。后期基因的產(chǎn)物包括大多數(shù)病毒衣殼蛋白，只是在主要后期啟動(dòng)子(MLP)產(chǎn)生的一個(gè)原代轉(zhuǎn)錄物經(jīng)過有效加工后才表達(dá)。在感染后期此MLP(位于16.8m.u.)特別有效，和/或此啟動(dòng)子產(chǎn)生的所有mRNA含有5’-三聯(lián)前導(dǎo)(TPL)序列，使它們能優(yōu)先翻譯mRNA。
在此系統(tǒng)中，通過穿梭載體和前病毒載體之間的同源重組產(chǎn)生重組腺病毒。由于二個(gè)前病毒載體之間有可能重組，因此可產(chǎn)生野生型腺病毒。故從單一空斑分離單克隆病毒和/或檢測其基因組結(jié)構(gòu)很是重要。
產(chǎn)生和/或增殖復(fù)制缺陷性的此種腺病毒載體依賴于獨(dú)特的輔助細(xì)胞系，稱為293細(xì)胞系，產(chǎn)生自身Ad5 DNA片段轉(zhuǎn)化的人胚腎細(xì)胞，能組成性表達(dá)E1蛋白質(zhì)(E1A和/或E1B；Graham等，1977)。由于E3區(qū)不一定來自腺病毒基因組(Jones和Shenk，1978)，此腺病毒載體在293細(xì)胞幫助下能在E1區(qū)、D3區(qū)和這二區(qū)中攜帶外源DNA(Graham和Prevec，1991)。最近已報(bào)道了在E4區(qū)中含有缺失的腺病毒載體(美國專利5,670,488，納入本文作參考)。
實(shí)際上腺病毒可包裝大約105％的野生型基因組(Ghosh-Choudhury等，1987)提供額外的大約2kbDNA容量。加上E1和/或E3區(qū)中可替代的大約5.5kbDNA，此腺病毒載體的最大容量在7.5kb，和/或該載體總長的大約15％。該載體骨架中保留了80％以上的腺病毒基因組。
輔助細(xì)胞系可衍生自人細(xì)胞，如人胚腎細(xì)胞、肌細(xì)胞、造血細(xì)胞和其它人胚胎間充質(zhì)和上皮細(xì)胞。或者，輔助細(xì)胞可衍生自其它種類哺乳動(dòng)物的允許人腺病毒(生長)的細(xì)胞。這類細(xì)胞包括，如Vero細(xì)胞和其它猴胚胎間充質(zhì)和/或上皮細(xì)胞。如上所述，優(yōu)選的輔助細(xì)胞系是293。
最近，Racher等，(1995)公開了培養(yǎng)293細(xì)胞和/或增殖腺病毒3的改進(jìn)方法。一種方式中，通過在含100-200ml培養(yǎng)液的1升硅化旋轉(zhuǎn)瓶(Techne，Cambridge，UK)中接種單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)成天然細(xì)胞集落。以40rpm攪拌后用臺(tái)酚蘭估計(jì)細(xì)胞活力。另一方式中，如下采用Fibra-Cel微載體(Bibby Sterlin，Stone，UK)(5g/l)。細(xì)胞接種重懸于5ml培養(yǎng)液中，加入到250ml Erlenmeyer瓶的載體(50ml)中，和/或靜置1-4小時(shí)，偶而攪動(dòng)。用50ml新鮮培養(yǎng)液替換原培養(yǎng)液和/或搖動(dòng)。為產(chǎn)生病毒，讓細(xì)胞生長至80％匯合，然后更換培養(yǎng)液(至25％最終體積)和/或加入0.05MOI的腺病毒。培養(yǎng)物靜置過夜，然后體積增加到100％和/或再開始搖動(dòng)72小時(shí)。
除了要求腺病毒載體是復(fù)制缺陷型和至少是條件缺陷型的之外，不認(rèn)為腺病毒載體的性質(zhì)對成功實(shí)施本發(fā)明是關(guān)鍵性的。腺病毒可以是已知的42種不同血清型和A-F亞組中的任何一種。優(yōu)選亞組C的5型腺病毒作為起始材料，以獲得用于本發(fā)明的條件性復(fù)制缺陷型腺病毒載體。這是因?yàn)?型腺病毒是人腺病毒，已知道其大量的生化和遺傳信息，并且歷史上已被用于采用腺病毒作載體的大多數(shù)構(gòu)建物中。
如上所述，本發(fā)明典型的載體是復(fù)制缺陷型的、不含有腺病毒的E1區(qū)。因此最方便的是在E1編碼序列已被去除的部位導(dǎo)入轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)。然而，該結(jié)構(gòu)插入腺病毒序列中的部位對本發(fā)明不是關(guān)鍵的?？扇鏚arlsson等，(1986)所述，將編碼感興趣基因的聚核苷酸插入E3取代載體中E3缺失區(qū)位置，在E4區(qū)中輔助細(xì)胞系和輔助病毒互補(bǔ)了E4的缺失。
腺病毒的培養(yǎng)和/或操作是該領(lǐng)域技術(shù)人員知道的，腺病毒顯示在體外和體內(nèi)有著廣泛的宿主范圍。此屬病毒可獲得高效價(jià)，如每毫升109-1011空斑形成單位，它們具有高感染力。腺病毒的生命周期不需要整合入宿主細(xì)胞基因組中。腺病毒載體輸送的外源基因是游離體，因此對宿主細(xì)胞基因毒性低。接種野生型腺病毒的研究未見副作用報(bào)道(Couch等，1963；Top等，1971)，證明作為體內(nèi)基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體它們是安全的和/或有治療潛力。
腺病毒載體已用于真核基因表達(dá)(Levrero等，1991；Gomez-Foix等，1992)和疫苗開發(fā)(Grunhaus和Horwitz，1992；Graham和Prevec，1992)。最近，動(dòng)物研究提示，重組腺病毒可用于基因治療(Stratford-Perricaudet和Perricaudet，1991a；(Stratford-Perricaudet等，1991b；Rich等，1993)。將重組腺病毒給予不同組織，包括氣管灌注(Rosenfeld等，1991；Rosenfeld等，1992)、肌肉注射(Ragot等，1993)、外周靜脈注射(Herz和Gerard，1993)和/或腦內(nèi)定位接種(Le Gal La Salle等，1993)。重組腺病毒和腺病毒相關(guān)病毒(見下)能感染和轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂性人原代細(xì)胞。
2.AAV載體腺病毒相關(guān)病毒(AAV)是用于本發(fā)明細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的一種有吸引力的載體系統(tǒng)，因?yàn)樗项l率高，可感染非分裂細(xì)胞，使其可將基因輸送到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，例如組織培養(yǎng)物中(Muzyczka，1992)和體內(nèi)。AAV感染性具有廣泛宿主范圍(Tratschin等，1984；Laughlin等，1986；Lebkowski等，1988；McLaughlin等，1988)。關(guān)于rAAV載體產(chǎn)生和用途的詳述見美國專利No.5,139,941和/或4,797,368，各自納入本文作參考。
證明AAV可用于基因輸送的研究包括LaFace等，(1988)；Zhou等(1993)；Flotte等(1993)；Walsh等(1994)。重組AAV載體已成功用于體外和/或體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)標(biāo)記基因(Kaplitt等，1994；Lebkowski等，1988；Samulski等，1989；Yoder等，1994；Zhou等1994；Hermonat和Muzyczka，1984；Tratschin等，1985；McLaughlin等，1988)和涉及人類疾病的基因(Flotte等，1992；Luo等，1994；Ohi等，1990；Walsh等，1994；Wei等，1994)。最近AAV載體已批準(zhǔn)用于治療膀胱纖維變性的I期人體試驗(yàn)。
AAV是一種依賴性細(xì)小病毒，需要另一種病毒(或是腺病毒或皰疹病毒家族某成員)共感染才能在培養(yǎng)細(xì)胞中經(jīng)歷產(chǎn)毒性感染(Muzyczka，1992)。缺少輔助病毒共感染時(shí)，野生型AAV基因組通過其兩末端整合入人染色體19中，在那兒以潛伏狀態(tài)作為前病毒居留(Kotin等，1990；Samulski等，1991)。然而，rAAV整合不限于染色體19，除非AAV的Rep蛋白也表達(dá)(Shelling和Smith，1994)。當(dāng)攜帶AAV前病毒的細(xì)胞加上輔助病毒感染時(shí)，可從該染色體和從重組質(zhì)粒中“拯救”AAV基因組，和/或建立正常的產(chǎn)毒性感染(Samulski等，1989；McLaughlin等，1988；Kotin等，1990；Muzyczka，1992)。
通常，通過共轉(zhuǎn)染含有側(cè)接二個(gè)AAV末端重復(fù)序列的感興趣基因的質(zhì)粒(McLaughlin等，1988；Samulski等，1989；各自納入本文作參考)和/或含有野生型AAV編碼序列而無末端重復(fù)序列的表達(dá)質(zhì)粒，如pIM45(McCarty等，1991；納入本文作參考)來制備重組AAV(rAAV)。也用腺病毒和攜帶AAV輔助功能所需腺病毒基因的質(zhì)粒感染和轉(zhuǎn)染細(xì)胞。以此種方式制備的rAAV病毒貯藏液有腺病毒污染，必須用物理方法將其與rAAV顆粒分離(例如氯化銫密度離心)。或者，可采用含AAV編碼區(qū)的腺病毒載體和含AAV編碼區(qū)及某些和所有腺病毒輔助基因的細(xì)胞系(Yang等，1994；Clark等，1995)。也可采用攜帶rAAV DNA作為整合前病毒的細(xì)胞系(Flotte等，1995)。
3.逆轉(zhuǎn)錄病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒作為基因輸送載體具有應(yīng)用前景，因?yàn)樗鼈兡軐⑵浠蛘先胨拗骰蚪M中，而轉(zhuǎn)運(yùn)大量的外源性遺傳物質(zhì)，能感染廣譜的物種和細(xì)胞類型，并被包裝在特定的細(xì)胞系中(Miller，1992)。
逆轉(zhuǎn)錄病毒是一組單鏈RNA病毒，特征是能通過逆轉(zhuǎn)錄過程在感染細(xì)胞中將其RNA轉(zhuǎn)變成雙鏈DNA(Coffin，1990)。產(chǎn)生的DNA然后穩(wěn)定整合入細(xì)胞染色體中成為前病毒，和/或指導(dǎo)病毒蛋白質(zhì)的合成。整合導(dǎo)致在受體細(xì)胞和/或其后代中保留該病毒的基因序列。逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組含有分別編碼衣殼蛋白質(zhì)、聚合酶和包膜組分的三個(gè)基因gag，pol和/或env。Gag基因上游的序列含有將其基因組包裝到病毒粒子中的信號(hào)。在病毒基因組的5’和3’末端有兩個(gè)長末端重復(fù)(LTR)序列。這些病毒含有的強(qiáng)啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列也是整合入宿主細(xì)胞基因組所需要的(Coffin，1990)。
為了構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，將編碼感興趣基因的核酸插入病毒基因組某些病毒序列處產(chǎn)生復(fù)制缺陷型病毒。為了產(chǎn)生病毒粒子，需構(gòu)建含gag，pol和env基因但無LTR的包裝細(xì)胞系和包裝組分(Mann等，1983)。當(dāng)將含cDNA的重組質(zhì)粒，與逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR和包裝序列一起導(dǎo)入(例如通過磷酸鈣沉淀)此細(xì)胞系中時(shí)，包裝序列能使重組質(zhì)粒進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)錄并被包裝成為病毒顆粒，然后分泌到培養(yǎng)液中(Nicolas和Rubenstein，1988；Temin，1986；Mann等，1983)。收集含重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的培養(yǎng)液，任選地濃縮，用于基因轉(zhuǎn)運(yùn)。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能感染廣泛的各種細(xì)胞類型。然而，其整合和/或穩(wěn)定表達(dá)需要宿主細(xì)胞分裂(Paskind等，1975)。
與采用缺陷性逆轉(zhuǎn)錄病毒載體有關(guān)的是可能在包裝細(xì)胞中出現(xiàn)野生型復(fù)制活性病毒。這可能是由于gag，pol env序列上游重組病毒插入物的完整序列整合入宿主細(xì)胞基因組中所致。然而，現(xiàn)已有新的包裝細(xì)胞系可大大減少重組的可能性(Markowitz等，1988；Hersdorffer等，1990)。
已報(bào)道了采用第二代逆轉(zhuǎn)錄病毒載體輸送基因。Kasahara等(1994)制備了莫洛尼小鼠白血病病毒的工程改造變體，通常只能感染小鼠細(xì)胞，其包膜蛋白經(jīng)過修飾，使該病毒能特異性結(jié)合和感染攜帶有紅細(xì)胞生成素(EPO)受體的人細(xì)胞。這一點(diǎn)是通過將EPO序列的一部分插入包膜蛋白中而產(chǎn)生具有新結(jié)合特性的嵌合蛋白而實(shí)現(xiàn)的。
4.其它病毒載體可采用其它病毒載體作為本發(fā)明中的表達(dá)構(gòu)建物。可采用衍生自病毒，如牛痘病毒(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Coupar等，1988)、新德比斯病毒、巨細(xì)胞病毒和單純皰疹病毒的載體。對于各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞它們可賦予幾種有吸引力的特征(Friedmann，1989；Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Coupar等，1988；Horwich等，1990)。
隨著最近發(fā)現(xiàn)的缺陷型乙肝病毒，對于不同病毒序列的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系有了新的理解。體外研究顯示，該病毒盡管其基因組缺失了80％以上，仍可保留輔助-依賴性包裝和逆轉(zhuǎn)錄能力(Horwich等，1990)。這提示，其基因組的大部分可用外源遺傳物質(zhì)替代。Chang等最近將氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因?qū)滕喴腋尾《净蚪M的聚合酶、表面和/或pre-表面抗原編碼序列位置。將其與野生型病毒共轉(zhuǎn)染入禽肝細(xì)胞瘤細(xì)胞系中。用含有高效價(jià)重組病毒的培養(yǎng)液感染了原代鴨肝細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后至少24天中測到CAT基因的穩(wěn)定表達(dá)。
某些其它實(shí)施方式中，基因療法的載體是HSV。使HSV成為有吸引力的載體的因素是其基因組的大小和組成。因?yàn)镠SV大，與其它較小病毒系統(tǒng)相比，加入多個(gè)基因和表達(dá)盒不成問題。此外，可得到具有不同性能(溫度、強(qiáng)度等)的不同病毒調(diào)控序列，使其比其它系統(tǒng)能在更大程度上控制表達(dá)。還有一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是該病毒具有較少剪接的信使，易于遺傳操作。HSV也較易操縱和/或可高效價(jià)生長。因此就獲得足夠MOI所需體積和重復(fù)劑量需要較少而言，輸送問題不大。
5.修飾的病毒本發(fā)明其它實(shí)施方式中，待輸送的核酸包含在經(jīng)基因工程改造能表達(dá)特異性結(jié)合配體的感染性病毒中。因而該病毒顆粒能特異性結(jié)合靶細(xì)胞的同源受體，將其組分輸送給細(xì)胞。依靠在病毒包膜上化學(xué)加入乳糖殘基化學(xué)修飾逆轉(zhuǎn)錄病毒，最近設(shè)計(jì)開發(fā)了特異性靶向逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的新方法。此種修飾可使該病毒通過唾液酸糖蛋白受體而特異性感染肝細(xì)胞。
設(shè)計(jì)了使重組逆轉(zhuǎn)錄病毒靶向的另一種方法，是采用抗逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋白和/或抗特異性細(xì)胞受體的生物素化抗體。該抗體用鏈霉親和素經(jīng)生物素組分偶聯(lián)(Roux等，1989)。采用抗主要組織相容性復(fù)合體I類和II類抗原的抗體，他們證明可體外用親嗜性病毒感染各種帶有這些表面抗原的人細(xì)胞(Roux等，1989)。
B.DNA輸送的其它方法本發(fā)明的不同實(shí)施方式中，將DNA作為表達(dá)構(gòu)建物輸送給細(xì)胞。為了有效表達(dá)基因構(gòu)建物，必須將該表達(dá)構(gòu)建物輸送給細(xì)胞。如上所述，優(yōu)選的輸送方法是通過病毒感染，將表達(dá)構(gòu)建物在感染性病毒顆粒中殼體化。然而，本發(fā)明也考慮用幾種非病毒方法轉(zhuǎn)運(yùn)表達(dá)構(gòu)建物到細(xì)胞中。本發(fā)明一實(shí)施方式中，表達(dá)構(gòu)建物只由裸露重組DNA和/或質(zhì)粒組成。該構(gòu)建物的轉(zhuǎn)運(yùn)可采用物理和/或化學(xué)方法透過細(xì)胞膜進(jìn)行。如下所述是一些可成功用于體內(nèi)和/或活體外的方法。
C.脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染本發(fā)明另一實(shí)施方式中，可將表達(dá)構(gòu)建物包裹在脂質(zhì)體中。脂質(zhì)體是以磷脂雙層膜和/或內(nèi)部水性介質(zhì)為特征的囊泡性結(jié)構(gòu)。多層脂質(zhì)體具有被水性介質(zhì)分隔的多層脂質(zhì)層。當(dāng)將磷脂懸浮在過量水溶液中時(shí)可自發(fā)性形成脂質(zhì)體。在形成封閉結(jié)構(gòu)和/或包裹水份和/或?qū)⑷苜|(zhì)溶解在脂質(zhì)雙層間之前，脂成分經(jīng)歷了自身重排(Ghosh和Bachhawat，1991)。也考慮表達(dá)構(gòu)建物與脂轉(zhuǎn)染胺(Lipofectamine，Gibco BRL)的復(fù)合物。
脂質(zhì)體介導(dǎo)的核酸輸送和外源DNA的體外表達(dá)已非常成功(Nicolau和Sene，1982；Fraley等，1979；Nicolau等，1987)。Wong等(1980)證明了在培養(yǎng)的雞胚、HeLa和肝細(xì)胞瘤細(xì)胞中脂質(zhì)體介導(dǎo)的外源DNA輸送和/或表達(dá)的可行性。
本發(fā)明某些實(shí)施方式中，可將脂質(zhì)體與血凝性病毒(HVJ)組成復(fù)合物，顯示促進(jìn)了與細(xì)胞膜的融合和/或促進(jìn)了脂質(zhì)體包裹DNA進(jìn)入細(xì)胞(Kaneda等，1989)。本發(fā)明其它實(shí)施方式中，將脂質(zhì)體與核內(nèi)非組蛋白性染色體蛋白質(zhì)(HMG-1)復(fù)合和/或結(jié)合運(yùn)用(Kato等，1991)。其它實(shí)施方式中，將脂質(zhì)體與HVJ和HMG-1二者復(fù)合和/或結(jié)合運(yùn)用。其它實(shí)施方式中，輸送載體可包含配體和脂質(zhì)體。當(dāng)在DNA構(gòu)建物中采用細(xì)菌啟動(dòng)子時(shí)，最好還將合適的細(xì)菌聚合酶包含在脂質(zhì)體中。
本發(fā)明人考慮可將neu-抑制性基因產(chǎn)物用脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移導(dǎo)入細(xì)胞。Nabel等(1990)提出，可將這類構(gòu)建物與脂質(zhì)體偶聯(lián)，通過導(dǎo)管直接導(dǎo)入。采用這些方法，neu-抑制性基因產(chǎn)物可在體內(nèi)特定部位有效表達(dá)，不只是在靜脈注射可抵達(dá)的肝、脾細(xì)胞中表達(dá)。因此，本發(fā)明還包含neu-抑制基因產(chǎn)物編碼DNA構(gòu)建物的組合物(配制成DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物)，和使用這種構(gòu)建物的方法。
如美國專利No.5,641,484所述，脂質(zhì)體特別適合治療HER2/neu介導(dǎo)的癌癥。
可用Gao等(1991)的方法制備動(dòng)物細(xì)胞Bik的有效轉(zhuǎn)染試劑陽離子脂質(zhì)體。Gao等描述了一步合成的新的陽離子膽固醇衍生物。據(jù)報(bào)道此種脂質(zhì)制備的脂質(zhì)體用于轉(zhuǎn)染更有效，對處理細(xì)胞的毒性比用Lipofectin試劑制備的低。這些脂質(zhì)是DC-Chol(“3’(N-(N’N’-二甲基胺乙烷)-氨甲酰膽固醇”)和DOPE(“二油酰磷脂酰乙醇胺”)。生產(chǎn)這些脂質(zhì)體的步驟如下。
通過膽甾烯基氯甲酸酯和N，N-二甲基乙二胺簡單的反應(yīng)合成DC-Chol。將膽甾烯基氯甲酸酯溶液(2.25g，5mmol，用5ml無水氯仿配)0℃逐滴加入到過量N，N-二甲基乙二胺的溶液(2ml，18.2mmol，溶于3ml無水氯仿)中。蒸發(fā)除去溶劑后，4℃在無水乙醇中重結(jié)晶純化殘留物，真空干燥。產(chǎn)品是白色DC-Chol粉末。
在氯仿中混合1.2□μmol DC-Chol和8.0□μmol DOPE制備陽離子脂質(zhì)體。干燥該混合物，真空干燥，在試管中重懸于1ml stero 20mM Hepes緩沖液(pH7.8)中。4℃水合24小時(shí)后，將分散物超聲波儀超聲處理5-10分鐘，形成平均直徑150-200nm的脂質(zhì)體。
制備脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物，發(fā)明人采用如下步驟。將待轉(zhuǎn)染的DNA放在DMEM/F12培養(yǎng)液中，比例為15μg DNA比50μl DMEM/F12。用DMEM/F12稀釋DC-Chol/DOPE脂質(zhì)體混合物至50μl DMEM/F12比100μl脂質(zhì)體。然后輕輕混合DNA稀釋液和脂質(zhì)體稀釋液，37℃培育10分鐘。培育后DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物備用注射。
可通過含有，例如磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰絲氨酸(PS)、膽固醇(Chol)、氯化N-[1-(2，3-二油?；?丙基]-N，N-三甲胺(DOTMA)、二油酰磷酯酰乙醇胺(DOPE)和/或者3.β-[N-(N’N’-二甲基胺乙烷)氨甲?；懝檀?DC-Chol)，及該技術(shù)人員所知的其它脂類組成的脂質(zhì)體進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。該領(lǐng)域技術(shù)員知道有各種脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)可用于本發(fā)明。其中有Nicolau等，1987；Nabel等，1990和Gao等，1991所述的那些技術(shù)。在一具體實(shí)施方式
中，脂質(zhì)體含有DC-Chol。更具體說，在優(yōu)選實(shí)施方式章節(jié)中發(fā)明人的脂質(zhì)體含有按照Gao等(1991)所說制備的DC-Chol和DOPE。發(fā)明人還預(yù)備使用含DOTMA的脂質(zhì)體，可從San Diego，Calif.的Vical，Inc.，以商標(biāo)名LipofectinTM購買到。
可用各種方法將脂質(zhì)體導(dǎo)入與細(xì)胞接觸進(jìn)行轉(zhuǎn)染。細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，可簡單地將脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物分散加入在細(xì)胞培養(yǎng)液中。體內(nèi)應(yīng)用時(shí)，通常注射脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物。靜脈注射可使脂質(zhì)體介導(dǎo)DNA復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)到例如肝和脾。為了讓DNA轉(zhuǎn)染進(jìn)入通過靜脈注射不能進(jìn)入的細(xì)胞，可將脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物直接注射到動(dòng)物機(jī)體中的特定部位。例如，Nabel等通過導(dǎo)管注射入動(dòng)脈壁。其它例子中，發(fā)明人采用腹膜內(nèi)注射使基因轉(zhuǎn)運(yùn)到小鼠中。
本發(fā)明還設(shè)想含有脂質(zhì)體復(fù)合物的組合物。該脂質(zhì)體復(fù)合物將含有脂質(zhì)成分和編碼核酸的DNA片段，該核酸編碼Bik突變形式。脂質(zhì)體復(fù)合物中采用的編碼Bik突變形式的核酸可以是，例如，編碼Bik-T145A或Bik-T145D的核酸。
制備脂質(zhì)體復(fù)合物所用的脂質(zhì)可以是任何上述脂質(zhì)。具體說，DOTMA、DOPE和/或DC-Chol可構(gòu)成脂質(zhì)體復(fù)合物的全部或一部分。發(fā)明人特別成功的是用含有DC-Chol的復(fù)合物。在優(yōu)選實(shí)施方式中，脂質(zhì)將含有DC-Chol和DOPE。雖然預(yù)計(jì)任何比例的DC-Chol與DOPE都可用，但預(yù)計(jì)所含DC-Chol與DOPE的比例在1∶20和20∶1的脂質(zhì)特別優(yōu)異。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)約1∶1 0-1∶5比例的DC-CholDOPE制備的脂質(zhì)體有用。
在一
具體實(shí)施例方式
中，采用能提高Bik在細(xì)胞核中保留所需的最小區(qū)域，這樣不會(huì)在接受Bik基因構(gòu)建物的細(xì)胞中導(dǎo)入不需要的DNA。該領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)，如限制性酶切，將能產(chǎn)生Bik的小區(qū)域。這些區(qū)域抑制neu的能力不難通過實(shí)施方式中所述試驗(yàn)測定。
本發(fā)明某些實(shí)施方式中，將脂質(zhì)體與血凝性病毒(HVJ)組成復(fù)合物，顯示能促進(jìn)與細(xì)胞膜的融合和促進(jìn)脂質(zhì)體包裹的DNA進(jìn)入細(xì)胞(Kaneda等，1989)。其它實(shí)施方式中，將脂質(zhì)體與細(xì)胞核內(nèi)非組蛋白性染色體蛋白質(zhì)(HMG-1)復(fù)合和/或結(jié)合運(yùn)用(Kato等，1991)。還有其它實(shí)施方式中，將脂質(zhì)體與HVJ和HMG-1二者復(fù)合和/或結(jié)合運(yùn)用。這類表達(dá)構(gòu)建物已成功用于在體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和表達(dá)核酸，它們也適合于本發(fā)明。當(dāng)在DNA構(gòu)建物中采用細(xì)菌啟動(dòng)子時(shí)，最好還將合適的細(xì)菌聚合酶包含在脂質(zhì)體中。
D.電穿孔本發(fā)明某些實(shí)施方式中，通過電穿孔將表達(dá)構(gòu)建物導(dǎo)入細(xì)胞中。電穿孔包括將細(xì)胞和/或DNA懸液暴露于高壓放電。
采用電穿孔轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞已相當(dāng)成功。以此方式已采用人κ免疫球蛋白基因轉(zhuǎn)染了小鼠前B淋巴細(xì)胞(Potter等，1984)和/或用氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)染了大鼠肝細(xì)胞(Tur-Kaspa等，1986)。
E.磷酸鈣和/或DEAE-葡聚糖本發(fā)明其它實(shí)施方式中，采用磷酸鈣沉淀將表達(dá)構(gòu)建物導(dǎo)入細(xì)胞。已用此技術(shù)以腺病毒5型DNA轉(zhuǎn)染了人KB細(xì)胞(Graham和Van Der Eb，1973)。還以此方式用新霉素標(biāo)記基因轉(zhuǎn)染了小鼠L(A9)、小鼠C127、CHO、CV-1、BHK、NTH3T3和/或HeLa細(xì)胞(Chen和Okayama，1987)，和/或用各種標(biāo)記基因轉(zhuǎn)染了大鼠肝細(xì)胞(Rippe等，1990)。
另一實(shí)施方式中，采用DEAE-葡聚糖然后用聚乙二醇將表達(dá)構(gòu)建物輸送給細(xì)胞。以此方式將報(bào)告質(zhì)粒導(dǎo)入小鼠骨髓瘤和/或紅白血病細(xì)胞(Gopal，1985)。
F.粒子轟擊技術(shù)本發(fā)明另一實(shí)施方式將裸DNA表達(dá)構(gòu)建物轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞涉及顆子轟擊技術(shù)。此方法依靠加速包被DNA的微粒到高速使微粒穿過細(xì)胞膜和/或進(jìn)入細(xì)胞而不殺傷它們(Klein等，1987)。已開發(fā)了加速小粒子的幾種裝置。一種裝置依靠高壓放電產(chǎn)生的電流來提供驅(qū)動(dòng)力(Yang等，1990)。所用微粒由生物學(xué)惰性物質(zhì)如鎢和金珠組成。
G.直接顯微注射和/或超聲加載本發(fā)明其它實(shí)施方式包括用直接微量注射和/或超聲加載導(dǎo)入表達(dá)構(gòu)建物。已采用直接微量注射將核酸構(gòu)建物導(dǎo)入蟾蜍卵母細(xì)胞(Harland和Weintraub，1985)，和/或通過超聲加載用胸苷激酶基因轉(zhuǎn)染了LTK-成纖維細(xì)胞(Fechheimer等，1987)。
H.腺病毒輔助轉(zhuǎn)染本發(fā)明某些實(shí)施方式中，采用腺病毒輔助的轉(zhuǎn)染將表達(dá)構(gòu)建物導(dǎo)入細(xì)胞。據(jù)報(bào)道采用腺病毒偶聯(lián)系統(tǒng)在細(xì)胞系統(tǒng)中提高了轉(zhuǎn)染效率(Kelleher和Vos，1994；Cotton等，1992；Curiel，1994)。
V.聯(lián)合治療為了提高含有本發(fā)明啟動(dòng)子的構(gòu)建物所編碼的治療性基因產(chǎn)物的效率，可能需要將這些組合物與能有效治療過度增殖性疾病的其它制劑，如抗癌癥制劑聯(lián)用?！翱拱┌Y制劑”能負(fù)面影響對象的癌，例如通過殺傷癌細(xì)胞、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡、降低癌細(xì)胞生長速度、減少轉(zhuǎn)移發(fā)生或數(shù)量、減少腫瘤體積、抑制腫瘤生長、減少腫瘤或癌細(xì)胞的血供、促進(jìn)針對癌細(xì)胞或腫瘤的免疫應(yīng)答反應(yīng)、防止或抑制癌癥進(jìn)展或提高癌癥受試者壽限而負(fù)面影響受試者的癌瘤。更一般說，這些其它組合物以有效殺傷或抑制細(xì)胞增殖的聯(lián)合劑量提供。此方法可能包括使細(xì)胞同時(shí)與表達(dá)構(gòu)建物和制劑或多種因素相接觸。這可通過使細(xì)胞與單一組合物或包含兩種制劑的藥物相接觸，或使細(xì)胞同時(shí)與不同的組合物或藥物接觸而實(shí)現(xiàn)，其中，一種組合物含有表達(dá)構(gòu)建物，另一種含有第二種制劑。
用本發(fā)明的方法和組合物進(jìn)行的治療可與化療、放療、免疫療法、手術(shù)治療、激素治療、或用其它促調(diào)亡制劑或細(xì)胞周期調(diào)控制劑進(jìn)行的其它基因治療聯(lián)用。用本發(fā)明啟動(dòng)子進(jìn)行的基因治療和/或除本發(fā)明組合物和方法之外其它的基因治療可使用細(xì)胞增殖誘導(dǎo)劑、細(xì)胞增殖誘導(dǎo)劑的反義序列、細(xì)胞增殖抑制劑，如p53、p16、Rb、APC、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、zac1、p73、VHL、MMAC1/PTEN、DBCCR-1、FCC、rsk-3、p27、p27/p16融合蛋白、Bik/p27融合蛋白、抗凝血基因(例如，COX-1，TFPI)、PGS、Dp、E2F、ras、myc、neu、raf、erb、fms、trk、ret、gsp、hst、abl、E1A、p300、參與血管新生的基因(例如，VEGF、FGF、血小板反應(yīng)素、BAI-1、GDAIF，或它們的受體)或MCC；和/或程序性細(xì)胞死亡的調(diào)節(jié)劑，如抵抗BcI-2的功能和促進(jìn)細(xì)胞死亡的物質(zhì)(例如，Bax，Bak，Bik，Bim，Bid，Bad，Harakiri)。
VI.藥物制備本發(fā)明的藥物組合物含有有效量的構(gòu)建物，所述構(gòu)建物含有調(diào)控治療性基因產(chǎn)物表達(dá)的本發(fā)明調(diào)控序列，在具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明藥物組合物中還含有溶于或分散于藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體或賦形劑中的一種或多種其它制劑。短語“藥學(xué)上或藥理學(xué)上可接受的”是指當(dāng)動(dòng)物時(shí)，例如人(適當(dāng)時(shí))，不會(huì)產(chǎn)生副作用、過敏或其它不良反應(yīng)的分子實(shí)體和組合物。通過本文所公開的內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)知道含有至少一種構(gòu)建物、在某些實(shí)施方式中還含有一種或多種其它活性成分的藥物組合物的制備，例如見《雷明頓藥物科學(xué)》第18版，Mack Printing Company，1990(納入本文參考文獻(xiàn))，所述構(gòu)建物含有調(diào)控治療性多核苷酸表達(dá)的本發(fā)明調(diào)控序列。另外，對動(dòng)物(如人)給藥，可以理解的是制品應(yīng)符合FDA公署生物標(biāo)準(zhǔn)要求的無菌、無致熱原，總體安全和純度標(biāo)準(zhǔn)。
本文使用的“藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體”包括任何和所有的溶劑、分散介質(zhì)、包衣劑、表面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(如抗菌劑，抗真菌劑)、等滲劑、吸收延緩劑、鹽類、防腐劑、藥物、藥物穩(wěn)定劑、粘合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、增甜劑、調(diào)味劑、染料等物質(zhì)和它們的組合，這是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道的(見例如，《雷明頓藥物科學(xué)》第18版，Mack Printing Company，1990，1289-1329頁，納入本文參考文獻(xiàn))。除了與活性成分不相容的常規(guī)運(yùn)載體外，認(rèn)為均可用于治療或藥物組合物中。在具體實(shí)施方式
中，突變型Bik組合物在脂質(zhì)體中給藥。
包含組織特異性調(diào)控序列的治療性構(gòu)建物可含不同類型的運(yùn)載體，對于注射這種給藥途徑，運(yùn)載體的形式取決于是否要以固體、液體或氣溶膠形式給藥，以及是否需要除菌。本發(fā)明組合物可通過靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、病灶內(nèi)、顱內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、前列腺內(nèi)、胸膜內(nèi)、氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、玻璃體內(nèi)、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、局部、腫瘤內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、膀胱內(nèi)、粘膜、心包內(nèi)、口服、局部、采用氣溶膠、注射、輸液、持續(xù)輸液、局部灌注直接浸浴靶細(xì)胞、通過導(dǎo)管、通過灌洗、配制在霜膏中、在脂質(zhì)組合物(如脂質(zhì)體)中或通過該領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道的其它方法或上述方法的任何組合給藥(見例如，《雷明頓藥物科學(xué)》第18版，Mack Printing Company，1990，納入本文參考文獻(xiàn))。
給予患病動(dòng)物本發(fā)明組合物的實(shí)際劑量由物理和生理因素，如體重、疾病嚴(yán)重性、待治療疾病的類型、原有和共同的治療措施、受試者的特發(fā)病和給藥途徑所決定。負(fù)責(zé)給藥的醫(yī)生將決定組合物中活性成分的濃度和受試者個(gè)體的合適劑量。
某些實(shí)施方式中，藥物組合物可含有，例如至少約0.1％的活性成分。其它實(shí)施方式中，該活性成分含有的重量單位約在2％-75％之間，或約在25％-60％之間，例如，可從其中推斷出的任何范圍。其它非限制性例子中，每次給藥的一個(gè)劑量也可含約1μg/kg/體重，約5μg/kg/體重，約10μg/kg/體重，約50μg/kg/體重，約100μg/kg/體重，約200μg/kg/體重，約350μg/kg/體重，約500μg/kg/體重，約1mg/kg/體重，約5mg/kg/體重，約10mg/kg/體重，約50mg/kg/體重，約100mg/kg/體重，約200mg/kg/體重，約350mg/kg/體重，約500mg/kg/體重，約1000mg/kg/體重，或每次施用更多，和可從其中推斷出的任何范圍。在從上列數(shù)字推斷出的范圍的非限制性例子中，可根據(jù)上述數(shù)字給予約5mg/kg/體重-100mg/kg/體重，約5μg/kg/體重-約500mg/kg/體重等。
無論如何，該組合物可含有各種抗氧化劑以防止一種或多種組分的氧化。此外可用防腐劑來預(yù)防微生物的作用，如各種抗菌和抗真菌劑，包括但不僅限于對羥基苯丙酸酯(如甲基對羥基苯丙酸酯、丙基對羥基苯丙酸酯)、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞或其組合。
治療性構(gòu)建物可配制成游離堿、中性或鹽形式的組合物。藥學(xué)上可接受的鹽包括酸加成鹽，如與蛋白質(zhì)組分的游離氨基形成的鹽，或與無機(jī)酸，如鹽酸或磷酸，或有機(jī)酸如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸形成的鹽。與游離羧基形成的鹽也可衍生自無機(jī)堿，如氫氧化鈉、鉀、銨、鈣或鐵；或有機(jī)堿如異丙胺、三甲基胺、組胺或普魯卡因。
在該組合物是液體形式的實(shí)施方式中，運(yùn)載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，包括但不限于水、多元醇(如甘油、丙烯二醇、液態(tài)聚乙二醇等)、脂質(zhì)(如甘油三酯、植物油、脂質(zhì)體)和它們的組合。例如，可通過采用包衣如卵磷酯；通過用運(yùn)載體如液體多元醇或脂分散維持所需顆粒大??；用表面活性劑如羥丙基纖維素；或這些方法的組合來維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。許多情況下，優(yōu)選包含等滲劑如糖、氯化鈉或其組合。
其它實(shí)施方式中，本發(fā)明可采用滴眼劑、滴鼻液或噴霧、氣溶膠或吸入劑。通常將這類組合物設(shè)計(jì)成與靶組織類型相容。一非限制性例子中，滴鼻液常設(shè)計(jì)成以液滴或噴霧形式給予鼻通道的水溶液。制備的滴鼻液在許多方面類似于鼻分泌液，從而可維持正常的纖毛運(yùn)動(dòng)。因此，在優(yōu)選實(shí)施方式中，滴鼻水溶液通常等滲或輕度緩沖，將pH維持在約5.5-6.5。此外，類似于眼科制品中使用的抗微生物防腐劑、藥物或適合的藥物穩(wěn)定劑，如需要可包含于配方中。例如，已知的各種商品化滴鼻制品，其中包括抗菌素或抗組胺藥。
某些實(shí)施方式中，制備通過諸如口服消化途徑給藥的Bik突變形式。這些實(shí)施方式中，固體組合物可含有，例如溶液、懸浮液、乳液、片劑、藥丸、膠囊(如硬或軟衣殼明膠膠囊)、緩釋制劑、口頰吸收組合物、栓劑、酏劑、懸浮劑、糖漿、糯米紙囊劑、漱口水或它們的組合?？诜M合物可直接加到飲食中。口服給藥的優(yōu)選運(yùn)載體包括惰性稀釋劑、可同化食用運(yùn)載體或它們的組合。在本發(fā)明其它方面，可將口服組合物制成糖漿或酏劑。糖漿或酏劑可含有，例如至少一種活性制劑、增甜劑、防腐劑、矯味劑、染色劑、防腐劑功它們的組合。
在某些優(yōu)選實(shí)施例中，口服組合物可含有一種或多種粘合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、矯味劑和它們的組合。某些實(shí)施例中，此組合物可含有以下一種或多種物質(zhì)粘合劑如西黃嗜膠、阿拉伯膠、玉米淀粉、明膠或其組合；賦形劑如磷酸二鈣、甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂或其組合；崩解劑如谷物淀粉、土豆淀粉、海藻酸或其組合；潤滑劑如硬脂酸鎂；增甜劑如蔗糖、乳糖、糖精或其組合；矯味劑如薄荷、冬青油、櫻桃香精、橙子香精等；或上述物質(zhì)的組合。當(dāng)劑量單位形式是膠囊時(shí)，除上述類型物質(zhì)外可含有運(yùn)載體如液體運(yùn)載體?？纱嬖诙喾N其它物質(zhì)，如以包衣劑的形式存在，或用以修飾劑量單位的物理形式。例如可用蟲膠、糖或二者包衣藥片、藥丸，或膠囊。
適合于其它給藥方式的其它制劑包括栓劑。栓劑是重量和形狀不同的固體劑量形式，醫(yī)學(xué)上常用于插入直腸、陰道或尿道給藥。插入后，栓劑變軟，融化或溶于體腔液體中。通常對于栓劑，傳統(tǒng)的運(yùn)載體包括，例如，聚亞烷基二醇、甘油三脂或其組合。某些實(shí)施方式中，栓劑可由含有約0.5％--10％，優(yōu)選約1％--2％范圍活性成分的混合物形成。
通過在適當(dāng)溶劑中加入所需量的活性組分與根據(jù)所需加入上述各種其它成分，然后按需要過濾除菌配制而成滅菌可注射溶液。通常在含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)和/或其它組分的無菌運(yùn)載體中，加入不同的除菌活性成分配成分散劑。配制滅菌注射液、懸浮液或乳液用的滅菌粉劑時(shí)，優(yōu)選的配制方法是真空干燥或冷凍干燥技術(shù)，這樣的技術(shù)可從事先過濾除菌的液體介質(zhì)產(chǎn)生活性成分加上其它所需成分的粉末。如需要液體介質(zhì)應(yīng)適當(dāng)緩沖，注射前該液體稀釋液先用足夠的鹽或葡萄糖做成等滲。也考慮制備供直接注射的高濃度組合物制品，考慮用DMSO作為溶劑可導(dǎo)致極快的滲透，輸送高濃度的活性制劑到小區(qū)域中。
該組合物在制備和貯存條件下必須穩(wěn)定，防止微生物如細(xì)菌和真菌的污染。需知應(yīng)將內(nèi)毒素的污染控制到最低，處在安全水平內(nèi)，例如低于0.5ng/mg蛋白質(zhì)。
在
具體實(shí)施例方式
中，可在該組合物中采用延遲吸收的制劑如單硬脂酸鋁、明膠或其組合來延緩可注射組合物的吸收。
實(shí)施例本文包括以下實(shí)施例以說明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該知道根據(jù)本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的代表性技術(shù)，實(shí)施例中公開的技術(shù)在實(shí)施本發(fā)明時(shí)能很好地起作用，因此可認(rèn)為構(gòu)成實(shí)施本發(fā)明的優(yōu)選方式。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀本文內(nèi)容后應(yīng)知道可對公開的具體實(shí)施方式
作出許多改變?nèi)阅塬@得相似或類似結(jié)果而不脫離本發(fā)明的構(gòu)思和范圍。
實(shí)施例1乳腺癌組織特異性表達(dá)當(dāng)前乳腺癌(BC)的治療方法，例如化療(CT)和放療對腫瘤細(xì)胞的選擇性低并且對正常組織具有副作用。為盡可能降低副作用，這些療法通常以間歇方式給予從而使正常細(xì)胞能在治療周期之間得以恢復(fù)。然而，在恢復(fù)期間，一些存活下來的癌細(xì)胞因基因突變而變得對該治療更為耐受。結(jié)果發(fā)生癌癥復(fù)發(fā)或進(jìn)展。腫瘤靶向基因治療通過作用于腫瘤特異性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而能盡量降低治療的副作用和產(chǎn)生耐受性的風(fēng)險(xiǎn)。在本發(fā)明中，將乳腺癌特異性啟動(dòng)子用于示范的治療性多核苷酸突變體Bik的乳腺癌靶向基因治療。
乳腺癌的腫瘤發(fā)生和乳腺癌的進(jìn)展涉及一系列遺傳變化。腫瘤中被特異性激活的基因是治療的良好靶標(biāo)。首先，本發(fā)明人收集并回顧了cDNA微陣列和SAGE的公開數(shù)據(jù)，鑒定了表1所示的乳腺癌細(xì)胞中特異性上調(diào)的6個(gè)基因。
表1.乳腺癌細(xì)胞中特異性上調(diào)的基因

T/N，腫瘤對正常細(xì)胞的基因表達(dá)比例。PCI，預(yù)后相關(guān)指數(shù)(prognosticcorrelation index)。負(fù)的PCI值表明預(yù)后較差。負(fù)PCI的最大值是-0.4。
其中，將轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TR)、B-Myb、銅藍(lán)蛋白和拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα(topoIIα)亞克隆入螢光素酶受體載體中，用正常和癌細(xì)胞系的報(bào)道試驗(yàn)進(jìn)行測試。與正常乳腺上皮細(xì)胞184A1細(xì)胞相比，TopoIIα和TR啟動(dòng)子在乳腺癌細(xì)胞中具有最高活性。因此，本發(fā)明人還在此兩種啟動(dòng)子中尋求乳腺癌特異性順式元件。
TopoIIα催化了DNA的拓?fù)鋵W(xué)改變以緩解其在復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和染色體分離期間產(chǎn)生的張力。它也是幾種抗癌癥藥物，例如蒽環(huán)類(如依托泊苷和阿霉素)的靶點(diǎn)。許多研究顯示topoIIα的水平與癌細(xì)胞對蒽環(huán)類的敏感性相關(guān)。此外，topoIIα是乳腺癌、腦腫瘤、肝癌等預(yù)后不良的標(biāo)記。對topoIIα表達(dá)的調(diào)節(jié)是嚴(yán)格依賴于細(xì)胞周期的在G0/G1期它的mRNA水平和啟動(dòng)子活性非常低，在S晚期開始增高，在G2/M期達(dá)到峰值。TopoIIα是含有5個(gè)反向CCAAT盒(ICB)和兩個(gè)GC盒的缺少TATA的啟動(dòng)子。其受熱激、細(xì)胞周期各階段和p53調(diào)節(jié)。NF-Y(也稱為CBF)結(jié)合該啟動(dòng)子中的ICB，是細(xì)胞周期中topoIIα轉(zhuǎn)錄所需。綜合看來，在一些實(shí)施方式中，這表明topoIIα啟動(dòng)子可對致癌性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起反應(yīng)，ICB位點(diǎn)和它們的結(jié)合因子在其BC-特異性活性中起著非常重要的作用。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的復(fù)合啟動(dòng)子中采用了轉(zhuǎn)鐵蛋白受體。TR是能與結(jié)合鐵的轉(zhuǎn)鐵蛋白相互作用的一種膜受體，能促進(jìn)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)通過細(xì)胞膜。較高的TR mRNA水平與乳腺癌細(xì)胞分化差、侵襲力較強(qiáng)和增殖指數(shù)高相關(guān)。體外研究證明靶向TR mRNA的反義寡核苷酸可特異性抑制人乳腺癌細(xì)胞的生長而不影響正常乳腺細(xì)胞，表明TR在乳腺癌發(fā)展中起著關(guān)鍵性作用。即使調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性是正常細(xì)胞中TR表達(dá)的主要決定因素，但許多研究揭示在增殖細(xì)胞中幾種致癌性信號(hào)高度激活了TR轉(zhuǎn)錄。TR啟動(dòng)子的核心區(qū)域含有TATA盒、GC盒、AP-1/CRE位點(diǎn)和對缺氧起反應(yīng)的HRE。諸如增殖、缺氧、鐵短缺和分化等信號(hào)可激活TR啟動(dòng)子的該區(qū)段。
如下所示，本發(fā)明人聯(lián)合利用了這些示范性的乳腺癌特異性CT90和CTR116啟動(dòng)子與編碼突變體Bik多肽的多核苷酸，在具體的實(shí)施方式中它們包含于脂質(zhì)體中。示范性CT90驅(qū)動(dòng)的BikDD治療性載體(CT90-BikDD)在體外能選擇性殺傷BC細(xì)胞并抑制小鼠模型中乳腺腫瘤異種移植物的生長。綜合看來，這些結(jié)果表明CT90和CTR116是有效的乳腺癌特異性強(qiáng)啟動(dòng)子，可用于在乳腺癌靶向基因治療中控制突變體Bik基因的表達(dá)。
鑒定topoIIα啟動(dòng)子中的核心BC特異性區(qū)段為鑒定含有乳腺癌特異性所需順式元件的一個(gè)或多個(gè)區(qū)段，本發(fā)明人通過，例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)制備了一系列topoIIα啟動(dòng)子缺失突變體。每種突變體含有1到5個(gè)數(shù)目不等的ICB位點(diǎn)，將其亞克隆入螢光素酶表達(dá)載體中。然后用這些報(bào)道構(gòu)建物瞬時(shí)轉(zhuǎn)染各種細(xì)胞系，利用螢光素酶報(bào)道試驗(yàn)檢測它們的啟動(dòng)子活性。在所有缺失突變體中580-bp(稱為全長)的啟動(dòng)子活性最高，其在乳腺癌細(xì)胞中最為活化(圖1)。然而，跨越從轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)計(jì)算的90個(gè)堿基對和含有第一ICB位點(diǎn)的最短啟動(dòng)子區(qū)段具有啟動(dòng)子活性最低，但仍保留了乳腺癌特異性(圖2)。該結(jié)果表明90-bp區(qū)段含有乳腺癌特異性核心元件。
用CMV增強(qiáng)子序列提高topoIIα啟動(dòng)子的活性所有topoIIα啟動(dòng)子缺失突變體的活性低于CMV啟動(dòng)子活性的10％。為提高啟動(dòng)子活性以應(yīng)用于臨床，本發(fā)明人通過PCR獲得了pCDNA3.1質(zhì)粒的示范性CMV增強(qiáng)子序列，將其直接連接于全長和90-bptopoIIα啟動(dòng)子缺失突變體的上游，然后亞克隆入螢光素酶報(bào)道載體中。兩種示范性復(fù)合啟動(dòng)子分別稱為CT572和CT90。與原初啟動(dòng)子缺失突變體相比，CT572和CT90的活性顯著提高，與CMV啟動(dòng)子相當(dāng)，但保留了它們的乳腺癌特異性(圖3)。CT90啟動(dòng)子的活性遠(yuǎn)高于CT572，在一些細(xì)胞系中它幾乎與CMV啟動(dòng)子一樣強(qiáng)(圖3)。因此，利用CT90進(jìn)行了體內(nèi)測試。將乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞接種入裸鼠的乳腺脂肪墊(pad)中。接種4周后，通過靜脈內(nèi)注射從尾靜脈給予實(shí)驗(yàn)組每只小鼠遞送50μg與脂質(zhì)體形成復(fù)合物的CT90-螢光素酶載體，對照組小鼠給予CMV-螢光素酶載體。注射48小時(shí)后，處死小鼠，通過腫瘤、心臟、肺、肝臟、脾臟、腎臟和肌肉的螢光素酶試驗(yàn)檢測啟動(dòng)子活性(圖4)。CT90在腫瘤中的活性高于CMV啟動(dòng)子。然而，CT90在正常組織中的活性遠(yuǎn)低于CMV啟動(dòng)子。這表明CT90啟動(dòng)子在體內(nèi)具有BC特異性活性。
CT90-BikDD的抗癌癥作用為分析CT90在乳腺癌靶向基因治療中的特性，產(chǎn)生了下文稱為CT90-BikDD的治療性構(gòu)建物，該構(gòu)建物中CT90可驅(qū)動(dòng)BikDD表達(dá)。將該構(gòu)建物與螢光素酶報(bào)道載體共轉(zhuǎn)染入乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和468和正常的乳腺上皮細(xì)胞系184A1中，然后通過螢光素酶活力試驗(yàn)測定細(xì)胞殺傷作用。用CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的BikDD載體(CMV-BikDD)和空載體分別作為陽性和陰性對照。雖然CMV-BikDD殺傷所有3種細(xì)胞系的程度幾乎相同，但CT90-BikDD優(yōu)先殺傷乳腺癌細(xì)胞(圖5)，表明CT90-BikDD的殺傷作用對乳腺癌細(xì)胞具有選擇性。因此，CT90可用于乳腺癌靶向基因治療。
然后，在體內(nèi)特征分析了該乳腺癌靶向基因治療的抗腫瘤作用。將乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞接種入乳腺脂肪墊一周后，用與脂質(zhì)體形成復(fù)合物的CT90-BikDD(治療組)、CMV-BikDD(陽性對照)和CMV-PGL3(模擬治療)或作為非治療對照的葡萄糖緩沖液D5W每周治療裸鼠一次。每只小鼠靜脈內(nèi)注射15μg與脂質(zhì)體形成復(fù)合物的DNA構(gòu)建物，每周一次，定期檢測腫瘤大小。與CMV-BikDD或CMV-PGL3相比，CT90-BikDD組顯示了優(yōu)良的腫瘤抑制作用(圖6)。
鑒定轉(zhuǎn)鐵蛋白受體啟動(dòng)子中的乳腺癌特異性核心區(qū)段為鑒定含有乳腺癌特異性所需順式元件的區(qū)段，通過PCR產(chǎn)生了一系列TR啟動(dòng)子缺失突變體(在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游1412-、1123-和193-bp)，將其亞克隆入螢光素酶表達(dá)載體中。然后將這些報(bào)道構(gòu)建物瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入上述各種細(xì)胞系，利用螢光素酶報(bào)道試驗(yàn)檢測它們的啟動(dòng)子活性。193-bp區(qū)段(在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游187bp)的體外活性和乳腺癌特異性最高(圖7)。
用CMV增強(qiáng)子序列提高TR核心活性啟動(dòng)子活性如上述CT90一樣，為縮小乳腺癌特異性核心啟動(dòng)子的范圍，進(jìn)一步刪除了TR啟動(dòng)子193-bp區(qū)段5’末端的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游116-bp，將其連接于CMV增強(qiáng)子序列。將本文稱為CTR116的該復(fù)合啟動(dòng)子亞克隆入螢光素酶報(bào)道載體中并轉(zhuǎn)染入細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染后，用正常含氧或低含氧(94％N2、5％CO2、1％O2，20小時(shí))條件處理細(xì)胞，通過螢光素酶試驗(yàn)測定CTR116的啟動(dòng)子活性。與原初缺失突變啟動(dòng)子相比，CTR116的活性明顯升高同時(shí)保留了其乳腺癌特異性。此外，可通過缺氧處理進(jìn)一步誘導(dǎo)其活性與CMV啟動(dòng)子相當(dāng)(圖8)。這是首次證明了TR啟動(dòng)子的至少一部分具有乳腺癌特異性，CMV啟動(dòng)子增強(qiáng)子可提高其活性而不影響低氧誘導(dǎo)(的能力)。
在本發(fā)明的其它實(shí)施方式中，分別縮小CT90和CTR116元件來進(jìn)一步鑒定保留了乳腺癌特異表達(dá)活性的甚至更小的區(qū)段。例如，可用這些反應(yīng)區(qū)域的缺失構(gòu)建物，測試它們的組織特異性以鑒定保留了在乳腺癌組織中直接表達(dá)能力的更小區(qū)段。
CT90啟動(dòng)子以CMV啟動(dòng)子相當(dāng)?shù)乃津?qū)動(dòng)BikDD表達(dá)為進(jìn)一步特征分析CT90啟動(dòng)子的活性是否以類似于CMV啟動(dòng)子(活性強(qiáng)并廣泛應(yīng)用于全身基因治療)的水平誘導(dǎo)基因表達(dá)，通過電穿孔將CT90-BikDD或CMV-BikDD構(gòu)建物轉(zhuǎn)染入MCF-7乳腺癌細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，收集細(xì)胞，并裂解用于Western印跡。如圖14所示，CT90啟動(dòng)子的BikDD蛋白質(zhì)表達(dá)水平略高于CMV啟動(dòng)子。該結(jié)果表明CT90啟動(dòng)子在乳腺癌細(xì)胞中活性強(qiáng)。
CT90-BikDD脂質(zhì)復(fù)合物在常位小鼠模型中選擇性抑制乳腺癌腫瘤生長和延長存活(時(shí)間)為特征鑒定全身遞送與脂質(zhì)體形成復(fù)合物的CT90-BikDD(CT90-BikDD脂質(zhì)復(fù)合物(lipoplex))在體內(nèi)是否可導(dǎo)致BikDD的選擇性表達(dá)，將MDA-MB-231(圖5)或MDA-MB-468細(xì)胞(圖15B)接種入雌性裸鼠的乳腺脂肪墊以形成乳腺腫瘤。攜帶腫瘤的小鼠接受脂質(zhì)體遞送的CT90-BikDD、CMV-BikDD、pGL3載體(模擬治療)治療或不治療(D5W)，每個(gè)治療組8只小鼠。在相應(yīng)的治療組中，每周一次給小鼠靜脈內(nèi)注射不同DNA構(gòu)建物的脂質(zhì)復(fù)合物。與模擬治療(pGL3)和不治療(D5W)組的結(jié)果(圖15A和15B)相比，CT90-BikDD和CMV-BikDD治療組中的腫瘤生長明顯受到抑制(T-檢驗(yàn)p＜0.05)。如圖15所示，CT90-BikDD、CMV-BikDD、pGL3和D5W組小鼠的平均存活時(shí)間分別是25.25±1.83、23.25±1.74、17.5±1.3和16.25±0.98周。與不治療(D5W)或模擬治療(pGL3)組相比，CT90-BikDD和CMV-BikDD治療均產(chǎn)生明顯的存活優(yōu)勢，表明CT90-BikDD可提供與CMV-BikDD相當(dāng)?shù)闹委熥饔?圖16的下圖)。
CT90-BikDD具有抗腫瘤活性并且在正常組織中副作用最小然后本發(fā)明人進(jìn)一步特征分析了CT90-BikDD和CMV-BikDD是否能反映CT90-luc和CMV-luc的體內(nèi)差異性表達(dá)情況。為應(yīng)對此事，通過原位雜交檢測腫瘤和心臟中的BikDD mRNA表達(dá)(圖17)。CMV-BikDD治療小鼠的整個(gè)心臟組織呈深棕色染色表明CMV啟動(dòng)子導(dǎo)致了高水平的BikDD表達(dá)(圖17A，左上圖)。相反，CT90-BikDD治療在心臟組織中誘導(dǎo)了較弱的BikDD表達(dá)(圖17A，右上圖)。在CT90-BikDD和CMV-BikDD(治療)組的腫瘤樣品之間沒能檢測到密度和表達(dá)水平的明顯差異(圖17B)。采用正義BikDD的陰性對照在這些實(shí)驗(yàn)中未顯示棕色染色(圖17A和圖17B，下圖)，表明反義組中的陽性信號(hào)來自BikDD表達(dá)。這些數(shù)據(jù)證明全身給予CT90-BikDD脂質(zhì)復(fù)合物可導(dǎo)致乳腺腫瘤中BikDD的選擇性表達(dá)。重要的是，在CT90-BikDD治療小鼠的正常器官，例如心臟中BikDD的表達(dá)遠(yuǎn)低于CMV-BikDD治療小鼠。因此，CT90-BikDD具有與CMV-BikDD相當(dāng)?shù)目鼓[瘤活性而其在正常組織中表達(dá)所誘導(dǎo)的副作用最小。
ICB1能通過乳腺癌細(xì)胞中的特異性Cdk2/周期蛋白A介導(dǎo)TopoIIα啟動(dòng)子激活為提高乳腺癌細(xì)胞中topoIIα啟動(dòng)子的基礎(chǔ)活性，在一具體的實(shí)施方式中將給其連接于一個(gè)強(qiáng)增強(qiáng)子。然而在某些方面，由于topoIIα啟動(dòng)子中的一些調(diào)節(jié)元件可能干擾，加入該強(qiáng)增強(qiáng)子不可能實(shí)現(xiàn)高的基礎(chǔ)活性甚至可能喪失乳腺癌特異性(見以后的圖26)。為開發(fā)在乳腺癌細(xì)胞中具有特異性和高基礎(chǔ)活性的TSP，本發(fā)明人推斷將最小的乳腺癌特異性元件與增強(qiáng)子相連可能更加成功。因此，我們開始鑒定topoIIα啟動(dòng)子中的乳腺癌特異性元件。為此目的，我們首先研究了激活topoIIα啟動(dòng)子的可能的乳腺癌特異性信號(hào)，然后尋找介導(dǎo)該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的順式元件。TopoIIα表達(dá)在S期上調(diào)，在G2/M期達(dá)到高峰(Woessner等，1991)。由于重要的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)物Cdk2在S和G2期激活(Vermeulen等，2003)，本發(fā)明人懷疑是否Cdk2能上調(diào)topoIIα啟動(dòng)子活性？為此目的，通過在報(bào)道試驗(yàn)中共轉(zhuǎn)染顯性-失活Cdk2突變體(Cdk2-dn)(van den Heuvel和Harlow，1993)和topoIIα啟動(dòng)子受體構(gòu)建物來檢測Cdk2對topoIIα啟動(dòng)子活性的調(diào)節(jié)。Cdk2-dn在3種不同的乳腺癌細(xì)胞中抑制topoIIα啟動(dòng)子活性，但在正常乳腺上皮細(xì)胞(184A1)、肺癌細(xì)胞(A549)或非惡性肝細(xì)胞(Chang肝臟)中不抑制(Castagnetta等，2003)(圖25A)。由于Cdk2分別與G1后期和S期中的周期蛋白E和周期蛋白A相關(guān)，我們研究了哪一個(gè)能激活topoIIα啟動(dòng)子。周期蛋白A的表達(dá)在乳腺癌細(xì)胞中明顯誘導(dǎo)topoIIα啟動(dòng)子的激活，但在其它細(xì)胞類型中不誘導(dǎo)(圖25B)。相反，在乳腺癌細(xì)胞中周期蛋白E對topoIIα啟動(dòng)子的作用最低(數(shù)據(jù)未顯示)。這些數(shù)據(jù)提示周期蛋白A/Cdk2以乳腺癌特異性方式激活topoIIα啟動(dòng)子。
按照以上結(jié)果，topoIIα啟動(dòng)子中的周期蛋白A/Cdk2-響應(yīng)元件可能是潛在的乳腺癌特異性元件。為鑒定該元件，我們制備了一系列topoIIα啟動(dòng)子的缺失突變體，包括含有3個(gè)、1個(gè)ICB和不含ICB的-182、-90、-60(圖25C)(Adachi等，2000；Falck等，1999；Hochhauser等，1992)。在乳腺癌細(xì)胞系SK-BR3中檢測了它們對周期表達(dá)A激活的反應(yīng)(圖25D，左圖)。周期蛋白A能激活全長啟動(dòng)子及其至少含有1個(gè)ICB的-182和-90缺失突變體(圖2D左圖中的-572、-182和-90，p＜0.05)，但不激活缺少任何ICB的-60缺失突變體(圖2D左圖中的-60)。在其它兩種乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-468和MDA-MB-231中進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)得到了類似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)，表明ICB對介導(dǎo)周期蛋白A信號(hào)可能很重要。全長topoIIα啟動(dòng)子中的ICB1突變(圖2C，最下圖)導(dǎo)致較大降低了對周期蛋白A的反應(yīng)(圖2E，右圖)，此事實(shí)更支持了該觀點(diǎn)，提示topoIIα啟動(dòng)子中的ICB1是對周期蛋白A/Cdk2激活完全反應(yīng)所需，可能代表了最小的乳腺癌特異性元件。
為驗(yàn)證ICB1在介導(dǎo)topoIIα啟動(dòng)子的乳腺癌特異性中的作用，在一組細(xì)胞系中檢測了-90缺失突變體的活性，因?yàn)樗缓幸粋€(gè)ICB位點(diǎn)。與全長啟動(dòng)子類似，-90啟動(dòng)子在大多數(shù)乳腺癌細(xì)胞系中的活性高于其它類型細(xì)胞(圖25E，上圖)，表明它保留了乳腺癌特異性。然而，-90啟動(dòng)子與CMV啟動(dòng)子的活性比(-90/CMV)再次顯示其在乳腺癌細(xì)胞中的基礎(chǔ)活性低(圖25E的下圖＜0.5％)。由于刪除了-90啟動(dòng)子中的大多數(shù)其它調(diào)節(jié)元件，可容易地將它工程改造為在乳腺癌(細(xì)胞)中具有較高的基礎(chǔ)活性和保留了特異性。
用CMV啟動(dòng)子的增強(qiáng)子序列加強(qiáng)的CT90啟動(dòng)子，-90topoIIα啟動(dòng)子在體外和體內(nèi)乳腺癌細(xì)胞中具有更強(qiáng)的特異性活性為提高在乳腺癌細(xì)胞中的基礎(chǔ)活性，我們將CMV啟動(dòng)子的增強(qiáng)子序列(CMV增強(qiáng)子)(Xu等，2001)與3個(gè)含ICB的啟動(dòng)子全長topoIIα啟動(dòng)子及其-182和-90缺失突變體相連。這些組合啟動(dòng)子分別稱為CT572、CT182和CT90(圖26A)。令人感興趣的是，在這些組合啟動(dòng)子中，與正常184A1細(xì)胞相比，CT90在乳腺癌細(xì)胞中活性最高(圖26B，用對數(shù)標(biāo)尺顯示報(bào)道子的活性)。此外，CT90在乳腺癌中的活性與CMV啟動(dòng)子相當(dāng)(圖26C)。CT572和CT182對乳腺癌細(xì)胞的特異性低于CT90(圖26B)，并且它們活性的提高程度有限(圖26C)，提示topoIIα中除ICB外的一些元件可能干擾CMV增強(qiáng)子的活性。
為檢驗(yàn)CT90對于全身性脂質(zhì)體基因治療是否具有足夠的特異性和活性，我們還檢測了它的體內(nèi)活性。使CT90或CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的螢光素酶構(gòu)建物(分別是CT90-luc和CMV-luc)與DOTAPChol脂質(zhì)體形成復(fù)合物，然后靜脈內(nèi)注射入攜帶MDA-MB-231乳腺癌異種移植物的小鼠中。用報(bào)道物試驗(yàn)測定正常和腫瘤組織中的啟動(dòng)子活性(圖26D的上圖)。如前所述，當(dāng)陽離子脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物經(jīng)靜脈內(nèi)注射給予動(dòng)物時(shí)，肺和心臟將攝入脂質(zhì)體的主要部分，導(dǎo)致在這兩種器官中基因表達(dá)的水平較高(Barron，1999；Li等，1998；Lu等，2002；Templeton等，1997)。同樣，CMV-luc的報(bào)道物活性生物分布顯示了類似的模式肺中最高，心臟和肝臟第二和第三高(圖26D，上圖)。這表明CMV-luc的報(bào)道物活性代表了脂質(zhì)體在我們的動(dòng)物模型中的基因遞送效率。為評價(jià)CT90的體內(nèi)特異性，通過計(jì)算CT90與CMV啟動(dòng)子的活性比(圖26D下圖中的CT90/CMV)從而將不同組織中的脂質(zhì)體攝取效率標(biāo)準(zhǔn)化(Barron，1999；Li等，1998；Lu等，2002；Templeton等，1997)。標(biāo)準(zhǔn)化的CT90活性在腫瘤中較高，在正常器官中很低，特別是在捕獲脂質(zhì)體的主要器官，例如心臟、肺和肝臟中很低(圖26D)。在攜帶MDA-MB-468乳腺癌異種移植物的另一小鼠模型中觀察到CNV-luc和CT90-luc活性的生物分布相似(數(shù)據(jù)未顯示)。當(dāng)采用另一脂質(zhì)體SN(Li等，2003；Zou等，2002)遞送DNA構(gòu)建物時(shí)，CT90仍顯示相似的腫瘤特異性(數(shù)據(jù)未顯示)。需要提及的是對脾臟、腎臟和肌肉遞送脂質(zhì)體的效率遠(yuǎn)低于肺、心臟和肝臟。因此，在這些實(shí)驗(yàn)中，所遞送基因在后三中器官中的表達(dá)最低，與啟動(dòng)子活性相比可忽略不計(jì)。為排除基因遞送效率的影響，通過DOTAPChol脂質(zhì)體將CMV-luc或CT90-luc經(jīng)腫瘤內(nèi)注射遞送入攜帶MDA-MB-231腫瘤的小鼠。與CMV啟動(dòng)子的相比，CT90啟動(dòng)子所致的螢光素酶活性在腫瘤中仍較高，而在肺或心臟中仍較低(圖26E)，表明CT90在體內(nèi)是腫瘤特異性啟動(dòng)子。令人感興趣的是，CT90的體內(nèi)乳腺癌特異性和活性高于體外(圖26C和26D)。在其它研究中也觀察到與體外遞送相比，體內(nèi)遞送脂質(zhì)體提高了啟動(dòng)子特異性這種現(xiàn)象(Lu等，2002)。這些結(jié)果證明CT90是適用于基因治療方法中乳腺癌靶向的較強(qiáng)乳腺癌特異性啟動(dòng)子。
實(shí)施例2胰腺癌特異性表達(dá)本發(fā)明人利用胰腺癌特異性啟動(dòng)子序列來控制編碼突變體Bik多肽的多核苷酸表達(dá)。本實(shí)施例描述了涉及該目的的示范性方法與組合物。
細(xì)胞系人胰腺癌(PANC-1、CAPAN-1和AsPC-1)、前列腺癌(LNCaP和PC-3)細(xì)胞系，無限增殖的正常肺成纖維細(xì)胞(WI-38)和乳腺上皮細(xì)胞(184Al)得自美國模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC，Rockville，MD)。無限增殖的人胰腺細(xì)胞E6E7由德克薩斯，休斯頓，德克薩斯大學(xué)，M.D.Anderson癌癥中心(University of TexasM.D.Anderson Cancer Center，Houston，TX)的Paul Chiao博士惠贈(zèng)。也采用了Chang肝細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞系SKOV3.ipl。用補(bǔ)加了10％胎牛血清(FBS)、青霉素(100單位/ml)和鏈霉素(100mg/ml)的DMEM/F12培養(yǎng)基(Invitrogen，Carlsbad，CA)培養(yǎng)PANC-1、CAPAN-1、AsPC-1、WI-38和SKOV3.ipl和Chang肝細(xì)胞。LNCaP和PC-3細(xì)胞培養(yǎng)在含10％(FBS)、青霉素和鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基(Invitrogen)中。184A1細(xì)胞培養(yǎng)在乳腺上皮細(xì)胞生長完全培養(yǎng)基中(MEGM)(Cambrex，Walkerswille，MD)，E6E7細(xì)胞培養(yǎng)在補(bǔ)加了上皮細(xì)胞生長因子、垂體提取物的Keratiocyte-SFM中(Invitrogen)。
構(gòu)建物利用如下表2所示的引物通過PCR擴(kuò)增PANC-1基因組DNA得到CCKAR啟動(dòng)子(-726到+1；引物CCKAR-p1和CCKAR-p2)、uPAR啟動(dòng)子(-812到+1；引物uPAR-p1和uPAR-p2)、RDC-1啟動(dòng)子(-881到+1；引物RDC-p1和RDC-p2)、CTRB1啟動(dòng)子(-946到+1；引物CTRB1-p1和CTRB1-p2)和CPA1啟動(dòng)子(-1010到+108；CPA1-p1和CPA1-p2)。
表2可能的胰腺癌特異性啟動(dòng)子序列

將這些PCR片段亞克隆入pCRII-TOPO(Invitrogen)中產(chǎn)生pCRII-TOPO-CCKAR、pCRII-TOPO-uPAR、pCRII-TOPO-RDC1和pCRII-TOPO-CTRB。測序驗(yàn)證所有的PCR產(chǎn)物。然后將這些啟動(dòng)子片段插入pGL-3基礎(chǔ)(質(zhì)粒)(Promega，Madison，WI)的KpnI/Xho1位點(diǎn)得到質(zhì)粒pGL3-CCKAR-Luc、pGL3-uPAR-Luc、pGL3-RDC1-Luc和pGL3-CTRB1-Luc。CMV增強(qiáng)子/啟動(dòng)子控制的螢火蟲螢光素酶基因質(zhì)粒pCMV-Luc(包含克隆入pGL-3載體的CMV啟動(dòng)子)。含有Renilla螢光素酶報(bào)道基因的質(zhì)粒pRL-TK得自Promega。
用Asp718/SalI消化從pGEM-3Z-WPRE(J.B Uney博士惠贈(zèng)，University ofBristol，Bristol，UK)釋放出WPRE增強(qiáng)子片段，通過平頭連接將其插入pGL3-基礎(chǔ)(質(zhì)粒)的SmalI位點(diǎn)中產(chǎn)生中間體pGL3-Luc-WPRE。用Xbal消化pGL3-基礎(chǔ)質(zhì)粒，用Klenow使其成為平頭，與中間體pGL3-Luc-WPRE的平頭Asp718/SallWPRE片段一起退火得到pGL3-Luc-WPRE。將pCRII-TOPO-CCKAR的SpeI/XhoI-平頭CCKAR片段亞克隆入pGL3-Luc-WPRE的平頭NheI/XhoI位點(diǎn)中得到pGL3-CCKAR-Luc-WPRE。將pCRII-TOPO-CCKAR的HindIII/NotI-平頭CCKAR片段亞克隆入pGL3-TSTA-Luc(洛杉磯，加州大學(xué)洛杉磯分校，醫(yī)學(xué)院的M.Carey博士惠贈(zèng))的MscI/NheI平頭位點(diǎn)(Zhang L等，Cancer Res，2003)，得到pGL3-CCKAR-TSTA-Luc-WPRE。最后，將用NotI/BgIII消化pCRII-TOPO-CCKAR產(chǎn)生的CCKAR片段插入pGL3-CCKAR-TSTA-Luc-WPRE的相同位點(diǎn)中，得到pGL3-CCKAR-TSTA-Luc-WPRE(pGL3-CTP-Luc)。
轉(zhuǎn)染在轉(zhuǎn)染前16小時(shí)，將細(xì)胞接種在12-孔板的上述相應(yīng)培養(yǎng)基中，37℃，5％CO2培養(yǎng)至40-50％匯合。按照推薦的方法用DOTAPChol脂質(zhì)體(得自N.Templeton，Baylor College of Medicine，Houston，TX)，用指定的質(zhì)粒DNA與作為內(nèi)部對照的pRL-TK轉(zhuǎn)染細(xì)胞。非表達(dá)載體，pGL3-基礎(chǔ)(質(zhì)粒)用作陰性對照。為比較轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件彼此之間的活性，采用了相同摩爾量的質(zhì)粒DNA。
胰腺癌和質(zhì)粒DNA全身遞送的常位動(dòng)物模型將6-8周齡無胸腺雌性BALB/c nu/nu小鼠(Charles River Laboratories，Wilmington，MA)用作異種移植物宿主。按照M.D.Anderson Cancer Center規(guī)則將小鼠飼養(yǎng)在無特定病原菌的環(huán)境中。用胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的AsPC-1細(xì)胞，用PBS洗滌兩次。就常位模型而言，用Aventin(Sigma)(Xie，Mol.Endocrinl，2004)麻醉小鼠，使其處于仰臥體位。用70％乙醇清潔腹部區(qū)域，切開上腹中部。從腹內(nèi)移出胰腺，在其尾部注射50μl等份的AsPC-1細(xì)胞(1×106個(gè)細(xì)胞)。用傷口夾閉合切口。
如前人所述制備質(zhì)粒DNA脂質(zhì)體復(fù)合物(Templeton，Nat Biotech，1997)。簡言之，室溫用5％的葡萄糖水溶液(D5W)分別稀釋DNA和DOTOPChol儲(chǔ)存液。將DNA溶液快速加至等體積的脂質(zhì)體溶液表面，上下抽吸兩次使之混合。此制備物在注射前2小時(shí)新鮮制備。對異位模型中腫瘤大小達(dá)到50mm3的裸鼠或常位模型中同樣時(shí)期的裸鼠用29-號(hào)針頭尾靜脈注射100μl含有50μgDNA的DNA脂質(zhì)體復(fù)合物，每天一次連續(xù)三天。每天注射后對小鼠進(jìn)行體內(nèi)成像，最后一次注射24小時(shí)后處死小鼠。
螢光素酶試驗(yàn)裂解瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞并按照生產(chǎn)商的方案采用Dual-Luciferase報(bào)道試驗(yàn)系統(tǒng)(Promega，Madison，WI)以TD20/20發(fā)光儀(Turner Designs，Sunnyvale，CA)測試螢光素酶活性。二螢光素酶之比定義為所測試質(zhì)粒的螢火蟲螢光素酶活性與pRL-TK的RenilIa螢光素酶活性之比，以一式三份轉(zhuǎn)染的平均值表示，此試驗(yàn)重復(fù)至少四次。與CMV活性之比相比較給出百分比。
為檢測組織產(chǎn)生的螢光素酶活性，無痛處死小鼠并解剖。切下腫瘤和其它器官，包括胰腺、肺、心臟、肝臟、脾臟、腎臟、大腦、小腸、肌肉和卵巢等組織樣品，用PRO 250勻漿器(Pro Scientific，Inc.，Monore，CT)在含有1/100稀釋的蛋白質(zhì)抑制劑混合物(Roche)的300μl螢光素酶裂解緩沖液中制備勻漿。8,000rpm離心樣品5分鐘，暫時(shí)放置于冰上。用Lumat LB9507發(fā)光儀(Berthod，Bad Wildbad，Germany)測定上清液的螢光素酶活性，采用洗滌劑相容(DC)的蛋白質(zhì)試驗(yàn)系統(tǒng)(Bio-Rad，Hercules，CA)以MRX微板讀數(shù)儀(Dynex technologies，Inc.，Chantilly，VA)測定蛋白質(zhì)濃度。發(fā)光測定結(jié)果報(bào)告為每微克蛋白質(zhì)的相對光單位(RLU)。
生物發(fā)光數(shù)據(jù)的成像和定量用Aventin麻醉小鼠。以150mg/kg小鼠體重腹膜內(nèi)注射D-熒光素(Xenogen，Alemeda，CA)(用PBS配成30mg/ml)。D-熒光素注射10分鐘后，小鼠用IVISTM成像系統(tǒng)(Xenogen)成像，該系統(tǒng)包括裝在不透光樣品小室(暗盒)上的冷卻的CCD照相機(jī)、照相機(jī)控制器、照相機(jī)制冷系統(tǒng)和基于Windows(系統(tǒng))的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)。維持成像參數(shù)用于比較分析。使灰度色標(biāo)反射圖像(gray scale reflectedimage)與生物發(fā)光彩色圖像重疊用現(xiàn)場成像軟件(Living Imaging software)，2.11版(Xenogen)分析。手工選出信號(hào)強(qiáng)度相關(guān)區(qū)域中的感興趣區(qū)域(ROI)。使ROI的面積維持恒定，強(qiáng)度記錄為ROI中的最高光計(jì)數(shù)(Xie等，2004)。在成像后的一些實(shí)驗(yàn)中，無痛處死小鼠，取出感興趣的器官，排列在黑色無生物發(fā)光(bioluminescence-free)紙上，在30分鐘內(nèi)離體成像。
圖9A描述了胰腺特異性啟動(dòng)子的構(gòu)建物。用PCR擴(kuò)增人縮膽囊肽A受體(CCKAR)、孤兒G蛋白-偶聯(lián)受體(RDC1)、尿激酶型纖溶酶原激活物受體(uPAR)和胰凝乳蛋白酶原B1(CTRB1)的啟動(dòng)子序列，亞克隆入基礎(chǔ)性報(bào)道質(zhì)粒pGL3，從而調(diào)節(jié)螢火蟲螢光素酶基因的表達(dá)。用相似摩爾量的質(zhì)粒DNA與內(nèi)部對照pRL-TK瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。如圖9B所示，48小時(shí)后測定二螢光素酶之比，以按Rellina螢光素酶標(biāo)準(zhǔn)化的RLU(倍數(shù))表示。
所需多核苷酸的胰腺癌特異性表達(dá)圖10A描述了含有螢火蟲螢光素酶報(bào)道基因的CCKAR-和CMV-構(gòu)建物的示意圖，所述報(bào)道基因在最小CCKAR啟動(dòng)子(含或不含WPRE)、或CCKAR/TSTA(含或不含WPRE)或CMV增強(qiáng)子/啟動(dòng)子控制下。當(dāng)Ga14VP2VP2復(fù)制的HSV1VP16立即早期反式激活蛋白結(jié)構(gòu)域與GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合時(shí)，其能高效激活(表達(dá))。就G5E4T序列(SEQ ID NO22)而言，G5在接近共有序列DNA結(jié)合位點(diǎn)處含有17bp GAL4 DNA結(jié)合位點(diǎn)的5個(gè)串聯(lián)拷貝。E4T是包含位于起始點(diǎn)-38到+38的腺病毒E4最小啟動(dòng)子的E4TATA。圖10B顯示瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入AsPC-1和PANC-1胰腺癌細(xì)胞中的構(gòu)建物的活性。用相似摩爾量的質(zhì)粒DNA與內(nèi)部對照pRL-TK瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。48小時(shí)后測定二螢光素酶之比，然后與CMV活性相比較給出百分比。數(shù)據(jù)表示為四次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值；標(biāo)桿表示SD。圖10C顯示CCKAR啟動(dòng)子組合物的組織特異性。用內(nèi)部對照pRL-TK共同瞬時(shí)轉(zhuǎn)染其它癌細(xì)胞(LNCaP、PC-3、SKOV3.ip1、MDA-468)和無限增殖的正常細(xì)胞(Chang肝細(xì)胞、WI-38、184A1和E6E7細(xì)胞)。48小時(shí)后測定二螢光素酶之比。與AsPC-1中的活性之比相比較給出百分比。
圖11顯示了全身性遞送CTP-Luc和CMV-Luc質(zhì)粒DNA后，在AsPC細(xì)胞的常位腫瘤模型中體內(nèi)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。圖11A顯示了小鼠的體內(nèi)成像。攜帶皮下AsPC-1腫瘤的裸鼠經(jīng)尾靜脈注射含50μgDNA的DNA(CTP-Luc或CMV-Luc)脂質(zhì)體復(fù)合物，每日一次連續(xù)三天。最后一次注射24小時(shí)后，麻醉小鼠，腹膜內(nèi)注射D-熒光素10分鐘后用IVISTM成像系統(tǒng)成像5分鐘。顯示了小鼠的代表性圖像。圖11B顯示了用發(fā)光儀定量組織提取物中螢火蟲螢光素酶的活性，以每毫克總蛋白的相對螢光素酶單位表示。比較CTP小鼠與CMV小鼠的螢光素酶活性水平計(jì)算該比例。
圖18顯示人縮膽囊肽A型受體(CCKAR)啟動(dòng)子可能是胰腺癌特異性的。在圖18A中，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增胰腺癌特異性啟動(dòng)子的候選構(gòu)建物，CCKAR、孤兒G蛋白-偶聯(lián)受體(RDC1)、尿激酶型纖溶酶原激活物受體(uPAR)和胰凝乳蛋白酶原B1(CTRB1)，亞克隆入基礎(chǔ)報(bào)道質(zhì)粒pGL3，從而驅(qū)動(dòng)螢火蟲螢光素酶基因(表達(dá))。在圖18B中，用所述質(zhì)粒DNA和pRL-TK共轉(zhuǎn)染PANC-1和AsPC-1細(xì)胞。48小時(shí)后測定二螢光素酶之比，表示為按照Rellina螢光素酶標(biāo)準(zhǔn)化的相對光單位(RLU)。
圖19顯示分子工程改造的縮膽囊肽A型受體(CCKAR)啟動(dòng)子活性更強(qiáng)并保留了胰腺癌特異性。圖19A是工程改造的CCKAR構(gòu)建物的示意圖，包括pGL3-CCKAR-Luc-WPRE(CCKAR-P-Luc))、pGL3-CCKAR-TSTA-Luc(CCKAR-T-Luc)和pGL3-CCKAR-TSTA-Luc-WPRE(CTP-Luc)。圖19B顯示了CCKAR啟動(dòng)子在胰腺癌細(xì)胞中的活性。用質(zhì)粒DNA和pRL-TK共同瞬時(shí)轉(zhuǎn)染AsPC-1、PANC-1和PanO2細(xì)胞。48小時(shí)后檢測二螢光素酶之比。表示為相對于CMV啟動(dòng)子活性的百分比。數(shù)據(jù)代表了4個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。圖19C顯示了CCKAR啟動(dòng)子復(fù)合物的組織特異性。用所示質(zhì)粒和pRL-TK共同瞬時(shí)轉(zhuǎn)染非胰腺癌(LNCaP、PC-3、SKOV3.ipl、MDA-MB-468和HeLa)細(xì)胞和正常的以及無限增殖(WI-38、184A1和E6E7)細(xì)胞系。48小時(shí)后檢測二螢光素酶之比。表示為相對于在AsPC-1細(xì)胞中活性的百分比。
圖20顯示了縮膽囊肽A型受體(CCKAR)-兩步-轉(zhuǎn)錄激活(TSTA)-土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件(WPRE)組合物，CTP在常位動(dòng)物模型中是強(qiáng)有力的和胰腺癌特異性的。攜帶常位AsPC-1腫瘤的裸鼠經(jīng)尾靜脈給予含50μg DNA的DNA脂質(zhì)體復(fù)合物，每日一次連續(xù)三天。圖20A顯示了小鼠體內(nèi)圖像。麻醉小鼠，腹膜內(nèi)注射D-熒光素10分鐘后用IVIS成像系統(tǒng)成像5分鐘。圖20B顯示了熒光素表達(dá)的組織分布。切取所示腫瘤和器官的組織樣品用發(fā)光儀檢測螢光素酶活性。數(shù)據(jù)以每毫克總蛋白的相對螢光素酶單位表示。
圖21顯示CTP驅(qū)動(dòng)的Bik突變體(BikDD)表達(dá)能有效和特異殺傷胰腺癌細(xì)胞。圖20A是以pUK21為骨架的表達(dá)構(gòu)建物CMV-BikDD、pUK21-CMV-BikDD、CTP-BikDD、pUK21-CTP-BikDD的示意圖。。圖20B顯示了CMV或CTP驅(qū)動(dòng)的BikDD的殺傷作用。用2μg的pUK21(陰性對照)、pUK21-CMV-BikDD(陽性對照)或pUK21-CTP-BikDD加上100ng pGL3-CMV-Luc共轉(zhuǎn)染一組胰腺癌(AsPC-1、PANC-1、MDA-Panc28和PanO2)細(xì)胞和無限增殖的人胰腺上皮E6E7細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，使(細(xì)胞)與5ng/ml D-螢光素培育5分鐘，然后用IVIS成像系統(tǒng)使螢光素酶活性成像2分鐘。上圖顯示了代表性圖像。計(jì)算與陰性對照(設(shè)置為100％)相比的信號(hào)百分比(下圖)。
在本發(fā)明具體的實(shí)施方式中，類似地產(chǎn)生了包含這些操作性連接于編碼突變體Bik的多核苷酸的示范性胰腺特異性啟動(dòng)子的構(gòu)建物，然后將其導(dǎo)入需要按照本文所述類似方法治療胰腺癌的哺乳動(dòng)物中。本領(lǐng)域的技術(shù)人員不難優(yōu)化所述參數(shù)，例如遞送模式、組合物的濃度等。
在本發(fā)明的其它實(shí)施方式中進(jìn)一步縮小胰腺癌特異性元件來鑒定保留了胰腺癌特異性表達(dá)活性的甚至更小的區(qū)段。例如，可制備這些相應(yīng)區(qū)域的缺失構(gòu)建物，測試它們的組織特異性來鑒定保留了在胰腺癌組織中直接表達(dá)能力的更小區(qū)段。
實(shí)施例3前列腺癌特異性表達(dá)本發(fā)明人利用前列腺癌特異性啟動(dòng)子序列來控制編碼突變體Bik多肽的多核苷酸表達(dá)。本實(shí)施例描述了涉及該目標(biāo)的示范性方法和組合物。
轉(zhuǎn)移性和復(fù)發(fā)的激素難治療前列腺癌靶向基因療法的開發(fā)在具體的實(shí)施方式中，采用了能調(diào)節(jié)雄激素依賴性和雄激素不依賴性方式表達(dá)突變體Bik的啟動(dòng)子。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道在前列腺癌基因治療中近年來開發(fā)了前列腺特異性啟動(dòng)子，例如PSA(Greenberg，DeMayo等，1995；Spitzweg，Zhang等，1999；Latham，Searle等，2000；Wu，Matherly等，2001)、probasin(Greenberg，DeMayo等，1995；Zhang，Thomas等，2000；Wen，Giri等，2003)和hK2(Xie，Zhao等，2001)。這些啟動(dòng)子的活性依賴于雄激素。就晚期、轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者而言，激素去除是治療的基本選擇。然而，在化學(xué)去雄(chemicalcastration)后，腎上腺腺體會(huì)分泌大量的無活性前體類固醇脫氫表雄酮和雄烯二酮作為雄激素的補(bǔ)償來源(Denis，1996)。此外，大多數(shù)不依賴雄激素的前列腺腺癌細(xì)胞上調(diào)了AR表達(dá)、選擇具有類固醇反應(yīng)性增強(qiáng)或類固醇特異性降低的突變體AR或上調(diào)能刺激AR活性的生長因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Feldman和Feldman，2001)。此外，與該療法相關(guān)的明顯副作用導(dǎo)致了更廣泛地使用間歇(激素)去除方案，該方案在停止治療前用促黃體生成激素釋放激素激動(dòng)劑治療患者達(dá)12個(gè)月直至腫瘤開始發(fā)生進(jìn)展(Bruchovsky，Klotz等，2000)。因此，就許多疾病階段而言，患者產(chǎn)生激素的能力完好(hormonally intact)，故可允許利用雄激素反應(yīng)性載體來使前列腺組織表達(dá)治療性基因。
雄激素不依賴性前列腺癌(AIPC)是一種不可治療形式的前列腺癌，其生長和存活繞過了對雄激素的正常依賴。可選擇雄激素去除療法來(治療)AIPC(Feldman和Feldman，2001)。有人提議說該療法選擇了“隱藏”在正常前列腺中的雄激素-和AR-不依賴性的惡性上皮干細(xì)胞。這些AR突變的一個(gè)亞組在基因圖中位于配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(LBD)，并提出改變該受體應(yīng)答可導(dǎo)致耐受性，因而可采用非典型配體，例如雌激素或氫化可的松，或甚至雄激素受體拮抗劑，例如氟他胺作為激動(dòng)劑而起作用(Chen，Welsbie等，2004)。在這些情況下，在自殺性基因療法中開發(fā)一種雄激素不依賴性啟動(dòng)子對完全根治轉(zhuǎn)移性和復(fù)發(fā)性激素難治前列腺癌非常關(guān)鍵。
人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)啟動(dòng)子是癌癥特異性的在過去數(shù)年中，負(fù)責(zé)維持染色體末端的端粒DNA的酶，即端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶是實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的與神奇的抗癌癥方法相關(guān)的主體。端粒是保護(hù)染色體末端避免降解和末端間融合、重排和染色體丟失的必須元件。在人的體細(xì)胞中缺乏端粒酶活性不能對由于常規(guī)DNA聚合酶不能完全復(fù)制線性DNA分子所致的端粒DNA喪失進(jìn)行補(bǔ)償。所導(dǎo)致的端粒縮短限制了細(xì)胞增殖壽命和細(xì)胞衰老。體內(nèi)細(xì)胞的無限增殖和腫瘤發(fā)展與端粒酶激活相關(guān)，并且可能依賴于其激活。
文獻(xiàn)中報(bào)道了許多關(guān)于不同癌癥患者中端粒酶活性的內(nèi)容。例如，通常在80-100％的人類癌癥中發(fā)現(xiàn)有端粒酶表達(dá)，但除了精子細(xì)胞或高增殖性細(xì)胞外幾乎所有正常細(xì)胞都是陰性。在前列腺癌中，約84％的前列腺癌和100％的人前列腺癌細(xì)胞系是hTERT-陽性(Vasef，Ross等，1999)。近來，hTERT啟動(dòng)子已用于癌癥基因治療以及前列腺癌基因治療(Gu，Andreeff等，2002；Kim，Kim等，2003；Irving，Wang等，2004)。
兩步轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增(TSTA)明顯增加基因表達(dá)hTERT啟動(dòng)子增加了基因治療的安全性和效力。然而，這種未修飾的hTERT啟動(dòng)子的活性遠(yuǎn)弱于常用的非組織特異性病毒啟動(dòng)子，例如巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子(Cong，Wen等，1999；Gu，Andreeff等，2002；Komata，Kondo等，2002)。利用GAL4-VP16融合蛋白的一種擴(kuò)增方法稱為兩步轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增(激活)(TSTA)法，其可用于增強(qiáng)細(xì)胞啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性(Iyer，Wu等，2001；Zhang，Adams等，2002)。在該系統(tǒng)中，第一步涉及GAL4-VP16融合蛋白的組織特異性表達(dá)。進(jìn)而在第二步中，GAL4-VP16能在最小啟動(dòng)子中的GAL4應(yīng)答元件的控制下驅(qū)動(dòng)靶基因表達(dá)。利用TSTA可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平的放大。
WPRE是有用的增強(qiáng)子為提高組織特異性啟動(dòng)子的活性，本發(fā)明人和其他人采用了與最小組織特異性啟動(dòng)子融合的CMV增強(qiáng)子。雖然提高了活性，但組織特異性降低(未發(fā)表和(Latham，Searle等，2000))。為應(yīng)對此事，本發(fā)明人采用了土撥鼠肝炎病毒的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件(WPRE)，該元件參與RNA聚腺苷酸化的修飾，RNA輸出和/或RNA翻譯(Donello，Loeb等，1998)。在非病毒載體與病毒載體的瞬時(shí)表達(dá)期間(Loeb，Cordier等，1999；Glover，Bienemann等，2002)和當(dāng)基因穩(wěn)定摻入靶細(xì)胞的基因組中時(shí)，WPRE產(chǎn)生增強(qiáng)作用而不喪失組織特異性時(shí)(Lipshutz，Titre等，2003)。以正義方向克隆在靶基因和poly(A)序列之間的WPRE刺激螢光素酶表達(dá)在體外比不用WPRE的高2到7倍，在體內(nèi)高2到50倍(Zufferey，Donello等，1999；Lipshutz，Titre等，2003)。此外，可通過含有WPRE的腺病毒載體介導(dǎo)長期轉(zhuǎn)基因表達(dá)(Glover，Bienemann等，2003)。因此，WPRE是增加并延長基因治療中轉(zhuǎn)基因表達(dá)的有效工具。
TSTA和WPRE增強(qiáng)hTERT啟動(dòng)子的活性為測定TSTA和WPRE是否增強(qiáng)了hTERT啟動(dòng)子的活性，本發(fā)明人先亞克隆了一系列含有TSTA和WPRE的hTERT啟動(dòng)子復(fù)合物。用PCR擴(kuò)增LNCaP細(xì)胞DNA提取物的hTERT片段(核苷酸-378到+56)(Takakura，Kyo等，1999)。將hTERTp片段亞克隆入Pgl3-基礎(chǔ)質(zhì)粒中以驅(qū)動(dòng)螢火蟲螢光素酶基因，得到phTERTp-Luc。然后將WPRE插入phTERTp-Luc-Luc，得到phTERTp-Luc-WPRE。為利用TSTA系統(tǒng)，用hTERTp取代pTSTA質(zhì)粒的PSA啟動(dòng)子(Zhang，Johnson等，2003)，得到phTERTp-TSTA-Luc。最后，將WPRE片段插入phTERTp-TSTA-Luc得到質(zhì)粒phTERTp-TSTA-Luc-WPRE。
雄激素可激活A(yù)RR2融合的hTERTp啟動(dòng)子檢測用相似摩爾量的質(zhì)粒DNA和內(nèi)部對照pRL-TK瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染的AR陽性和AR陰性前列腺癌細(xì)胞以及正常的人上皮細(xì)胞(HUVEC)中不同啟動(dòng)子復(fù)合物的活性。不含增強(qiáng)子/啟動(dòng)子的pGL3-基礎(chǔ)(質(zhì)粒)用作陰性對照。48小時(shí)后檢測二螢光素酶之比，然后與CMV活性相比較給出百分比。
特別是用相似摩爾量的質(zhì)粒DNA和內(nèi)部對照pRL-TK瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染LNCaP細(xì)胞或PC-3細(xì)胞。48小時(shí)后檢測二螢光素酶之比，然后與CMV活性相比較給出百分比。數(shù)據(jù)表示四次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值；標(biāo)桿表示SD。圖12C顯示hTERTp復(fù)合物的組織特異性。用所示質(zhì)粒和內(nèi)部對照pRL-TK共同瞬時(shí)轉(zhuǎn)染肺成纖維細(xì)胞WI-38。48小時(shí)后測定二螢光素酶之比。與AsPC-1中的活性比相比較給出百分比。
如圖12所示，hTERTp在LNCaP細(xì)胞和PC-3細(xì)胞中均有活性，但是與CMV增強(qiáng)子/啟動(dòng)子相比其活性非常微弱。然而，WPRE約增加了2倍活性。出乎意料的是，TSTA系統(tǒng)在LNCaP細(xì)胞中使CMV活性提高了67％，在PC-3細(xì)胞中提高了90％。對于WPRE聯(lián)合的TSTA系統(tǒng)而言，在PC-3中其活性與CMV相當(dāng)，在LNCaP細(xì)胞中甚至高1.5倍。相反，其活性在WI-38細(xì)胞中仍檢測不到活性(數(shù)據(jù)未顯示)。
在大多數(shù)復(fù)發(fā)性前列腺癌病例中，AR基因得到擴(kuò)增和/或AR過度表達(dá)(Visakorpi T，Nat Genet1995(Chen，Welsbie等，2004))。因此，如果雄激素可激活該系統(tǒng)的活性，則應(yīng)該也可極大提高療效指數(shù)。為實(shí)現(xiàn)該目的，將得自質(zhì)粒ARR2PB的ARR2元件(Zhang，Thomas等，2000；Xie，Zhao等，2001)與phTERTp-TSTA-Luc和phTERTp-TSTA-Luc-WPRE的hTERTp啟動(dòng)子相融合，得到質(zhì)粒pARR2.hTERTp-TSTA-Luc和pARR2.hTERTp-TSTA-Luc-WPRE(圖13A)。用相似摩爾量的質(zhì)粒DNA和內(nèi)部對照pRL-TK瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染LNCaP細(xì)胞和PC-3細(xì)胞，在含有木炭/葡聚糖處理的FBS培養(yǎng)基中用0.01、0.1、1和10nM濃度的未被代謝的雄激素類似物R1881刺激兩天。然后如上所述測定二螢光素酶之比，與CMV活性相比較給出百分比。如所期望的那樣，與CMV的活性相比，ARR2.hTERTp-TSTA和ARR2.hTERTp-TSTA-WPRE復(fù)合物在LNCaP細(xì)胞中的活性以雄激素依賴方式提高了10倍，而在PC-3細(xì)胞中無明顯變化。
在本發(fā)明的其它實(shí)施方式中，進(jìn)一步縮小相應(yīng)的前列腺癌特異性元件來鑒定保留了前列腺癌特異性表達(dá)活性的甚至更小的區(qū)段。例如，可制備這些相應(yīng)區(qū)域的缺失構(gòu)建物，測試它們的組織特異性以鑒定保留了在前列腺癌組織中直接表達(dá)能力的更小區(qū)段。
TSTA和WPRE增強(qiáng)hTERT啟動(dòng)子活性圖22比較了在CMV啟動(dòng)子和hTERTp啟動(dòng)子復(fù)合物控制下的螢光素酶活性。圖22A是報(bào)道構(gòu)建物的示意圖。圖22B顯示了用報(bào)道質(zhì)粒DNA和內(nèi)部對照載體pRL-TK瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染前列腺癌LNCaP和PC-3細(xì)胞與正常人成纖維細(xì)胞WI-38細(xì)胞系。48小時(shí)后測定二螢光素酶之比。表示為相對于CMV啟動(dòng)子(設(shè)置為1)的螢光素酶活性(倍數(shù))。通過TSTA系統(tǒng)提高了hTERTp在LNCaP和PC-3細(xì)胞中的活性，WPRE進(jìn)一步提高了該活性(圖22B)。聯(lián)合TSTA和WPRE，在PC-3和LNCaP細(xì)胞中hTERTp-TSTA-WPRE的活性或與CMV啟動(dòng)子相當(dāng)或甚至高1.5倍。重要的是，在人正常肺成纖維細(xì)胞WI-38和以下進(jìn)一步驗(yàn)證的小鼠模型的正常組織中其活性維持沉默。
在體內(nèi)，順式作用的ARR2元件在對雄激素刺激的反應(yīng)中進(jìn)一步提高了TSTA和WPRE修飾的hTERTp的活性。從ADPC到AIPC的大多數(shù)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性前列腺癌病例中，AR基因得到擴(kuò)增和/或AR過度表達(dá)，但仍能在結(jié)合雄激素效應(yīng)元件(ARE)后與雄激素(或雄激素類似物)結(jié)合，導(dǎo)致激活轉(zhuǎn)錄(Chen等，2004；Visakorpi等，1995)。關(guān)于這點(diǎn)，如果啟動(dòng)子含有能結(jié)合雄激素(或雄激素類似物)/AR復(fù)合物的ARE，則治療指數(shù)應(yīng)極大提高，從而激活治療性基因表達(dá)。
為實(shí)現(xiàn)此目的，將得自ARR2PB(Xie等，2001；Zhang等，2000)的ARR2元件(雄激素受體效應(yīng)元件2)與我們新構(gòu)建的系統(tǒng)中的hTERTp上游融合，產(chǎn)生ATT-Luc(pGl3-ARR2.hTERTp-TSTA-Luc)和ATTP-Luc(pGl3-ARR2.hTERTp-TSTA-Luc-WPRE)(圖23A)。ARR2PB-Luc(pGl3-ARR2PB-Luc)用作對照，CMV-Luc用作參比工具。用這些構(gòu)建物和內(nèi)部對照載體pRL-TK瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，使細(xì)胞與濃度遞增的雄激素類似物R1881共同培育。的確，與CMV啟動(dòng)子活性相比，ATT和ATTP組合物的活性在AR+ADPC LNCaP細(xì)胞中以雄激素依賴性方式分別增加了15和25倍，在AR+AIPC LAPC-4細(xì)胞中分別增加了2.8和5.5倍(圖23B)。在PC-3和LNCaP細(xì)胞中ARR2不干擾hTERTp-TSTA和hTERTp-TSTA-WPRE的轉(zhuǎn)錄活性(圖22B和圖23B)，和它們在正常細(xì)胞中的特異性(數(shù)據(jù)未顯示)。與ATTP和ATT相比，ARR2PB在AR+(LNCaP and LAPC-4)中的活性低很多，在AR-(PC-3和DU145)細(xì)胞中幾乎無活性(圖23B)。因此，新產(chǎn)生的ATTP和ATT在所測試的所有四種細(xì)胞系中均具有高活性，與CMV啟動(dòng)子的活性相比，它們在AR-AIPC(PC-3和DU145)細(xì)胞中的活性相當(dāng)，在AR+ADPC(LNCaP)和AR+AIPC(LAPC-4)細(xì)胞中的活性強(qiáng)很多，重要的是在正常細(xì)胞中仍維持沉默。
ATTP在ADPC和AIPC體內(nèi)異種移植物中活性強(qiáng)為進(jìn)一步測定ATTP在體內(nèi)是否可維持活性和特異性，本發(fā)明人建立了皮下LNCaP和PC-3異種移植物的雄性BABL/c nu/nu小鼠模型。給攜帶LNCaP或PC-3腫瘤的小鼠靜脈內(nèi)注射含50μg pGL3-ATTP-Luc和pGL3-CMV-Luc的DNA脂質(zhì)體復(fù)合物，每日一次連續(xù)3天。每天用非侵入性成像系統(tǒng)對攜帶LNCaP腫瘤的小鼠體內(nèi)成像兩分鐘(Xie等，2004)，最后一次注射24小時(shí)后處死小鼠。生物發(fā)光圖像顯示在用CMV-Luc治療小鼠胸部(肺/心臟)區(qū)域有非常亮的斑點(diǎn)，但在用ATTP-Luc治療小鼠同一區(qū)域中幾乎無亮點(diǎn)(圖24A)。為進(jìn)一步特征分析光源部位，將小鼠在活體成像后立即處死，切取它們的主要器官進(jìn)行離體成像。本發(fā)明人證實(shí)用CMV-Luc治療小鼠的最強(qiáng)發(fā)光器官是肺，而用ATTP-Luc治療小鼠的肺部未檢測到信號(hào)(圖24B)。為延長光子激發(fā)時(shí)間來增加信號(hào)強(qiáng)度，然后對切取的腫瘤立即成像10分鐘。用ATTP-Luc治療小鼠的腫瘤所產(chǎn)生的信號(hào)遠(yuǎn)強(qiáng)于用CMV-Luc治療小鼠(P，0.002)(圖224C)。與體內(nèi)和離體成像的結(jié)果一致，用CMV-Luc治療小鼠的肺和心臟的螢光素酶活性明顯高于用ATTP-Luc治療的小鼠。相反，用ATTP-Luc治療小鼠的腫瘤的螢光素酶活性比用CMV-Luc治療小鼠的腫瘤的高14.5倍(P，0.004)(圖24E)。在LNCaP腫瘤模型中，ATTP-Luc的癌癥特異性指數(shù)(腫瘤相對于肺的螢光素酶活性)(Chen等，2004)是14.3，相反，CMV-Luc是0.012。由于PC-3細(xì)胞是AR-，用ATTP-Luc治療的PC-3腫瘤的信號(hào)比不上LNCaP腫瘤的。然而，用ATTP-Luc治療小鼠的PC-3腫瘤的信號(hào)仍強(qiáng)于用CMV-Luc治療的小鼠(圖24D)，ATTP-Luc的癌癥特異性指數(shù)(3.9)仍遠(yuǎn)好于CMV-Luc的(0.015)(數(shù)據(jù)未顯示)。綜合看，“嵌合性”ATTP導(dǎo)致前列腺腫瘤(AR+和AR-)中感興趣基因的表達(dá)效力至少與CMV啟動(dòng)子在AR-前列腺癌中的效力相當(dāng)，但在AR+前列腺癌中更有效，而在正常細(xì)胞中幾乎不表達(dá)。
實(shí)施例4體外測試癌癥特異性啟動(dòng)子在體外測試了包含操作性連接于相應(yīng)治療性多核苷酸的本發(fā)明啟動(dòng)子的構(gòu)建物。例如，在一些實(shí)施方式中，根據(jù)以前得到的表明該序列在所需組織或細(xì)胞中有效的數(shù)據(jù)來選擇調(diào)控序列。在其它實(shí)施方式中，不依賴潛在效力的在先知識(shí)來選擇調(diào)控序列。使待測試的調(diào)控序列操作性連接于報(bào)道序列，例如可通過包括顏色、光或熒光來監(jiān)測其表達(dá)和/或基因產(chǎn)物的報(bào)道序列。報(bào)道基因的例子包括螢光素酶或β-半乳糖苷酶。也可在該構(gòu)建物中加入任何種類的其它調(diào)控序列，包括轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后調(diào)控序列、最小啟動(dòng)子等。然后將待測試的構(gòu)建物及其一種或多種適當(dāng)?shù)恼{(diào)控(序列)導(dǎo)入所需的細(xì)胞并測試其表達(dá)。在具體實(shí)施方式
中，本領(lǐng)域技術(shù)人員測定待測試構(gòu)建物所產(chǎn)生的表達(dá)水平在其所定居的所需細(xì)胞或組織中是否有效。
實(shí)施例5體內(nèi)測試癌癥特異性啟動(dòng)子在動(dòng)物模型中測試了包含操作性連接于與其抗腫瘤活性相關(guān)的相應(yīng)治療性多核苷酸的本發(fā)明啟動(dòng)子的構(gòu)建物。通過載體，例如脂質(zhì)體或質(zhì)?；虿《据d體將該構(gòu)建物遞送入裸鼠模型來測試其抗腫瘤活性。一旦證實(shí)有抗腫瘤活性，利用免疫活性小鼠進(jìn)一步檢測可能的毒性，然后進(jìn)行臨床試驗(yàn)。
在一具體的實(shí)施方式中，在動(dòng)物中測試了包含操作性連接于治療性多核苷酸的本發(fā)明啟動(dòng)子的構(gòu)建物的優(yōu)先生長抑制活性。簡言之，將HER-2/neu過度表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞系(例如SKBR3和MDA-MB361)注射入裸鼠的乳腺脂肪墊中以產(chǎn)生乳腺異種移植物模型(只是舉例)。腫瘤達(dá)到特定大小后，將本發(fā)明的構(gòu)建物或其對照物與可接受的運(yùn)載體(例如脂質(zhì)體)相混合經(jīng)靜脈內(nèi)注射入小鼠。比較和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析這些治療所致的腫瘤大小和存活曲線。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，與野生型p21相比，包含本發(fā)明啟動(dòng)子的構(gòu)建物優(yōu)先抑制了組織特異性腫瘤的生長。
實(shí)施例6臨床測試癌癥特異性啟動(dòng)子本實(shí)施例涉及只用包含本發(fā)明癌癥特異性啟動(dòng)子的構(gòu)建物或聯(lián)合其它抗癌癥藥物來開發(fā)人體治療方案。采用包含本發(fā)明癌癥特異性啟動(dòng)子的構(gòu)建物的抗癌癥藥物治療可用于臨床治療各種癌癥。這種治療方法對抗腫瘤治療，例如治療患有相應(yīng)的乳腺癌、前列腺癌和胰腺癌的患者，如對常規(guī)化療方案耐受的那些患者特別有用。
根據(jù)本文內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道進(jìn)行臨床試驗(yàn)，包括患者治療和監(jiān)測所用的各種元件。以下信息是為臨床試驗(yàn)建立包含本發(fā)明癌癥特異性啟動(dòng)子的構(gòu)建物的通用指南。
臨床試驗(yàn)選擇的晚期轉(zhuǎn)移性乳腺癌、前列腺癌或胰腺癌患者通常處于癌癥發(fā)展的高風(fēng)險(xiǎn)中，以前已對目前消退的癌癥進(jìn)行過治療，或者對至少一次常規(guī)治療療程無反應(yīng)。在一示范性療程方案中，可在患者的胸膜腔或腹膜腔中植入Tenckhoff導(dǎo)管，或其它合適的裝置，并對胸膜/腹膜滲出液進(jìn)行連續(xù)取樣。通常期望測到未形成胸膜或腹膜腔的已知小腔(loculation)，肌酸酐水平低于2mg/dl和膽紅素水平低于2mg/dl。患者應(yīng)該顯示正常的血凝結(jié)模式。
就含有本發(fā)明癌癥特異性啟動(dòng)子的構(gòu)建物和其它抗癌癥藥物的給藥而言，可將Tenckhoff導(dǎo)管或其它裝置植入胸膜腔或腹膜腔中，除非這種裝置在先前的手術(shù)中已植入?？色@得胸腔或腹腔液樣品，從而可評估并記錄液體和細(xì)胞(包含本發(fā)明癌癥特異性啟動(dòng)子的構(gòu)建物)中的基線細(xì)胞性質(zhì)、細(xì)胞學(xué)(特性)、LDH和適當(dāng)?shù)臉?biāo)記(CEA、CA15-3、CA125、PSA、p38(磷酸化和未磷酸化形式)、Akt(磷酸化和未磷酸化形式))。
在同一方法中，包含本發(fā)明癌癥特異性啟動(dòng)子的構(gòu)建物可單獨(dú)給予或聯(lián)合其它抗癌癥藥物給予。例如，可施加入胸膜/腹膜腔，直接施加入腫瘤或以全身性方式給予。起始劑量可以是約0.05mg/kg體重。在低于3級毒性時(shí)，以每種劑量水平治療3位患者?？梢?00％遞增量加大劑量(0.5mg、1mg、2mg、4mg)直至檢測到藥物相關(guān)的2級毒性。然后以25％遞增量加大劑量。對某給定患者而言，如測定到包含本發(fā)明癌癥特異性啟動(dòng)子的所有構(gòu)建物和所有抗癌癥藥物混合物的內(nèi)毒素水平超過5EU/kg，則可將給予的劑量分為相等的兩份輸液，間隔6小時(shí)給予。
可在較短的輸液時(shí)間或在7到21天輸液期間以穩(wěn)定速度聯(lián)合給予包含本發(fā)明癌癥特異性啟動(dòng)子的構(gòu)建物和/或其它抗癌癥藥物?？蓡为?dú)給予包含本發(fā)明癌癥特異性啟動(dòng)子的構(gòu)建物或聯(lián)合給予抗癌癥藥物。以任何劑量水平給予輸液取決于每次輸液后所達(dá)到的毒性。因此，如果一次輸液后，或在穩(wěn)定速度輸液一段特定時(shí)間后達(dá)到II級毒性，應(yīng)中止進(jìn)一步給藥或停止穩(wěn)定速度輸液除非毒性改善?？陕?lián)合給予各組患者劑量遞增的包含本發(fā)明癌癥特異性啟動(dòng)子的構(gòu)建物和抗癌癥藥物直至約60％的患者顯示不可接受的任何種類的III或IV級毒性。該值2/3的劑量可定義為安全劑量。
當(dāng)然，應(yīng)該在治療前和約3-4周間隔后進(jìn)行體檢、腫瘤測量和實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)室研究應(yīng)包括CBC、差別性血小板計(jì)數(shù)(differential and platelet count)、尿分析、SMA-12-100(肝和腎功能檢驗(yàn))、血凝結(jié)狀況和任何其它合適的化學(xué)方法來測定疾病的程度或確定當(dāng)前癥狀的原因。也應(yīng)該監(jiān)測血清中合適的生物學(xué)標(biāo)記，例如CEA、CA15-3、p38(磷酸化和非磷酸化形式)和Akt(硫酸化和非磷酸化形式)、p185等。
為監(jiān)測疾病進(jìn)程和評價(jià)抗腫瘤反應(yīng)，考慮應(yīng)每4周檢測患者的相應(yīng)腫瘤標(biāo)記，如果最初異常，進(jìn)行4周的CBC、差別性血小板計(jì)數(shù)檢測，每周兩次；然后如果沒觀察到骨髓抑制，則每周一次。如果患者的骨髓抑制延長，建議進(jìn)行骨髓檢測以排除造成各類血細(xì)胞減少的腫瘤侵入骨髓的可能性。每4周應(yīng)檢測血凝結(jié)情況。應(yīng)每周進(jìn)行一次SMA-12-100。首次給藥72小時(shí)后取樣胸腔/腹腔滲出液，此后在前兩個(gè)療程中每周取樣一次，然后每4周一次直至研究或進(jìn)展結(jié)束。可評估液體中(CEA、CA15-3、CA125、ki67和Tunel試驗(yàn)來檢測凋亡，Akt)和細(xì)胞中(Akt)的細(xì)胞性質(zhì)、細(xì)胞學(xué)(特性)、LDH和相應(yīng)的標(biāo)記。當(dāng)存在可檢測的疾病(標(biāo)記)時(shí)，每4周記錄腫瘤測定值。每8周應(yīng)重復(fù)進(jìn)行合適的放射學(xué)研究來評價(jià)腫瘤應(yīng)答。治療開始后4周和8周和研究參與結(jié)束時(shí)重復(fù)進(jìn)行肺活量測定和DLCO。每4周進(jìn)行尿分析。
可通過可檢測的度量確定臨床應(yīng)答。例如，完全應(yīng)答可定義為所有可檢測的疾病(標(biāo)記)消失至少一個(gè)月。而部分應(yīng)答可定義為所有產(chǎn)生的可評估腫瘤結(jié)節(jié)的垂直直徑之和減少了50％或以上，或者至少一個(gè)月腫瘤部位顯示不擴(kuò)大。類似地，混合應(yīng)答可以定義為所有產(chǎn)生的可檢測的病損垂直直徑減少了50％或以上，伴有一處或多處部位進(jìn)展。
參考文獻(xiàn)本說明書中述及的所有專利和出版物代表了本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的水平。如同每篇出版物專門且獨(dú)立地引作參考一樣，所有專利和出版物全文納入本文作為參考。
專利美國專利4,683,202美國專利4,797,368美國專利4,879,236美國專利5,139,941美國專利5,220,007美國專利5,284,760美國專利5,354,670美國專利5,366,878美國專利5,389,514美國專利5,635,377美國專利5,641,484美國專利5,670,488美國專利5,789,166美國專利5,798,208美國專利5,830,650
美國專利5,871,986美國專利5,925,565美國專利5,928,906美國專利5,935,819出版物Adachi，N.，Nomoto，M.，Kohno，K.和Koyama，H.，(2000)，Gene，245，49-57。
Anderson，LM.，Krotz，S.，Weitzman，S.A.和Thimmapaya，B.，(2000)，“用轉(zhuǎn)錄靶向方法進(jìn)行的白色念珠菌胞嘧啶脫氨酶基因的乳腺癌特異性表達(dá)”(Breastcancer-specific expression of the Candida albicans cytosine deaminase gene using atranscriptional targeting approach)，Cancer Gene Ther7，845-852。
Barron，LG.，Szoka Jr.，F(xiàn).C.，(1999)，《用于基因治療的非病毒載體》(Non-viralvectors for gene therapy).，Huang，L.，Hung，M.-C.，Wagner，E.(編.).，Academic PressSan Diego，CA，第229-266頁。
Bartke，T.，Siegmund，D.，Peters，N.，Reichwein，M.，Henkler，F(xiàn).，Scheurich，P.，和Wajant，H.，“在DLD-1細(xì)胞中，p53上調(diào)cFLIP，抑制NF-kappaB-調(diào)控的基因轉(zhuǎn)錄，以及誘導(dǎo)胱冬酶-8不依賴性細(xì)胞死亡”(p53 upregulates cFLIP，inhibitstranscription of NF-kappaB-regulated genes and induces caspase-8-independent cell deathin DLD-1 cells)，Oncogene.20571-80.，2001。
Boyd，J.M.，Gallo，G.J.，Elangovan，B.，Houghton，A.B.，Malstrom，S.，Avery，B.J.，Ebb，R.G.，Subramanian，T.，Chittenden，T.，Lutz，R.J.等，“Bik，一種新型的死亡誘導(dǎo)蛋白，與Bcl-2家族蛋白共有獨(dú)特的序列基序，并能與病毒和細(xì)胞存活促進(jìn)蛋白相互作用”(Bik，a novel death-inducing protein shares a distinct sequence motifwith Bcl-2 family)，Oncogene.，111921-8，1995。
Chen，C.D.，D.S.Welsbie，C.Tran，S.H.Baek，R.Chen，R.Vessella，M.G.Rosenfeld和C.L.Sawyers，“對抗雄激素療法耐受的分子決定簇”(Molecular determinants ofresistance to antiandrogen therapy)，Nat Med，2004，10(1)第33-39頁。
Chen，J.S.，J.C.Liu，L.Shen，K.M.Rau，H.P.Kuo，Y.M.Li，D.Shi，Y.C.Lee，K.J.Chang和M.C.Hung，“存活蛋白啟動(dòng)子的癌癥特異性激活及其在基因治療中的潛在用途”(Cancer-specific activation of the survivin promoter and its potential use in genetherapy)，Cancer Gene Ther，2004。
Daniel，P.T.，Pun，K.T.，Ritschel，S.，Sturm，I.，Holler，J.，Dorken，B.和Brown，R.，“死亡基因Bik/Nbk的表達(dá)促進(jìn)了皮質(zhì)類固醇抗性T-細(xì)胞淋巴瘤對藥物誘導(dǎo)的凋亡的敏感性，并能防止嚴(yán)重組合型免疫缺陷小鼠的腫瘤生長”(Expression ofthe death gene Bik/Nbk promotes sensitivity to drug-induced apoptosis incorticosteroid-resistant T-cell lymphoma and prevents tumor growth in severe combinedimmunodeficient mice)，Blood.，941100-7.，1999。
Desagher，S.，Osen-Sand，A.，Montessuit，S.，Magnenat，E.，Vilbois，F(xiàn).，Hochmann，A.，Journot，L.，Antonsson，B.和Martinou，J.C.，“酪蛋白激酶I和II導(dǎo)致的bid磷酸化調(diào)控胱冬酶8對bid的切割”(Phosphorylation of bid by casein kinases Iand II regulates its cleavage by caspase 8)，Mol Cell.，8601-11，2001。
Emami，K.H.和Carey，M.，(1992)，“多聚VP16轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域功效力的協(xié)同性增強(qiáng)”(A synergistic increase in potency of a multimerized VP16 transcriptionalactivation domain)，EMBO J.，115005-5012。
Fuernkranz，H.A.，Schwob，J.E.和Lucas，J.J.，(1991)，“輸卵管和紅細(xì)胞轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的不同組織定位”(Differential issue localization of oviduct and erythroidtransferrin receptors)，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，887505-7508。
Han，J.，Sabbatini，P.和White，E.，“Nbk/Bik，一種含有BH3能與E1B 19K相互作用的蛋白，對凋亡的誘導(dǎo)”(Induction of apoptosis by human Nbk/Bik，aBH3-containing protein that interacts with E1B 19K)，Mol Cell Biol.，165857-64，1996。
Hochhauser，D.，Stanway，C.A.，Harris，A.L.，Hickson，I.D.，(1992)，“人拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα基因的5’側(cè)翼區(qū)域的克隆與特征鑒定”(Cloning and characterization ofthe 5′flanking region of the human topoisomerase II alpha gene)，J.Biol.Chem.，267(26)18961-5。
Iyer，M.，Wu，L.，Carey，M.，Wang，Y.，Smallwood，A.和Gambhir，S.S.，(2001)，“兩步轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增可作為采用弱啟動(dòng)子時(shí)顯現(xiàn)報(bào)告基因表達(dá)的方法”(Two-steptranscriptional amplification as a method for imaging reporter gene expression using weakpromoters)，Proc.Natl.Acad.Sci.，9814595-14600。
Katabi，M.M.，Chan，H.L.，Karp，S.E.和Batist，G.，(1999)，“己糖激酶II型一種用于基因靶向治療的在人癌細(xì)胞中差異性表達(dá)和調(diào)節(jié)的新型腫瘤特異性啟動(dòng)子”(Hexokinase type IIa novel tumor-specific promoter for gene-targeted therapydifferentially expressed and regulated in human cancer cells)，Hum Gene Ther10，155-164。
Klumpp，S.和Krieglstein，J.，“凋亡中的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶”(Serine/threonine protein phosphatases in apoptosis)，Curr Opin Pharmacol.，2458-62，2002。
Li，S.，Rizzo，M.A.，Bhattacharya，S.和Huang，L.，(1998)，Gene Ther，5，930-7。
Li，Y.M.，Wen，Y.，Zhou，B.P.，Kuo，H.P.，Ding，Q.和Hung，M.C.，(2003)，Cancer Res，63，7630-3。
Lu，H.，Zhang，Y.，Roberts，D.D.，Osborne，C.K.和Templeton，N.S.，(2002)，“在體外乳腺癌細(xì)胞中和體內(nèi)腫瘤中增強(qiáng)的基因表達(dá)”(Enhanced gene expression inbreast cancer cells in vitro and tumors in vivo)，Mol Ther，6，783-792。
Maeda，T.，J，O.W.，Matsubara，H.，Asano，T.，Ochiai，T.，Sakiyama，S.和Tagawa，M.，(2001)，“最小c-erbB-2啟動(dòng)子介導(dǎo)的單純皰疹病毒胸苷激酶基因的表達(dá)使更昔洛維對人乳腺癌細(xì)胞具有選擇性細(xì)胞毒性”(A minimum c-erbB-2promoter-mediated expression of herpes simplex virus thymidine kinase gene confersselective cytotoxi city of human breast cancer cells to ganciclovir)，Cancer Gene Ther，8，890-896。
Mathai，J.P.，Germain，M.，Marcellus，R.C.和Shore，G.C.，“在對E1A和p53引起的凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)反應(yīng)中的BIK/NBK的誘導(dǎo)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位“(Induction andendoplasmic reticulum location of BIK/NBK in response to apoptotic signaling by E1Aand p53)，Oncogene.，212534-44，2002。
Mo，Y.Y.，Ameiss，K.A.和Beck，W.T.，(1998)，“通過與增強(qiáng)型綠色熒光蛋白融合過度表達(dá)人DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα”(Overexpression of human DNA topoisomeraseII alpha by fusion to enhanced green fluorescent protein)，Biotechn.，25(6)1052-7。
Nettelbeck，D.M.，Jerome，V.和Muller，R.，(2000)，“基因治療用于腫瘤靶向的設(shè)計(jì)者(designer)啟動(dòng)子”(Gene therapydesigner promoters for tumour targeting)，Trends Genet.，16174-181。
Panaretakis，T.，Pokrovskaja，K.，Shoshan，M.C.和Grander，D.，“在對阿霉素的凋亡反應(yīng)中，Bak，Bax，和僅含BH3的蛋白質(zhì)的激活”(Activation of Bak，Bax，andBH3-only Proteins in the Apoptotic Response to Doxorubicin)，J Biol Chem.，27744317-26，2002。
Puthalakath，H.和Strasser，A.，“緊緊約束殺傷分子僅含BH3的蛋白質(zhì)促調(diào)亡活性的轉(zhuǎn)錄和翻譯后控制”(Keeping killers on a tight leashtranscriptional and post-translational control of the pro-apoptotic activity of BH3-only proteins)，Cell DeathDiffer.，9505-12，2002。
Qiao，J.，Doubrovin，M.，Sauter，B.V.，Huang，Y.，Guo，Z.S.，Balatoni，J.，Akhurst，T.，Blasberg，R.，G.，Tjuvajev，J.G.，Chen，S.H.和Woo，S.L.，(2002)，“自殺型基因治療的腫瘤特異性轉(zhuǎn)錄靶向”(umor-specific transcriptional targeting ofsuicide gene therapy)，Gene Ther，9，168-175。
Sadowski I，Ma J，Triezenberg S，Ptashne M.，“GAL4-VP16是一種罕見的強(qiáng)效轉(zhuǎn)錄激活劑”(GAL4-VP16 is an unusually potent transcriptional activator)，Nature.，1988年10月6日；335(6190)563-4。
Sato，M.，Johnson，M.，Zhang，L.，Zhang，B.，Le，K.，Gambhir，S.S.，Carey，M.，Wu，L.，(2003)，“優(yōu)化腺病毒載體以指導(dǎo)高度擴(kuò)增的前列腺特異性表達(dá)，用于成像和基因治療”(Optimization of adenoviral vectors to direct highly amplifiedprostate-specific expression for imaging and gene therapy)，Mol.Ther.，8(5)726-737。
Shindelman，J.E.，Ortmeyer，a.E.和Sussman，H.H.，(1981)，“證明人乳腺癌組織中有轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，鑒定分裂細(xì)胞的潛在標(biāo)記”(Demonstration of the TransferrinReceptor in human breast cancer tissue.Potential marker for identifying dividing cells)，Int.J.Cancer，27329-334。
Shterman，N.，Kupfer，B.和Moroz，C.，(1991)，“正常和惡性人乳腺細(xì)胞系的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、鐵含量和異鐵蛋白分布的比較”(Comparison of Transferrin Receptors，Iron Content and Isoferritin profile in normal and malignant human breast cell lines)，Pathobiol.，5919-25。
Templeton，N.S.，Lasic，D.D.，F(xiàn)rederik，P.M.，Strey，H.H.，Roberts，D.D.和Pavlakis，G.N.，(1997)，Nat Biotechnol，15，647-52。
Theodorakis，P.，Lomonosova，E.和Chinnadurai，G，“BAX是多次刺激人上皮癌細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生凋亡的關(guān)鍵因素”(Critical requirement of BAX for manifestation ofapoptosis induced by multiple stimuli in human epithelial cancer cells)，Cancer Res.，623373-6，2002。
Verma，S.，Zhao，L.和Chinnadurai，G.，“促調(diào)亡蛋白BIK的磷酸化磷酸化位點(diǎn)的圖譜以及對凋亡的作用”(Phosphorylation of the Pro-Apoptotic Protein BIKMapping of Phosphorylation sites and Effect on Apoptosis)，J Biol Chem.，1717，2000。
Visakorpi，T.，E.Hyytinen，P.Koivisto，M.Tanner，R.Keinanen，C.Palmberg，A.Palotie，T.Tammela，J.Isola和O.P.，Kallioniemi，“雄激素受體基因的體內(nèi)擴(kuò)增與人前列腺癌的進(jìn)展”(In vivo amplification ofthe androgen receptor gene and progressionof human prostate cancer)，Nat Genet，1995，9(4)第401-6頁。
Wang，H.G.，Pathan，N.，Ethell，I.，M.，Krajewski，S.，Yamaguchi，Y.，Shibasaki，F(xiàn).，McKeon，F(xiàn).，Bobo，T.，F(xiàn)ranke，T.F.和Reed，J.C.，“通過鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶對BAD的去磷酸化產(chǎn)生Ca2+-誘導(dǎo)的凋亡”(Ca2+-induced apoptosis through calcineurindephosphorylation of BAD)，Science.，284339-43，1999。
Xie X，Luo Z，Slawin KM，Spencer DM.，“EZC前列腺模型在活小鼠中的非侵入性前列腺成像”(The EZC-prostate modelnoninvasive prostate imaging in livingmice)，Mol Endocrinol.，2004年三月；18(3)722-32。
Xie，X.，X.Zhao，Y.Liu，J.Zhang，R.J.Matusik，K.M.Slawin和D.M.Spencer，“胱冬酶-9人工死亡開關(guān)的腺病毒介導(dǎo)的組織靶向表達(dá)用于治療前列腺癌”(Adenovirus-mediated tissue-targeted expression of a caspase-9-based artificial deathswitch for the treatment of prostate cancer)，Cancer Res，2001，61(18)第6795-804頁。
Zhang，L.，Adams，J.Y.，Billick，E.，Ilagan，R.，Iyer，M.，Le，K.，Smallwood，A.，Gambhir，S.S.，Carey，M.，Wu，L.，(2002)，“用于前列腺癌中轉(zhuǎn)基因遞送的兩步法轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增(TSTA)系統(tǒng)的分子工程”(Molecular engineering of a two-steptranscription amplification(TSTA)system for transgene delivery in prostate cancer)，Mol.Ther.，5(3)223-232。
Zhang，J.，T.Z.Thomas，S.Kasper和R.J.Matusik，“小的復(fù)合性probasin啟動(dòng)子通過體外和體內(nèi)雄激素和糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)賦予高水平的前列腺特異性基因表達(dá)”(Asmall composite probasin promoter confers high levels of prostate-specific geneexpression through regulation by androgens and glucocorticoids in vitro and in vivo)，Endocrinology，2000，141(12)第4698-710頁。
Zou，Y.，Peng，H.，Zhou，B.，Wen，Y.，Wang，S.C.，Tsai，E.M.和Hung，M.C.，“促調(diào)亡基因bik所導(dǎo)致的全身性腫瘤抑制”(Systemic tumor suppression by theproapoptotic gene bik)，Cancer Res.，628-12，2002。
雖然已對本發(fā)明及其優(yōu)點(diǎn)作了詳細(xì)描述，但應(yīng)理解可對本發(fā)明作出各種變化、替代和改變而不脫離本文所附權(quán)利要求所確定的構(gòu)思和范圍。而且，并不意味本申請的范圍受限于說明書所述的工藝、機(jī)制、制造方法、材料組成、工具、方法和步驟的具體實(shí)施方式
。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明公開的內(nèi)容不難理解，可按照本發(fā)明采用與本文所述相應(yīng)實(shí)施方式行使基本上相同的功能或獲得基本上相同結(jié)果的現(xiàn)有或?qū)黹_發(fā)的工藝、機(jī)制、制造方法、材料組成、工具、方法和步驟。因此，希望將這些工藝、機(jī)制、制造方法、材料組成、工具、方法或步驟包括在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
序列表<110>M.-C.洪(HUNG，MIEN-CHIE)C.-P.戴(DAY，CHI-PING)K.-M.勞(RAU，KUN-MING)X.謝(XIE，XIAOMING)Z.李(LI，ZHENG)<120>癌癥特異性啟動(dòng)子<130>UTFC845WO<140>未知<141>2005-04-01<150>60/559，111<151>2004-04-02<160>24<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>人工序列的描述合成引物<400>14ccttgcctgc tgctttccac caagtgctgg agagctggtg aattgctcac tcccggctca 60ttcctctaat gaccgaagcg tctcgcagat gcaacctgcc gtggaggagc agggagggag 120tgatttccag gtgtgggctt tttcagccat tcctaaaggc gacttgagtt cacctcactc 180actccagcat ttgtactcct gttgtggaaa aggcagtgag cacaagccaa gcccgctcca 240ccttcacccc gccccacctc ccccggccct ttcctgggcc agtcttaggg ccctgagtac 300agacagcctg gctacccgtt aaccattctc agcgtgtggc tgctttttac acacatgtgt 360acatatgcac ggacacacac acacacacag aggcttcccc agtactcctc tatataggaa 420cccgtcacca tcccagacat atgcagaaga aagcccaaac cggctgtgtg agacaggaac 480aattaacacg gtaacagatc cgataatgca gaccatcagg cctaaagaac acggagggac 540tgtgttctac ctccttatag aaaagcaatt agtgcctttt tagctttgga accatgcccg 600gtggtgtgtg tgtggacaga actgctggct ggttgttaag ttgctactaa acacagtgtt 660gtttctcgtg gtctctgccc ttgttaacta ggattgaggc acttttgaac ataggtacct 720gggtcctaag ggcgaattcc agcacactgg cggccgttac tagtggatcc gagctcggta 780ccaagctcca gctgggaata gagataggag gggacccagc tggatgcagt gggcagtggg 840ggtcatagag tcaagagggt acagaataca atggggtcct agtatcatgg tggaggtcag 900aaagagccct aaaagagagg gtcaaggtag gaggttagtg aaggtccacc tccaccctct 960ccaggacagg gacatcaggc cacaattaat ttctctgcag ttggtgagtg gtcatggtct 1020ctggagtccc cagcatccag agtgtccctg gtctagtggt cccccctttc tgagccacag 1080ccactttctc catcaaatga ggccagtaat acccatccca tagtgatgct gtgaggatga 1140gatgagcatc tgtaagtgct gaagataatc cctgacacat cccaagcatt cagcagtgca 1200agcatacact tacacggcac tccccagagc caggcatgtg ctggtgcctc atacacgtga 1260ccacatttga tcgtcacaat gaccctgtga gggagactgt gcaacagagg actgaccttg 1320ctcaaagacc tcaggcgttt cccctcagag cctgagaggt catctctttt tttttttttt 1380tttcctttct ttctttttct tttccatttc tttttctttg caagaggtca tctctaatgc 1440tttggaatat cctgccagat tagagtccct ttgttcacct gaaggtttgg gccacaccag 1500atagtctaac ggtgtgattt gtgctgaagg ttttgagcca cactatatca gctagatttc 1560tagagcggcc ggccgcaata aaatatcttt attttcatta catctgtgtg ttggtttttt 1620gtgtgaatcg atagtactaa catacgctct ccatcaaaac aaaacgaaac aaaacaaact 1680agcaaaatag gctgtcccca gtgcaagtgc aggtgccaga acatttctct atcgataggt 1740accgagctca tttaggt 1757<210>15<211>646<212>DNA
<213>人工序列<220>
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<223>人工序列的描述合成引物<400>21cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag ggcgatcggt gcgggcctct tcgctattac 60gccagcccaa gctaccatga taagtaagta atattaaggt acgggaggta cttggagcgg 120ccgcgatcca gacatgataa gatacattga tgagtttgga caaaccacaa ctagaatgca 180gtgaaaaaaa tgctttattt gtgaaatttg tgatgctatt gctttatttg taaccattat 240aagctgcaat aaacaagtta acaacaacaa ttgcattcat tttatgtttc aggttcaggg 300ggaggtgtgg gaggtttttt aaagcaagta aaacctctac aaatgtggta tggctgatta 360tgatcatgaa cagactgtga ggactgaggg gcctgaaatg agccttggga ctgtgaattt 420aaaatacaca aacaattaga atcagtagtt taacacatta tacacttaaa aattttatat 480ttaccttaga gctttaaatc tctgtaggta gtttgtccaa ttatgtcaca ccacagaagt 540aaggttcctt cacaaagatc ccaagctgtc gatcgacatt tctagaggat ctcggacccg 600gggaatcccc gtcccccaac atgtccagat cgaaatcgtc tagcgcgtcg gcatgcgcca 660tcgccacgtc ctcgccgtct aagtggagct cgtcccccag gctgacatcg gtcggggggg 720
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<223>人工序列的描述合成引物<400>22gacactatag aatacaagct tgcatgcctg caggtccgga ggacagtact ccgctcggag 60gacagtactc cgctcggagg acagtactcc gctcggagga cagtactccg ctcggaggac 120agtactccga ctctagagga tccccagtcc tatatatact cgctctgcac ttggcccttt 180tttacactgt gactgattga gctggtgccg tgtcgagtgg tgtctcgaga tctgcgatct 240aagtaagctt ggcattccgg tactgttggt aaagccacc 279<210>23<211>650<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成引物<400>23gctagctacg ggccagatat acgcgttgac attgattatt gactagttat taatagtaat 60caattacggg gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg 120taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt 180atgttcccat agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac 240ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg 300acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact 360ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt 420ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt ttgactcact cgagagacgg tgagagcgag 480tcagggattg gctggtctgc ttcgggcggg ctaaaggaag gttcaagtgg agctctccta 540accgacgcgc gtctgtggag aagcggcttg gtcgggggtg gtctcgtggg gtcctgcctg 600tttagtcgct ttcagggttc ttgagcccct tcacgaccgt caccaagctt 650<210>24<211>678<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成引物
<400>24gctagctacg ggccagatat acgcgttgac attgattatt gactagttat taatagtaat 60caattacggg gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg 120taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt 180atgttcccat agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac 240ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg 300acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact 360ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt 420ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt ttgactcact cgagcggccg ccagtgtgat 480ggatatctgc agaattcgcc cttgcgatct gtcagagcac ctcgcgagcg tacgtgcctc 540aggaagtgac gcacagcccc cctgggggcc gggggcgggg ccaggctata aaccgccggt 600taggggccgc catcccctca gagcgtcggg atatcgggtg aagggcgaat tccagcacac 660tggcggccgt tactagtg678
權(quán)利要求
1.一種多核苷酸構(gòu)建物，其包含乳腺癌特異性調(diào)控序列，所述調(diào)控序列包含拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα啟動(dòng)子的所選部分或轉(zhuǎn)鐵蛋白受體啟動(dòng)子的所選部分。
2.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述調(diào)控序列包含拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα啟動(dòng)子的所選部分。
3.如權(quán)利要求2所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα啟動(dòng)子的所選部分包含SEQ ID NO12。
4.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述調(diào)控序列包含轉(zhuǎn)鐵蛋白受體啟動(dòng)子的所選部分。
5.如權(quán)利要求4所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述轉(zhuǎn)鐵蛋白受體啟動(dòng)子的所選部分包含SEQ ID NO13。
6.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建物，還包含增強(qiáng)子。
7.如權(quán)利要求6所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述增強(qiáng)子含有巨細(xì)胞病毒(CMV)增強(qiáng)子、甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動(dòng)子(GAPDH)或β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。
8.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建物，還包含轉(zhuǎn)錄后調(diào)控序列。
9.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述轉(zhuǎn)錄后調(diào)控序列是土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(WPRE)。
10.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建物，還包含兩步轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增(TSTA)序列，所述TSTA序列包含DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和活化結(jié)構(gòu)域。
11.如權(quán)利要求10所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域是Gal1、Gal4或LexA。
12.如權(quán)利要求10所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述活化結(jié)構(gòu)域是VP2或VP16。
13.如權(quán)利要求10所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述TSTA序列是GAL4-VP2或GAL4-VP16。
14.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述調(diào)控序列可操作性連接于編碼治療性基因產(chǎn)物的多核苷酸。
15.如權(quán)利要求14所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述治療性基因產(chǎn)物包括細(xì)胞增殖抑制劑、程序性細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)劑、或腫瘤抑制劑。
16.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建物，該構(gòu)建物還明確包含在脂質(zhì)體中。
17.一種多核苷酸構(gòu)建物，其包含前列腺癌特異性調(diào)控序列，所述調(diào)控序列包含下列序列的至少兩種前列腺組織特異性調(diào)控序列；癌癥特異性調(diào)控序列；和兩步轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增(TSTA)序列，所述TSTA序列包含DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和活化結(jié)構(gòu)域。
18.如權(quán)利要求17所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述前列腺癌特異性調(diào)控序列包含SEQ ID NO17。
19.如權(quán)利要求17所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述癌癥特異性調(diào)控序列包含SEQ ID NO18。
20.如權(quán)利要求17所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域是Gal1、Gal4、或LexA。
21.如權(quán)利要求17所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述活化結(jié)構(gòu)域是VP2或VP16。
22.如權(quán)利要求17所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述TSTA序列是GAL4-VP2或GAL4-VP16。
23如權(quán)利要求17所述的構(gòu)建物，還包含轉(zhuǎn)錄后調(diào)控序列。
24.如權(quán)利要求23所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述轉(zhuǎn)錄后調(diào)控序列是土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(WPRE)序列。
25.如權(quán)利要求17所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述調(diào)控序列可操作性連接于編碼治療性基因產(chǎn)物的多核苷酸。
26.如權(quán)利要求25所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述治療性基因產(chǎn)物是細(xì)胞增殖抑制劑、程序性細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)劑、或腫瘤抑制劑。
27.如權(quán)利要求17所述的構(gòu)建物，該構(gòu)建物還明確包含在脂質(zhì)體中。
28.一種多核苷酸構(gòu)建物，包含胰腺癌特異性調(diào)控序列，所述調(diào)控序列包含胰腺組織特異性調(diào)控序列；和兩步轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增(TSTA)序列，所述TSTA序列包含DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和活化結(jié)構(gòu)域。
29.如權(quán)利要求28所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述胰腺組織特異性調(diào)控序列包含SEQ ID NO14。
30.如權(quán)利要求28所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域是Gal1、Gal4、或LexA。
31.如權(quán)利要求28所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述活化結(jié)構(gòu)域是VP2或VP16。
32.如權(quán)利要求28所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述TSTA序列是GAL4-VP2或GAL4-VP16。
33如權(quán)利要求28所述的構(gòu)建物，還包含轉(zhuǎn)錄后調(diào)控序列。
34.如權(quán)利要求33所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述轉(zhuǎn)錄后調(diào)控序列是土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(WPRE)。
35.如權(quán)利要求28所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述調(diào)控序列可操作性連接于編碼治療性基因產(chǎn)物的多核苷酸。
36.如權(quán)利要求46所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述治療性基因產(chǎn)物是細(xì)胞增殖抑制劑、程序性細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)劑、或腫瘤抑制劑。
37.如權(quán)利要求28所述的構(gòu)建物，該構(gòu)建物還明確包含在脂質(zhì)體中。
38.一種抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的方法，包括使乳腺癌細(xì)胞與有效量的多核苷酸構(gòu)建物接觸，該多核苷酸構(gòu)建物包含拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα啟動(dòng)子的所選部分或轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的所選部分，所述所選部分可操作性連接于編碼有效抑制細(xì)胞增殖的基因產(chǎn)物的多核苷酸。
39.一種抑制前列腺癌細(xì)胞增殖的方法，包括使前列腺癌細(xì)胞與有效量的多核苷酸構(gòu)建物接觸，所述多核苷酸構(gòu)建物具有下列序列的至少兩種前列腺癌特異性調(diào)控序列；兩步轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增序列；和癌細(xì)胞特異性序列，其中，所述序列可操作性連接于編碼有效抑制前列腺癌細(xì)胞增殖的基因產(chǎn)物的多核苷酸。
40.如權(quán)利要求39所述的方法，其特征在于，所述構(gòu)建物還包含轉(zhuǎn)錄后調(diào)控序列，所述轉(zhuǎn)錄后調(diào)控序列可操作性連接于編碼有效抑制前列腺癌細(xì)胞增殖的基因產(chǎn)物的多核苷酸。
41.一種抑制胰腺癌細(xì)胞增殖的方法，包括使胰腺癌細(xì)胞與有效量的多核苷酸構(gòu)建物接觸，所述多核苷酸構(gòu)建物包含胰腺細(xì)胞特異性序列和兩步擴(kuò)增序列，這兩種序列均可操作性連接于編碼有效抑制細(xì)胞增殖的基因產(chǎn)物的多核苷酸。
42.如權(quán)利要求41所述的方法，其特征在于，所述構(gòu)建物還包含轉(zhuǎn)錄后調(diào)控序列，所述轉(zhuǎn)錄后調(diào)控序列可操作性連接于編碼有效抑制細(xì)胞增殖的基因產(chǎn)物的多核苷酸。
43.一種治療患有癌癥的個(gè)體的乳腺癌的方法，包括使該個(gè)體的至少一個(gè)乳腺癌細(xì)胞與治療有效量的多核苷酸構(gòu)建物接觸，所述多核苷酸構(gòu)建物包含拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα啟動(dòng)子的所選部分或轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的所選部分，所述所選部分可操作性連接于編碼有效治療乳腺癌的基因產(chǎn)物的多核苷酸。
44.一種治療患有癌癥的個(gè)體的前列腺癌的方法，包括使該個(gè)體的至少一個(gè)前列腺癌細(xì)胞與治療有效量的多核苷酸構(gòu)建物接觸，所述多核苷酸構(gòu)建物包含以下序列的至少兩種前列腺細(xì)胞特異性調(diào)控序列；癌細(xì)胞特異性調(diào)控序列；和兩步轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增序列，其中所述這些序列可操作性連接于編碼有效治療前列腺癌的基因產(chǎn)物的多核苷酸。
45.如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸構(gòu)建物還包含轉(zhuǎn)錄后調(diào)控序列。
46.一種治療患有癌癥的個(gè)體的胰腺癌的方法，包括使該個(gè)體的至少一個(gè)胰腺癌細(xì)胞與治療有效量的多核苷酸構(gòu)建物接觸，所述多核苷酸構(gòu)建物包含胰腺細(xì)胞特異性調(diào)控序列和兩步轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增序列，這兩種序列均可操作性連接于編碼有效治療胰腺癌的基因產(chǎn)物的多核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及癌癥特異性調(diào)控序列，所述序列指導(dǎo)編碼用于癌癥治療的治療性基因產(chǎn)物的多核苷酸。具體地說，本發(fā)明包括乳腺癌、前列腺癌和胰腺癌特異性調(diào)控序列。兩種乳腺癌特異性序列采用了拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體啟動(dòng)子的特定區(qū)域，尤其是和增強(qiáng)子結(jié)合。前列腺癌特異性和胰腺癌特異性調(diào)控序列采用了組織特異性調(diào)控序列、兩步轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增序列和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控序列的復(fù)合物。在更具體的實(shí)施方式中，這些多核苷酸與脂質(zhì)體一起給藥。
文檔編號(hào)C12N15/11GK1997745SQ200580011993
公開日2007年7月11日 申請日期2005年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月2日
發(fā)明者M·-C·洪, C·－P·戴, K·－M·勞, X·謝, Z·李 申請人:得克薩斯州大學(xué)系統(tǒng)董事會(huì)