專利名稱：淋病奈瑟氏球菌檢測的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及細菌淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)的檢測，更具體地涉及細菌核酸的檢測。本發(fā)明具體涉及典型地出于臨床診斷的目的，檢測淋病奈瑟氏球菌的porA基因的擴增片段以確定細菌是否存在于獲自個體的生物樣品中。
背景技術(shù)：
淋病奈瑟氏球菌是一種革蘭氏陰性雙球菌細菌病原體，它是已知為淋病的性傳播疾病(STD)的病原生物。盡管淋病是首先由Galen在AD 150發(fā)現(xiàn)的古老疾病，其仍舊是人類主要的STD。不能檢測和治療淋病奈瑟氏球菌感染會使疾病發(fā)展到嚴重的系統(tǒng)感染，所述系統(tǒng)感染影響心臟、關節(jié)、腦膜、眼睛和咽。因此，早期的確定診斷可以協(xié)助治療疾病并且預防作為這種細菌感染的結(jié)果引起的嚴重并發(fā)癥。
盡管聚合酶鏈式反應(PCR)是用于淋病奈瑟氏球菌的常規(guī)檢測的選擇方法，PCR具有限制，而細菌分離仍舊是確定診斷的金標準。這主要是因為淋病奈瑟氏球菌與其它的奈瑟球菌屬物種包括腦膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)具有很高的序列同源性，此外包含許多非保守序列(Palmer等，2003，J.Clin.Microbiol.41 835-7)。因此，當使用PCR來常規(guī)檢測淋病奈瑟氏球菌時，有發(fā)生假陽性和假陰性結(jié)果的可能。在兩種情況下，結(jié)果會是有重大影響的。從公眾健康的角度來看，假陰性結(jié)果可以使疾病不受制止地傳播，而假陽性結(jié)果對于患者而言會具有相當?shù)纳鐣?br> Roche Cobas Amplicor系統(tǒng)(Roche Diagnostics，澳大利亞)是廣泛用于檢測淋病奈瑟氏球菌的PCR測定法。它的吸引力存在于同時檢測淋病奈瑟氏球菌、鸚鵡熱衣原體(Chlamydia trachomatis)和抑制物質(zhì)的存在的能力，同時還攜有美國食品和藥監(jiān)局(FDA)的批準。但是所述Cobas Amplicor系統(tǒng)確實具有局限。最顯著地，已知其淋病奈瑟氏球菌測定與一些共生的奈瑟球菌屬物種的菌株，包括微黃色奈瑟氏球菌(N.subflava)，灰色奈瑟氏球菌(N.cinerea)，變黃奈瑟氏球菌(N.flavescens)，嗜乳糖奈瑟氏球菌(N.lactamica)和干燥奈瑟氏球菌(N.sicca)交叉反應(Palmer等，2003，上文；Farrell，1999，J.Clin.Microbiol.37386-90)。結(jié)果，需要使用第二PCR測定來證實Cobas Amplicor的陽性結(jié)果。作為響應，臨床實驗室已經(jīng)采取了內(nèi)部(in-house)證實測定法。
到目前為止，內(nèi)部證實測試的最常用靶標是淋病奈瑟氏球菌的隱蔽性質(zhì)粒(cppB)基因，其中已經(jīng)描述了一些這樣的方法(Ho等，1992，J.ClinPathol.45439-442；Farrell，1999，上文；Whiley等，2002，Diagn.Microbiol.Infect.Dis.4285-9；Tabrizi等，2004，Sex.Trans.Infect.8068-71)。特別地，已經(jīng)開發(fā)了基于LightCycler的cppB PCR(cppB-LC)測定法來證實Cobas淋病奈瑟氏球菌的陽性樣本(Whiley等，2002，上文)。然而，現(xiàn)在存在關于靶向cppB基因的淋病奈瑟氏球菌測定法的靈敏度和特異性的深度關注。在英國和澳大利亞進行的研究已經(jīng)鑒定了缺乏cppB基因的淋病奈瑟氏球菌分離株(Palmer等2003，上文，OttawaA cluster of culture-positive，but PCR false negative infections with Neisseria gonorrhoeae.Tapsall等，Abstract 0129.15th Biennial Congress of the International Society forSexually Transmitted Diseases Research ISSTDR)。因此靶向該基因的實驗室冒著假陰性結(jié)果的風險。此外，所述cppB基因可以存在于包括灰色奈瑟氏球菌的共生的奈瑟氏球菌菌株中，并且因此還會產(chǎn)生假陽性的結(jié)果(Palmer等2003，上文)。
交叉反應是基于淋球菌核酸診斷測試的嚴重問題并且在奈瑟氏球菌屬中的水平基因交換是這些交叉反應的主要來源(Johnson等，2002，MMWR Recomm.Rep181-38)。此外，將淋球菌測試用在未消毒的部位，而其它的奈瑟氏球菌屬菌株可以頻繁地在這些部位發(fā)現(xiàn)。
已經(jīng)將porA基因的PCR檢測用于檢測腦膜炎奈瑟氏球菌(Glustein等，1999，Molecular Diagnosis 4233-9)，部分是由于該基因在共生的奈瑟氏球菌中不存在的假設(Feavers & Maiden，1998，Mol.Microbiol.30 647-656)。而且，在這些測定中，當這些測試用在消毒的部位上時，交叉反應(或交叉反應的可能)不是顯著的威脅，所述消毒的部位包括血液和CSF。
其中porA序列已經(jīng)被鑒定的僅有的其它的奈瑟氏球菌屬物種是淋病奈瑟氏球菌，它具有與腦膜炎奈瑟氏球菌porA基因有相當大的序列類似性的porA假基因(Feavers & Maiden，1998，上文)。然而，不清楚的是這種假基因是否存在于淋病奈瑟氏球菌所有的菌株中，也沒有證實其在共生菌株中的不存在。
發(fā)明概述盡管存在這樣的事實，即淋病奈瑟氏球菌porA假基因是基于核酸檢測淋病奈瑟氏球菌、更具體地，區(qū)分淋病奈瑟氏球菌和腦膜炎奈瑟氏球菌的不大可能的靶標，并且可能在淋病奈瑟氏球菌分離株和菌株中不是普遍存在的，或在共生菌株中不存在，本發(fā)明人已經(jīng)令人驚奇地開發(fā)了敏感的和可再現(xiàn)的使用淋病奈瑟氏球菌porA假基因作為靶標的基于核酸的檢測方法。
因此，本發(fā)明已經(jīng)廣泛涉及確定個體是否被或已經(jīng)被淋病奈瑟氏球菌感染的方法，所述方法使用來自其中的porA假基因或porA核酸作為感染的指示物。
本發(fā)明還廣泛涉及一種或多種寡核苷酸，其有利于檢測淋病奈瑟氏球菌，porA基因或porA核酸。
在第一方面中，本發(fā)明提供確定個體是否被或已經(jīng)被淋病奈瑟氏球菌感染的方法，所述方法包括，如果分離的porA核酸存在于獲自所述個體的生物樣品中，檢測淋病奈瑟氏球菌的步驟，所述porA核酸的存在指示所述個體被或已經(jīng)被淋病奈瑟氏球菌感染。
優(yōu)選地，所述方法包括使核酸樣品在促進所述分離的porA核酸擴增到可檢測水平的條件下，使核酸樣品進行核酸序列擴增的步驟。
在本發(fā)明的第二個方面，提供了確定個體是否被或已經(jīng)被淋病奈瑟氏球菌感染的方法，所述方法包括如果存在于獲自所述個體的所述生物學樣品中，從另一種奈瑟氏球菌屬物種的porA核酸中選擇性檢測或區(qū)分分離的淋病奈瑟氏球菌的porA核酸的步驟，所述分離的porA核酸的存在指示所述個體被或已經(jīng)被淋病奈瑟氏球菌所感染。
優(yōu)選地，所述方法包括在這樣的條件下，使核酸樣品進行核酸序列擴增的步驟，所述條件促進所述分離的porA核酸擴增到可檢測的水平，但是不有利于所述另一種奈瑟氏球菌屬物種的porA核酸擴增到可檢測水平。
優(yōu)選地，所述另一種奈瑟氏球菌屬物種是腦膜炎奈瑟氏球菌。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供確定人個體被或已經(jīng)被淋病奈瑟氏球菌感染的方法，所述方法包括下列步驟(i)如果存在于所述生物樣品中，使獲自所述人個體的生物樣品進行核酸序列擴增以選擇性地產(chǎn)生來自淋病奈瑟氏球菌porA核酸的porA淋病奈瑟氏球菌擴增產(chǎn)物；和(ii)如果存在，通過探針雜交來檢測所述擴增產(chǎn)物，其中所述porA擴增產(chǎn)物的存在指示所述個體被或已經(jīng)被淋病奈瑟氏球菌所感染。
在第三個方面，本發(fā)明提供足以使得所述porA核酸的檢測能夠進行的能夠與淋病奈瑟氏球菌的porA核酸雜交的寡核苷酸，但是其在足以使所述另一種奈瑟氏球菌屬物種的所述porA核酸能夠檢測的情況下，不能與另一種奈瑟氏球菌屬物種的porA核酸雜交。
優(yōu)選地，所述另一種奈瑟氏球菌屬物種是腦膜炎奈瑟氏球菌。
在優(yōu)選的實施方案中，所述寡核苷酸包括如表1和

圖1所提出的核苷酸序列(SEQ ID NOS3-9)。
在第四個方面，本發(fā)明提供一種試劑盒，所述試劑盒包括按照第三個方面的一種和多種寡核苷酸以及DNA聚合酶和/或一種或多種檢測試劑。
在第五個方面，本發(fā)明提供一種核酸陣列，其包括按照第二個方面的寡核苷酸，所述寡核苷酸固定，偶聯(lián)，浸透于基底或以其它方式與基底聯(lián)系。
要理解的是，本發(fā)明提供有利于淋病奈瑟氏球菌的porA核酸的檢測的方法和寡核苷酸。
優(yōu)選地，所述porA核酸對應于淋病奈瑟氏球菌的porA假基因的片段。
更優(yōu)選地，按照該實施方案，porA核酸對應于淋病奈瑟氏球菌的porA假基因的片段，所述片段具有不同于另一種奈瑟氏球菌屬物種的porA基因或假基因的片段的核苷酸序列。
在特別優(yōu)選的實施方案中，淋病奈瑟氏球菌的porA核酸包括足以使所述porA核酸的檢測能夠進行的核苷酸序列，寡核苷酸能夠與所述核苷酸序列退火。
適合地，所述核苷酸序列不存在，或不具有一個或多個不同于另一種奈瑟氏球菌屬物種的porA核酸的核苷酸序列的核苷酸，從而使所述寡核苷酸不能與所述另一種奈瑟氏球菌屬物種的所述porA核酸雜交，所述寡核苷酸足以有利于檢測所述另一種奈瑟氏球菌屬物種的所述porA核酸。
優(yōu)選地，所述另一種奈瑟氏球菌屬物種是腦膜炎奈瑟氏球菌。
在特別有利的實施方案中，本發(fā)明的方法和寡核苷酸有利于檢測可以存在于淋病奈瑟氏球菌的多種分離株，菌株，等位基因變體或亞種的每種中的porA核酸。
在整個說明書中，除非另外指出，所用的“包括(comprise)”，“包括(comprises)”和“包括(comprising)”是包含性的而不是窮盡性的，從而使指定的整數(shù)或整數(shù)的組可以包括一個或多個其它未指定的整數(shù)或整數(shù)的組。
附圖簡述圖1淋病奈瑟氏球菌porA假基因的優(yōu)選的寡核苷酸引物序列(AS＝反義)和核苷酸序列列表。加粗體表示的殘基表示(5′到3′)NG-pap-F(正向)引物退火位點；NG-pap-p1探針雜交位點；NG-pap-p2探針雜交位點；和NG-pap-R(反向)引物退火位點。預期的擴增產(chǎn)物大小是132bp。用陰影表示的殘基是與相應的腦膜炎奈瑟氏球菌porA序列不相同的那些。序列標識如下NG-pap-F(正向)引物序列(SEQ ID NO1)；NG-pap-R(反向)引物序列(SEQ ID NO2)；NG-pap-p1探針(SEQ ID NO3)；NG-pap-p2探針序列(SEQ ID NO4)；NG-pap-p3探針序列(SEQ ID NO5)；NG-pap-p4探針序列(SEQ ID NO6)；NG-pap-p5探針序列(SEQ ID NO7)；NG-pap-p6探針序列(SEQ ID NO8)；NG-pap-p7探針序列(SEQ ID NO9)；淋病奈瑟氏球菌porA假基因序列(SEQ ID NO10)；
優(yōu)選實施方案詳述本發(fā)明涉及淋病奈瑟氏球菌的改善的基于核酸的檢測。為此目的，本發(fā)明人已經(jīng)鑒定了在淋病奈瑟氏球菌的基因組上的備選PCR靶標序列，即porA假基因，其在以前從未用作淋病奈瑟氏球菌檢測的靶際并且出乎意料地提供與目前所述的其它PCR測定相比，大大提高的淋病奈瑟氏球菌檢測的臨床靈敏度和特異性。
更具體地，本發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了靶向淋病奈瑟氏球菌的porA假基因的新淋病奈瑟氏球菌的LightCyclerTM測定法。重要的是，顯示奈瑟氏球菌屬porA基因存在于所測試的所有的淋病奈瑟氏球菌樣品和分離株中，但是在共生的奈瑟氏球菌屬物種中不存在。因此，這種基因靶標的選擇消除或至少部分減少與共生的奈瑟氏球菌屬物種交叉反應的可能。
在淋病奈瑟氏球菌和腦膜炎奈瑟氏球菌之間的porA序列之間存在的差異還已經(jīng)被用于開發(fā)研制這樣得寡核苷酸，其能夠只特異性PCR擴增和檢測淋病奈瑟氏球菌來源的porA核酸。
本發(fā)明克服的特別的困難是在淋病奈瑟氏球菌和腦膜炎奈瑟氏球菌之間僅存在極少的小部分的具有足夠差異的porA序列來發(fā)展特異性的淋球菌測定法。在擴增引物和污染DNA，即腦膜炎球菌porA DNA之間的過少的錯配，將導致測定交叉反應。在引物和它們各自的靶標之間的過多的錯配可能減少淋球菌靶標porA序列的PCR擴增的擴增效率。
本發(fā)明的寡核苷酸引物具有足夠的錯配從而即使當被相當高濃度的腦膜炎球菌DNA(約0.5μg/反應)所污染，該測定也特異于淋球菌porADNA。
因此，本發(fā)明提供檢測生物樣品中淋病奈瑟氏球菌的分離的porA核酸的方法和有利于擴增和/或檢測所述porA核酸的一種或多種寡核苷酸。
出于本發(fā)明的目的，所謂“分離的”指已經(jīng)從天然狀態(tài)移去或進行了人工操作的物質(zhì)。分離的物質(zhì)可以相當多地或基本上游離于通常在其天然狀態(tài)伴隨其的成分，或可以被進行操控以與通常在其天然狀態(tài)伴隨其的成分一起處于人工狀態(tài)。分離的物質(zhì)可以是天然的，化學合成的或重組形式的。
用于本文時，“核酸”包括和涵蓋DNA，RNA和DNA-RNA雜交分子。DNA包括單鏈和雙鏈基因組DNA和cDNA，如本領域所公知。RNA包括單鏈和雙鏈未加工的RNA，mRNA和tRNA。
將理解的是所謂“porA核酸”指對應于porA基因或假基因的至少片段或區(qū)域的核酸。
用于本文時，“基因”是可以包括一個或多個元件的基因組的不連續(xù)的結(jié)構(gòu)單元，所述元件諸如典型地存在于一個或多個順反子中的氨基酸編碼區(qū)域，操縱基因，啟動子、終止子和/或任何其它調(diào)節(jié)核苷酸序列。
用于本文時，“假基因”是基因組的無活性的單元、區(qū)域或序列，其與已知的功能基因具有類似的序列。典型地，因為這種序列類似性，考慮假基因通常相對于正常發(fā)揮功能的基因是進化的。
在淋病奈瑟氏球菌中，porA是假基因而在腦膜炎奈瑟氏球菌中porA是基因。
在上下文中的所謂“對應于”或“相應于”指porA核酸包括存在于porA假基因中的核苷酸序列，或互補于存在于porA假基因中的核苷酸序列的核苷酸序列，或與這些中的任一具有至少80％，優(yōu)選地至少85％，更優(yōu)選地至少90％或甚至更優(yōu)選地至少95％，96％，97％，98％或99％同一性的核苷酸序列。
在特別優(yōu)選的實施方案中，所述porA核酸對應于porA假基因的132bp的片段。
在特別的方面中，本發(fā)明提供一種或多種寡核苷酸和/或使用其來促進核酸序列擴增和/或porA核酸檢測的方法。
用于本文時，“寡核苷酸”是具有不超過一百(100)個核苷酸(堿基)或核苷酸對(堿基對)的單鏈或雙鏈核酸。“多核苷酸”具有超過一百(100)個核苷酸或核苷酸對。
在核酸序列擴增的具體上下文中，本發(fā)明的寡核苷酸可以以引物的形式存在。
用于本文時，“引物”是單鏈寡核苷酸，其能夠與核酸“模板”雜交并且通過適合的DNA聚合酶諸如Taq聚合酶、RNA-依賴型DNA聚合酶或測序酶TM的作用以模板-依賴型方式進行延伸。
典型地，引物可以具有至少12、15、20、25、30、35或40個但是不超過50個連續(xù)的核苷酸堿基。
將理解的是，已經(jīng)按照選定的標準對本文所述的引物進行設計從而使檢測敏感型和特異性最大化。
適合地，對本發(fā)明的引物進行設計從而能夠與淋病奈瑟氏球菌的核苷酸序列、不存在于或具有一個或多個不同于另一種奈瑟氏球菌屬物種的porA核酸的核苷酸序列的核苷酸的porA核酸退火，從而使所述寡核苷酸不能與所述另一種奈瑟氏球菌屬物種的所述porA核酸進行退火，從而不足以促進所述另一種奈瑟氏球菌屬物種的所述porA核酸的檢測。
優(yōu)選地，所述另一種奈瑟氏球菌屬物種是腦膜炎奈瑟氏球菌。
將理解的是，本發(fā)明部分根據(jù)這樣觀察，即，其它的共生奈瑟氏球菌屬物種諸如微黃色奈瑟氏球菌，灰色奈瑟氏球菌，變黃奈瑟氏球菌，嗜乳糖奈瑟氏球菌和干燥奈瑟氏球菌交叉反應不具有porA假基因。
在一個特別有利的實施方案中，對本發(fā)明的引物進行設計從而促進淋病奈瑟氏球菌的多個分離株、菌株、等位基因變體或亞種的porA核酸的檢測。
因此，本發(fā)明人已經(jīng)鑒定了淋病奈瑟氏球菌的porA基因中的核苷酸序列，其在該病原生物中多個分離株中是保守的，所述序列不存在于，或充分不同于腦膜炎奈瑟氏球菌的porA假基因的各自的核苷酸序列。
這已經(jīng)使本發(fā)明人能夠設計有利于淋病奈瑟氏球菌、porA核酸的特異性、靈敏度和廣譜擴增的引物，同時避免擴增所述另一種奈瑟氏球菌屬物種的porA核酸，或至少使其擴增最小化到不可檢測的水平。
按照本發(fā)明的引物的具體實例提供在圖1和表1中(SEQ ID NOS1和2)。
比較圖1的引物序列(SEQ ID NOS1和2)，淋病奈瑟氏球菌，在圖1中提出的porA假基因核苷酸序列(SEQ ID NO10)和相應的公布的腦膜炎奈瑟氏球菌porA核苷酸序列的引物序列，將被理解的是，在引物序列中的變化容易實現(xiàn)，同時維持選擇性擴增淋病奈瑟氏球菌，porA序列所必需的特異性。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明意欲通過porA擴增產(chǎn)物的核酸序列擴增和隨后的檢測來檢測porA核酸或其片段。
核酸擴增技術(shù)對于本領域技術(shù)人員而言是公知的，并且包括如例如在Ausubel等CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY的第15章中的聚合酶鏈式反應(PCR)和連接酶鏈式反應(LCR)(John Wiley & SonsNY，1995-1999)；如例如在美國專利號5,422,252中描述的鏈置換擴增(SDA)；如例如在Liu等，1996，J.Am.Chem.Soc.118 1587和國際申請?zhí)朩O 92/01813和Lizardi等在國際申請?zhí)朩O 97/19193中描述的滾環(huán)復制(RCR)；如例如在Sooknanan等，1994，Biotechniques 17 1077中所述的基于核酸序列的擴增(NASBA)；如例如在Tyagi等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93 5395中描述的Q-β復制酶擴增和如在國際出版物WO 2004/02025中所述的解選酶依賴型擴增。
上述是核酸序列擴增技術(shù)的實例，但是不作為技術(shù)的窮盡性列表出現(xiàn)。本領域技術(shù)人員將充分意識到各種其它的可應用的技術(shù)以及本文所述技術(shù)的變化和改進。
例如，本發(fā)明意欲使用有利于核酸序列擴增產(chǎn)物的量化的具體技術(shù)諸如“競爭PCR”或技術(shù)諸如“實時”PCR擴增諸如在Whiley等，2002，上文中所述。
優(yōu)選地，核酸序列擴增技術(shù)是PCR。
用于本文時，“擴增產(chǎn)物”是由如前面所述的核酸序列擴增技術(shù)所產(chǎn)生的核酸。
在特別優(yōu)選的實施方案中，所述方法產(chǎn)生單一的132bp的porA擴增產(chǎn)物。
用于本文時，“雜交(hybridization)”，“雜交(hybridize)”和“雜交(hybridizing)”指在限定條件下，通過在互補或至少部分互補的核苷酸序列之間通過堿基配對形成雜交的核酸，如本領域所公知的。在互補的A和T或U堿基之間，和G和C堿基之間通過形成氫鍵發(fā)生正常的堿基配對。還將理解的是，堿基配對可能發(fā)生在嘌呤(G和A)和嘧啶(C，T和U)的各種衍生物之間。嘌呤衍生物包括肌苷、甲基次黃嘌呤和甲基腺苷。嘧啶衍生物包括含硫的嘧啶諸如硫尿苷和甲基化嘧啶諸如甲基胞嘧啶。對于通常影響核酸雜交的因素的詳細討論而言，本領域技術(shù)人員涉及CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，上文的第2章。
更具體地，術(shù)語“退火(aneal)”和“退火(anealing)”用在引物與核酸模板雜交以進行隨后的引物延伸反應的背景中，諸如在例如核酸序列擴增或雙脫氧核苷酸測序過程中發(fā)生。
對于影響PCR引物的退火的因素的討論而言，本領域技術(shù)人員參考CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY Eds Ausubel等(John Wiley & Sons NY 1995-1999)的第15章。
本發(fā)明提供在生物樣品中檢測淋病奈瑟氏球菌的porA核酸作為淋病奈瑟氏球菌的指示或存在，在生物樣品來自或獲自其中的個體中檢測淋病奈瑟氏球菌的porA核酸，或作為過去淋病奈瑟氏球菌，所述個體的感染的指示。
優(yōu)選地，porA核酸擴增產(chǎn)物，所述擴增產(chǎn)物通過本領域所公知的一種或多種方法來檢測。
擴增產(chǎn)物的檢測可以通過雜交于擴增產(chǎn)物的探針的檢測，通過以瓊脂糖凝膠電泳直接觀察擴增產(chǎn)物，擴增產(chǎn)物的核苷酸測序或通過熒光-標記擴增產(chǎn)物進行檢測來實現(xiàn)擴增產(chǎn)物的檢測。
用于本文時，“探針”是單鏈或雙鏈寡核苷酸或多核苷酸，其中的一個和/或其它鏈能夠雜交于另一種核酸從而形成“雜交”核酸。
本發(fā)明的探針和/或引物可以用例如生物素或地高辛，用熒光染料或供體熒光團諸如FITC，TRITC，得克薩斯紅，TET，F(xiàn)AM6，HEX，ROX或Oregon Green，受體熒光團諸如LC-Red640，酶諸如辣根過氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶(AP)或用放射性核素諸如125I，32P，33P或35S進行標記來輔助通過本領域公知的技術(shù)檢測擴增產(chǎn)物。
按照本發(fā)明的探針的優(yōu)選實施方案具有在圖1和表2中提出的分別的核苷酸序列(SEQ ID NOS3-9)。
按照本發(fā)明的探針的特別的優(yōu)選實施方案具有在SEQ ID NOS3和4中提出的分別的核苷酸序列。
關于熒光標記的擴增產(chǎn)物的檢測，這可以使用結(jié)合了如前所述的熒光標記的一種或多種引物來實現(xiàn)。
在另一個實施方案中，檢測可以使用結(jié)合了熒光標記的探針通過熔解曲線分析進行，所述探針在序列擴增反應中與擴增產(chǎn)物雜交。具體的實例是當擴增產(chǎn)物在擴增的每個循環(huán)中產(chǎn)生時，使用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)探針來以“實時”與擴增產(chǎn)物雜交。
對FRET雜交探針對進行設計從而與靶標DNA上的鄰近區(qū)域進行雜交。每個探針用不同的標記染料進行標記。兩種染料的相互作用僅發(fā)生在兩者與它們的靶標結(jié)合的時候。典型地，用熒光團(諸如FITC，TRITC，得克薩斯紅TET，F(xiàn)AM6，HEX，ROX或Oregon Green)在3′末端標記供體探針，并用受體熒光團(諸如LC-Red640，TAMRA或QSY染料)在其5′末端標記受體探針。在PCR過程中，兩種不同的寡核苷酸探針與靶標DNA的鄰近區(qū)域進行雜交從而使與寡核苷酸偶聯(lián)的熒光團在雜交結(jié)構(gòu)的近端。供體熒光團由外部光源激發(fā)，接著將其激發(fā)能量的部分傳遞到鄰近的受體熒光團。激發(fā)的受體熒光團發(fā)射不同波長的光，其可以接著進行檢測和測量。
在另一個實施方案中，本發(fā)明意欲使用熔解曲線分析，其中核酸-嵌入染料諸如溴化乙錠(EtBr)或SYBR Green I結(jié)合擴增產(chǎn)物并且對嵌入復合物的熒光發(fā)射進行檢測。
熔解曲線分析可以有利地使用裝置諸如LightCyclerTM進行，如例如在Whiley等，2002，上文中所述。
根據(jù)前述，顯而易見的是，本發(fā)明的淋病奈瑟氏球菌檢測方法理想地適合于輔助診斷可能已經(jīng)或目前具有淋病奈瑟氏球菌感染的個體。
淋病奈瑟氏球菌是人主要的病原生物，因此本發(fā)明特別涉及人個體的淋病奈瑟氏球菌感染的檢測。
適合地，所述生物樣品是宮頸、尿道、陰莖、肛門、直腸、咽喉、唾液、糞便或尿液樣品，盡管不局限于此。
適合地，所述生物樣品包括一種或多種細菌或可以來自其中的以DNA或RNA存在的核酸。
優(yōu)選地，為了使所述生物樣品的操作最少化，按照本發(fā)明的方法，基因組DNA分離自所述生物樣品。然而，原則上，cDNA可以通過本領域公知的逆轉(zhuǎn)錄分離的RNA來產(chǎn)生，如例如描述在CURRENT PROTOCOLSIN MOLECULAR BIOLOGY的第15章，上文。
特別地出于臨床診斷的目的，盡管不限于此，本發(fā)明提供一種試劑盒，其包括一種或多種寡核苷酸諸如按照本發(fā)明第三個方面的引物對，所述試劑盒還可以包括其它的試劑諸如熱穩(wěn)定性的DNA聚合酶，porA核酸探針，陽性和/或陰性核酸對照樣品，分子量標記物，諸如用于擴增產(chǎn)物的比色檢測或熒光檢測的檢測試劑和/或反應容器諸如微量滴定板。
還將理解的是，本發(fā)明的方法可以單獨或組合以其它形式的診斷使用，所述其它形式的診斷諸如細菌培養(yǎng)測試或基于臨床癥狀的常規(guī)診斷以提高的診斷的精確性。
在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供確定人個體是否被或已經(jīng)被淋病奈瑟氏球菌感染的方法，所述方法包括下列步驟(i)使獲自所述人個體的生物樣品進行核酸序列擴增從而選擇性地產(chǎn)生來自淋病奈瑟氏球菌porA核酸的porA淋病奈瑟氏球菌擴增產(chǎn)物，如果存在于所述生物樣品中的話；和(ii)如果存在，通過探針雜交檢測所述擴增產(chǎn)物，其中所述porA擴增產(chǎn)物的存在指示所述個體被或已經(jīng)被淋病奈瑟氏球菌所感染。
按照該實施方案的特別優(yōu)選的形式，在步驟(ii)中通過使用鄰近的雜交探針形式的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)使用實時PCR檢測。優(yōu)選的上游寡核苷酸探針(NGpapP1；表1；SEQ ID NO3)用供體熒光團，熒光素在3′末端進行標記，而優(yōu)選的下游寡核苷酸探針(NGpapP2；表1；SEQ ID NO4)用受體熒光團LC-Red640在5′末端進行標記。探針NGpapP2(SEQ ID NO4)還在3′末端進行磷酸化。
還將理解的是，本發(fā)明可以與其它病原生物的基于核酸的檢測結(jié)合來進行。
在該方面，本發(fā)明意欲淋病奈瑟氏球菌的porA核酸的核酸陣列檢測，其中可以檢測其它病原生物的一種或多種其它的核酸。
在Bryant等，2004，Lancet Infect.Dis.4 100中提供關于這種類型的多-病原體檢測的微陣列方法的一般討論。
將理解的是，核酸陣列可以包括按照第二個方面的寡核苷酸，所述寡核苷酸固定、偶聯(lián)、浸透于基底，或以其它方式與基底聯(lián)系。
更通常地，核酸陣列技術(shù)已經(jīng)成為本領域眾所周知的并且在CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY Eds Ausbel等(John Wiley & Sons NY USA 1995-2001)的第22章中提供可應用于陣列技術(shù)的方法的實例。
在某些實施方案中，多個的至少一個地址(address)包括核酸捕獲探針，所述探針與核酸文庫的成員，例如有義鏈或反義鏈特異性雜交。在一個優(yōu)選實施方案中，多個地址的地址的子集具有用于核酸文庫成員的核酸捕獲探針。每個地址的亞組可以包括雜交于文庫成員的不同區(qū)域的捕獲探針。
關于本發(fā)明，優(yōu)選的陣列形式包括載玻片，所述載玻片具有多個cDNA片段的固定的、有序的柵格。
所述陣列可以具有至少10，50，100，200，500，1,000，2,000，或10,000個或更多地址/cm2和在其間的范圍的密度?；卓梢允莾删S基底諸如載玻片，片(例如硅石或塑料)，質(zhì)譜板，或三維基底諸如凝膠墊。
陣列可以通過各種方法，例如通過光刻法(見，例如美國專利號5,143,854；5,510,270；和5,527,681)，機械方法(例如，如在美國專利號5,384,261中所述的定向流動方法)，基于針的方法(例如，如在美國專利號5,288,514中所述)，和基于珠的技術(shù)(例如，如在PCT/US93/04145中所述)來產(chǎn)生。
參考下面的非限制性實施例，使本發(fā)明可以容易地理解，并且進行實踐應用。
實施例材料&方法患者樣品將來自進行性健康篩查的患者的總共282個臨床樣本(46個宮頸拭子，12個尿道拭子和224個尿液樣本)用在該研究中?？紤]到淋病奈瑟氏球菌感染在我們當?shù)厝巳褐械牡桶l(fā)生率，選擇樣品來提供大比例的Cobas陽性樣本。
患者包括178個女性和104個男性，并且年齡在13歲到70歲，其中平均年齡26歲，中位值年齡為23歲。通過NgpapLC測定并通過組合RocheCobas Amplicor測定和cppB-LC測定的測試算法來測試所有的282個樣本。使用該算法，開始通過Cobas Amplicor方法來測試樣品。通過CobasAmplicor測定提供陽性淋病奈瑟氏球菌結(jié)果的任何樣品接著通過cppB-LC測定進行測試從而確證。
Roche Cobas Amplicor測定對尿液和拭子樣本進行處理并按照生產(chǎn)商的說明書在Roche CobasAmplicor系統(tǒng)上進行測試。同時對每個樣品測試淋病奈瑟氏球菌、鸚鵡熱衣原體和抑制物質(zhì)的存在。使用生產(chǎn)商提供的標準來進行結(jié)果解釋。簡言之，將提供少于0.2的吸光度的樣本認為是淋病奈瑟氏球菌陰性的，而將提供0.2或更大的吸光度值的樣本認為是陽性的。
LightCycler測定(NGpapLC和cppB-LC)將柱提取用于NGpapLC和cppB-LC LightCycler測定。按照生產(chǎn)商的說明書，使用高純病毒核酸試劑盒(Roche Diagnostics，澳大利亞)來從0.2ml的每個樣品提取核酸。以50μl的洗脫緩沖液(Roche Diagnostics，澳大利亞)來從柱上洗脫純化的樣品DNA。將DNA提取物貯存于-20℃直到分析。
所述NGpapLC測定包括一個引物對，一對雜交探針并且靶向淋病奈瑟氏球菌porA假基因。使用引物papF和papR(表1；Invitrogen，澳大利亞)來進行擴增，其在反應中產(chǎn)生132bp的PCR產(chǎn)物。實時PCR檢測通過使用鄰近雜交探針形式的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)來實現(xiàn)。上游寡核苷酸探針(papP1；表1)用供體熒光團，熒光素在3′末端進行標記，而下游寡核苷酸探針(papP2；表1)用受體熒光團，LC-Red640在5′末端(TIBMOLBIOL，德國)進行標記。探針papP2還在3′末端進行了磷酸化。將LightCycler FastStart DNA Master雜交探針試劑盒(Roche Diagnostics，澳大利亞)用作反應混合物的基礎，在每個反應毛細管中使用20μl體積。簡言之，毛細管裝載有2μl的試劑盒專用試劑(10x；Roche Diagnostics，澳大利亞，試劑1)，4mM的MgCl2(Roche Diagnostics，澳大利亞，試劑2)，0.4μM的引物papF，0.6μM的引物papR，0.2μM的每種雜交探針和5μl的DNA提取物。使用無菌的PCR級水(Roche Diagnostics，澳大利亞，試劑3)將每個混合物補足到20μl。每輪測試包括陽性對照和三個無靶標的對照，由15μl的反應混合物和5μl的提取物洗脫緩沖液組成。使用下列參數(shù)在LightCycler(軟件版本5.32)上進行擴增和檢測在95℃進行開始的變性步驟達10分鐘，隨后進行55個循環(huán)的在95℃變性10秒，在55℃進行引物和探針退火達10秒，在72℃延伸20秒。在退火階段獲得熒光反應數(shù)據(jù)，并且用通道設定(channel setting)F2/F1來進行分析。在PCR擴增后，進行熔解曲線分析。簡言之，在40℃進行所述分析，并以0.2℃/秒的速率將溫度升到95℃。
如前所述(Whiley等，2002，上文)進行cppB-LC測定并使用類似于NGpapLC測定的條件的條件。簡言之，將LightCycler FastStart DNA Master雜交探針試劑盒(Roche Diagnostics，澳大利亞)用作反應混合物的基礎。每個反應毛細管包括20μl的總反應體積，其包括兩種引物(HO1@0.2M和HO2@0.4M)和靶向淋病奈瑟氏球菌cppB基因的兩種雜交探針(0.2M每種)(Whiley等，2002，上文)。
檢測限度通過測試5×10E4菌落形成單位/ml(cfu/ml)的淋病奈瑟氏球菌培養(yǎng)物(ATCC49226)的混懸液的測試稀釋物來確定和比較NGpapLC和cppB-LC測定的檢測限度。提取該混懸液的系列10倍稀釋物，并通過使用上述條件的兩種測定來對其進行測試。將每個測定的檢測限度確定為重現(xiàn)陽性反應的最低濃度。
奈瑟氏球菌屬的組群通過NGpapLC和cppB-LC測定來測試奈瑟氏球菌屬物種的組。該組包括63個非淋球菌奈瑟氏球菌屬分離株，測試它們以確定假陽性交叉反應。該物種包括腦膜炎奈瑟氏球菌(38)，微黃色奈瑟氏球菌(12)，干燥奈瑟氏球菌(6)，長奈瑟氏球菌(N.elongata)(3)，粘液奈瑟氏球菌(N.mucosa)嗜乳糖奈瑟氏球菌(3)和與奈瑟氏球菌屬緊密相關的卡他莫拉氏菌(Branhamella catarrhalis)(6)。此外，測試84株淋病奈瑟氏球菌分離株以確定是否觀察到每個測定中的引物和探針序列靶標。其中包括的6株淋病奈瑟氏球菌分離株以前用cppB-LC測定測試為陰性。這6株分離株由RoyalDarwin Hospital，Northern Territory提供。從整個昆士蘭州的不同地理位置選擇剩下的淋病奈瑟氏球菌分離株以確保分離株的寬交叉部分。按照生產(chǎn)商的說明書，使用高純病毒核酸試劑盒(Roche Diagnostics，澳大利亞)從每個分離株的培養(yǎng)物中提取核酸。將約0.5μg的細菌DNA加入每個反應中。非奈瑟氏球菌屬組群-常見的人病原體和正常菌群還使用常見的人病原體和正常菌群的其它組群進一步確定NGpapLC測定法的特異性；Acinetobacter aranitratus ATCC 19606，Acinetobacterbeaumanni ACM 686，溶血不動桿菌(Acinetobacter haemolyticus)ACM620，約氏不動桿菌(Acinetobacter johnsonii)ACM 621，瓊氏不動桿菌(Acinetobacter junii)ACM 617，魯氏不動桿菌(Acinetobacter lwolfii)ACM 664，氣單胞菌(Aeromonas hydrophilia)ATCC 35654，糞產(chǎn)堿菌(Alcaligenes faecalis)ATCC 35655，解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquifaciens)ATCC 3642，短芽孢桿菌(Bacillus brevis)ATCC 37，蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)ATCC 11778，環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)ATCC 61，凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)ATCC 264，堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)ATCC 31，側(cè)孢芽孢桿菌(Bacilluslaterosporus)ATCC 295，地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)ATCC127559，浸麻類芽孢桿菌(Bacillus macerans)ATCC 401，巨獸芽孢桿菌(Bacillus megaterium)ATCC 2640，蕈狀芽孢桿菌(Bacillus mycoides)ATCC 28，多粘芽孢桿菌(Bacillus polymyxa)ATCC 35，短小芽孢桿菌(Bacillus pumulis)ATCC 433，球形芽孢桿菌(Bacillus sphaericus)ATCC4525，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtillus)ATCC 11774，蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)ATCC 453，迪氏擬桿菌(Bacteroides distasonis)ATCC 8503，牙齦卟啉單胞菌(Bacteroides gingivalis)ATCC 33277，普通擬桿菌(Bacteroides vulgatus)ATCC 8482，支氣管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)ATCC 10580，副百日咳博德特氏菌(Bordetellaparapertussis)ATCC 15237，洋蔥伯克氏菌(Burkholduria cepacia)ATCC17765，空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)ATCC 33291，白色念珠菌(Candida albicans)ATCC 14053，克魯斯念珠菌(Candida krusei)(實驗室分離株)，熱帶念珠菌(Candida tropicalis)(實驗室分離株)，費氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)ATCC 8090，白喉棒狀桿菌(Corynebacteriumdiptheriae)ATCC 13812，產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)ATCC13048，陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)(實驗室分離株)，耐久腸球菌(Enterococcus durans)ATCC 6506，糞腸球菌(Enterococcus faecalis)ATCC 29212，屎腸球菌(Enterococcus faecium)ATCC 35667，豬紅斑丹毒絲菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)ATCC 19414，大腸桿菌(Esherichiacoli)ATCC 35218，產(chǎn)吲哚黃桿菌(Flavobacterium indologenes)(實驗室分離株)，F(xiàn)lavobacterium multivoram ATCC 35656，流感嗜血菌(Haemophilis influenzae)ATCC 10211，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)ATCC 13883，單核細胞增多性李斯特桿菌(Listeriamonocytogenes)ATCC 7646，藤黃微球菌(Micrococcus luteus)ATCC 4988，奇異變形菌(Proteus mirabilus)ATCC 7002，普通變形菌(Proteus vulgaris)ATCC 6380，斯氏普羅威登斯菌(Providencia stuartii)ATCC 35031，銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC 27853，泡囊假單胞菌(Pseudomonas vesicularis)(實驗室分離株)，釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)ATCC 2366，鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)ATCC14028，粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)(實驗室分離株)，氣味沙雷氏菌(Serratia oderifera)ATCC 33077，弗氏志賀氏菌(Shigella flexneri)(實驗室分離株)，宋氏志賀氏菌(Shigella sonnei)ATCC 25931，模仿葡萄球菌(Staphyloccus simulans)ATCC 27851，金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(實驗室分離株)，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC33591，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)NCTC 6751，頭葡萄球菌(Staphylococcus capitis)ATCC 27840，科氏葡萄球菌(Staphylococcuscohnii)ATCC 29974，表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)(實驗室分離株)，溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)ATCC 29970，人葡萄球菌(Staphylococcus hominus)ATCC 27844，中間葡萄球菌(Staphylococcus intermedius)ATCC 29663，里昂葡萄球菌(Staphylococcuslugdenensis)(實驗室分離株)，Staphylococcus scuiri(實驗室分離株)，沃氏葡萄球菌(Staphylococcus warneri)ATCC 27836，木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)ATCC 29971，嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)(實驗室分離物)，無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)ATCC 12386，牛鏈球菌(Streptococcus bovis)ATCC 9809，馬鏈球菌(Streptococcus equi)ATCC 9528，似馬鏈球菌(Streptococcus equisimilis)ATCC 35666，鏈球菌(B組)ATCC 12386，鏈球菌(F組)ATCC 12392，鏈球菌(G組)ATCC 12394，變異鏈球菌(Streptococcus mutans)ATCC 35668，肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)ATCC 27336，釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)ATCC 19615，唾液鏈球菌(Streptococcus salivarius)ATCC13419，解藻酸弧菌(Vibrioalginolyticus)ATCC 17749，副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)ATCC17802，Yarrowia lipolytica ATCC 9773和小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Yersinia enterocolitica)ATCC 23715。由這些生物的培養(yǎng)物中純化基因組DNA并利用上述條件在NGpapLC測定法中進行測試。
結(jié)果通過NGpapLC測定法并且通過結(jié)合了Roche Cobas Amplicor測定法與cppB-LC測定法的測試算法對總共282個臨床樣品進行測試。在表2中提供了這些結(jié)果的總結(jié)。
總體上，通過全部三種PCR方法，對于淋病奈瑟氏球菌DNA來說，79(28.0％)個樣本是陽性的而120(42.6％)個樣本是陰性的。通過CobasAmplicor測定法另外81(28.7％)個樣本是陽性的，但是通過NGpapLC和cppB-LC測定法則為陰性。這些被認為是由Cobas Amplicor獲得的假陽性結(jié)果。通過Cobas Amplicor測定法另外兩個(0.7％)樣本是陽性的，但是對于LightCycler測定法則給出了不同的結(jié)果；一個樣本通過cppB-LC測定為陽性，周期閾值(Ct值)為47，但是通過NGpapLC則為陰性，而剩余的樣本只通過NGpapLC為陽性，提供Ct值為41。這些Ct值是每種測試最高記錄的Ct值，并且指示在每個樣本中的低淋病奈瑟氏球菌DNA濃度。在進行重復測試后，沒有一個樣本始終是陽性的。這提示在兩種樣本中的DNA濃度是各自測試的靈敏度的閾值。
通過測試淋病奈瑟氏球菌的稀釋物，從5×10E+4到5×10E-2cfu/ml范圍，確定NGpapLC靈敏度的限度為5cfu/ml的樣本中的淋病奈瑟氏球菌。cppB-LC的檢測限度被確定為5×10E-1cfu/ml。這提示cppB-LC比NGpapLC測定法具有更加好10倍的檢測限度。
為了進一步確定NGpapLC測定法的特異性，從許多種生物的培養(yǎng)物中純化基因組DNA并進行測試。這些包括奈瑟氏球菌屬物種以及其它常見的人病原體和正常菌群。當通過NGpapLC測定法測試時所有非淋球菌物種都是陰性的。相反，三種腦膜炎奈瑟氏球菌分離株通過cppB-LC測定法測試為陽性。在cppB-LC測定法中這三種腦膜炎奈瑟氏球菌分離株提供的周期閾值(Ct值)比陽性淋病奈瑟氏球菌分離株所提供的顯著更大，淋病奈瑟氏球菌分離株的Ct值始終低于16，而這三種腦膜炎奈瑟氏球菌分離株提供了Ct值為33或更大。這提示cppB基因可能在這些腦膜炎奈瑟氏球菌分離株中以較低的拷貝數(shù)存在。
在測試的84株淋病奈瑟氏球菌分離株中，七個通過cppB-LC測定法為陰性。這七個陰性分離株中的六個為獲自Northern Territory的淋病奈瑟氏球菌分離株，之前通過cppB-LC測定法測試為陰性。因此只有另外一個cppB陰性分離株是在昆士蘭州分離株中鑒定出來的。相反，當通過NGpapLC測定法測試時，全部84個淋病奈瑟氏球菌分離株都提供陽性結(jié)果。這顯示NGpapLC寡核苷酸靶標存在于所有分離株中。此外，通過NGpapLC測定法進行的熒光熔解曲線分析顯示在淋病奈瑟氏球菌分離株或任何陽性臨床樣本之間沒有變化；所有NGpapLC陽性反應都提供65℃的熔解溫度。
NGpapLC與細菌培養(yǎng)物相比較在當?shù)乩ナ刻m州人群中進行與細胞培養(yǎng)物的比較，并包括557個取自參加性健康門診患者的樣本?？紤]到在該人群中的淋病奈瑟氏球菌的低發(fā)生率，該人群對于測試NGpapLC測定法的特異性而言是理想的。
與細菌培養(yǎng)物相比，該測定法是100％靈敏的并且是88.2％特異性的(表3)。
然而，這種特異性計算基于這樣的假設，即兩種另外的PCR陽性是假陽性結(jié)果。相反，我們相信這些另外的陽性結(jié)果是真實的陽性結(jié)果。這是因為NgpapLC的結(jié)果由靶向單獨的淋病奈瑟氏球菌基因的第二PCR測定所支持。此外，以前的研究已經(jīng)顯示PCR比細胞培養(yǎng)物具有更好的臨床靈敏度。因此，另外的PCR陽性將是意外的。總而言之，上述結(jié)果顯示新的NGpapLC測定法是高度適合于在臨床樣品中常規(guī)檢測淋病奈瑟氏球菌。
表4-7提供表3的數(shù)據(jù)分類到樣本的類型。
對于尿道和宮頸樣本二者而言，所述NGpapLC測定法是100％特異性的。
咽喉拭子的結(jié)果顯示該NGpapLC還適合于用在這些樣本類型上，對在肛門拭子上的更局限的數(shù)據(jù)也一樣。
討論與Cobas Amplicor淋病奈瑟氏球菌測定法的特異性相關的問題和對于確證測定的需要在文獻中充分記載。不幸的是，還證實了用于確證測試的常規(guī)基因靶標具有限制。該研究的結(jié)果顯示NGpapLC測定法對于證實Cobas Amplicor淋病奈瑟氏球菌陽性結(jié)果，是對于cppB-LC的適合的備選。通過靶向淋病奈瑟氏球菌porA假基因，NGpapLC克服了與cppB基因相關的局限并且提供了對于提高臨床靈敏度和特異性的可能。
通過測試淋病奈瑟氏球菌的ATCC菌株的稀釋物，cppB-LC測定法與我們新的NGpapLC測定法相比具有10倍更好的檢測限制。這可能是因為隱蔽性質(zhì)粒比淋病奈瑟氏球菌porA假基因具有更高的拷貝數(shù)。然而，在檢測限制中的差異沒有影響測定法的臨床靈敏度。對于臨床樣本而言，NGpapLC和cppB-LC測定法給出了檢測淋病奈瑟氏球菌的良好一致性。在282個樣本中只有兩個提供了不同的結(jié)果，其中每個LightCycler測定檢測不同于其它的另外的陽性結(jié)果。起初，認為另外的cppB-LC陽性結(jié)果可能來自低于NGpapLC測定法的檢測限度的淋病奈瑟氏球菌DNA負載。然而，通過使用更靈敏的嵌套式PCR測定法，我們還是不能檢測在該樣本中的淋病奈瑟氏球菌porA假基因的存在(數(shù)據(jù)未顯示)。這說明使用我們的Roche Amplicor和cppB-LC測試算法，該樣本的是假陽性，或表示淋病奈瑟氏球菌菌株缺乏porA假基因。盡管，到目前為止，仍舊沒有關于淋病奈瑟氏球菌菌株缺乏porA假基因的報道。還令人感興趣的是，注意到通過使用嵌套式擴增，我們能夠檢測cppB基因在樣本中的存在，所述樣本通過cppB-LC測定法檢測為陰性，而通過NGpapLC測試為陽性。這說明該cppB-LC陰性結(jié)果沒有發(fā)生，因為在該假定的淋病奈瑟氏球菌菌株中cppB基因的缺乏(數(shù)據(jù)未顯示)。
總而言之，臨床樣本的結(jié)果顯示NGpapLC和cppB-LC測定法具有相似的臨床靈敏度和特異性，并且cppB-LC測定法可能事實上適合于用在我們?nèi)巳褐械哪蛞汉蜕称魇米訕颖局小Ｈ欢?，這些結(jié)果與細菌組群的那些相反，這突出了cppB-LC測定法的局限。更顯著地，該cppB-LC測定法不能檢測7個淋病奈瑟氏球菌分離株。這顯示，在我們的人群中，存在缺乏cppB基因的淋病奈瑟氏球菌菌株。更重要地，我們的測試算法可能產(chǎn)生假陰性結(jié)果；通過Cobas Amplicor測試為陽性的樣本會被cppB-LC測定法錯誤地鑒定為假陽性。在該研究中，沒有對淋病奈瑟氏球菌分離株進行隨機選擇，因此需要更多的測試來確定總的cppB-LC假陰性率。其它的研究已經(jīng)顯示缺乏cppB基因的這些分離株的發(fā)生率在澳大利亞是低的(Leslie等，2003，Commun Dis Intell.27 373-9)。
然而，當使用cppB-LC測定法時，假陰性結(jié)果的可能性存在。與此相反，所述NGpapLC方法在本研究中正確地鑒定所測試的所有的淋病奈瑟氏球菌分離株。這說明NGpapLC測定法可能不易受由在我們當?shù)亓懿∧紊锨蚓曛械膒orA假基因的缺乏所引起的假陰性結(jié)果的影響。因此，其應該提供與cppB-LC測定法相比的提高的臨床靈敏度。
還證明所述NGpapLC測定法對于淋病奈瑟氏球菌的DNA具有高度特異性；當通過NGpapLC方法測試時，所有的非-淋球菌物種提供陰性結(jié)果。應該注意的是，我們經(jīng)歷了獲得奈瑟氏球菌屬物種的困難并且因此我們的細菌組群不包括所有已知的奈瑟氏球菌屬物種，僅包含對于大多數(shù)物種的有限數(shù)量的分離株。因此，與其它奈瑟氏球菌屬物種的交叉反應不能單獨在這些結(jié)果的基礎上被排除。然而，僅報道奈瑟氏球菌屬porA基因存在于淋病奈瑟氏球菌和腦膜炎奈瑟氏球菌中(Feavers & Maiden 1998，上文)，并且因此將與腦膜炎奈瑟氏球菌的交叉反應視為更相關的。在該研究中，我們測試了38株腦膜炎奈瑟氏球菌分離株，并且沒有發(fā)現(xiàn)交叉反應。結(jié)果，當用在我們當?shù)氐臉悠啡褐袝r，我們確信該測試的特異性。
當從三種腦膜炎奈瑟氏球菌培養(yǎng)物種獲得陽性結(jié)果時，用于細菌組群的cppB-LC結(jié)果提供了與使用cppB靶標相關的特異性問題的良好實例。然而，在當?shù)啬X膜炎奈瑟氏球菌分離株中的cppB基因的存在可能沒有引起主要的特異性問題，如果測試不局限于尿液和生殖器拭子樣本的話。到目前為止，沒有關于在Cobas Amplicor測定法中產(chǎn)生假陽性結(jié)果的腦膜炎奈瑟氏球菌的報道，并且當開始通過Cobas Amplicor篩選時，這些分離株是陰性的。另一方面，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在其它的奈瑟氏球菌屬物種的分離株中的cppB基因，所述奈瑟氏球菌屬物種包括灰色奈瑟氏球菌，其也與CobasAmplicor測定法交叉反應(Palmer等，2003，supra；Farrell，1999，上文)。此外，我們的研究僅檢查了有限數(shù)量的奈瑟氏球菌屬物種和菌株，因此與我們?nèi)巳褐械钠渌紊锨蚓鷮傥锓N的交叉反應的可能性不能被排除。
與淋病奈瑟氏球菌的確證測試的特異性有關的重要性還取決于樣本部位。Cobas Amplicor的關鍵限制的一個是當在生殖器外部位上使用時，其特異性顯著下降。具體而言，咽喉拭子是主要的問題，因為它們可以具有各種奈瑟氏球菌屬物種并且因此提供假陽性交叉反應的更大的可能性。最近的研究(Leslie等，2003，上文)發(fā)現(xiàn)Cobas Amplicor淋病奈瑟氏球菌陽性結(jié)果的確證率從對于陰莖和尿道拭子的86.2％下降到對于口咽拭子的5.6％。應該注意的是，甚至當使用cppB-LC確證測定法時，獲自咽喉拭子的真實陽性的數(shù)量可能比獲自生殖器樣本的那些低得多。這是因為在咽喉拭子中的多種奈瑟氏球菌屬物種的存在增加了兩種測定提供假陽性結(jié)果的機會；一個物種能夠與篩選測定交叉反應，而另一個物種可能與確證測定交叉反應，因此從算法產(chǎn)生假陽性結(jié)果。我們相信由我們新的NGpapLC確證測定法提供的特異性可能提供在生殖器外部位的淋病奈瑟氏球菌的提高的檢測。我們的目標是廣泛評價NGpapLC測定法在多種樣本類型上的使用，所述樣本包括咽喉拭子。
該研究的結(jié)果顯示porA假基因是PCR檢測淋病奈瑟氏球菌的適合靶標。值得強調(diào)的是，porA基因以前是通過PCR檢測腦膜炎奈瑟氏球菌的一般靶標。然而，其已經(jīng)失去了吸引力，因為發(fā)現(xiàn)插入序列可能結(jié)合到一些腦膜炎奈瑟氏球菌分離株的porA基因中，給出假陰性結(jié)果(van der Ende等，1999，Infect Immun.67 2928-34；Newcombe等，1998，Mol Microbiol.30 453-4；Jelfs等2000，Clin Diagn Lab.Immunol 7 390-5)。
這些突變會有可能阻斷PCR擴增或探針雜交，并因此阻止一些腦膜炎奈瑟氏球菌分離株的檢測。所有的淋病奈瑟氏球菌分離株在該研究中被檢測的事實說明插入序列可能未在淋病奈瑟氏球菌porA假基因中發(fā)現(xiàn)。然而，考慮到我們淋病奈瑟氏球菌分離株的選擇不是隨機的，可能包含插入序列的淋病奈瑟氏球菌分離株僅是在該研究中失去?；蛘?，插入序列可以已經(jīng)存在，但是由于其小的PCR產(chǎn)物大小(132bp)而沒有影響NGpapLC測定；這樣的小PCR產(chǎn)物大小可以減少序列在PCR引物靶標之間插入的可能性。我們的目標是進一步評價針對淋病奈瑟氏球菌分離株的延伸組群的NGpapLC測定法。
在整個說明書中，目標是描述本發(fā)明的優(yōu)選實施方案而不將本發(fā)明局限于任何一個實施方案或具體的特征的集合。因此，本領域那些技術(shù)人員要理解的是，根據(jù)本公開內(nèi)容，在不背離本發(fā)明范圍的前提下，可以在例示的具體實施方案中作出各種改進和變化。
將本說明書參考的所有的專利和科技文獻，算法和計算機程序全部內(nèi)容并入本文作為參考。
表1靶向淋病奈瑟氏球菌的porA假基因的NGpapLC引物和探針
aGenbank登記號AJ223448
表2提高的靶向porA假基因的確證淋病奈瑟氏球菌的實時PCR測定
*在這些樣本中的81個通過Cobas Amplicor測定證實為陽性，但是通過cppB-LC測定證實為陰性表3所有的樣本類型PCRv培養(yǎng)物
*目前，沒有可獲得的測定法能夠可靠地用于在這些樣本上的差異分析。然而，這些樣本通過cppB-LC也是陽性的(其還可以與其它的奈瑟氏球菌屬物種交叉反應)。此外，這些樣本提供在NGpapLC和cppB-LC測定法中可比較的Ct值。這說明通過這些測定檢測的細菌DNA在大約相同的濃度上?？偠灾?，這些結(jié)果說明這些是真實的淋病奈瑟氏球菌陽性樣本。
表4宮頸拭子PCRv培養(yǎng)物
表5尿道拭子PCRv培養(yǎng)物
表6咽喉拭子PCRv培養(yǎng)物
表7肛門拭子PCRv培養(yǎng)物
權(quán)利要求
1.一種確定個體被或已經(jīng)被淋病奈瑟氏球菌感染的方法，所述方法包括檢測淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)的分離的porA核酸的步驟，如果存在于獲自所述個體的生物樣品中的話，所述porA核酸的存在指示所述個體被或已經(jīng)被淋病奈瑟氏球菌所感染。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述方法包括從存在于所述生物樣品中的另一種奈瑟氏球菌屬物種的porA核酸中區(qū)分所述淋病奈瑟氏球菌的分離的porA核酸的步驟。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述另一種奈瑟氏球菌屬物種是腦膜炎奈瑟氏球菌。
4.權(quán)利要求1的方法，所述方法包括在這樣的條件下使所述生物樣品進行核酸序列擴增從而產(chǎn)生擴增產(chǎn)物，所述條件有利于淋病奈瑟氏球菌的所述分離的porA核酸的擴增。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述的擴增產(chǎn)物對應于淋病奈瑟氏球菌，porA假基因的片段。
6.權(quán)利要求4的方法，其中使用一種或多種PCR引物來進行核酸序列的擴增，所述引物具有選自由SEQ ID NO1和SEQ ID NO2組成的組的核苷酸序列。
7.權(quán)利要求4的方法，所述方法包括通過探針雜交來檢測所述擴增產(chǎn)物。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述探針是具有選自由下列各項組成的組的核苷酸序列的寡核苷酸SEQ ID NO3；SEQ ID NO4；SEQ IDNO5；SEQ IDNO6；SEQ ID NO7；SEQ ID NO8；SEQ ID NO9。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述探針是具有選自由SEQ ID NO3和SEQID NO4組成的組的核苷酸序列的寡核苷酸。
10.權(quán)利要求7的方法，其中使用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)來進行所述擴增產(chǎn)物的檢測。
11.一種確定人個體是否被或已經(jīng)被淋病奈瑟氏球菌感染的方法，所述方法包括下列步驟(i)使用具有按照SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的分別的核苷酸序列的引物，使獲自所述人個體的生物樣品進行核酸序列擴增，從而產(chǎn)生來自淋病奈瑟氏球菌porA核酸的porA淋病奈瑟氏球菌擴增產(chǎn)物，如果存在于所述生物樣品的話；和(ii)如果存在，使用寡核苷酸通過探針雜交和熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)來檢測所述擴增產(chǎn)物，所述寡核苷酸具有具有供體熒光團的SEQ ID NO3和具有受體熒光團的SEQ ID NO4的分別的核苷酸序列，其中所述porA擴增產(chǎn)物的存在指示所述個體被或已經(jīng)被淋病奈瑟氏球菌所感染。
12.一種寡核苷酸，其能夠雜交于淋病奈瑟氏球菌的porA核酸，足能夠檢測所述porA核酸，但是所述寡核苷酸不能夠充分地與所述另一種奈瑟氏球菌屬物種的所述porA核酸雜交而不能檢測所述另一種奈瑟氏球菌屬物種的所述porA核酸。
13.權(quán)利要求12的寡核苷酸，其中所述另一種奈瑟氏球菌屬物種是腦膜炎奈瑟氏球菌。
14.權(quán)利要求13的寡核苷酸，其具有選自由下列各項組成的組的核苷酸序列SEQ ID NO3；SEQ ID NO4；SEQ ID NO5；SEQ ID NO6；SEQ IDNO7；SEQ ID NO8；SEQ ID NO9。
15.權(quán)利要求14的寡核苷酸，其具有選自由SEQ ID NO3和SEQ ID NO4組成的組的核苷酸序列。
16.一種檢測淋病奈瑟氏球菌的porA核酸的試劑盒，所述試劑盒包括按照權(quán)利要求12的一種或多種寡核苷酸和DNA聚合酶和/或一種或多種檢測試劑。
17.權(quán)利要求16的試劑盒，其中所述一種或多種寡核苷酸具有選自由下列各項組成的組的核苷酸序列SEQ ID NO3；SEQ ID NO4；SEQ ID NO5；SEQ ID NO6；SEQ ID NO7；SEQ ID NO8；SEQ ID NO9。
18.權(quán)利要求17的試劑盒，其中所述一種或多種寡核苷酸具有選自由SEQID NO3和SEQ ID NO4組成的組的核苷酸序列。
19.權(quán)利要求16的試劑盒，其還包括有利于淋病奈瑟氏球菌，porA核酸擴增的一種或多種引物。
20.權(quán)利要求19的試劑盒，其中所述一種或多種引物具有選自由SEQ IDNO1和SEQ ID NO2組成的組的核苷酸序列。
21.一種核酸陣列，所述陣列包括按照權(quán)利要求12的一種或多種寡核苷酸，所述寡核苷酸固定、偶聯(lián)、結(jié)合、浸透于基底，或以其它形式與基底聯(lián)系。
22.按照權(quán)利要求21的核酸陣列，其中所述一種或多種寡核苷酸具有選自由下列各項組成的組的核苷酸序列SEQ ID NO3；SEQ ID NO4；SEQ IDNO5；SEQ ID NO6；SEQ ID NO7；SEQ ID NO8；SEQ ID NO9。
23.權(quán)利要求22的核酸陣列，其中所述一種或多種寡核苷酸具有選自由SEQ ID NO3和SEQ ID NO4組成的組的核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種確定個體是否被或已經(jīng)被淋病奈瑟氏球菌所感染的方法。所述方法檢測獲自生物樣品的淋病奈瑟氏球菌，porA核酸片段。所述方法包括使用具有按照SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的分別核苷酸序列的引物來使生物樣品進行核酸序列擴增，從而產(chǎn)生porA淋病奈瑟氏球菌擴增產(chǎn)物。使用寡核苷酸通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移來檢測所述擴增產(chǎn)物，所述寡核苷酸具有按照SEQ ID NO3的具有供體熒光團和具有受體熒光團的SEQ ID NO4的分別的核苷酸序列。
文檔編號C12Q1/68GK1942592SQ200580011945
公開日2007年4月4日 申請日期2005年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月8日
發(fā)明者D·M·維爾雷, T·P·斯洛茲 申請人:昆士蘭州衛(wèi)生部