專利名稱：雜交方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在使用了寡核苷酸的雜交反應(yīng)中使反應(yīng)溫度區(qū)域在反應(yīng)溶液中部分形成、然后在該反應(yīng)溫度區(qū)域中進(jìn)行雜交反應(yīng)而有效形成雜交物的雜交方法，使用了該雜交方法的基因的檢測(cè)方法，以及信號(hào)擴(kuò)增方法；所述信號(hào)擴(kuò)增方法使用該雜交方法，可以提高與DNA芯片或者DNA微陣列(參照非專利文獻(xiàn)1等。在本說明書中總稱DNA芯片和DNA微陣列為DNA微陣列。)、微型板、以及磁性體粒子等用于檢測(cè)基因的反應(yīng)機(jī)械材料結(jié)合的靶基因的檢測(cè)感度。
背景技術(shù)：
作為用于檢測(cè)基因的反應(yīng)機(jī)械材料(以下，稱為反應(yīng)平臺(tái)。)，微型板、DNA微陣列、磁性體粒子等價(jià)格低，容易均勻地控制反應(yīng)溫度，且不需要特殊的設(shè)備，市場(chǎng)上有大量的使用了顯色系酶或發(fā)光系酶的基因診斷試劑盒出售。
目前，這些反應(yīng)平臺(tái)的溫度控制在通常稱為恒溫槽的設(shè)備中進(jìn)行。特別是在基因的檢測(cè)中，在目的基因、或者通過PCR法等放大的基因上標(biāo)識(shí)酶等，作為一般的生化學(xué)反應(yīng)，使用基于恒溫槽的均一反應(yīng)溫度。
另一方面，本發(fā)明人等提出了不使用酶的新型等溫核酸放大法(探針自聚合物的形成方法)(專利文獻(xiàn)1～4)。圖1～圖3是專利文獻(xiàn)1記載的方法的概略說明圖。例如，如圖1所示，專利文獻(xiàn)1記載的方法是使用由3處區(qū)域構(gòu)成的1對(duì)寡核苷酸探針18(HoneyComb Probe、以下稱為HCP。)的方法，第1HCP(X區(qū)域，Y區(qū)域以及Z區(qū)域)和第2HCP(Z’區(qū)域，Y’區(qū)域以及X’區(qū)域)各自的3處區(qū)域具有相互互補(bǔ)的堿基序列，在使兩者發(fā)生反應(yīng)的情況下，對(duì)按照只和區(qū)域的1處雜交的方式對(duì)各區(qū)域的堿基序列作出努力(圖2)。通過該努力，在使多個(gè)1對(duì)HCP發(fā)生反應(yīng)的情況下，如圖9所示，依賴于反應(yīng)溫度相互雜交，可以形成探針的自聚合物20(圖9的箭頭)(圖3)。在本說明書中，通過這些寡核苷酸探針的自聚合反應(yīng)(Probe alternation link self-assembly reaction)的聚合物的形成法被稱為PALSAR法。
另外，本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)，通過利用PALSAR法可以提高靶基因的檢測(cè)感度(專利文獻(xiàn)5)。圖4表示在利用了PALSAR法的微型板中的信號(hào)擴(kuò)增方法的一個(gè)例子。如圖4(a)所示，在微型板10等反應(yīng)機(jī)械材料上結(jié)合靶基因12的捕獲探針14(capture probe)，接著如圖4(b)所示，捕獲靶基因12之后，如圖4(c)所示，在HCP和靶基因中加入具有互補(bǔ)區(qū)域的寡核苷酸DNA16(專利文獻(xiàn)5的接合探針。在本發(fā)明中，將具有與檢測(cè)的靶基因互補(bǔ)的序列、以及與形成自聚合物的核酸(探針)互補(bǔ)的序列兩者的探針稱為輔助探針。)，進(jìn)而如圖4(e)所示，加入多對(duì)的HCP18，通過自聚合反應(yīng)形成自聚合物20，而可以使信號(hào)擴(kuò)增。
專利文獻(xiàn)1專利第3267576號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2專利第3310662號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)3國(guó)際公開第02/31192號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)4特開2002-355081號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)5國(guó)際公開第03/029441號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)6國(guó)際公開第92/20702號(hào)公報(bào)非專利文獻(xiàn)1Marshall，A.，Hodgson，J.DNA chipsan array ofpossibilities.Nat Biotechnol.16，27-31，1998.
非專利文獻(xiàn)2Koshkin AA et al.Tetrahedron 1998.54，3607-3630.，非專利文獻(xiàn)3Koshkin AA et al.J.Am.Chem.Soc.1998.120，13252-13253.，非專利文獻(xiàn)4Wahlestedt C et al.PNAS.2000.97，5633-5638.
非專利文獻(xiàn)5H.C.Birnboim，J.Doly，Nucleic Acids Res.，7，1513(1979)但是，本發(fā)明人等進(jìn)行了潛心研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過均一的反應(yīng)溫度的PALSAR法是在反應(yīng)溶液中均一地形成自聚合物，所以當(dāng)通過使用了均一反應(yīng)溫度的信號(hào)擴(kuò)增來檢測(cè)基因時(shí)，與在固相結(jié)合的靶基因上HCP的自聚合物形成反應(yīng)相比，靶基因上以外的反應(yīng)溶液中的HCP的自聚合物的形成反應(yīng)更優(yōu)先。
圖5是表示通過使用了均一反應(yīng)溫度的PALSAR法進(jìn)行信號(hào)擴(kuò)增的一個(gè)例子的概略說明圖，(a)表示通過均一反應(yīng)溫度形成自聚合物；(b)表示在進(jìn)行自聚合物的形成反應(yīng)之后進(jìn)行清洗，該清洗后的在靶基因上結(jié)合的自聚合物。如圖5可知，盡管通過在靶基因上形成的自聚合物可以獲得足夠的信號(hào)擴(kuò)增効果，但在靶基因上以外的反應(yīng)溶液中形成的自聚合物通過隨后的清洗被除去，所以與實(shí)際的自聚合物的總形成量相比，信號(hào)擴(kuò)增減少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供可以進(jìn)行有效的雜交反應(yīng)的雜交方法、使用了該雜交方法的高感度的靶基因檢測(cè)方法、以及顯著提高靶基因的檢測(cè)感度的信號(hào)擴(kuò)增方法。
本發(fā)明人等為了解決上述問題，以提高在靶基因上的HCP的自聚合物形成效率為目的，進(jìn)行潛心研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過在反應(yīng)溶液中部分設(shè)定反應(yīng)溫度區(qū)域，可以顯著提高在靶基因上的HCP的自聚合物形成效率，另外，不僅是HCP的自聚合物反應(yīng)，即便是在一般的雜交反應(yīng)中，通過在反應(yīng)溶液中部分設(shè)定反應(yīng)溫度區(qū)域，可以顯著提高在靶基因上的雜交物形成效率，從而完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明的雜交方法是使用反應(yīng)溶液中的寡核苷酸的雜交方法，其特征在于，在反應(yīng)溶液中部分形成反應(yīng)溫度區(qū)域，在該反應(yīng)溫度區(qū)域中進(jìn)行雜交反應(yīng)。
在本發(fā)明中，作為上述雜交反應(yīng)，沒有特別限制，使用具有可以相互雜交的互補(bǔ)堿基序列區(qū)域的多種寡核苷酸探針使其雜交，由此，更適合包括寡核苷酸發(fā)生自聚合而形成雙鏈的自聚合物的自聚合反應(yīng)。
作為上述的多種寡核苷酸探針的第1例，可以舉出由如下所述的探針構(gòu)成的一對(duì)寡核苷酸探針，所述的探針是從5’端側(cè)按順序至少設(shè)置核酸區(qū)域X、核酸區(qū)域Y以及核酸區(qū)域Z且具有下述化學(xué)式(1)的結(jié)構(gòu)的由3處以上的核酸區(qū)域形成的第1探針、和從5’端側(cè)按順序至少設(shè)置核酸區(qū)域X’、核酸區(qū)域Y’以及核酸區(qū)域Z’且具有下述化學(xué)式(2)的結(jié)構(gòu)的由3處以上的核酸區(qū)域形成的第2探針(專利文獻(xiàn)1以及2)。
[化2] (在上述化學(xué)式(1)以及(2)中，X和X’、Y和Y’、Z和Z’分別是可以雜交的互補(bǔ)核酸區(qū)域。)圖1～圖3是表示使用一對(duì)寡核苷酸探針(一對(duì)HCP)的自聚合反應(yīng)的例子的概略說明圖，所述的一對(duì)寡核苷酸探針是由3處核酸區(qū)域所形成的第1探針(第1HCP)和第2探針(第2HCP)構(gòu)成。如圖1～圖3所示，使用多對(duì)具有上述化學(xué)式(1)以及(2)的結(jié)構(gòu)的一對(duì)寡核苷酸探針18(圖1)、以交替交叉的方式使其雜交(圖2)，由此寡核苷酸發(fā)生自聚合，形成雙鏈的自聚合物(聚合物)20(圖3)。
作為上述的多種寡核苷酸探針的第2例，可以舉出具有二聚體形成用探針含有系和交聯(lián)探針含有系且該交聯(lián)探針的堿基序列是可以對(duì)由該二聚體形成用探針?biāo)纬傻亩垠w進(jìn)行交聯(lián)的堿基序列的多個(gè)寡核苷酸探針，其中，所述的二聚體形成用探針含有系是從含有多對(duì)二聚體形成用探針的第1系至第(2n-1)(n≥1)系順序形成n個(gè)，其中的二聚體形成用探針是將No.1以及No.2的一對(duì)寡核苷酸的各寡核苷酸分成3’側(cè)區(qū)域、中央?yún)^(qū)域、以及5’側(cè)區(qū)域這3個(gè)區(qū)域，使各寡核苷酸的中央?yún)^(qū)域成為相互互補(bǔ)的堿基序列，使3’側(cè)區(qū)域以及5’側(cè)區(qū)域成為相互不互補(bǔ)的堿基序列，所述的交聯(lián)探針含有系是從分別含有多對(duì)交聯(lián)探針的第2系至第2n系順序形成n個(gè)，其中的交聯(lián)探針是將No.1以及No.2的一對(duì)寡核苷酸的各寡核苷酸分成3’側(cè)區(qū)域以及5’側(cè)區(qū)域這2個(gè)區(qū)域，使各寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域以及5’側(cè)區(qū)域成為相互不互補(bǔ)的堿基序列(專利文獻(xiàn)4)。
可以舉出如下所述的自聚合反應(yīng)，即通過使該寡核苷酸探針進(jìn)行雜交，寡核苷酸發(fā)生自聚合，從而形成自聚合物。上述探針的雜交優(yōu)選在使二聚體形成用探針進(jìn)行雜交、形成各系的二聚體(二聚體探針)之后，使該二聚體和交聯(lián)探針進(jìn)行雜交，形成自聚合物。
在上述的多種寡核苷酸探針的第2例中，在是n＝1的情況下，第1系的二聚體形成用探針和第2系的交聯(lián)探針的互補(bǔ)堿基序列的組合存在兩種。
作為n＝1時(shí)的1例，就可以使用的上述探針的堿基序列而言，其第1系的No.1-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域和第2系的No.1-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域、第1系的No.2-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域和第2系的No.2-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域、第2系的No.2-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域和第1系的No.2-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域、第2系的No.1-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域和第1系的No.1-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域，各自成為互補(bǔ)堿基序列。
作為n＝1時(shí)的其他例，就可以使用的上述探針的堿基序列而言，其第1系的No.1-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域和第2系的No.1-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域、第1系的No.2-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域和第2系的No.1-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域、第1系的No.2-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域和第2系的No.2-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域、第1系的No.1-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域和第2系的No.2-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域，各自成為互補(bǔ)堿基序列。
在上述的多種寡核苷酸探針的第2例中，在n≥2的情況下，第1、第3、…、第(2n-1)系的二聚體形成用探針和第2、第4、…、第2n系的交聯(lián)探針的互補(bǔ)堿基序列的組合存在兩種。作為n≥2時(shí)的1例，就可以使用的上述探針的堿基序列而言，其第(2n-3)系的No.1-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域和第(2n-2)系的No.1-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域、第(2n-3)系的No.2-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域和第(2n-2)系的No.2-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域、第(2n-2)系的No.2-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域和第(2n-1)系的No.2-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域、第(2n-2)系的No.1-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域和第(2n-1)系的No.1-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域、二聚體形成用探針的最后的系的No.1-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域和交聯(lián)探針的最后的系的No.1-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域、二聚體形成用探針的最后的系的No.2-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域和交聯(lián)探針的最后的系的No.2-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域、交聯(lián)探針的最后的系的No.2-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域和第1系的No.2-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域、交聯(lián)探針的最后的系的No.1-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域和第1系的No.1-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域，各自成為互補(bǔ)堿基序列。
作為n≥2時(shí)的其它例子，就可以使用的上述探針的堿基序列而言，其第(2n-3)系的No.1-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域和第(2n-2)系的No.1-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域、第(2n-3)系的No.2-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域和第(2n-2)系的No.2-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域、第(2n-2)系的No.2-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域和第(2n-1)系的No.2-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域、第(2n-2)系的No.1-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域和第(2n-1)系的No.1-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域、二聚體形成用探針的最后的系的No.1-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域和交聯(lián)探針的最后的系的No.1-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域、二聚體形成用探針的最后的系的No.2-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域和交聯(lián)探針的最后的系的No.1-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域、交聯(lián)探針的最后的系的No.2-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域和第1系的No.2-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域、交聯(lián)探針的最后的系的No.2-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域和第1系的No.1-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域，各自成為互補(bǔ)堿基序列。
具體說明使用了上述的多種寡核苷酸探針的第2例的自聚合反應(yīng)。例如，在n＝1的情況下，利用使用一對(duì)二聚體形成用探針而形成的具有下述化學(xué)式(3)的結(jié)構(gòu)的二聚體探針、和具有下述化學(xué)式(4)的結(jié)構(gòu)的一對(duì)交聯(lián)探針或者具有下述化學(xué)式(5)的結(jié)構(gòu)的一對(duì)交聯(lián)探針，使這些探針進(jìn)行雜交，由此形成具有下述化學(xué)式(6)的結(jié)構(gòu)的自聚合物。
[化4] [化5] (在式(3)～式(5)中，A和A’、B和B’、C和C’、D和D’以及F和F’分別是可以雜交的互補(bǔ)核酸區(qū)域。)[化6]
作為上述的多種寡核苷酸探針的第3例，可以舉出如下所述的多對(duì)二聚體形成用探針，其中，所述的二聚體形成用探針是，自第1系至第k(k≥2)系順序形成多個(gè)含有一對(duì)二聚體形成用探針的系，且具有分別使(a)第(k-1)系的No.1-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域和第k系的No.2-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域、(b)第(k-1)系的No.2-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域和第k系的No.1-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域、(c)最后的系的No.1-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域和第1的系的No.2-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域、(d)最后的系的No.2-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域和第1的系的No.1-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域、成為相互互補(bǔ)的堿基序列的結(jié)構(gòu)，另外，自第1系至第k系形成該多對(duì)二聚體形成用探針；其中的一對(duì)二聚體形成用探針是將No.1以及No.2的一對(duì)寡核苷酸的各寡核苷酸分成3’側(cè)區(qū)域、中央?yún)^(qū)域、以及5’側(cè)區(qū)域這3個(gè)區(qū)域，使各寡核苷酸的中央?yún)^(qū)域成為相互互補(bǔ)的堿基序列，使3’側(cè)區(qū)域、以及5’側(cè)區(qū)域成為相互不互補(bǔ)的堿基序列(專利文獻(xiàn)3)。
作為上述的多種寡核苷酸探針的第4例，可以舉出如下所述的多對(duì)二聚體形成用探針，其中，所述的二聚體形成用探針是，自第1系至第k(k≥2)系順序形成多個(gè)含有一對(duì)二聚體形成用探針的系，且具有分別使(a)第(k-1)系的No.1-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域和第k系的No.2-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域、
(b)第(k-1)系的No.1-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域和第k系的No.2-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域、(c)最后的系的No.1-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域和第1的系的No.2-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域、(d)最后的系的No.1-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域和第1的系的No.2-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域、成為相互互補(bǔ)的堿基序列的結(jié)構(gòu)，另外，自第1系至第k系形成該多對(duì)二聚體形成用探針；其中的一對(duì)二聚體形成用探針是將No.1以及No.2的一對(duì)寡核苷酸的各寡核苷酸分成3’側(cè)區(qū)域、中央?yún)^(qū)域、以及5’側(cè)區(qū)域這3個(gè)區(qū)域，使各寡核苷酸的中央?yún)^(qū)域成為相互互補(bǔ)的堿基序列，使3’側(cè)區(qū)域、以及5’側(cè)區(qū)域成為相互不互補(bǔ)的堿基序列(專利文獻(xiàn)3)。
在上述的多種寡核苷酸探針的第3以及第4例中，可以舉出使自第1系至第k系的多對(duì)二聚體形成用探針進(jìn)行雜交，由此使寡核苷酸發(fā)生自聚合而形成自聚合物的自聚合反應(yīng)。二聚體形成用探針的雜交優(yōu)選，分別在各系使二聚體形成用探針進(jìn)行雜交而分別形成二聚體(二聚體探針)，然后使各系的二聚體探針進(jìn)行雜交，形成自聚合物。
具體說明使用了上述的多種寡核苷酸探針的第3或者第4例的自聚合反應(yīng)。例如、在k＝2的情況下，利用使用一對(duì)二聚體形成用探針形成的具有下述化學(xué)式(7)的結(jié)構(gòu)的二聚體探針、和使用一對(duì)二聚體形成用探針形成的具有下述化學(xué)式(8)的結(jié)構(gòu)的二聚體探針或者使用一對(duì)二聚體形成用探針形成的具有下述化學(xué)式(9)的結(jié)構(gòu)的二聚體探針，使這些探針進(jìn)行雜交，由此形成具有下述化學(xué)式(10)的結(jié)構(gòu)的自聚合物。
[化8]
[化9] (在式(7)～式(9)中，A和A’、B和B’、C和C’、D和D’以及F和F’分別是可以雜交的互補(bǔ)核酸區(qū)域。)[化10] 本發(fā)明的信號(hào)擴(kuò)增方法，其特征在于，使用具有可以相互雜交的互補(bǔ)堿基序列區(qū)域的多種寡核苷酸探針，使其進(jìn)行雜交，由此寡核苷酸發(fā)生自聚合，形成雙鏈的自聚合物，利用如上所述的自聚合反應(yīng)，可以提高用于檢測(cè)基因的反應(yīng)機(jī)械材料中靶基因的檢測(cè)感度，其中，該自聚合反應(yīng)是使用上述本發(fā)明的雜交方法進(jìn)行的。
為了連接上述靶基因和上述自聚合物，優(yōu)選使用具有與在靶基因的堿基序列和自聚合物的形成中使用的至少1個(gè)寡核苷酸探針的堿基序列分別互補(bǔ)的區(qū)域的輔助探針。另外，還優(yōu)選以包括與靶基因互補(bǔ)的序列的方式構(gòu)成在上述自聚合物的形成中使用的寡核苷酸探針的至少1個(gè)。
本發(fā)明的信號(hào)擴(kuò)增方法通過檢測(cè)所形成的自聚合物，可以進(jìn)行靶基因的高感度檢測(cè)。作為檢測(cè)自聚合物的方法，沒有特別限制，例如，優(yōu)選預(yù)先用標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記在上述自聚合反應(yīng)中使用的寡核苷酸探針，并檢測(cè)標(biāo)記物質(zhì)，由此檢測(cè)自聚合物。對(duì)上述標(biāo)記物質(zhì)沒有特別限制，可以廣泛使用公知的標(biāo)記物質(zhì)。例如、可以舉出放射性同位素、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、顯色物質(zhì)、顯色系酶或者發(fā)光系酶等。
另外，相對(duì)于通過與上述靶基因結(jié)合的寡核苷酸的自聚合反應(yīng)而形成自聚合物，使標(biāo)記探針進(jìn)行雜交，可以檢測(cè)自聚合物的存在。作為標(biāo)記探針，可以使用用顯色系酶、發(fā)光系酶、或者放射性同位素等標(biāo)記的探針。
進(jìn)而，相對(duì)于上述自聚合物，加入具有與核酸結(jié)合的性質(zhì)的熒光物質(zhì)，通過該熒光物質(zhì)的光化學(xué)變化，可以檢測(cè)上述自聚合物的存在。作為熒光物質(zhì)，優(yōu)選的熒光物質(zhì)具有插入到雙鏈堿基對(duì)中的性質(zhì)。
本發(fā)明的靶基因的檢測(cè)方法的第1的實(shí)施方式，其特征在于，使用上述本發(fā)明的信號(hào)擴(kuò)增方法檢測(cè)靶基因。
本發(fā)明的靶基因的檢測(cè)方法的第2的實(shí)施方式，其特征在于，利用反應(yīng)溶液中寡核苷酸的雜交反應(yīng)，檢測(cè)基因，其中，該雜交反應(yīng)包括使用上述本發(fā)明的雜交方法進(jìn)行雜交反應(yīng)。
優(yōu)選以在上述靶基因的一部分具有互補(bǔ)序列的方式，構(gòu)成在上述雜交反應(yīng)中使用的核苷酸的至少一個(gè)。
在本發(fā)明中，對(duì)用于檢測(cè)上述基因的反應(yīng)機(jī)械材料沒有特別限制，可以用于為了基因檢測(cè)的各種反應(yīng)機(jī)械材料，尤其適合用于微型板、DNA微陣列、以及磁性體粒子等。
在本發(fā)明中，作為上述靶基因，可以使用單鏈的DNA和/或RNA、以及雙鏈的DNA和/或RNA。另外，作為上述靶基因，還可以使用含有SNPs(單核苷酸多態(tài))的基因。
在本發(fā)明中，優(yōu)選預(yù)先用標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記在上述雜交反應(yīng)中使用的寡核苷酸，并檢測(cè)標(biāo)記物質(zhì)，由此檢測(cè)靶基因。對(duì)上述標(biāo)記物質(zhì)沒有特別限制，可以廣泛使用公知的標(biāo)記物質(zhì)。例如，可以舉出放射性同位素、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、顯色物質(zhì)、顯色系酶或者發(fā)光系酶等。
上述寡核苷酸通常由DNA或者RNA構(gòu)成，還可以是核酸類似物。作為核酸類似物，例如，可以舉出肽核酸(PNA、專利文獻(xiàn)6)或LockedNucleic Acid(LNA、非專利文獻(xiàn)2～4)。另外，一對(duì)寡核苷酸探針通常由相同種類的核酸構(gòu)成，例如可以使DNA探針和RNA探針成為一對(duì)。即，探針的核酸的種類可以從DNA、RNA或核酸類似物(例如PNA或LNA等)中進(jìn)行選擇。另外，一個(gè)探針內(nèi)的核酸組成沒有必要由一種、例如只由DNA構(gòu)成，根據(jù)需要，例如還可以使用由DNA和RNA構(gòu)成的寡核苷酸探針(嵌合體探針)，這包括在本發(fā)明制中。
就上述寡核苷酸探針的各互補(bǔ)堿基序列區(qū)域的長(zhǎng)度而言，以堿基數(shù)量計(jì)，至少為5個(gè)堿基，優(yōu)選10～100個(gè)堿基，進(jìn)一步優(yōu)選15～30個(gè)堿基。
這些探針可以采用公知的方法合成。例如在是DNA探針的情況下，可以使用Applied Biosystem公司的DNA合成裝置394型，利用ホスホアミダイド豪斯豪阿密達(dá)以道(ホスホアミダイド)法進(jìn)行合成。另外，作為其他方法，有磷酸三酯法、H-磷酸酯法、硫代磷酸酯法等，還可以通過任何方法合成。
對(duì)在本發(fā)明中使用的寡核苷酸探針的個(gè)數(shù)沒有特別限制，但在102～1015個(gè)的范圍內(nèi)使用。對(duì)反應(yīng)緩沖液的組成、濃度沒有特別限制?？梢赃m當(dāng)使用在核酸放大中常用的通常的緩沖液。pH也適合在常用的范圍內(nèi)，優(yōu)選使用pH7.0～9.0的范圍的緩沖液。在部分的反應(yīng)溫度區(qū)域應(yīng)用的反應(yīng)溫度是40～80℃，優(yōu)選55～65℃。
本發(fā)明中的靶基因(DNA或者RNA)測(cè)定用試樣，可以應(yīng)用有可能含有該核酸的所有試樣。靶基因是可以通過試樣適當(dāng)制備或離析的基因，沒有特別限制。例如，可以舉出血液、血清、尿、糞便、腦脊液、組織液、細(xì)胞培養(yǎng)物等源自生物體的試樣，有可能含有或者感染病毒、細(xì)菌、真菌等的試樣等。另外，還可以使用通過公知的方法放大試樣中的靶基因而得到的DNA或者RNA等核酸。
通過本發(fā)明，可以通過簡(jiǎn)便的方法提高靶基因的檢測(cè)感度。另外，通過本發(fā)明可以提高雜交反應(yīng)中的雜交物形成效率。進(jìn)而通過本發(fā)明，可以放大在檢測(cè)中使用的自聚合物的形成，提高信號(hào)擴(kuò)增。


圖1是表示一對(duì)HCP的概略說明圖。
圖2是表示一對(duì)HCP的結(jié)合形式的概略說明圖。
圖3是表示由多對(duì)HCP形成的自聚合物的概略說明圖。
圖4是表示利用了PALSAR法的微型板中信號(hào)擴(kuò)增法的一個(gè)例子的概略說明圖。
圖5是表示通過使用了均一的反應(yīng)溫度的PALSAR法進(jìn)行信號(hào)擴(kuò)增的方法的一個(gè)例子的概略說明圖。
圖6是表示使用了微型板的使用部分的反應(yīng)溫度區(qū)域的靶基因的檢測(cè)方法的一個(gè)例子的概略說明圖。
圖7是表示通過本發(fā)明的使用了部分的反應(yīng)溫度區(qū)域的信號(hào)擴(kuò)增來檢測(cè)靶基因的方法的一個(gè)例子的概略說明圖。
圖8是表示通過本發(fā)明的使用了部分的反應(yīng)溫度區(qū)域的信號(hào)擴(kuò)增來檢測(cè)基因的方法的其他例子的概略說明圖。
圖9是表示實(shí)驗(yàn)例1的結(jié)果的照片。
圖10是表示實(shí)驗(yàn)例2的結(jié)果的照片。
圖11是表示實(shí)施例1的工序圖的概略說明圖。
圖12是表示實(shí)施例2的工序圖的概略說明圖。
圖13是表示實(shí)施例3的工序圖的概略說明圖。
圖14是表示實(shí)施例4的工序圖的概略說明圖。
圖15是表示實(shí)施例4以及比較例4的結(jié)果的曲線圖。
圖中10-微型板，12-靶基因，14-捕獲探針，15-標(biāo)記物質(zhì)，16-輔助探針，17-一對(duì)HCP的一個(gè)，18-一對(duì)HCP，20-自聚合物，22-加熱板，24-冷卻機(jī)構(gòu)，50-輔助探針-1，51-輔助探針-2，52-靶基因，53-探針A，54-捕獲探針-1，55-輔助探針-3，56-捕獲探針-2，57-探針B，58-捕獲探針-3，59-探針C，60-靶基因。
具體實(shí)施例方式
下面，根據(jù)

本發(fā)明的實(shí)施方式，圖示的例子只是例示，只要不脫離本發(fā)明的技術(shù)思想，就可以進(jìn)行各種變形。
在熱傳播方法中有熱傳導(dǎo)(分子的碰撞)、對(duì)流(物質(zhì)的移動(dòng))、以及放射(電磁波)的3種。本發(fā)明的雜交方法是，利用該熱傳播方法使微型板等檢測(cè)平臺(tái)內(nèi)的反應(yīng)溶液的溫度不均一，在反應(yīng)溶液內(nèi)部分制作反應(yīng)溫度區(qū)域。
可以將該部分的反應(yīng)溫度區(qū)域的設(shè)定應(yīng)用在利用了雜交反應(yīng)的基因檢測(cè)中，特別優(yōu)選用于通過利用了圖4或圖8所示的PALSAR法的信號(hào)擴(kuò)增來檢測(cè)基因。在本發(fā)明中，在靶基因的固定部位付近、例如在檢測(cè)用平臺(tái)的底部等部分地形成反應(yīng)溫度區(qū)域，通過優(yōu)先進(jìn)行在該檢測(cè)用平臺(tái)底部的雜交反應(yīng)，可以高感度地進(jìn)行基因檢測(cè)。
下面，具體說明雜交反應(yīng)中部分的反應(yīng)溫度區(qū)域的形成的例子。
本發(fā)明是，通過只使反應(yīng)溶液的一部分達(dá)到適于雜交的溫度，只在該局部有效進(jìn)行雜交反應(yīng)，可以以良好的感度進(jìn)行使用了雜交的靶基因的檢測(cè)。只要僅以局部為反應(yīng)溫度進(jìn)行雜交反應(yīng)，就在本發(fā)明的范圍內(nèi)，但優(yōu)選在反應(yīng)溶液中設(shè)置高溫區(qū)域以及低溫區(qū)域，使得在反應(yīng)溶液中產(chǎn)生溫度梯度，而僅使局部為反應(yīng)溫度，更優(yōu)選通過加熱高溫區(qū)域并冷卻低溫區(qū)域而產(chǎn)生。另外，優(yōu)選預(yù)先冷卻反應(yīng)溶液以使雜交反應(yīng)不進(jìn)行具體而言，可以舉出在圖6中示出了概略說明圖的使用了微型板的使用部分的反應(yīng)溫度區(qū)域的雜交方法的例子。下面，以使用微型板作為反應(yīng)平臺(tái)的情況為例，具體說明本發(fā)明的靶基因的檢測(cè)方法。其中，其他的平臺(tái)也同樣可以應(yīng)用于微型板。
首先，在捕獲了靶基因的微型板10中添加用于雜交反應(yīng)的寡核苷酸，然后將微型板10全體例如冷卻至4℃[圖6(a)]。冷卻后，如圖6(b)所示，將微型板10放置到加熱板22等加熱機(jī)構(gòu)上，將冷卻機(jī)構(gòu)24(例如，保冷劑(-20℃)或者與其類似的冷卻板，例如冷卻的鋁封口等)覆蓋其上，進(jìn)行雜交反應(yīng)[圖6(c)]，其中所述的加熱板22已將溫度調(diào)節(jié)至適合雜交反應(yīng)的溫度。
雜交反應(yīng)優(yōu)選使用具備上述加熱機(jī)構(gòu)以及冷卻機(jī)構(gòu)的設(shè)備，對(duì)反應(yīng)溶液進(jìn)行加熱以及冷卻而進(jìn)行，上述加熱機(jī)構(gòu)以及冷卻機(jī)構(gòu)優(yōu)選可以控制溫度。在用微型板進(jìn)行雜交反應(yīng)的情況下，上述加熱機(jī)構(gòu)以及冷卻機(jī)構(gòu)都進(jìn)一步優(yōu)選用平面接觸微型板的結(jié)構(gòu)，特別優(yōu)選底面可以進(jìn)行加熱以及冷卻兩者。
進(jìn)一步具體說明進(jìn)行自聚合反應(yīng)作為雜交反應(yīng)的例子。圖7是表示通過在微型板設(shè)定部分的反應(yīng)溫度區(qū)域的信號(hào)擴(kuò)增來檢測(cè)基因的方法的一例的概略說明圖，是使用本發(fā)明的雜交方法進(jìn)行圖4中的步驟(e)～(f)的自聚合反應(yīng)的例子。
如上述的圖4(e)所示，在捕獲了靶基因的微型板10中加入用于自聚合反應(yīng)的多種寡核苷酸探針，然后進(jìn)行冷卻。冷卻后，如圖7(a)所示，通過在接近靶基因的階層W(微型板的底部)設(shè)定成最適合自聚合反應(yīng)的溫度，只在該部位進(jìn)行雜交反應(yīng)。如圖7(b)所示，隨著反應(yīng)時(shí)間的經(jīng)過，從微型板的底部向上部達(dá)到最適合自聚合反應(yīng)的溫度，所以在清洗后，如圖7(c)所示，只與靶基因結(jié)合成大的自聚合物，可以高感度地檢測(cè)基因。
圖8是表示通過在微型板設(shè)定部分的反應(yīng)溫度區(qū)域的信號(hào)擴(kuò)增來檢測(cè)基因的方法的其他例子的概略說明圖。圖8是使用了一對(duì)HCP的號(hào)放大，表示使用一對(duì)HCP的一方的一個(gè)區(qū)域是與靶基因互補(bǔ)的區(qū)域的一對(duì)HCP的例子。通過PALSAR法，如圖8(a)所示，在檢測(cè)用平臺(tái)(微型板10或DNA微陣列等)的底部結(jié)合用于捕獲基因的捕獲探針14，利用圖8(b)～圖8(d)所示的步驟來捕獲靶基因12(例如、E.coli-16SrRNA等)，向該靶基因12中加入具有與靶基因互補(bǔ)的區(qū)域的HCP17[圖8(b)]，使該靶基因12和HCP17結(jié)合[圖8(c)]，如圖8(d)所示，加入多對(duì)的HCP18，通過自聚合反應(yīng)形成自聚合物20，可以放大信號(hào)。
在本發(fā)明中，在該步驟(d)-(e)的自聚合反應(yīng)中，在用于檢測(cè)靶基因的存在的平臺(tái)的底部部分地形成反應(yīng)溫度區(qū)域，優(yōu)先在該檢測(cè)用平臺(tái)的底部進(jìn)行自聚合反應(yīng)，由此可以顯著提高靶基因上的自聚合物形成效率[圖8(e)]，可以高感度地進(jìn)行基因檢測(cè)。其中，在圖8中表示的例子是，預(yù)先用標(biāo)記物質(zhì)來標(biāo)記在自聚合反應(yīng)中使用的一對(duì)HCP的一方，通過檢測(cè)標(biāo)記物質(zhì)來檢測(cè)自聚合物，由此檢測(cè)靶基因を檢測(cè)，但對(duì)自聚合物的檢測(cè)方法沒有特別限制。
實(shí)施例下面，舉出實(shí)施例進(jìn)一步具體說明本發(fā)明，但這些實(shí)施例只是例示，當(dāng)然不限定性解釋本發(fā)明。
(實(shí)驗(yàn)例1以及2)通過使用了一對(duì)探針的PALSAR法的反應(yīng)溫度、時(shí)間的差異的自聚合物形成。
<各溶液的制備方法>
(1)雜交溶液的制備制備以下的試劑，并用作雜交溶液。
雜交溶液-1[4XSSC、0.2％SDS、1％Blocking reagent(Roche制)](2)雜交·HCP溶液的制備在上述雜交溶液-1中溶解下述一對(duì)探針(HCP-1以及HCP-2)并使?jié)舛葹?pmol/μL，將其作為雜交·HCP溶液。
HCP-1的堿基序列(序列編號(hào)1)5’-X區(qū)域(CATGTCTCGTGTCTTGCATC)·Y區(qū)域(CTGCTACAGTGAACACCATC)·Z區(qū)域(GTTCTCGACATAGACCAGTC)-3′HCP-2的堿基序列(序列編號(hào)2)(5’末端異羥基洋地黃毒苷配基標(biāo)記)DIG-5’-X’區(qū)域(GATGCAAGACACGAGACATG)·Y’區(qū)域(GATGGTGTTCACTGTAGCAG)·Z’區(qū)域(GACTGGTCTATGTCGAGAAC)-3’<反應(yīng)以及檢測(cè)方法>
將上述雜交·HCP溶液分別注入到128個(gè)0.2mL的微管中，每管20μL，在分別對(duì)其中的1/2進(jìn)行“實(shí)驗(yàn)例1在94℃下加熱分注后的管30秒”、或者“實(shí)驗(yàn)例2在冰上冷卻分注后的管”之后，在各反應(yīng)溫度(37.0、39.6、41.4、43.8、46.4、48.7、50.5、53.0、55.0、57.1、58.7、60.6、62.8、64.6、66.0或者68.0℃)下使其反應(yīng)30分鐘、1小時(shí)、或者3小時(shí)，在冰上使其驟冷。利用0.5％瓊脂糖凝膠電泳對(duì)它們進(jìn)行確認(rèn)。
圖9是表示實(shí)驗(yàn)例1的結(jié)果的照片，圖10是表示實(shí)驗(yàn)例2的結(jié)果的照片。在圖9以及圖10中，(a)是表示在各反應(yīng)溫度下反應(yīng)30分鐘的結(jié)果，(b)是表示在各反應(yīng)溫度下反應(yīng)1小時(shí)的結(jié)果，(c)是表示在各反應(yīng)溫度下反應(yīng)3小時(shí)的結(jié)果。另外，在圖9以及圖10中，各道的樣品的溫度條件如下所示。
M尺寸記號(hào)、137.0℃，239.6℃，341.4℃，443.8℃，546.4℃，648.7℃，750.5℃，853.0℃，955.0℃，1057.1℃，1158.7℃，1260.6℃，1362.8℃，1464.6℃，1566.0℃，1668.0℃。
如圖9所示，在進(jìn)行94℃的熱變性的實(shí)驗(yàn)例1中，在任何反應(yīng)時(shí)間內(nèi)都可以確認(rèn)在55℃以上有滯留在瓊脂糖凝膠的孔內(nèi)的大小的自聚合物形成(圖中的箭頭)。另一方面，如圖10所示，在不進(jìn)行熱變性的實(shí)驗(yàn)例2中，可以與實(shí)驗(yàn)例1一樣在55℃以上確認(rèn)自聚合物的形成，在不到55℃下確認(rèn)看成是HCP的非特異性凝聚的涂抹帶，即使反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)也出現(xiàn)相同的趨勢(shì)。由此，在本實(shí)驗(yàn)例中使用的雜交·HCP溶液的條件中一對(duì)探針(HCP-1以及2)的自聚合物形成的最佳反應(yīng)溫度是55℃附近。
(實(shí)施例1～3以及比較例1～3)通過使用了部分的反應(yīng)溫度區(qū)域的雜交反應(yīng)來檢測(cè)靶基因的檢測(cè)感度的測(cè)定實(shí)施例1～3是，在使用了HCP的雜交反應(yīng)中，以使用了均一的反應(yīng)溶液的情況為對(duì)照(比較例1～3)，來確認(rèn)在反應(yīng)溶液中作成部分的反應(yīng)溫度區(qū)域的情況的效果。下面，將作成部分的反應(yīng)溫度區(qū)域使其發(fā)生反應(yīng)的條件稱為「C/H」，將在作為的對(duì)照的均一反應(yīng)溫度下使其發(fā)生反應(yīng)的條件稱為「H/H」。
另外，在進(jìn)行使用了HCP的反應(yīng)的情況下，將使用一對(duì)HCP(HCP-1以及HCP-2)進(jìn)行自聚合反應(yīng)的情況下記載為「2HCP」，將只使用HCP中的單鏈(HCP-1或者HCP-2)進(jìn)行雜交反應(yīng)的情況記載為「1HCP」。
<各溶液的制備>
(1)雜交溶液的制備制備以下的試劑，在下述實(shí)施例1～3以及比較例1～3中用作雜交溶液。
雜交溶液-1[4XSSC、0.2％SDS、1％Blocking reagent(Roche制)]雜交溶液-2[4XSSC、0.2％SDS、1％Blocking reagent(Roche制)、20％甲醛、Salmon sperm DNA(10μg/mL)]雜交溶液-3[4XSSC、0.2％SDS、1％Blocking reagent(Roche制)、5％PEG20000](2)溶菌液的制備將在生理鹽水懸浮用胰酶大豆瓊脂培養(yǎng)了18小時(shí)金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)而成的液體作為培養(yǎng)菌原液。用生理鹽水將其稀釋成規(guī)定的細(xì)菌數(shù)，將通過堿-SDS法(非專利文獻(xiàn)5)發(fā)生溶菌的液體作為用于下述實(shí)施例1～3以及比較例1～3的含有靶rRNA的溶菌液。關(guān)于細(xì)菌數(shù)，作成培養(yǎng)菌原液的稀釋系列，從用胰酶大豆瓊脂培養(yǎng)得到的活細(xì)菌數(shù)計(jì)算出規(guī)定的細(xì)菌數(shù)。
(實(shí)施例1以及比較例1)比較對(duì)“C/H”以及“H/H”條件下的靶基因的檢測(cè)感度以及靶基因上的自聚合物的形成效率的効果。實(shí)施例1的概略說明圖表示于圖11。
<各溶液的制備方法>
(1)第1雜交·探針溶液的制備在0.2mL微管中加入下述輔助探針-1(100pmol/μL)10μL、下述輔助探針-2(100pmol/μL)10μL、下述探針A(100pmol/μL)10μL、雜交溶液-270μL，用攪拌器充分混合，在94℃下加熱30秒加熱之后，馬上冰冷卻，作為探針混液。
在已分別注入了3.9mL上述雜交溶液-2的15mL錐形管中加入上述探針混液，用攪拌器充分混合，將其用作在靶rRNA和捕獲探針的雜交中使用的第1雜交·探針溶液(各探針的終濃度為0.25pmol/μL)。
輔助探針-1(圖11的符號(hào)50)的堿基序列(序列編號(hào)3)5′-T1區(qū)域(TAGCTAATGCAGCGCGGATCC)·S區(qū)域(GAGAAAGTTCATAGATATAC)·X區(qū)域(CATGTCTCGTGTCTTGCATC)·Y區(qū)域(CTGCTACAGTGAACACCATC)·Z區(qū)域(GTTCTCGACATAGACCAGTC)-3′輔助探針-2(圖11的符號(hào)51)的堿基序列(序列編號(hào)4)5′-X區(qū)域(CATGTCTCGTGTCTTGCATC)·Y區(qū)域(CTGCTACAGTGAACACCATC)·Z區(qū)域(GTTCTCGACATAGACCAGTC)·S’區(qū)域(GTATATCTATGAACTTTCTC)·T2區(qū)域(ATCTATAAGTGACAGCAAGAC)-3′探針A(圖11的符號(hào)53)的堿基序列(序列編號(hào)5)5’-K1區(qū)域(CGACGACGACGACGACGACG)·T3區(qū)域(GCGGTTCAAAATATTATCCGG)-3’(2)第2雜交·HCP溶液的制備在0.2mL微管中加入上述實(shí)驗(yàn)例1記載的HCP-1(100pmol/μL)以及HCP-2(100pmol/μL)各30μL，加入40μL雜交溶液-1，用攪拌器充分混合，在94℃下加熱30秒然后馬上冰冷卻，作為HCP混液。
將該HCP混液加入到已分注了1.9mL上述雜交溶液-1的15mL錐形管中，用攪拌器充分混合，作為第2雜交·HCP溶液(各探針的終濃度為1.5pmol/μL)，在實(shí)施例1-1以及比較例1-1中使用。
另外，作為在實(shí)施例1-2以及比較例1-2中使用的第2雜交·HCP溶液，使用30μL滅菌蒸餾水來代替HCP-1，一樣制備溶液。
<微型板的制備>
將具有與金黃色葡萄球菌的rRNA互補(bǔ)的序列的下述捕獲探針-1固定在帶形孔型的96孔微型板上，在實(shí)施例1、實(shí)施例3、比較例1以及比較例3中使用。
捕獲探針-1(圖11的符號(hào)54)的堿基序列(序列編號(hào)6)5’-T4區(qū)域(CGTCTTTCACTTTTGAACCAT)·K1’區(qū)域(CGTCGTCGTCGTCGTCGTCG)-3’-酰胺鍵(Amino link)<反應(yīng)以及檢測(cè)方法>
(1)第1雜交向2.0mL微管中加入上述制備的溶菌液(菌濃度1×105CFU/mL)800μL、第1雜交·探針溶液800μL，用攪拌器充分混合，在45℃下反應(yīng)1小時(shí)。圖11的(a)以及(b)是該反應(yīng)工序的概略說明圖。另外，作為對(duì)照，使用生理鹽水來代替溶菌液，一樣進(jìn)行反應(yīng)。
將該反應(yīng)液各100μL分注到上述制備的帶形孔型的96孔微型板中，用板密封器緊密地密封，進(jìn)而在45℃下反應(yīng)1小時(shí)。圖11的(c)以及(d)是該反應(yīng)工序的概略說明圖。
在上述反應(yīng)后，用清洗液(50mM-Tris，0.3M-NaCl，0.01％-TritonX-100，pH7.6)對(duì)96孔微型板進(jìn)行清洗。
(2)第2雜交(通過HCP的自聚合物或者雜交物形成反應(yīng))在上述清洗后、將第2雜交·HCP溶液各以50μL分注到已徹底清除清洗液的96孔微型板中、用板密封器緊密地密封。
在實(shí)施例1、即實(shí)施例1-1以及實(shí)施例1-2中，使用上述微型板的帶形孔的一半，在“C/H”條件下使其反應(yīng)。實(shí)施例1中的“C/H”條件如下所示。
用4℃的保冷庫冷卻帶形孔30分鐘之后，將冷卻的帶形孔設(shè)置在分間恒溫槽(ク一ルスタツト、アナテツク制)的微型板用鋁封口(重量828g，寬度12.1cm，直徑8.2cm，高度4.2cm)上，在微型板上載置冷卻機(jī)構(gòu)(STRATA冷卻器的蓋、STRATAGENE制)，將恒溫槽設(shè)定成45℃或者55℃，使其反應(yīng)1小時(shí)。
在比較例1、即比較例1-1以及比較例1-2中，使用上述帶形孔的剩余部分，在“H/H”條件下使其反應(yīng)。比較例1的“H/H”條件如下所示。
在室溫下放置帶形孔30分鐘之后，用設(shè)定成45℃或者55℃的孵化器使其發(fā)應(yīng)1小時(shí)。
(3)檢測(cè)在清洗微型板孔之后，加入溶解于50mM-Tris(pH7.6)的POD標(biāo)記抗異羥基洋地黃毒苷配基(60mU/mL)50μL，用37℃的孵化器使其反應(yīng)。在用清洗液清洗后，加入含有0.2M乙酸緩沖液(pH5.0)、0.06％TMB以及0.04％H2O2的顯色液50μL，在暗處放置15分鐘，測(cè)定655nm的吸光度。將吸光度的結(jié)果顯示于表1以及表2。
第二雜交在反應(yīng)溫度45℃下的吸光度
第二雜交在反應(yīng)溫度55℃下的吸光度

如表1以及表2所示，在1HCP、2HCP中，都是C/H條件下的實(shí)施例1的測(cè)定值高于H/H條件下的比較例1的測(cè)定值，通過使用C/H條件，在靶基因上有效地進(jìn)行雜交反應(yīng)。
另外，在C/H條件下的實(shí)施例1中，與使用1HCP的實(shí)施例1-2相比，使用2HCP的實(shí)施例1-1的測(cè)定值更高，另一方面，在H/H條件下的比較例1中，與使用1HCP的比較例1-2相比，使用2HCP的比較例1-2的測(cè)定值與其相同或其以下。根據(jù)該結(jié)果，確認(rèn)階段性地作成溶液中的反應(yīng)溫度的C/H與均一的反應(yīng)溫度的H/H相比，更能在靶基因上通過HCP形成自聚合物。
(實(shí)施例2以及比較例2)關(guān)于C/H中的階段性反應(yīng)溫度的作成，加入基于HCP的雜交物形成或者自聚合物形成的反應(yīng)液量來進(jìn)行確認(rèn)。實(shí)施例2的概略說明圖如圖12所示。
<各溶液的制備方法>
(1)第1雜交·探針溶液的制備向0.2mL微管中加入下述輔助探針-3(100pmol/μL)20μL、80μL雜交溶液-2，用攪拌器充分混合，在94℃下加熱30秒之后，馬上冰冷卻而作為探針液。
輔助探針-3(圖12的符號(hào)55)的堿基序列(序列編號(hào)7)5′-X區(qū)域(CATGTCTCGTGTCTTGCATC)·Y區(qū)域(CTGCTACAGTGAACACCATC)·Z區(qū)域(GTTCTCGACATAGACCAGTC)·T2區(qū)域(ATCTATAAGTGACAGCAAGAC)-3′向已分注7.9mL雜交溶液-2的15mL錐形管中加入上述探針液，用攪拌器充分混合，將其用作在靶rRNA和捕獲探針的雜交中使用的第1雜交·探針溶液(探針的終濃度0.25pmol/μL)。
(2)第2雜交·HCP溶液的制備向0.2mL微管中加入實(shí)驗(yàn)例1記載的HCP-1(100pmol/μL)以及HCP-2(100pmol/μL)各32μL、36μL的雜交溶液-1，用攪拌器充分混合，在94℃下加熱30秒之后，馬上冰冷卻作為HCP混液，一共準(zhǔn)備3管。
將該HCP混液分別加入到3管已分注了1.5mL雜交溶液-1的15mL錐形管中，用攪拌器充分混合，作為第2雜交·HCP溶液(各終濃度2pmol/μL)。
另外，作為在實(shí)施例2-2以及比較例2-2中使用的第2雜交·HCP溶液，使用32μL的滅菌蒸餾水來代替HCP-1，一樣制備溶液。
<微型板的制備>
將具有與金黃色葡萄球菌的rRNA互補(bǔ)的序列的下述捕獲探針-2固定在帶形孔型的96孔微型板上，在實(shí)施例2以及比較例2中使用。
捕獲探針-2(圖12的符號(hào)56)的堿基序列(序列編號(hào)8)5’-T4區(qū)域(CGTCTTTCACTTTTGAACCAT)-3’-酰胺鍵<反應(yīng)以及檢測(cè)方法>
(1)第1雜交向上述制備的帶形孔型的96孔微型板中分注上述制備的溶菌液(細(xì)菌濃度1×105CFU/mL)各50μL、第1雜交·探針溶液50μL，用板密封器緊密地密封，在45℃下使其反應(yīng)1小時(shí)。圖12是該反應(yīng)工序的概略說明圖。另外，作為對(duì)照，使用生理鹽水來代替溶菌液，一樣進(jìn)行反應(yīng)。
在反應(yīng)后，使用板清洗器并利用清洗液進(jìn)行清洗。
(2)第2雜交(基于HCP的自聚合物或者雜交物形成反應(yīng))在清洗后，將第2雜交·HCP溶液分別以50μL或者100μL分別分注到已徹底清除清洗液的96孔微型板中，用板密封器緊密地密封。
在實(shí)施例2、即實(shí)施例2-1以及實(shí)施例2-2中，使用“C/H”條件使上述微型板的帶形孔中的一半在50℃或者55℃下反應(yīng)1小時(shí)。其中，“C/H”條件除了使用保冷劑作為冷卻機(jī)構(gòu)且變更恒溫槽的設(shè)定溫度以外，與實(shí)施例1一樣進(jìn)行。
在比較例2、即比較例2-1以及比較例2-2中，使用“H/H”條件使上述帶形孔的剩余部分在50℃或者55℃下反應(yīng)1小時(shí)。其中，“H/H”條件除了微型板加熱器(DIGENE制)來代替孵化器且變更設(shè)定溫度以外，與比較例1一樣進(jìn)行。
(3)檢測(cè)通過和實(shí)施例1一樣的方法測(cè)定吸光度。結(jié)果如表3以及表4所示。其中，表3以及表4中所示的各吸光度的數(shù)值是，從所測(cè)定的數(shù)值中減去使用生理鹽水代替溶菌液的的對(duì)照實(shí)驗(yàn)的測(cè)定數(shù)值而得到的數(shù)值。
第二雜交在反應(yīng)溫度50℃下的吸光度
第二雜交在反應(yīng)溫度55℃下的吸光度

如表3以及表4所示，在C/H條件下的實(shí)施例2中，與使用1HCP的實(shí)施例2-2相比，使用2HCP的實(shí)施例2-1的測(cè)定值更高，與H/H條件下的比較例2中使用了2HCP的比較例2-1相比，都呈現(xiàn)較高的測(cè)定值。另外，關(guān)于1HCP，在C/H條件下的實(shí)施例2-2中，當(dāng)使反應(yīng)液量從50μL向100μL增加時(shí)，測(cè)定值增高，但在H/H條件下的比較例2-2中，即使改變反應(yīng)液量也沒有看到差別。根據(jù)這些結(jié)果，在C/H中進(jìn)一步階段性地作成溶液中的反應(yīng)溫度，容易地在靶基因上通過HCP形成自聚合物，同時(shí)非PALSAR法的通常的單鏈雜交效率也增高。
(實(shí)施例3以及比較例3)改變應(yīng)用部分的反應(yīng)溫度區(qū)域的第2雜交的反應(yīng)液量，確認(rèn)對(duì)單鏈探針的雜交效率以及基于HCP的自聚合物的形成效率的効果。實(shí)施例3的概略說明圖顯示于圖13。
<各溶液的制備>
(1)第1雜交·探針溶液-1的制備向0.2mL微管中加入實(shí)施例1記載的輔助探針-1(100pmol/μL)以及輔助探針-2(100pmol/μL)各10μL、80μL的雜交溶液-2，用攪拌器充分混合，在80℃下加熱30秒之后，馬上冰冷卻作為探針混液。
將該探針混液加入到已分注3.9mL冷卻的雜交溶液-2的15mL錐形管中，用攪拌器充分混合，將其作為在與靶rRNA的雜交中使用的第1雜交·探針溶液-1(各探針的終濃度0.25pmol/μL)。
(2)第1雜交·探針溶液-2的制備向0.2mL微管中加入實(shí)施例1記載的探針A(100pmol/μL)10μL、90μL的雜交溶液-2，用攪拌器充分混合，在80℃下加熱30秒之后，馬上冰冷卻作為探針混液。
將該探針混液加入到已分注1.9mL冷卻的雜交溶液-2的15mL錐形管中，用攪拌器充分混合，將其作為在靶rRNA和捕獲探針的雜交中使用的第1雜交·探針溶液-2(探針的終濃度0.25pmol/μL)。
(3)第2雜交·HCP溶液的制備向0.2mL微管中加入實(shí)驗(yàn)例1記載的HCP-1(100pmol/μL)以及HCP-2(100pmol/μL)各40μL、20μL的雜交溶液-1，用攪拌器充分混合，在80℃下加熱30秒之后，馬上冰冷卻作為HCP混液。
將該HCP混液加入到已分注1.9mL的雜交溶液-1的15mL錐形管中，用攪拌器充分混合，作為第2雜交·HCP溶液(各探針的終濃度2pmol/μL)，在實(shí)施例3-1以及比較例3-1中使用。
另外，作為在實(shí)施例3-2以及比較例3-2中使用的第2雜交·HCP溶液，使用40μL滅菌蒸餾水來代替HCP-1，一樣制備溶液。
<反應(yīng)以及檢測(cè)方法>
(1)第1雜交向?qū)嵤├?記載的帶形孔型的96孔微型板中加入50μL第1雜交·探針溶液-2，用板密封器緊密地密封，在45℃下使其反應(yīng)1小時(shí)。圖13的(c)以及(d)是該反應(yīng)工序的概略說明圖。
在反應(yīng)后，使用板清洗器并利用清洗液進(jìn)行清洗。
同時(shí)，向1.5mL微管中加入采用上述的方法調(diào)制成5×104CFU/mL的溶菌液或者生理鹽水(對(duì)照)500μL、500μL的第1雜交·探針溶液-1，用攪拌器充分混合，在45℃下使其反應(yīng)1小時(shí)。圖13的(a)以及(b)是該反應(yīng)工序的概略說明圖。
將該反應(yīng)液各100μL分注到通過上述第1雜交·探針溶液-2的反應(yīng)后的微型板中，用板密封器緊密地密封，進(jìn)而在45℃下使其反應(yīng)1小時(shí)。圖13的(b)、(d)以及(e)是該反應(yīng)工序的概略說明圖。
在反應(yīng)后，使用板清洗器并利用清洗液進(jìn)行清洗。
(2)第2雜交(基于HCP的自聚合物或者雜交物形成反應(yīng))在上述清洗后，將第2雜交·HCP溶液分別以50μL或者100μL分注到已徹底清除清洗液的96孔微型板中，用板密封器緊密地密封。
在實(shí)施例3、即實(shí)施例3-1以及實(shí)施例3-2中，使用上述微型板的帶形孔中的一半，“在C/H”條件下使其反應(yīng)。實(shí)施例3中的“C/H”條件如下所述。
用4℃的保冷庫冷卻帶形孔30分鐘之后，將冷卻的帶形孔設(shè)置在微型板加熱器(DIGENE制)上，在微型板上載置預(yù)先用4℃的保冷庫冷卻的鋁封口(aluminium block)、在其上載置冷卻機(jī)構(gòu)(STRATA冷卻器的蓋、STRATAGENE制)，將微型板加熱器設(shè)定成55℃后使其反應(yīng)1小時(shí)。
在比較例3、即比較例3-1以及比較例3-2中，在“H/H”條件下使上述帶形孔的剩余部分在55℃下反應(yīng)1小時(shí)。其中，“H/H”條件除了變更設(shè)定溫度以外，與比較例2一樣進(jìn)行。
其中，在實(shí)施例3以及比較例3中，為了提高和帶形孔的粘附性，在反應(yīng)前向任何封口上都滴下礦物油。
(3)檢測(cè)采用和實(shí)施例1一樣的方法測(cè)定吸光度。結(jié)果顯示于表5。其中，表5中所示的各吸光度的數(shù)值是、從所測(cè)定的數(shù)值中減去使用生理鹽水來代替溶菌液的對(duì)照實(shí)驗(yàn)的測(cè)定數(shù)值而得到的數(shù)值。


如表5所示，在1HCP、2HCP中，C/H的測(cè)定值都比H/H高，當(dāng)反應(yīng)液量從50μL向100μL增加時(shí)，關(guān)于作為通常的雜交的1HCP，特別是C/H的測(cè)定值升高。根據(jù)這些結(jié)果，在C/H中進(jìn)一步階段性地作成溶液中的反應(yīng)溫度，容易地在靶基因上通過HCP形成自聚合物，同時(shí)，非PALSAR法的通常的單鏈雜交的效率也提高。
(實(shí)施例4以及比較例4)實(shí)施例4使用標(biāo)記寡核苷酸DNA，將均一的反應(yīng)溫度溶液作為對(duì)照(比較例4)，比較反應(yīng)溶液中作成部分的反應(yīng)溫度區(qū)域的情況下的靶基因的檢測(cè)效率。
<各溶液的制備方法>
(1)雜交·探針溶液-A的制備在雜交溶液-2[4XSSC、0.2％SDS、1％Blocking reagent(Roche制)、20％甲醛、Salmon sperm DNA(10μg/mL)]中溶解下述探針B并使?jié)舛葹?.025pmol/μL，將其作為雜交·探針溶液-A。
探針B(圖14的符號(hào)57)的堿基序列(序列編號(hào)9)5’-K1區(qū)域(CGACGACGACGACGACGACG)·T5區(qū)域(AAATCGACAGCGTTTACAGCG)-3′(2)雜交·探針溶液-B的制備在上述雜交溶液-2中溶解5′末端標(biāo)有DIG標(biāo)簽的下述探針C并使其濃度為0.025pmol/μL，將其作為雜交·探針溶液-B。
探針C(圖14的符號(hào)59)的堿基序列(序列編號(hào)10)(5’末端異羥基洋地黃毒苷配基標(biāo)記)DIG-5′-T6區(qū)域(TTATCACGTTAGCTACGGGCGC)-3′(3)溶菌液的制備將用巧克力瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)了18小時(shí)流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)懸浮于生理鹽水中而成的液體作為培養(yǎng)菌原液。將其用生理鹽水稀釋并使菌濃度為1×107CFU/mL，采用堿-SDS法(非專利文獻(xiàn)5)使其溶菌，將其作為溶菌液。關(guān)于菌數(shù)，作成培養(yǎng)菌原液的稀釋系列，從用巧克力瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)得到的活細(xì)菌數(shù)計(jì)算出規(guī)定的細(xì)菌數(shù)。其中，將使用生理鹽水來代替溶菌液并進(jìn)行相同反應(yīng)的情況作為對(duì)照<微型板的制備>
將具有與流感嗜血桿菌的rRNA互補(bǔ)的序列的下述捕獲探針-3分別固定在帶形孔型的96孔微型板上，在實(shí)施例4以及比較例4中使用。
捕獲探針-3(圖14的符號(hào)58)的堿基序列(序列編號(hào)11)5′-T7區(qū)域(CAGAGTTAAACCCCAACCCCC)·K1’區(qū)域(CGTCGTCGTCGTCGTCGTCG)-3′-酰胺鍵<反應(yīng)以及檢測(cè)方法>
(1)雜交反應(yīng)向上述制備的帶形孔型的96孔微型板中以50μL分注雜交·探針溶液-A，在將微型板設(shè)定成45℃的條件下使其反應(yīng)1小時(shí)。圖14(a)是該反應(yīng)工序的概略說明圖。
在反應(yīng)后，用清洗液(50mM-Tris，0.3M-NaCl，0.01％-TritonX-100，pH7.6)進(jìn)行清洗。
在清洗后，向已徹底清除清洗液的96孔微型板中分注上述制備的溶菌液50μL、50μL的雜交·探針溶液-B，用板密封器緊密地密封。其中，細(xì)菌數(shù)是4×105CFU/well。
實(shí)施例4在將上述微型板的下部控制成45℃、將上部電控制成20℃的條件下反應(yīng)1小時(shí)。圖14(b)是該反應(yīng)工序的概略說明圖。在反應(yīng)后，用清洗液進(jìn)行清洗。
另一方面，比較例4在將微型板設(shè)定成45℃的條件進(jìn)行同樣的反應(yīng)以及清洗。
(2)檢測(cè)在清洗微型板孔之后，加入溶解于50mM-Tris(pH7.6)的POD標(biāo)記抗異羥基洋地黃毒苷配基(60mU/mL)50μL，用37℃的孵化器使其反應(yīng)。在用清洗液進(jìn)行清洗之后，加入含有0.2M乙酸緩沖液(pH5.0)、0.06％TMB以及0.04％H2O2的顯色液50μL，在暗處放置15分鐘，測(cè)定655nm的吸光度。結(jié)果顯示于表6以及圖15。


如表6以及圖15所示，將下部控制成45℃、將上部電控制成20℃的實(shí)施例4，與比較例4相比，測(cè)定值更高，感度提高。根據(jù)該結(jié)果，可以確認(rèn)不僅在通過HCP的自聚合反應(yīng)的信號(hào)擴(kuò)增中，即便在使用標(biāo)記寡DNA的情況的檢測(cè)中，也可以提高感度。
序列表<110>衛(wèi)材R&D管理有限公司<120>雜交方法<130>76694-PCT-CN<140>PCT/JP2005/8248<141>2005-04-28<150>JP 2004-133870<151>2004-04-28<160>11<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>1catgtctcgt gtcttgcatc ctgctacagt gaacaccatc gttctcgaca tagaccagtc60<210>2<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>標(biāo)記在5’端的異羥基洋地黃毒苷配基<400>2gatgcaagac acgagacatg gatggtgttc actgtagcag gactggtcta tgtcgagaac60<210>3<211>101<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>合成序列<400>4catgtctcgt gtcttgcatc ctgctacagt gaacaccatc gttctcgaca tagaccagtc60gtatatctat gaactttctc atctataagt gacagcaaga c 101
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<221>misc_feature<222>(21)..(21)<223>標(biāo)記在3’端的酰胺鍵<400>8cgtctttcac ttttgaacca t 21<210>9<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>標(biāo)記在5’端的異羥基洋地黃毒苷配基<400>10ttatcacgtt agctacgggc gc 22<210>11<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成序列<220>
<221>misc_feature<222>(41)..(41)<223>標(biāo)記在3’端的酰胺鍵<400>11cagagttaaa ccccaacccc ccgtcgtcgt cgtcgtcgtc g4權(quán)利要求
1.一種雜交方法，是使用反應(yīng)溶液中的寡核苷酸的雜交方法，其特征在于，在反應(yīng)溶液中部分地形成反應(yīng)溫度區(qū)域，在該反應(yīng)溫度區(qū)域中進(jìn)行雜交反應(yīng)。
2.如權(quán)利要求1所述的雜交方法，其中，所述雜交反應(yīng)是，使用具有能夠相互雜交的互補(bǔ)堿基序列區(qū)域的多種寡核苷酸探針使其進(jìn)行雜交，由此使寡核苷酸發(fā)生自聚合，形成雙鏈的自聚合物的自聚合反應(yīng)。
3.如權(quán)利要求2所述的雜交方法，其中，所述多種寡核苷酸探針是由第1探針和第2探針構(gòu)成的一對(duì)寡核苷酸探針，所述的第1探針由從5’端側(cè)順次至少設(shè)置有核酸區(qū)域X、核酸區(qū)域Y以及核酸區(qū)域Z且具有下述化學(xué)式(1)的結(jié)構(gòu)的3處以上的核酸區(qū)域組成，所述第2探針由從5’端側(cè)順次至少設(shè)置有核酸區(qū)域X’、核酸區(qū)域Y’以及核酸區(qū)域Z’且具有下述化學(xué)式(2)的結(jié)構(gòu)的3處以上的核酸區(qū)域組成；[化1] [化2] 在所述化學(xué)式(1)以及(2)中，X和X’、Y和Y’、Z和Z’分別是能夠雜交的互補(bǔ)的核酸區(qū)域。
4.如權(quán)利要求2所述的雜交方法，其中，所述多種寡核苷酸探針具有二聚體形成用探針含有系和交聯(lián)探針含有系，所述二聚體形成用探針含有系是從含有多對(duì)二聚體形成用探針的第1系至第(2n-1)(n≥1)系順序形成n個(gè)，其中的二聚體形成用探針是將No.1以及No.2的一對(duì)寡核苷酸的各寡核苷酸分成3’側(cè)區(qū)域、中央?yún)^(qū)域、以及5’側(cè)區(qū)域這3個(gè)區(qū)域，使各寡核苷酸的中央?yún)^(qū)域成為相互互補(bǔ)的堿基序列，使3’側(cè)區(qū)域以及5’側(cè)區(qū)域成為相互不互補(bǔ)的堿基序列，所述交聯(lián)探針含有系是從分別含有多對(duì)交聯(lián)探針的第2系至第2n系順序形成n個(gè)，其中的交聯(lián)探針是將No.1以及No.2的一對(duì)寡核苷酸的各寡核苷酸分成3’側(cè)區(qū)域以及5’側(cè)區(qū)域這2個(gè)區(qū)域，使各寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域以及5’側(cè)區(qū)域成為相互不互補(bǔ)的堿基序列，該交聯(lián)探針的堿基序列是能夠?qū)τ稍摱垠w形成用探針形成的二聚體進(jìn)行交聯(lián)的堿基序列。
5.如權(quán)利要求4所述的雜交方法，其中，所述n＝1，就所述探針的堿基序列而言，第1系的No.1-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域和第2系的No.1-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域、第1系的No.2-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域和第2系的No.2-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域、第2系的No.2-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域和第1系的No.2-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域、第2系的No.1-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域和第1系的No.1-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域，各自成為互補(bǔ)堿基序列。
6.如權(quán)利要求4所述的雜交方法，其中，所述n＝1，就所述探針的堿基序列而言，第1系的No.1-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域和第2系的No.1-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域、第1系的No.2-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域和第2系的No.1-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域、第1系的No.2-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域和第2系的No.2-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域、第1系的No.1-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域和第2系的No.2-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域，各自成為互補(bǔ)堿基序列。
7.如權(quán)利要求4所述的雜交方法，其中，所述n≥2，就所述探針的堿基序列而言，第(2n-3)系的No.1-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域和第(2n-2)系的No.1-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域、第(2n-3)系的No.2-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域和第(2n-2)系的No.2-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域、第(2n-2)系的No.2-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域和第(2n-1)系的No.2-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域、第(2n-2)系的No.1-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域和第(2n-1)系的No.1-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域、二聚體形成用探針的最后的系的No.1-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域和交聯(lián)探針的最后的系的No.1-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域、二聚體形成用探針的最后的系的No.2-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域和交聯(lián)探針的最后的系的No.2-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域、交聯(lián)探針的最后的系的No.2-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域和第1系的No.2-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域、交聯(lián)探針的最后的系的No.1-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域和第1系的No.1-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域，各自成為互補(bǔ)堿基序列。
8.如權(quán)利要求4所述的雜交方法，其中，所述n≥2，就所述探針的堿基序列而言，第(2n-3)系的No.1-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域和第(2n-2)系的No.1-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域、第(2n-3)系的No.2-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域和第(2n-2)系的No.2-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域、第(2n-2)系的No.2-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域和第(2n-1)系的No.2-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域、第(2n-2)系的No.1-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域和第(2n-1)系的No.1-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域、二聚體形成用探針的最后的系的No.1-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域和交聯(lián)探針的最后的系的No.1-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域、二聚體形成用探針的最后的系的No.2-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域和交聯(lián)探針的最后的系的No.1-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域、交聯(lián)探針的最后的系的No.2-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域和第1系的No.2-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域、交聯(lián)探針的最后的系的No.2-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域和第1系的No.1-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域，各自成為互補(bǔ)堿基序列。
9.如權(quán)利要求2所述的雜交方法，其中，所述多種寡核苷酸探針是，具有如下所述的結(jié)構(gòu)且自第1系至第k系形成的多對(duì)二聚體形成用探針，即自第1系至第k(k≥2)系順序形成多個(gè)含有一對(duì)二聚體形成用探針的系，(a)第(k-1)系的No.1-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域和第k系的No.2-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域、(b)第(k-1)系的No.2-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域和第k系的No.1-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域、(c)最后的系的No.1-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域和第1的系的No.2-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域、(d)最后的系的No.2-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域和第1的系的No.1-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域、成為相互互補(bǔ)的堿基序列的結(jié)構(gòu)，另外，其中的一對(duì)二聚體形成用探針是將No.1以及No.2的一對(duì)寡核苷酸的各寡核苷酸分成3’側(cè)區(qū)域、中央?yún)^(qū)域、以及5’側(cè)區(qū)域這3個(gè)區(qū)域，使各寡核苷酸的中央?yún)^(qū)域成為相互互補(bǔ)的堿基序列，使3’側(cè)區(qū)域、以及5’側(cè)區(qū)域成為相互不互補(bǔ)的堿基序列。
10.如權(quán)利要求2所述的雜交方法，其中，所述多種寡核苷酸探針是，具有如下所述的結(jié)構(gòu)且自第1系至第k系形成的多對(duì)二聚體形成用探針，即自第1系至第k(k≥2)系順序形成多個(gè)含有一對(duì)二聚體形成用探針的系，(a)第(k-1)系的No.1-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域和第k系的No.2-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域、(b)第(k-1)系的No.1-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域和第k系的No.2-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域、(c)最后的系的No.1-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域和第1的系的No.2-寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)域、(d)最后的系的No.1-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域和第1的系的No.2-寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)域、成為相互互補(bǔ)的堿基序列的結(jié)構(gòu)，另外，其中的一對(duì)二聚體形成用探針是將No.1以及No.2的一對(duì)寡核苷酸的各寡核苷酸分成3’側(cè)區(qū)域、中央?yún)^(qū)域、以及5’側(cè)區(qū)域這3個(gè)區(qū)域，使各寡核苷酸的中央?yún)^(qū)域成為相互互補(bǔ)的堿基序列，使3’側(cè)區(qū)域、以及5’側(cè)區(qū)域成為相互不互補(bǔ)的堿基序列。
11.如權(quán)利要求1～10中任意一項(xiàng)所述的雜交方法，其中，所述寡核苷酸是由從DNA、RNA、PNA以及LNA中選擇的至少一種核苷酸構(gòu)成。
12.如權(quán)利要求1～11中任意一項(xiàng)所述的雜交方法，其中，所述寡核苷酸的至少一個(gè)標(biāo)記有標(biāo)記物質(zhì)。
13.如權(quán)利要求12所述的雜交方法，其中，所述標(biāo)記物質(zhì)是放射性同位素、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、顯色物質(zhì)、顯色系酶或者發(fā)光系酶。
14.一種信號(hào)擴(kuò)增方法，其中，使用具有能夠相互雜交的互補(bǔ)堿基序列區(qū)域的多種寡核苷酸探針使其進(jìn)行雜交，由此寡核苷酸發(fā)生自聚合，利用形成雙鏈的自聚合物的自聚合反應(yīng)，提高在用于檢測(cè)基因的反應(yīng)機(jī)械材料中的靶基因的檢測(cè)感度，其中該自聚合反應(yīng)是使用權(quán)利要求2～10中任意一項(xiàng)所述的雜交方法而進(jìn)行。
15.如權(quán)利要求14所述的信號(hào)擴(kuò)增方法，其中，所述反應(yīng)機(jī)械材料是微型板、DNA微陣列或者磁性體粒子。
16.如權(quán)利要求14或者15所述的信號(hào)擴(kuò)增方法，其中，所述靶基因是單鏈DNA和/或RNA。
17.如權(quán)利要求14或者15所述的信號(hào)擴(kuò)增方法，其中，所述靶基因是雙鏈DNA和/或RNA。
18.如權(quán)利要求14～17中任意一項(xiàng)所述的信號(hào)擴(kuò)增方法，其中，所述靶基因包括SNPs(單核苷酸多態(tài))。
19.如權(quán)利要求14～18中任意一項(xiàng)所述的信號(hào)擴(kuò)增方法，其中，在所述自聚合反應(yīng)中使用的寡核苷酸探針的至少一個(gè)具有與所述靶基因的一部分互補(bǔ)的序列
20.如權(quán)利要求14～19中任意一項(xiàng)所述的信號(hào)擴(kuò)增方法，其中，為了連接所述靶基因和所述自聚合物，使用具有與靶基因的堿基序列和所述寡核苷酸探針的堿基序列分別互補(bǔ)的區(qū)域的輔助探針。
21.如權(quán)利要求14～20中任意一項(xiàng)所述的信號(hào)擴(kuò)增方法，其中，所述寡核苷酸探針是由從DNA、RNA、PNA以及LNA中選擇的至少一種核苷酸構(gòu)成。
22.如權(quán)利要求14～21中任意一項(xiàng)所述的信號(hào)擴(kuò)增方法，其中，所述寡核苷酸探針的至少一個(gè)標(biāo)記有標(biāo)記物質(zhì)。
23.如權(quán)利要求22所述的信號(hào)擴(kuò)增方法，其中，所述標(biāo)記物質(zhì)是放射性同位素、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、顯色物質(zhì)、顯色系酶或者發(fā)光系酶。
24.如權(quán)利要求14～21中任意一項(xiàng)所述的信號(hào)擴(kuò)增方法，其中，對(duì)于在所述靶基因上結(jié)合的自聚合物，使標(biāo)記探針進(jìn)行雜交而檢測(cè)所述自聚合物的存在。
25.如權(quán)利要求24所述的信號(hào)擴(kuò)增方法，其中，所述標(biāo)記探針是用顯色系酶、發(fā)光系酶、或者放射性同位素標(biāo)記的標(biāo)記探針。
26.如權(quán)利要求14～21中任意一項(xiàng)所述的信號(hào)擴(kuò)增方法，其中，對(duì)于所述自聚合物，加入具有與核酸結(jié)合的型質(zhì)的熒光物質(zhì)，通過該熒光物質(zhì)的光化學(xué)變化檢測(cè)所述自聚合物的存在。
27.一種靶基因的檢測(cè)方法，其中，使用了權(quán)利要求14～26中任意一項(xiàng)所述的信號(hào)擴(kuò)增方法。
28.一種靶基因的檢測(cè)方法，其中，利用反應(yīng)溶液中的寡核苷酸的雜交反應(yīng)來檢測(cè)基因，該雜交反應(yīng)包括使用權(quán)利要求1～13中任意一項(xiàng)所述的雜交方法進(jìn)行的雜交反應(yīng)。
29.如權(quán)利要求28所述的靶基因的檢測(cè)方法，其中，用于檢測(cè)所述基因的反應(yīng)機(jī)械材料是微型板、DNA微陣列或者磁性體粒子。
30.如權(quán)利要求28或者29所述的靶基因的檢測(cè)方法，其中，在所述雜交反應(yīng)中使用的寡核苷酸的至少一個(gè)具有與所述靶基因的一部分互補(bǔ)的序列。
31.如權(quán)利要求28～30中任意一項(xiàng)所述的靶基因的檢測(cè)方法，其中，所述靶基因是單鏈DNA和/或RNA。
32.如權(quán)利要求28～30中任意一項(xiàng)所述的靶基因的檢測(cè)方法，其中，所述靶基因是雙鏈DNA和/或RNA。
33.如權(quán)利要求28～32中任意一項(xiàng)所述的靶基因的檢測(cè)方法，其中，所述靶基因包括SNPs(單核苷酸多態(tài))。
全文摘要
本發(fā)明提供可以進(jìn)行有效的雜交反應(yīng)的雜交方法、使用該雜交方法的高感度的靶基因的檢測(cè)方法、以及顯著提高靶基因的檢測(cè)感度的信號(hào)擴(kuò)增方法。該雜交方法是使用反應(yīng)溶液中的寡核苷酸的雜交方法，在反應(yīng)溶液中部分地形成反應(yīng)溫度區(qū)域，在該反應(yīng)溫度區(qū)域中進(jìn)行雜交反應(yīng)。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1942591SQ20058001169
公開日2007年4月4日 申請(qǐng)日期2005年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月28日
發(fā)明者波木井千雅子, 薄井貢 申請(qǐng)人:衛(wèi)材R&D管理有限公司