專利名稱：一種新藻酸鹽單克隆抗體及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的藻酸鹽單克隆抗體，以及分泌所述單克隆抗體的雜交瘤克隆，本發(fā)明還涉及所述單克隆抗體的制備方法，以及所述單克隆抗體的用途。
背景技術(shù)：
藻酸鹽是粘液型銅綠假單胞菌所分泌的重要致病因子之一，在細(xì)菌對(duì)生物醫(yī)學(xué)材料或機(jī)體腔道的粘附、生物被膜的形成以及抵抗機(jī)體免疫力等方面都起著重要作用。當(dāng)銅綠假單胞菌接觸到物體表面時(shí)，即觸發(fā)藻酸鹽的生物合成，促進(jìn)其粘附，使細(xì)菌聚集到達(dá)一定數(shù)量，形成菌落，最終導(dǎo)致生物被膜形成(Costerton J.W.Overview of microbial biofilms.J-Ind-Microbiol.1995 Sep；15(3)137-40)。細(xì)菌形成生物被膜而導(dǎo)致的生物被膜相關(guān)感染，是臨床頑固性感染的原因之一。銅綠假單胞菌是生物被膜相關(guān)感染常見致病菌，目前研究表明，銅綠假單胞菌分泌的蛋白多糖復(fù)合物--藻酸鹽，是其形成生物被膜以及致病的主要因素(CostertonJ.W.Overview of microbial biofilms.J-Ind-Microbiol.1995 Sep；15(3)137-40)。目前，藻酸鹽的檢測(cè)、測(cè)定方法，阻斷藻酸鹽的生物效應(yīng)手段等方面都存在困難。對(duì)銅綠假單胞菌生物被膜相關(guān)感染尚無(wú)確切的治療辦法，國(guó)外學(xué)者曾提出藻酸鹽單克隆抗體可能對(duì)細(xì)菌生物被膜有一定抑制作用(Mai GT，McCormack JG，Seow WK，et al.Inhibition ofadherence of mucoid Pseudomonas aeruginosa by alginase，specifcmonoclonal antibodies，and antibiotics.Infect Immun 1993Oct；61(10)4338-43)，但未見深入研究報(bào)道。
本發(fā)明人在研究細(xì)菌生物被膜過程中，探索出一種制備抗藻酸鹽單克隆抗體的新方法，并成功制備出新藻酸鹽單克隆抗體。
發(fā)明概述本發(fā)明一方面涉及新的藻酸鹽單克隆抗體，其由保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)的保藏號(hào)為CGMCCNo.0989和No.0990的雜交瘤細(xì)胞分泌。
本發(fā)明另一方面涉及保藏于CGMCC的保藏號(hào)為CGMCC No.0989和No.0990的雜交瘤細(xì)胞。
本發(fā)明再一方面涉及一種制備所述藻酸鹽單克隆抗體的方法。
本發(fā)明又一方面涉及所述單克隆抗體用于藻酸鹽的檢測(cè)、測(cè)定以及阻斷藻酸鹽的生物效應(yīng)的用途。
發(fā)明詳述已知藻酸鹽是一種多糖類化合物，其分子量較小，通常僅為(請(qǐng)結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)提供分子量范圍)，因此，藻酸鹽的抗原性較弱。
為了有效制備藻酸鹽抗體，本發(fā)明所述方法采用藻酸鹽與BSA的交聯(lián)復(fù)合物，并應(yīng)用完全佐劑加強(qiáng)免疫，使得BALB/C小鼠血清抗體可達(dá)1∶2000以上。同時(shí)，本發(fā)明所述方法還成功的克服了如下困難即與免疫原性較強(qiáng)的BSA交聯(lián)，造成所得融合骨髓瘤細(xì)胞分泌的抗體多為抗BSA抗體；且由于ELISA法篩選陽(yáng)性克隆過程中，封閉液中含有一定量BSA，往往會(huì)出現(xiàn)較高的假陽(yáng)性率。
具體的，本發(fā)明采用了三步法進(jìn)行篩選。
1)用免疫原包被板，ELISA反應(yīng)陽(yáng)性孔保留。
2)再將初篩得到的陽(yáng)性孔細(xì)胞株，用BSA包被的板進(jìn)行復(fù)篩，陰性孔保留。
3)最后，復(fù)篩合格的孔再用競(jìng)爭(zhēng)抑制反應(yīng)來(lái)確認(rèn)，能夠產(chǎn)生明顯抑制作用的孔為分泌藻酸鹽抗體的陽(yáng)性細(xì)胞。
最終篩選出兩株強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞株，分別分泌IgG和IgM。經(jīng)檢測(cè)其細(xì)胞培養(yǎng)液抗體效價(jià)可達(dá)l∶10000，且傳代穩(wěn)定。其中測(cè)定了IgG的親和力為1.8×107mol/L，親和力不算太高，但考慮到藻酸鹽的弱抗原性，其親和力仍可算滿意。
應(yīng)用本方法建立了穩(wěn)定分泌高效價(jià)抗藻酸鹽抗體的單克隆細(xì)胞株，并建立了制備和鑒定藻酸鹽單克隆抗體的方法，為進(jìn)一步研究藻酸鹽單克隆抗體對(duì)BF的影響提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。
本發(fā)明又一方面涉及所述單克隆抗體用于藻酸鹽的檢測(cè)、測(cè)定以及阻斷藻酸鹽的生物效應(yīng)的用途。具體地，本發(fā)明所述方法制備的單克隆抗體能夠用于抑制細(xì)菌生物被膜的形成，尤其是抑制銅綠假單胞菌的生物被膜形成。
實(shí)施例材料與方法1.1動(dòng)物與細(xì)胞株BALB/C小鼠，雄性，六周齡，18～20g，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供。小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)研究所細(xì)胞生物室常規(guī)傳代。
1.2主要試劑藻酸鹽(Sigma)、50％PEG溶液(Sigma)、HAT培養(yǎng)液(Gibco)、DMEM培養(yǎng)基(Sigma)、甲基纖維素半固體培養(yǎng)基(自制，內(nèi)含IMDM、1.25％甲基纖維素、25％胎牛血清、HAT、谷氨酰胺、雙抗)。
實(shí)施例1免疫原的制備藻酸鹽與BSA交聯(lián)精密稱取藻酸鹽5.0mg溶于pH10的硼酸緩沖液0.05M 50ml中，在磁力攪拌器下加入EDCI100mg室溫反應(yīng)8小時(shí)，然后加入pH10的硼酸緩沖液0.05M 5.0ml溶解BSA，室溫反應(yīng)8小時(shí)后4℃透析過夜。EDCI應(yīng)新鮮配制。
實(shí)施例2動(dòng)物免疫將如實(shí)施例1所制備的免疫原即藻酸鹽-BSA復(fù)合物溶于生理鹽水，與佛氏完全佐劑等體積混合，對(duì)BALB/C小鼠(雄性，六周齡，18～20g，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供)腹部皮下多點(diǎn)注射，40μg/200μl/只?；A(chǔ)免疫兩周后進(jìn)行第一次加強(qiáng)免疫，隨后每2-4周進(jìn)行1次，劑量為20μg/200μl/只。
經(jīng)過了初次免疫和6次追加免疫后1天，以間接ELISA法測(cè)定了待取脾融合小鼠的抗血清效價(jià)。以正常鼠血清為陰性對(duì)照，以(測(cè)定孔A值-空白值)/(陰性對(duì)照孔A值-空白值)≥2.1為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行測(cè)定。
用于融合小鼠抗血清終點(diǎn)效價(jià)為1∶2000。細(xì)胞融合前3天，經(jīng)尾靜脈注射免疫原20～25μg進(jìn)行沖擊免疫。
實(shí)施例3細(xì)胞融合細(xì)胞融合采用聚乙二醇法無(wú)菌操作取如實(shí)施例2所述免疫的小鼠脾臟，制成細(xì)胞懸液，離心，細(xì)胞計(jì)數(shù)，將脾細(xì)胞(約1×108)與SP2/0細(xì)胞(約1×107)混合，1000r/min離心10min，去上清。將離心管置于37℃水浴中，緩慢加入50％PEG溶液(Sigma)1ml，靜置1分鐘，再緩慢加入無(wú)血清培養(yǎng)液IMDM 9ml.800r/min離心10min，棄上清，洗滌2次后，加完全培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，以備接種。
實(shí)施例4融合細(xì)胞的篩選及克隆化培養(yǎng)采用甲基纖維素半固體培養(yǎng)基接種融合后的細(xì)胞，使選擇性培養(yǎng)與克隆化培養(yǎng)合為一步完成。
培養(yǎng)基所含成分IMDM(GIBEO)、1.25％甲基纖維素(Sigma)、25％胎牛血清(GIBCo)、HAT(Sigma)、谷氨酰胺、雙抗。接種后置37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)7天，第八天在解剖鏡下挑取克隆，將克隆轉(zhuǎn)移至96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。
陽(yáng)性細(xì)胞的篩選及克隆化培養(yǎng)采用ELISA方法，分三步進(jìn)行先用免疫原包被板，ELISA反應(yīng)陽(yáng)性孔保留。再將初篩得到的陽(yáng)性孔細(xì)胞株，用BSA包被的板進(jìn)行復(fù)篩，陰性孔保留。最后，復(fù)篩合格的孔再用競(jìng)爭(zhēng)抑制反應(yīng)來(lái)確認(rèn)，能夠產(chǎn)生明顯抑制作用的孔為分泌藻酸鹽抗體的陽(yáng)性細(xì)胞。采用甲基纖維素半固體培養(yǎng)基法進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，再克隆兩次。
具體的，用小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合后，在甲基纖維素半固體培養(yǎng)基中篩選融合細(xì)胞，其中陽(yáng)性克隆率為2.4％(23/960)，選擇陽(yáng)性較強(qiáng)的細(xì)胞孔內(nèi)的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆，經(jīng)3-5次亞克隆，建立了穩(wěn)定分泌的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別為CD3011和CD3014。本發(fā)明人于2003年8月11日將所述雜交瘤細(xì)胞株保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC，北京，中關(guān)村)，其保藏號(hào)分別為CGMCC No.0989和No.0990實(shí)施例5細(xì)胞株及抗體的鑒定參照沈關(guān)心，周汝麟主編?，F(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)。第一版。湖北科學(xué)技術(shù)出版社。1998，30-45中所述方法，進(jìn)行如下鑒定抗體類型及亞類分類采用免疫雙擴(kuò)散的方法，取細(xì)胞的培養(yǎng)上清，加硫酸銨沉淀抗體，離心去上清，用磷酸緩沖液溶解沉淀，在梅花孔中加樣，每孔10ul濕過夜。經(jīng)瓊脂糖雙向擴(kuò)散試驗(yàn)測(cè)定，細(xì)胞株3011分泌IgM，細(xì)胞株3014分泌IgG。
相對(duì)親和力測(cè)定采用稀釋抗體法對(duì)親和力進(jìn)行測(cè)定。將細(xì)胞株接種至BALB/C小鼠，按常規(guī)方法腹腔接種。收集腹水后，以正辛酸法提純抗體，測(cè)定純化后抗體的濃度，然后將抗體做系列稀釋，再用ELISA方法檢測(cè)。應(yīng)用ELISA測(cè)定抗體親和力結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞株3014分泌所分泌的IgG對(duì)藻酸鹽的親和力是1.8×107mol/L。傳代穩(wěn)定性測(cè)定體外連續(xù)培養(yǎng)1個(gè)月，約10-15代，檢測(cè)上清中抗體是否能夠保持同樣水平。
細(xì)胞株培養(yǎng)10代后，應(yīng)用ELISA法測(cè)定培養(yǎng)上清對(duì)，免疫原、藻酸鹽以及BSA抗體滴度，與第3代細(xì)胞相比均無(wú)明顯差異，其中對(duì)藻酸鹽的抗體滴度約為1∶10000。(見表1)表1藻酸鹽單克隆抗體分泌細(xì)胞株穩(wěn)定性
實(shí)施例6藻酸鹽單克隆抗體的制備取8周齡雌性BALB/C小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5ml石蠟油，一周后接種如實(shí)施例4中所述雜交瘤細(xì)胞3014株106/只，7-10天后收集腹水，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，收集上清液，以辛酸提取法(請(qǐng)?zhí)峁﹨⒖嘉墨I(xiàn))分離制備本發(fā)明的藻酸鹽單克隆抗體。
本實(shí)施例中從小鼠腹腔誘生腹水的步驟亦可該用體外細(xì)胞培養(yǎng)，具體方法是將克隆株細(xì)胞以含15％小牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)，收集培養(yǎng)上清液，以辛酸提取法分離制備本發(fā)明的藻酸鹽單克隆抗體。
權(quán)利要求
1.藻酸鹽單克隆抗體，其由保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏號(hào)為No.0990的雜交瘤細(xì)胞分泌。
2.一種制備權(quán)利要求1所述藻酸鹽單克隆抗體的方法，其中包括將藻酸鹽與小牛血清白蛋白交連，免疫BALB/C小鼠，取該小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，以選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，經(jīng)稀釋進(jìn)行克隆化，選擇陽(yáng)性克隆株，并大量擴(kuò)增，注入同系小鼠腹腔誘生腹水或體外細(xì)胞培養(yǎng)，分離獲得藻酸鹽單克隆抗體。
3如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征是所述的藻酸鹽與小牛血清白蛋白交連是將藻酸鹽溶于pH10的硼酸緩沖液中，加入EDCI室溫反應(yīng)，然后加入BSA，透析過夜所得。
4.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征是所述的免疫小鼠是將藻酸鹽與小牛血清白蛋白交連物溶于生理鹽水，與弗氏完全佐劑等體積混合，對(duì)小鼠腹部皮下多點(diǎn)注射。
5.一種保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏號(hào)為CGMCC No.0990的雜交瘤細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的藻酸鹽單克隆抗體，以及分泌所述單克隆抗體的雜交瘤克隆，本發(fā)明還涉及所述單克隆抗體的制備方法，以及所述單克隆抗體的用途。
文檔編號(hào)C12N5/16GK1763094SQ20051009950
公開日2006年4月26日 申請(qǐng)日期2003年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月23日
發(fā)明者王睿, 裴斐, 柴棟, 方翼, 陳遷, 方向群 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院