專(zhuān)利名稱(chēng)：由藻酸鹽制備糖醛酸嵌段的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型的由藻酸鹽(主要是G嵌段藻酸鹽和/或M嵌段藻酸鹽)制備嵌段部分的方法。
背景技術(shù)：
藻酸鹽是由海生褐色藻類(lèi)分離得到的。藻酸鹽還產(chǎn)生于土壤細(xì)菌(如棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)和Azotobacter crococcum)以及多種不同的假單胞菌屬細(xì)菌。然而，市售的藻酸鹽通常是由褐色藻類(lèi)得到的。
藻酸鹽用于食物和藥用、牙科用、美容用和其它工業(yè)產(chǎn)品。最普通的工業(yè)用途是基于它們的水解膠體和聚電解質(zhì)的性能，這成為提供形成凝膠、增稠、穩(wěn)定、溶脹和粘度這些性能的基礎(chǔ)。
藻酸鹽是藻酸的鹽類(lèi)，一種線形雜多糖，由(1→4)連接的β-D-甘露糖醛酸(記作M)和α-L-古洛糖醛酸(guluronic acid)(記作G)組成。這兩個(gè)糖醛酸具有以下化學(xué)式
聚合物以如下幾種方式存在甘露糖醛酸的均聚物序列(稱(chēng)為M嵌段)、古洛糖醛酸的均聚物序列(稱(chēng)為G嵌段)、甘露糖醛酸和古洛糖醛酸單元的混合序列(稱(chēng)為MG嵌段或交替嵌段)。
為了說(shuō)明藻酸鹽的結(jié)構(gòu)，以下是一種可以想到的嵌段結(jié)構(gòu)的示意圖GMMMMMMMGGGGGGMGMGMGMGMGGGGGGGGGMM嵌段G嵌段MG嵌段G嵌段通常，藻酸鹽含有所有的這三種嵌段，一個(gè)嵌段基本上由3-30個(gè)單體單元組成。這些嵌段的分布情況取決于分離出藻酸鹽的藻類(lèi)的類(lèi)型、該植物的年齡和部分，例如由莖桿得到的藻酸鹽與由葉得到的藻酸鹽具有不同的序列和嵌段組成。藻類(lèi)收獲那年的時(shí)間也會(huì)影響嵌段的組成和序列。根據(jù)我們目前所有的知識(shí)，在老L.hyperborea的莖桿中可發(fā)現(xiàn)最高的G含量。同一種類(lèi)植物的葉具有較低的G含量和較短的G嵌段，但是該含量仍然比大多數(shù)其它種類(lèi)的植物高。市售藻酸鹽的G含量通常為25％-70％。
具有高含量M嵌段的來(lái)源例如是褐色藻屬叢梗藻(Durvillea)、巨藻(Lessonia)和泡葉藻(Ascophyllum)這些種類(lèi)。
已有技術(shù)藻酸鹽嵌段部分、G嵌段、M嵌段和MG嵌段的制備描述于以下出版物中[A.Haug和O.Smidsrod(1966)的“通過(guò)部分水解研究藻酸的組成”Acta Chem.Scand.20，183-190]和[A.Haug，B.Larsen和O.Smidsrod(1967)“藻酸中糖醛酸殘基序列的研究”Acta Chem.Scand.21，691-704]。
這兩篇文章中描述的方法包括以下步驟a)將藻酸在100℃水解3-5小時(shí)，得到被分成古洛糖醛酸嵌段(G嵌段)、甘露糖醛酸嵌段(M嵌段)和交替嵌段(MG嵌段)的藻酸鹽。MG嵌段溶解。在水解10-30分鐘后中斷水解，能獲得最佳長(zhǎng)度的MG嵌段。
b)過(guò)濾，然后從未溶解的G和M嵌段中除去溶解的MG嵌段；c)用堿液將pH值調(diào)節(jié)至pH7，由此包含藻酸鹽G嵌段和M嵌段部分的未溶解部分溶解；d)用酸將pH值調(diào)節(jié)至pH2.4-2.8，沉淀出G嵌段部分；e)過(guò)濾；M嵌段仍然溶解；f)用酸將pH值調(diào)節(jié)至pH1.3或更低，以沉淀出M嵌段部分。
US專(zhuān)利5,503,771說(shuō)明了一種凝膠懸浮液，它含有膠體金屬或陶瓷顆粒、水和有效量的生物聚合物分散劑和摩爾重量最小為50,000克/摩爾、可以由非膠凝狀態(tài)轉(zhuǎn)化為膠凝狀態(tài)的生物聚合物膠凝劑。生物聚合物分散劑可以選自藻酸鹽的富含多甘露糖醛酸的水解產(chǎn)物、藻酸鹽的富含多古洛糖醛酸的水解產(chǎn)物、許多具有形成凝膠性能的其它多糖類(lèi)和這些多糖類(lèi)的混合物。藻酸鹽的富含多甘露糖醛酸的水解產(chǎn)物(對(duì)應(yīng)于M嵌段藻酸鹽)或者藻酸鹽的富含多古洛糖醛酸的水解產(chǎn)物(即G嵌段藻酸鹽)的制備方法與兩篇上述文章中所述相同。
工業(yè)應(yīng)用近年來(lái)，發(fā)現(xiàn)多種多糖醛酸部分(尤其是藻酸鹽的G嵌段和M嵌段部分)的數(shù)種新穎的用途。
G嵌段部分可以用作膠凝藻酸鹽體系的流變性能調(diào)節(jié)劑。這一發(fā)明描述于申請(qǐng)日為1996年7月12日的挪威專(zhuān)利申請(qǐng)962936。
此外，G嵌段和M嵌段的用途如上述US專(zhuān)利中所述生物聚合物分散劑(它可以是藻酸鹽的G嵌段或M嵌段部分)能夠?qū)⒛z體顆粒分散在水中，由此形成非團(tuán)聚的懸浮液，該懸浮液具有易流動(dòng)的低粘度以使得最終懸浮液能夠在開(kāi)始膠凝之前轉(zhuǎn)移至模具中，然后對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行熱解和燒結(jié)。
主要目的是得到分散的產(chǎn)物，其中形成凝膠，確保分散的顆粒保持在適當(dāng)?shù)奈恢谩?br> G嵌段的其它用途例如是作為低粘性的絮凝劑，它可用來(lái)除去毒性金屬離子(如鉛、鍶和鋇)。
可以獲得富含M嵌段的藻酸鹽，被稱(chēng)為多M藻酸鹽，它顯示對(duì)于一定的細(xì)胞在免疫防御機(jī)理方面有激發(fā)效應(yīng)，從而能夠防止例如侵染和輻射損傷。因此，這類(lèi)M嵌段藻酸鹽用來(lái)與藥用產(chǎn)品的制備相結(jié)合。這一發(fā)明描述于EP-B2-506326/US5,169,840中?？梢韵氲?，本發(fā)明制得的M嵌段可以通過(guò)常規(guī)有機(jī)化學(xué)方法或生物技術(shù)方法被聚合。
有理由相信這些不同的糖醛酸嵌段具有與制造新產(chǎn)品有關(guān)的有價(jià)值的性能，尤其是在藥物領(lǐng)域。
本發(fā)明所解決問(wèn)題的說(shuō)明然而，已知方法具有缺點(diǎn)，這使得它不適合用于工業(yè)制造大量的不同糖醛酸嵌段。
問(wèn)題在于當(dāng)G嵌段和M嵌段部分都需溶解時(shí)的大體積，這是步驟(c)中的操作所必需的。這通過(guò)將pH值從低調(diào)節(jié)至中性來(lái)實(shí)現(xiàn)。為了避免溶液的粘度太高并由此產(chǎn)生在步驟(d)中G嵌段部分沉淀不足，使用0.25％-1％濃度的藻酸鹽。結(jié)果，體積增量幾乎是初始藻酸體積的100-400倍。
在步驟(d)從溶液中沉淀出G嵌段的過(guò)程中，必需用“稀”酸進(jìn)行操作，以避免M嵌段也沉淀出來(lái)。這使得由稀釋造成體積進(jìn)一步增加。這一大體積的水溶液必須在隨后的剩余步驟中得以保持，這使得這一過(guò)程的實(shí)踐繁瑣，不能在工業(yè)水平上進(jìn)行實(shí)施。
發(fā)明的說(shuō)明現(xiàn)在令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明可以用一種解決以上問(wèn)題的方法制備藻酸鹽的嵌段部分，尤其是G嵌段和/或M嵌段部分。作為這一過(guò)程中的一個(gè)步騾，MG嵌段部分也可以分離并加以優(yōu)化，如前所述。
本發(fā)明的由藻酸鹽制備糖醛酸部分的方法包括以下步驟a)將藻酸用酸水解形成G嵌段、M嵌段和MG嵌段的部分，由此含有MG嵌段的部分溶解，含有G嵌段和M嵌段的部分保持不溶解；和b)將不溶解的部分懸浮在水中，用堿液調(diào)節(jié)pH值至pH2.8-4.0，最好的是pH值為3.0-3.5，由此含有M嵌段的部分溶解，而含有G嵌段的部分保持不溶解。
較好的是在該過(guò)程中實(shí)施一個(gè)或多個(gè)以下的附加步驟(i)在步驟a)和/或步驟b)后通過(guò)過(guò)濾、離心或其它合適的方法將不溶解部分與溶解部分分離；(ii)在步驟b)之后分離酸形式或鹽形式的G嵌段部分；(iii)分離含有M嵌段的部分(i)通過(guò)用酸將pH值調(diào)節(jié)至pH1.4-0.5以沉淀出M嵌段部分或(ii)通過(guò)使用薄膜技術(shù)，然后是除去水和干燥M嵌段部分的步驟或(iii)用醇沉淀出M嵌段部分(iv)在步驟b)中將pH值調(diào)節(jié)至3.5-4.0，得到具有高純度的G嵌段部分；(v)在步驟b)中將pH值調(diào)節(jié)至2.8-3.0，以高產(chǎn)率得到G嵌段部分；(vi)在步驟b)中將pH值調(diào)節(jié)至3.0-3.5，尤其是pH值為3.3，以較高產(chǎn)率得到具有較高純度的G嵌段部分；(vii)在步驟i)中將pH值調(diào)節(jié)至1.3，以沉淀出M嵌段部分；(viii)使用高M(jìn)含量的藻酸制得具有高純度的M嵌段和/或以高產(chǎn)率制得M嵌段；(ix)使用高G含量的藻酸制得具有高純度的G嵌段和/或以高產(chǎn)率制得G嵌段；(x)在步驟a)中于40-100℃用0.05-5M的酸水解藻酸；(xi)在步驟a)中在水解10-30分鐘后中斷水解以分離MG嵌段，在除去這些嵌段之后，繼續(xù)水解直至M嵌段部分大部分溶解；
通常，本發(fā)明的方法可以通過(guò)實(shí)施以下步驟進(jìn)行a)于40-100℃用濃度在0.05-5M范圍內(nèi)的酸水解藻酸，以使得含有MG嵌段的部分溶解；b)通過(guò)過(guò)濾、離心或另一種合適的方法將含有溶解的MG嵌段的部分與含有G嵌段和M嵌段的不溶解部分分離；c)將不溶解部分懸浮在水中，用堿液調(diào)節(jié)pH值至pH2.8-4.0，最好為pH3.0-3.5，由此含有M嵌段的部分溶解；d)通過(guò)過(guò)濾、離心或另一種合適的方法將含有G嵌段的不溶解部分與含有M嵌段的溶解部分分離；以及可以有e)以純凈形式制備含有M嵌段的部分(i)將pH值用酸調(diào)節(jié)至pH1.4-0.5，以沉淀出M嵌段部分或(ii)通過(guò)使用薄膜技術(shù)，然后是除去水和干燥M嵌段部分的步驟或(iii)用醇沉淀出M嵌段部分。
當(dāng)沉淀出M嵌段部分以后，可以通過(guò)過(guò)濾、離心、洗滌和干燥或類(lèi)似方法在隨后的步驟中將該M嵌段部分與剩余的酸部分或醇部分分離，這是專(zhuān)門(mén)技術(shù)人員熟悉的。可用于步驟e)(ii)的膜技術(shù)可以例如是滲析或其它膜過(guò)濾技術(shù)。用來(lái)去除水和干燥M嵌段部分的步驟可以例如是冷凍干燥或噴霧干燥。在步驟e)(iii)中，可以使用任何能被有效去除的醇，如異丙醇。
已有技術(shù)的方法代表了M嵌段和G嵌段的分級(jí)沉淀法，而另一方面本發(fā)明的方法則代表了分級(jí)分離法(fractionated release)。這就得到了本發(fā)明方法的一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)，就是所需的體積降低至一個(gè)小部分，因此該方法可以在工業(yè)級(jí)上實(shí)施。而且，另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是顯著地降低了調(diào)節(jié)pH值的化學(xué)試劑的消耗，從而大大地降低了成本。
圖2示出了兩種方法的示意圖。
可見(jiàn)，本發(fā)明方法與已有技術(shù)方法的主要不同之處在于在除去含有交替MG嵌段的溶解部分之后，包含M嵌段和G嵌段的整個(gè)未溶解部分是不溶解的。代之以完全中和，選擇在2.8-4.0范圍內(nèi)的pH值，這樣能有選擇地分離M嵌段部分，而G嵌段部分保持不溶解。因此，于此有關(guān)的步驟所需要的體積基于以下原因會(huì)減少只有含M嵌段的部分要被溶解因而待溶解的固體減少。而且，溶解部分只含有一種嵌段(即M嵌段)而不是一種混合物，這就不必在高度稀釋的溶液中進(jìn)行操作。
如前所述，根據(jù)已有技術(shù)在步驟c)中使用了0.25-1％的藻酸鹽溶液，這意味著體積的增量在100-400倍的范圍內(nèi)。然而，根據(jù)本發(fā)明該步驟中體積的增量為10-20倍。必需的含水溶液體積從100-400倍降低至10-20倍。這意味著與老方法相比，新方法在整個(gè)步驟中所用的體積最多為老方法所用體積的1/10。
工作體積大大減少是本發(fā)明的一個(gè)明顯的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)槿缜八?，它使得本發(fā)明的方法在工業(yè)上可行。
本發(fā)明方法與已有技術(shù)相比的另一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是顯著降低了化學(xué)試劑的消耗，因此大大降低了成本。這是因?yàn)楦鶕?jù)已有技術(shù)的方法所需的堿液用量是將pH值從強(qiáng)酸(pH1)調(diào)節(jié)至中性(pH7)溶液，而根據(jù)本發(fā)明的方法pH值調(diào)節(jié)是從強(qiáng)酸(pH1)調(diào)節(jié)至pH3.5(即只是對(duì)藻酸鹽嵌段的羧酸基團(tuán)進(jìn)行“一半”中和)，這樣堿液的所需用量就減半了。
因此，使用本發(fā)明方法沉淀出M嵌段部分的酸用量降低至已有技術(shù)所需酸用量的10％。如果使用其它技術(shù)制備純凈的M嵌段，那么可以完全不用酸。
表3示出了本發(fā)明方法相對(duì)于已知方法的化學(xué)試劑的相對(duì)體積和消耗量概況。
令人非常驚奇的是，可以進(jìn)行有選擇性的M嵌段和G嵌段的分級(jí)分離而仍能得到高純度的G嵌段部分，不必進(jìn)行對(duì)該部分進(jìn)行單獨(dú)溶解和沉淀。
實(shí)際上，使用本發(fā)明方法能夠以99％的純度分離出G嵌段部分。當(dāng)然純度和產(chǎn)率之間存在相互關(guān)系，這可以通過(guò)步驟c)中pH調(diào)節(jié)來(lái)得到。
參見(jiàn)表1，表1示出1)沉淀物中古洛糖醛酸(guluronate)的含量(FG沉淀物)，2)懸浮液中古洛糖醛酸的含量(FG溶解)，3)G嵌段的產(chǎn)率(產(chǎn)率％)，以水解后沉淀物的％計(jì)算取決于步驟c)中經(jīng)調(diào)節(jié)的pH值。在水解步驟中，損失了約50％的稱(chēng)量的藻酸鹽。計(jì)算得到的產(chǎn)率是步驟a)中過(guò)濾后分離出的沉淀物為基礎(chǔ)的。
為了得到高純度(FG沉淀物＝0.99)，步驟c)中的pH值必須調(diào)節(jié)至4.0-4.1。然而，此處的產(chǎn)率也大大地降低(24.4％)。
如果對(duì)于最終產(chǎn)物具有高純度并不同樣是決定性的話，可以通過(guò)在步驟c)中將pH值調(diào)節(jié)至2.8來(lái)實(shí)現(xiàn)超過(guò)90％的產(chǎn)率。
通常最好選擇一個(gè)對(duì)純度和產(chǎn)率都是折衷的值，如pH3.3，在該pH值時(shí)可以約80％的產(chǎn)率制得純度超過(guò)90％的產(chǎn)物。
可用于本發(fā)明方法的酸可以是任何不具有氧化性能的酸，如強(qiáng)酸(如鹽酸和硫酸)或弱酸(如草酸和乙酸)。水解步驟可以用專(zhuān)門(mén)技術(shù)人員通常所用的方式進(jìn)行。選用的酸濃度通常在0.05-5M的范圍內(nèi)，更好是0.1-1M，合適的例子是0.3M的鹽酸。
通常最好的是使用NaOH作為堿液，但是也可以使用對(duì)該方法中以前步驟所用的酸具有中和作用從而能夠進(jìn)行上述pH值調(diào)節(jié)的任何其它化合物。合適的濃度范圍是1-10M NaOH。
膜技術(shù)方法例如可以包括滲析或其它的膜過(guò)濾方法。此處重要的方面是，降低溶液中鹽的高含量。所需的去除水和隨后干燥產(chǎn)物的方法例如是用冷凍干燥或噴霧干燥法，可能與干燥之前用醇進(jìn)行沉淀和洗滌連用。
在本文的上下文中，“藻酸鹽的G嵌段部分”或“藻酸鹽的M嵌段部分”一詞分別意指包括具有高含量的古洛糖醛酸和甘露糖醛酸的低分子的藻酸鹽或藻酸。任何在嵌段中含有至少兩個(gè)G單元的多糖類(lèi)或多糖類(lèi)片斷屬于本發(fā)明“G嵌段部分”的表述范圍，給M嵌段部分的含義與此相同。然而，較好的是制得平均摩爾重量為1000-100,000g/mol的多糖類(lèi)部分。對(duì)于“G嵌段部分”，更好的是制得摩爾重量在1000-50,000g/mol的范圍內(nèi)，最好的是摩爾重量在2000-40,000g/mol的范圍內(nèi)。
“片斷”一詞意指包括整個(gè)藻酸鹽鏈的小的部分，尤其是那些具有主要由古洛糖醛酸單體(所謂的G嵌段)或甘露糖醛酸單體(所謂的M嵌段)或交替的古洛糖醛酸和甘露糖醛酸(所謂的MG嵌段)組成的共同特征的部分。
作為本發(fā)明方法的原料，可以使用任何含有藻酸的材料，如藻類(lèi)，或是其葉、莖桿或纏系器官。因此，在本發(fā)明的方法中不必在使用藻酸之前分離藻酸。
還可以使用任何藻酸鹽作為本方法的原料，從而第一步a)將是轉(zhuǎn)變成藻酸的過(guò)程而無(wú)需對(duì)其進(jìn)行分離。然而，在一定的情況下最好分離藻酸然后再進(jìn)行隨后的加工步驟。在大多數(shù)情況下，最簡(jiǎn)單的方法是使用市售的藻酸鹽/藻酸作為本發(fā)明的原料。
在本發(fā)明的說(shuō)明書(shū)和所附的權(quán)利要求書(shū)中，“藻酸”一詞用來(lái)描述所有含有藻酸或藻酸鹽的原料，如藻類(lèi)或者純度或高或低的藻酸和藻酸鹽。
根據(jù)所需的用途，選擇具有高或低的G嵌段含量或M嵌段含量或可能的MG含量的藻酸以得到最大產(chǎn)率的最終產(chǎn)物，不管是G嵌段部分、M嵌段部分還是MG部分。
在所附的權(quán)利要求書(shū)中以另外形式進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明加以說(shuō)明。
實(shí)施例材料以下通過(guò)實(shí)施例和附圖及表格對(duì)本發(fā)明作更詳細(xì)的說(shuō)明并給出實(shí)施例。
在附圖和表格中使用以下縮寫(xiě)″產(chǎn)率％″它是以步驟b)(酸水解)后未溶解部分為基礎(chǔ)計(jì)算的。在這一酸水解步驟中損失約50％的稱(chēng)量的藻酸/藻酸鹽?！錐G″它代表在經(jīng)分離的材料中古洛糖醛酸單元的分?jǐn)?shù)，是得到的G的純度的量度。當(dāng)FG＝1時(shí)，該部分具有100％的G嵌段。FM將是1-FG。
該值是基于經(jīng)分離的部分的NMR光譜測(cè)得的?！錐M″它代表在經(jīng)分離的材料中甘露糖醛酸單元的分?jǐn)?shù)，是得到的M的純度的量度。當(dāng)FM＝1時(shí)，該部分具有100％的M嵌段。FG將是1-FM。
該值是基于經(jīng)分離的部分的NMR光譜測(cè)得的?！錎Pn″ 平均的聚合程度，即是每個(gè)嵌段平均含有多少個(gè)單體的量度。
實(shí)施例l根據(jù)本發(fā)明制備G嵌段選擇Pronova Biopolymer a.s in Drammen，Norway出售的ProtanalTMLFR 5/60的一種高G含量的藻酸鹽(65％G單元)作為原料用于制備。該方法按如下所列進(jìn)行1.將100ml 0.3M HCl加入1.0g藻酸鹽中并攪拌過(guò)夜。
2.潷析去酸，加入新的50ml 0.3M HCl。
3.在水浴(100℃)中水解5小時(shí)。
4.潷析去酸，用50ml不含離子的水洗滌沉淀物。潷析去水并加入新的水(50ml)。
5.隨后用NaOH調(diào)節(jié)懸浮液至不同的最終pH值(3.8-5.3)。
6.將懸浮液置于攪拌機(jī)上過(guò)夜，然后進(jìn)行離心。
7.向沉淀物中加入新的水并將pH值調(diào)節(jié)至6.5-7.0。
8.對(duì)上層清液(6.)和沉淀物(7.)中的藻酸鹽進(jìn)行量(FS)和化學(xué)組成(NMR)的分析。
用于確定碳水化合物總量的FS分析方法的說(shuō)明可見(jiàn)于[M.Dubois等的分析化學(xué)，卷28，No.3，第350-356頁(yè)(1956年3月)]。
表1在水解、洗滌和調(diào)節(jié)pH值之后沉淀物和懸浮液中古洛糖醛酸的含量。該表還示出了在水解后、調(diào)節(jié)pH值之前分離出的沉淀物中的“G嵌段”的產(chǎn)率百分?jǐn)?shù)，I＝不溶的；S＝可溶的。<t
n.d.是指“未測(cè)定”。
可見(jiàn)，得到的產(chǎn)率和純度是與pH值有關(guān)的。
當(dāng)pH值為4.07時(shí)得到最大純度，F(xiàn)G(沉淀物)為0.99。但另一方面產(chǎn)率低，僅為24.4％。
在步驟c)中通過(guò)將pH值調(diào)節(jié)至2.85能得到最大的產(chǎn)率，但是純度并不相應(yīng)地高，F(xiàn)G(沉淀物)為0.81。
其原因是隨著pH值的增加，大部分G嵌段部分會(huì)與M嵌段部分一起溶解。這也表現(xiàn)于欄FG(溶液)中，其中當(dāng)pH值在2.85-4.38范圍內(nèi)上升時(shí)該數(shù)據(jù)也上升。


圖1示出了沉淀物(即在步驟c)調(diào)節(jié)pH值之后步騾d)的不溶部分)的FG與pH值的相關(guān)性。此外，還示出了步驟d)中分離出的G嵌段的產(chǎn)率與pH值的相關(guān)性?？梢钥闯?，當(dāng)pH值超過(guò)4時(shí)不溶解部分全部消失。
同時(shí)，溶液的FG值表明，在pH值為3.5之后，G嵌段加快溶解。
實(shí)施例2根據(jù)已有技術(shù)(Smidsrod，Haug等)制備G嵌段和M嵌段部分選擇與實(shí)施例1相同的藻酸鹽(即高G含量的藻酸鹽LFR 5/60)作為制備G嵌段的原料。M嵌段也由該原料制得。
選擇得自巨藻(Macrocystis pyrifera)的藻酸鹽，由The NutraSweet KelcoCompany出售的高M(jìn)含量的藻酸鹽(60％M單元)制備M嵌段。G嵌段也是由該原料制得的。
基于本說(shuō)明書(shū)上文提及的Smidsrod和Haug的出版物，進(jìn)行如下制備1.將5.0g藻酸鹽分散在500ml 0.3M HCl中，并置于100℃的水浴上5小時(shí)。
2.冷卻并離心。除去酸水解產(chǎn)物(即離心后的上層清液)。
3.用5M NaOH將離心后含有G嵌段和M嵌段部分的沉淀物中和至pH7，這兩種部分均溶解。
4.通過(guò)稀釋將溶液中的藻酸鹽濃度調(diào)節(jié)至1％。
5.通過(guò)HCl滴定將pH值降低至2.4。所用的酸強(qiáng)度是在pH值為2.4時(shí)得到藻酸鹽濃度在0.25-0.5％的范圍內(nèi)。本文指定Smidsrod和Haug的出版物為參考文獻(xiàn)，以上所述的這一點(diǎn)在該文獻(xiàn)中有說(shuō)明。進(jìn)行離心。用5MNaOH對(duì)含有G嵌段的沉淀物進(jìn)行中和，滲析并進(jìn)行冷凍干燥。
6.用1M HCl將步驟5.中上層清液的pH值降低至1.3。進(jìn)行離心。用5MNaOH對(duì)含有M嵌段部分的沉淀物進(jìn)行中和，滲析并進(jìn)行冷凍干燥。
結(jié)果列于表2中，它示出了產(chǎn)率(％)和分離出的部分的FG和FM。此外，還示出了平均的聚合程度DPn。
如這些數(shù)據(jù)所示，可以用該發(fā)明方法由不同性質(zhì)的藻酸鹽制備G嵌段和M嵌段部分，而即使是使用濃縮10倍多的溶液，結(jié)果是產(chǎn)率或純度低得不可接受。除了這一點(diǎn)，還有一個(gè)顯著的不同點(diǎn)，就是只有本發(fā)明的新方法才是工業(yè)上可行的。即使當(dāng)濃度為10％時(shí)，可以工業(yè)化實(shí)現(xiàn)各個(gè)部分的純度和產(chǎn)率。同時(shí)，這樣就可以對(duì)10倍多用量的藻酸鹽部分(水解后)進(jìn)行操作，這在實(shí)踐中意味著如果使用老方法和新方法，在兩種情況下都達(dá)到80％的所要結(jié)果，而新方法可制得10倍多的所需產(chǎn)物。
實(shí)施例3根據(jù)本發(fā)明制備G嵌段和M嵌段但有三種不同的濃度1％、5％和10％選擇與實(shí)施例1相同的藻酸鹽(即高G含量藻酸鹽LFR 5/60)作為制備G嵌段的原料。M嵌段也由該由原料制得。
選擇得自巨藻的藻酸鹽，由The NutraSweetKelco Company出售的高M(jìn)含量的藻酸鹽(60％M單元)制備M嵌段。G嵌段也是由該原料制得的。
該方法如下所列進(jìn)行1.將100ml 0.3M HCl加入20.0g藻酸鹽中并攪拌過(guò)夜。
2.潷析去酸，加入新的50ml 0.3M HCl。
3.在水浴(100℃)中水解5小時(shí)。
4.潷析去酸，用50ml不含離子的水洗滌沉淀物。潷析去水并加入新的水(50ml)。
5.隨后用NaOH調(diào)節(jié)懸浮液至pH3.5，加入水直至1000ml、200ml或100ml，分別制得濃度為1％、5％或10％的藻酸鹽。
6.將懸浮液置于攪拌機(jī)上過(guò)夜，然后進(jìn)行離心。
7.向沉淀物中加入新的水并將pH值調(diào)節(jié)至6.5-7.0。
8.對(duì)上層清液(6.M嵌段)和沉淀物(7.G嵌段)中的藻酸鹽進(jìn)行中和、滲析和冷凍干燥。隨后對(duì)由兩種性質(zhì)的藻酸鹽分離出的G嵌段和M嵌段的部分進(jìn)行量(FS)和化學(xué)組成(NMR)的分析。X結(jié)果示于表2中，它示出了產(chǎn)率(％)、由巨藻屬藻酸鹽分離出的部分的FG和FM。此外還示出了平均的聚合程度DPn。
表2用新方法和老方法由相等地水解的數(shù)批低G含量(巨藻)和高G含量(Laminaria hyperborea，LFR 5/60)的藻酸鹽分離出的M嵌段和G嵌段的化學(xué)組成、DPn和產(chǎn)率。在新方法中，還研究了分離體積(release volume)的效果。I＝不溶的；S＝可溶的。
進(jìn)行這些試驗(yàn)以比較取決于所使用的老方法或新方法而得到的兩種部分能達(dá)到的純度和產(chǎn)率。
實(shí)施例4用于由藻酸鹽制備G嵌段和M嵌段部分的兩種方法的過(guò)程步驟的總的表現(xiàn)1.將普通的藻酸鹽分散在500ml 0.3M HCl中。置于水浴(100℃)5小時(shí)。
“老”方法的藻酸鹽濃度＝1％，“新”方法的藻酸鹽濃度可以增至10％。
“已有技術(shù)”2.冷卻和離心。
除去酸水解液(離心后的上層清液)，(用5M NaOH)將pH值調(diào)節(jié)至7，進(jìn)行滲析和冷凍干燥。
3.將藻酸鹽的濃度調(diào)節(jié)至1％。濃度較高會(huì)導(dǎo)致共沉淀，純度較差。這使得體積顯著增加(100倍體積/干藻酸)。
4.通過(guò)HCl滴定將pH值降低至2.4。調(diào)節(jié)酸強(qiáng)度，以便使在pH值為2.4時(shí)的藻酸鹽濃度在0.25-0.5％的范圍內(nèi)。體積增至200-400倍。進(jìn)行離心。
對(duì)沉淀物進(jìn)行中和、滲析和冷凍干燥，制得G嵌段。
5.將步驟4.中上層清液的pH值降低至1.3。體積進(jìn)一步增加。進(jìn)行離心。
對(duì)沉淀物進(jìn)行中和、滲析和冷凍干燥，制得M嵌段。
“本發(fā)明”2.冷卻和離心。
除去酸水解液(離心后的上層清液)，(用5M NaOH)將pH值調(diào)節(jié)至7，進(jìn)行滲析和冷凍干燥。
3.將沉淀物(含有G嵌段和M嵌段)懸浮在水中，用5M NaOH將pH值調(diào)節(jié)至例如3.5。這樣，藻酸的濃度在5-10％的范圍內(nèi)。體積是10-20倍體積/干藻酸。如前所述，pH值在2.8-4.5之間變化(改變產(chǎn)率和純度的比值)。調(diào)節(jié)pH值并保溫(incubation)超過(guò)24小時(shí)。
4a.上層清液含有M嵌段。中和或者保持酸形式，滲析并冷凍干燥。
4b.不溶部分是G嵌段。中和或者保持酸形式，滲析并冷凍干燥。
表3示出了化學(xué)試劑的體積和消耗量。將已有技術(shù)的消耗量作為1，強(qiáng)調(diào)了根據(jù)本發(fā)明能夠在這些項(xiàng)目上實(shí)現(xiàn)大幅度降低。
表3“老”“新”堿液1 0.5酸 1 0.1(0)體積1 0.1-0.025
如果選擇其它技術(shù)來(lái)制備純凈的M嵌段(噴霧干燥)，則要除去新方法的分離過(guò)程中酸的消耗量。
實(shí)施例5按照已有技術(shù)(Haug.Larsen和Smidsrod 1967)用有限的水解時(shí)間優(yōu)化制備交替(MG)嵌段選擇由Laminaria hyperborea的葉分離得到的藻酸鹽(其FG＝0.48，交替序列含量高(FGM，MG＝0.18))作為制備該部分的原料。藻酸鹽是Pronova Biopolymer A/S市售的。
1.向5.0g藻酸鹽中加入100ml 0.3M HCl。
2.在水浴(100℃)上水解20分鐘。
3.冷卻并進(jìn)行離心。
4.用NaOH中和上層清液(含MG嵌段)，滲析并冷凍干燥。
表4中結(jié)果示出了分離出的MG部分的單體組成、平均的聚合程度(DPn)和產(chǎn)率(％)。
權(quán)利要求
1.一種由藻酸鹽制備G嵌段和/或M嵌段部分的方法，所述方法包括以下步驟a)用酸對(duì)藻酸進(jìn)行水解，以形成G嵌段、M嵌段和MG嵌段這些部分，由此含有MG嵌段的部分溶解，含有G嵌段和M嵌段的部分保持不溶解，其特征在于b)將不溶解的部分懸浮在水中，用堿液將pH值調(diào)節(jié)至pH2.8-4.0，最好是pH3.0-3.5，由此含有M嵌段的部分溶解，而含有G嵌段的部分保持不溶解。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在步驟a)和/或步驟b)之后通過(guò)過(guò)濾、離心或另一種合適的方法使不溶解部分與溶解部分分離。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在步驟b)之后以酸形式或鹽形式分離出G嵌段部分。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于如下分離出含M嵌段的部分(i)通過(guò)用酸將pH值調(diào)節(jié)至pH1.4-0.5以沉淀出M嵌段部分或(ii)通過(guò)使用薄膜技術(shù)，然后是除去水和干燥M嵌段部分的步驟或(iii)用醇沉淀出M嵌段部分。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在步驟b)中將pH值調(diào)節(jié)至3.5-4.0，得到具有高純度的G嵌段的部分。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在步驟b)中將pH值調(diào)節(jié)至2.8-3.0，以高產(chǎn)率得到G嵌段的部分。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在步驟b)中將pH值調(diào)節(jié)至3.0-3.5，較好為3.3，以較高產(chǎn)率制得具有較高純度的G嵌段的部分。
8.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于在步驟i)中將pH值調(diào)節(jié)至1.3，以沉淀出M嵌段的部分。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于使用具有高M(jìn)含量的藻酸制備具有高純度的M嵌段和/或以高產(chǎn)率制備M嵌段。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于使用具有高G含量的藻酸制備具有高純度的G嵌段和/或以高產(chǎn)率制備G嵌段。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在步驟a)中于40-100℃用0.05-5M的酸對(duì)藻酸進(jìn)行水解。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在步驟a)中在水解10-30分鐘后中斷水解以分離出MG嵌段，如有必要，隨后完成水解直至M嵌段部分大部分被溶解。
全文摘要
揭示了一種新方法,該方法通過(guò)M嵌段部分從固相中選擇性的分級(jí)分離,由藻酸鹽(主要是G嵌段藻酸鹽或M嵌段藻酸鹽)制備嵌段部分。還可以分離出MG嵌段部分。
文檔編號(hào)C08F4/651GK1261375SQ98806637
公開(kāi)日2000年7月26日 申請(qǐng)日期1998年5月8日 優(yōu)先權(quán)日1997年5月9日
發(fā)明者M·K·西門(mén)森, K·德雷格, O·斯米德勒德, F·耶拉德, E·奧索耶, T·F·博雷 申請(qǐng)人:Fmc生物聚合物聯(lián)合股份有限公司