專利名稱：一種通過特異性dna片段識別水稻糯性基因的分子標(biāo)記方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子標(biāo)記方法，具體涉及用于識別作物特異性基因的分子標(biāo)記方法。
背景技術(shù)：
水稻蠟質(zhì)基因編碼結(jié)合在淀粉粒上的淀粉合成酶(granule-bound starch synthase，GBSS)，又稱Wx蛋白，該蛋白催化合成直鏈淀粉。非糯性水稻直鏈淀粉含量(amylose content，AC)在7~33％，。Sano等(1986)根據(jù)Wx蛋白的特性，將非糯蠟質(zhì)基因進(jìn)一步分為Wxa和Wxb兩種等位基因，其中秈稻以Wxa為主，AC較高，粳稻全為Wxb，AC較低。糯性水稻的AC含量小于2％。
目前有關(guān)水稻非糯性Wx基因的分子標(biāo)記已有報(bào)道，Bligh等(1995)根據(jù)在非糯性水稻蠟質(zhì)基因的序列分析中發(fā)現(xiàn)的位于該基因前導(dǎo)內(nèi)含子剪接位點(diǎn)上游55bp處的一段(CT)n微衛(wèi)星序列而設(shè)計(jì)了一對SSR標(biāo)記引物484/485，由于(CT)n的重復(fù)次數(shù)在Wxa和Wxb之間不同，此標(biāo)記可用于區(qū)分Wxa和Wxb兩種等位基因。蔡秀玲等(2002)通過Wxa和Wxb的特定序列位點(diǎn)的差異，根據(jù)Wxb基因第一內(nèi)含子5′端的剪接位點(diǎn)為GT，Wxa基因的為TT這一差異，在此突變位點(diǎn)上下游區(qū)域設(shè)計(jì)一對PCR引物，并利用內(nèi)切酶AccI只識別未突變位點(diǎn)及其旁鄰序列g(shù)tatac而不能識別突變位點(diǎn)及其旁鄰序列ttatac的特點(diǎn)，建立的能特異性識別兩種非糯蠟質(zhì)基因的CAPS分子標(biāo)記PCR-AccI，該標(biāo)記也可用于區(qū)分Wxa和Wxb兩種等位基因。但上述分子標(biāo)記均不能專區(qū)分糯稻與非糯稻W(wǎng)x基因，目前也無有關(guān)水稻糯性Wx基因?qū)Ｒ恍苑肿訕?biāo)記的報(bào)道。
Masayuki Isshiki等(2001)對一個(gè)糯稻品種Wx基因的測序發(fā)現(xiàn)，該Wx基因在第二外顯子上有一段46bp、堿基序列為ACGGGTTCCAGGGCCTCAAGCCCACGGGTTCCAGGGCCTCAAGCCC的DNA片段，而非糯稻W(wǎng)x基因中只有23bp、堿基序列為ACGGGTTCCAGGGCCTCAAGCCC的片段，比糯性水稻的少23個(gè)核苷酸。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明通過對荊糥6號和沱江糥5號等20個(gè)糯稻品種的Wx基因進(jìn)行測序后證實(shí)，該片段為糯稻的Wx基因所特有，是水稻糯性Wx基因的標(biāo)志性特異片段(為了便于敘述，在本專利申請中將此片段簡稱為特異性片段)。
糯稻是水稻中重要的品種類型，具有很高的食用價(jià)值和工業(yè)價(jià)值。由于水稻糯性Wx基因?qū)τ诜桥葱訵x基因?yàn)殡[性，在育種過程中當(dāng)兩者處于雜合狀態(tài)時(shí)從外觀上無法區(qū)別，但如有相應(yīng)的分子標(biāo)記則能鑒別糯性Wx基因是否存在，從而為育種選擇提供準(zhǔn)確的依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是公開了一種通過特異性DNA片段識別水稻糯性基因的分子標(biāo)記方法。
本發(fā)明通過以下方式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明以水稻糯性Wx基因的特異性片段為核心序列設(shè)計(jì)并合成引物，利用該引物對待測水稻樣品的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過對擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(電泳等方式)，以擴(kuò)增產(chǎn)物中是否含有全部或部分特異性片段來識別待測樣品中是否含有水稻的糯性Wx基因。
為了保證對水稻糯性Wx基因PCR擴(kuò)增的特異性，根據(jù)特異性片段的序列特征，引物設(shè)計(jì)的范圍以特異性片段為核心，向左右兩側(cè)序列各延伸500個(gè)核苷酸，共1046個(gè)核苷酸，以下為該片段的核苷酸序列(其中加粗斜體的字母為特異性片段序列)1 TTAATCATTC ATCTGATCTG CTCAAAGCTC TGTGCATCTC CGGGTGCAAC GGCCAGGATA61TTTATTGTGC AGTAAAAAAA TGTCATATCC CCTAGCCACC CAAGAAACTG CTCCTTAAGT121 CCTTATAAGC ACATATGGCA TTGTAATATA TATGTTTGAG TTTTAGCGAC AATTTTTTTA181 AAAACTTTTG GTCCTTTTTA TGAACGTTTT AAGTTTCACT GTCTTTTTTT TTCGAATTTT241 AAATGTAGCT TCAAATTCTA ATCCCCAATC CAAATTGTAA TAAACTTCAA TTCTCCTAAT301 TAACATCTTA ATTCATTTAT TTGAAAACCA GTTCAAATTC TTTTAGGCTC ACCAAACCTT361 AAACAATTCA ATTCAGTGCA GAGATCTTCC ACAGAACAGC TAGACAACCA CCATGTCGGC421 TCTCACCACG TCCCAGCTCG CCACCTCGGC CACCGGCTTC GGCATCGCCG ACAGGTCGGC481 GCCGTCGTCG CTGCTCCGCC ACGGGTTCCA GGGCCTCAAG CCCACGGGTT CCAGGGCCTC601 AAGCCCCGCA GCCCCGCCGG CGGCGACGCG ACGTCGCTCA GCGTGACGAC CAGCGCGCGC661 GCGACGCCCA AGCAGCAGCG GTCGGTGCAG CGTGGCAGCC GGAGGTTCCC CTCCGTCGTC721 GTGTACGCCA CCGGCGCCGG CATGAACGTC GTGTTCGTCG GCGCCGAGAT GGCCCCCTGG781 AGCAAGACCG GCGGCCTCGG TGACGTCCTC GGTGGCCTCC CCCCTGCCAT GGCTGTAAGC901 ACACACAAAC TTCGATCGCT CGTCGTCGCT GACCGTCGTC GTCTTCAACT GTTCTTGATC961 ATCGCATTGG ATGGATGTGT AATGTTGTGT TCTTGTGTTC TTTGCAGGCG AATGGCCACA1021 GGGTCATGGT GATCTCTCCT CGGTACGACC AGTACAAGGA CGCTTGGGAT ACCAGCGTTG1081 TGGCTGAGGT AGGAGCATAT GCGTGATCAG ATCATCACAA GATCGATTAG CTTTAGATGA1121 TTTGTTACAT TTCGCAAGAT TTTAAC引物設(shè)計(jì)時(shí)，將上游引物5′端核苷酸的位置限制在上述1046個(gè)核苷酸片段中第1～523個(gè)核苷酸的序列范圍內(nèi)，超過此限范圍，上游引物將導(dǎo)致對水稻糯性Wx基因擴(kuò)增的特異性降低甚至不再具有特異性；下游引物的反向互補(bǔ)序列的3′端核苷酸則限制在上述1046個(gè)核苷酸片段中第524～1046個(gè)核苷酸的序列范圍內(nèi)，超過此限范圍，下游引物也將導(dǎo)致對水稻糯性Wx基因擴(kuò)增的特異性降低甚至不再具有特異性。引物的長度在18個(gè)核苷酸左右。引物設(shè)計(jì)完成后，按照設(shè)計(jì)的引物序列合成引物。引物的合成可交專業(yè)DNA合成公司合成。合成引物后，即可進(jìn)行DNA的擴(kuò)增。首先提取待測樣品的DNA，現(xiàn)已報(bào)道的DNA提取方法很多，可任意選擇一種。然后在0.2ml的PCR擴(kuò)增專用薄壁管中，依次加入10～40ng待測樣品DNA，上、下游引物各2.5pM，1mM MgCl2，4種dNTP(dCTP、dGTP、dATP、dTTP)各50μM及0.4個(gè)單位的taq聚合酶，反應(yīng)總體積為12.5μl。除待測樣品DNA和引物外，各試劑(dNTP、tap酶等)及實(shí)驗(yàn)用品(薄壁管、吸管、吸頭等)均在專業(yè)公司購買。將加好樣的薄壁管放入PCR循環(huán)儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增條件為95℃下變性60秒；在55~68℃下復(fù)性20秒；72℃延伸10秒；循環(huán)33次。擴(kuò)增結(jié)束后，取3～4μl擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)樣，1.5％瓊脂糖凝膠，80v，電泳15min。電泳完畢后，凝膠于EB溶液中染色15min，GelDoc2000凝膠自動(dòng)成相系統(tǒng)(Bio-RAD公司)照相分析。
根據(jù)引物設(shè)計(jì)的位置，在對水稻糯性基因進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)產(chǎn)生的DNA擴(kuò)增片段中所含水稻糯性Wx的特異性片段的大小有所不同當(dāng)上、下游引物的部分或全部序列均不在水稻糯性Wx的特異性片段上時(shí)，擴(kuò)增出的水稻糯性Wx基因的DNA片段具有完整的特異性片段；當(dāng)上、下游引物之一的部分或全部序列在該特異性片段中時(shí)，擴(kuò)增出的水稻糯性Wx基因的DNA片段則只具有該特異性片段的部分序列。而在對水稻非糯性Wx基因的擴(kuò)增時(shí)，由于DNA模版中沒有該特異性片段，用相同的引物對水稻非糯性Wx基因進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，其擴(kuò)增片段比糯性Wx基因的擴(kuò)增片段短，并且當(dāng)引物之一的位置位于特異性片段的某些特殊的引物位置上時(shí)，非糯性Wx基因甚至?xí)蛟撘锊荒芘c之配對或配對較弱而無擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生。上述糯性與非糯性Wx基因的差異都可以通過電泳顯示出來。
本方法與背景技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)1、本方法能專一性的識別水稻糯性Wx基因，這是本技術(shù)最大的特色和創(chuàng)新點(diǎn)。
2、該方法可用于糯稻的新品種選育，進(jìn)行糯稻的分子標(biāo)記輔助育種，從而縮短糯稻新品種的育種周期，加快育種進(jìn)程。
四

附圖中左圖為實(shí)施例1中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果，擴(kuò)增材料包括1-6荊糥6號、沱江糥5號、R838、明恢63、金23A、II-32A；附圖中右圖為實(shí)施例2中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果，擴(kuò)增材料包括1-6荊糥6號、沱江糥5號、R838、明恢63、金23A、II-32A。
五具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1I.引物的合成將上、下游引物均設(shè)計(jì)在水稻糯性Wx基因特異性片段的兩側(cè)，引物不含該特異性片段的序列，上游引物5′-TCA CCA CGT CCC AGCTCG-3′位于該特異序列左側(cè)(上述Wx基因序列中423～440bp處)，下游引物5′-ACC GAC CGC TGC TGC TTG-3′的反向互補(bǔ)序列位于該特異序列右側(cè)(上述Wx基因序列中609～626bp處)，兩個(gè)引物所涉及的擴(kuò)增片段總長度為204bp，由于上、下游引物均不在該特異序列上，所以該片段具有完整的水稻糯性Wx基因的特異序列，而相應(yīng)的非糯性Wx基因的片段長度為181bp。
II.引物的合成 本技術(shù)的引物由上海博雅生物工程有限公司合成。
III.DNA提取 現(xiàn)已報(bào)道的DNA提取方法很多，可任意選擇。本技術(shù)使用的是盧揚(yáng)江等(1992)報(bào)道的水稻DNA提取方法。
IV.DNA擴(kuò)增PCR反應(yīng)在9700(AB公司)上進(jìn)行，體積均為12.5ul，其中模板DNA 2ul(30ng)，10×Taq緩沖液1.25ul，2.5pM上下游引物各1ul，2.5mM dNTP混合液1ul，LA Taq酶(Takara)0.4U。擴(kuò)增反應(yīng)條件如表1。
表1 PCR反應(yīng)條件

V.電泳在DYC微型水平電泳槽(北京六一廠)上進(jìn)行。點(diǎn)樣4ul，1.5％瓊脂糖凝膠，80v，電泳15min；所用DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)為DL2000(天為時(shí)代公司)，參照物片段(bp)從小到大依次為100、250、500、750、1000、2000。電泳完畢，凝膠于EB溶液中染色15min，GelDoc2000凝膠自動(dòng)成相系統(tǒng)(Bio-RAD公司)照相分析。結(jié)果如說明書附圖中A圖所示(荊糥6號和沱江糥5號為糯稻品種，R838、明恢63為非糯的Wxb品種，金23A及II-32A為非糯的Wxa品種)。
實(shí)施例2引物的設(shè)計(jì)上游引物5′-GGG TGC AAC GGC CAG GAT-3′位于水稻糯性Wx基因的特異性片段左側(cè)(上述Wx基因序列中42～59bp處)，下游引物5′-TGG AAC CCG TGG GCT TGA-3′的反向互補(bǔ)序列位于該特異性片段的中部(上述Wx基因序列中516～533bp處)，兩個(gè)引物所涉及的擴(kuò)增片段總長度為492bp，由于下游引物的全部序列都在該特異性片段上，在糯性Wx基因的擴(kuò)增片段中只具有部分該特異性片段，但在非糯性Wx基因中，由于下游引物位于該特異性片段特殊的位置上，使該引物不能與非糯性Wx基因的相應(yīng)部位配對，故在非糯性水稻W(wǎng)x基因中不能產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果如說明書附圖中B圖所示(荊糥6號和沱江糥5號為糯稻品種，R838、明恢63為非糯的Wxb品種，金23A及II-32A為非糯的Wxa品種)。
引物的合成等具體操作方法同實(shí)施例1。
實(shí)施例3引物的設(shè)計(jì)上游引物5′-TCAAGCCCACGGGTTCCA-3′位于水稻糯性Wx基因的特異性片段的中部(上述Wx基因序列中514～531bp處)，下游引物5′-GCCATTCGCCTGCAAAGA-3′的反向互補(bǔ)序列位于該特異性片段的右側(cè)(上述Wx基因序列中879～896bp處)，兩個(gè)引物所涉及的擴(kuò)增片段總長度為383bp。
除復(fù)性溫度為62℃外，引物的合成等具體操作方法同實(shí)施例1。
實(shí)施例4引物的設(shè)計(jì)上游引物5′-AGAACAGCTAGACAACCACCAT-3′位于水稻糯性Wx基因的特異性片段的左惻(上述Wx基因序列中393～414bp處)，下游引物5′-TTCGCCTGCAAAGAACAC-3′的反向互補(bǔ)序列位于該特異性片段的右側(cè)(上述Wx基因序列中875～892bp處)，兩個(gè)引物所涉及的擴(kuò)增片段總長度為500bp。
除復(fù)性溫度為56℃外，引物的合成等具體操作方法同實(shí)施例1。
權(quán)利要求
1.一種分子標(biāo)記方法，其特征在于該方法是通過特異性DNA片段識別水稻糯性基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記方法，其特征在于本方法以水稻糯性Wx基因的特異性片段為核心序列設(shè)計(jì)并合成引物，利用該引物對待測水稻樣品的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過對擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測，以擴(kuò)增產(chǎn)物中是否含有全部或部分特異性片段來識別待測樣品中是否含有水稻的糯性Wx基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述分子標(biāo)記方法，其特征在于引物設(shè)計(jì)的范圍以特異性片段為核心，向左右兩側(cè)序列各延伸500個(gè)核苷酸，共1046個(gè)核苷酸，以下為該片段的核苷酸序列(其中加粗斜體的字母為特異性片段序列)1TTAATCATTC ATCTGATCTG CTCAAAGCTC TGTGCATCTC CGGGTGCAAC GGCCAGGATA61 TTTATTGTGC AGTAAAAAAA TGTCATATCC CCTAGCCACC CAAGAAACTG CTCCTTAAGT121 CCTTATAAGC ACATATGGCA TTGTAATATA TATGTTTGAG TTTTAGCGAC AATTTTTTTA181 AAAACTTTTG GTCCTTTTTA TGAACGTTTT AAGTTTCACT GTCTTTTTTT TTCGAATTTT241 AAATGTAGCT TCAAATTCTA ATCCCCAATC CAAATTGTAA TAAACTTCAA TTCTCCTAAT301 TAACATCTTA ATTCATTTAT TTGAAAACCA GTTCAAATTC TTTTAGGCTC ACCAAACCTT361 AAACAATTCA ATTCAGTGCA GAGATCTTCC ACAGAACAGC TAGACAACCA CCATGTCGGC421 TCTCACCACG TCCCAGCTCG CCACCTCGGC CACCGGCTTC GGCATCGCCG ACAGGTCGGC481 GCCGTCGTCG CTGCTCCGCC ACGGGTTCCA GGGCCTCAAG CCCACGGGTT CCAGGGCCTC601 AAGCCCCGCA GCCCCGCCGG CGGCGACGCG ACGTCGCTCA GCGTGACGAC CAGCGCGCGC661 GCGACGCCCA AGCAGCAGCG GTCGGTGCAG CGTGGCAGCC GGAGGTTCCC CTCCGTCGTC721 GTGTACGCCA CCGGCGCCGG CATGAACGTC GTGTTCGTCG GCGCCGAGAT GGCCCCCTGG781 AGCAAGACCG GCGGCCTCGG TGACGTCCTC GGTGGCCTCC CCCCTGCCAT GGCTGTAAGC901 ACACACAAAC TTCGATCGCT CGTCGTCGCT GACCGTCGTC GTCTTCAACT GTTCTTGATC961 ATCGCATTGG ATGGATGTGT AATGTTGTGT TCTTGTGTTC TTTGCAGGCG AATGGCCACA1021 GGGTCATGGT GATCTCTCCT CGGTACGACC AGTACAAGGA CGCTTGGGAT ACCAGCGTTG1081 TGGCTGAGGT AGGAGCATAT GCGTGATCAG ATCATCACAA GATCGATTAG CTTTAGATGA1121 TTTGTTACAT TTCGCAAGAT TTTAAC
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述分子標(biāo)記方法，其特征在于引物設(shè)計(jì)時(shí)，將上游引物5′端核苷酸的位置限制在權(quán)利要求3所述1046個(gè)核苷酸片段中第1～523個(gè)核苷酸的序列范圍內(nèi)；下游引物的反向互補(bǔ)序列的3′端核苷酸則限制在權(quán)利要求3所述1046個(gè)核苷酸片段中第524～1046個(gè)核苷酸的序列范圍內(nèi)。
5.本發(fā)明方法在水稻育種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子標(biāo)記方法，針對目前水稻育種中糯性基因不易識別的問題，本發(fā)明公開了一種通過特異性DNA片段識別水稻糯性基因的分子標(biāo)記方法，以水稻糯性Wx基因的特異性片段為核心序列設(shè)計(jì)并合成引物，利用該引物對待測水稻樣品的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過對擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測，以擴(kuò)增產(chǎn)物中是否含有全部或部分特異性片段來識別待測樣品中是否含有水稻的糯性Wx基因，本方法能專一性的識別水稻糯性Wx基因，用于糯稻的新品種選育，可縮短糯稻新品種的育種周期，加快育種進(jìn)程。
文檔編號C12N15/11GK1837373SQ20051002054
公開日2006年9月27日 申請日期2005年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月21日
發(fā)明者羅科, 田潔, 孫華欽 申請人:中國科學(xué)院成都生物研究所