專利名稱：多磷酸肌醇6－/3－激酶基因在植物抗鹽中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及擬南芥多磷酸肌醇6-/3-激酶基因在提高植物抗鹽能力中的用途，更具體涉及一種多磷酸肌醇6-/3-激酶基因在改造經(jīng)濟(jì)作物和其它植物抗鹽能力中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，環(huán)境壓力是導(dǎo)致減產(chǎn)的重要因素之一。在這些環(huán)境壓力中，鹽壓力的危害性在于它極大的阻礙了農(nóng)作物的生長(zhǎng)，最終降低產(chǎn)量(Boyer，J.S.(1982).Plant productivity and environment.Science 218，443-448.)。灌溉地區(qū)的鹽堿化限制了世界上很多地區(qū)農(nóng)業(yè)發(fā)展的未來(lái)(Ashraf，M.(1994).Breeding for salinity tolerance proteins in plants.Crit.Rev.Plant Sci.13，17-42.)。植物細(xì)胞內(nèi)鹽濃度的升高直接導(dǎo)致了胞內(nèi)離子的不平衡和滲透壓的改變(Niu，X.，Bressan，R.A.，Hasegawa，P.M.，and Pardo，J.M.(1995).Ion homeostasis in NaCl stress environments.Plant Physiol.109，735-742.Zhu，J.K.，Hasegawa，P.M.，and Bressan，R.A.(1997).Molecular aspectsof osmotic stress.Crit.Rev.Plant Sci.16，253-277.)。當(dāng)外界NaCl影響植物細(xì)胞內(nèi)鹽濃度時(shí)，不僅Na+與Cl+的平衡被打破，細(xì)胞內(nèi)的K和Ca的濃度也會(huì)受到很大的影響(Serrano，R.，Mulet，J.M.，Rios，G.，Marquez，J.A.，de Larriona，I.F.，Leube，M.P.，Mendizabal，I.，Pascual-Ahuir，A.，Proft，M.，Ros，R.，and Montesinos，C.(1999).A glimpse of the mechanisms ofion homeostasis during salt stress.J.Exp.Bot.50，1023-1036.Hasegawa，P.M.，Bressan，R.A.，and Zhu，J.K.(2000).Plant cellular and molecularresponses to high salinity.Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.51，463-499.Rodriguez-Navarro，A.(2000).Potassium transport in fungiand plants.Biochim.Biophys.Acta 1469，1-30.)。植物的生存和生長(zhǎng)，特別是農(nóng)作物的正常發(fā)育，直接依賴于植物自身對(duì)離子平衡重新調(diào)節(jié)的能力。
目前，通過(guò)改變植物生長(zhǎng)外界環(huán)境來(lái)適應(yīng)植物生長(zhǎng)需要的方法雖然能解決一定地區(qū)因鹽濃度過(guò)高而導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)作物產(chǎn)量下降的問(wèn)題。但這種方法不但需要大量的投入，應(yīng)用效果和適用地區(qū)也存在問(wèn)題。另外，也有通過(guò)品種改良的方法來(lái)提高某種經(jīng)濟(jì)作物適應(yīng)高鹽環(huán)境的例子。但經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)時(shí)間的品種優(yōu)化，既耗費(fèi)時(shí)間，也不一定能達(dá)到預(yù)期的結(jié)果。目前的基礎(chǔ)生物學(xué)研究已經(jīng)鑒定出了一些能被外界的鹽壓力所激活的重要基因，例如SOS1、SOS2、SOS3、KIN1、KIN2、RD29A、RD29B等(Bray，E.A.(1993).Molecular responses to water deficit.Plant Physiol.103，1035-1040.Botella，M.A.，Quesada，M.A.，Kononowicz，A.，Bressan，R.A.，Hasegawa，P.M.，and Valpuesta，V.(1994).Characterization and insitu localization of a salt induced tomato peroxidase gene.Plant Mol.Biol.25，105-114.Zhu，J.K.，Hasegawa，P.M.，and Bressan，R.A.(1997).Molecular aspects of osmotic stress.Crit.Rev.Plant Sci.16，253-277.Hasegawa，P.M.，Bressan，R.A.，and Zhu，J.K.(2000).Plant cellular andmolecular responses to high salinity.Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.51，463-499.)。
植物多磷酸肌醇6-/3-激酶基因(Inositol polyphosphate 6-/3-kinase)是植物細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)磷酸肌醇代謝的重要激酶。它能將三磷酸肌醇(IP3)磷酸化為四磷酸肌醇(IP4)以及高磷酸肌醇(Xia H-J，Brearley C，Elge S，et al.(2003).Arabidopsis inositol polyphosphate 6-/3-kinase is a nuclearprotein that complements a yeast mutant lacking a functional ArgR-Mcm1transcription complex.Plant Cell；15449-463.)。同時(shí)，IP3與IP4分子也是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的重要第二信使。因此，IP3K還能參與調(diào)節(jié)植物細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號(hào)途徑(Xia H-J，Brearley C，Elge S，et al.(2003).Arabidopsisinositol poiyphosphate 6-/3-kinase is a nuclear protein that complementsa yeast mutant lacking a functional ArgR-Mcm1 transcription complex.Plant Cell；15449-463.)。植物多磷酸肌醇6-/3-激酶基因的克隆，生化特性及該基因的初步功能研究已于2003年首次被報(bào)道(Xia H-J，Brearley C，Elge S，et al.(2003).Arabidopsis inositol polyphosphate 6-/3-kinase is anuclear protein that complements a yeast mutant lacking a functionalArgR-Mcm1 transcription complex.Plant Cell；15449-463.)。另外的研究也證實(shí)多磷酸肌醇6-/3-激酶基因能通過(guò)與鈣離子相關(guān)的途徑調(diào)節(jié)植物的正常生長(zhǎng)(Xu J，Brearley CA，Lin WH，et al.A role of Arabidopsis inositolpolyphosphate kinase AtIpk2α，in pollen germination and root growth.Plant Physiol 2005；13794-103.)。目前也有通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段來(lái)提高植物抗鹽能力的例子，但問(wèn)題在于所用基因大多數(shù)為植物抗鹽過(guò)程中的下游基因。而多磷酸肌醇6-/3-激酶基因是調(diào)節(jié)植物鈣信號(hào)的重要基因，其在植物信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中處于上游位置。因此，多磷酸肌醇6-/3-激酶基因能通過(guò)多種途徑來(lái)提高植物抗鹽能力。經(jīng)檢索未見(jiàn)到一種擬南芥多磷酸肌醇6-/3-激酶基因在植物抗鹽中的使用或報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種擬南芥多磷酸肌醇6-/3-激酶基因的新用途，即擬南芥多磷酸肌醇6-/3-激酶基因在植物抗鹽中的應(yīng)用。擬南芥多磷酸肌醇6-/3-激酶基因或類似基因?yàn)榻鉀Q植物，特別是糧食作物和經(jīng)濟(jì)作物，在高鹽環(huán)境中存活率低、生長(zhǎng)緩慢和產(chǎn)量低的問(wèn)題提供一條技術(shù)途徑。
本發(fā)明還涉及利用多磷酸肌醇6-/3-激酶基因(目的基因或類似基因)，通過(guò)轉(zhuǎn)基因等生物技術(shù)手段在提高植物抗鹽能力的方法。所改變的基因與所采用的方法不僅具有可操作性，還能明顯改善植物高鹽環(huán)境中的生長(zhǎng)狀況。
本發(fā)明還涉及一種擬南芥多磷酸肌醇6-/3-激酶基因在受體植物(例如水稻、煙草等)抗鹽中的應(yīng)用。
本發(fā)明所涉及的多磷酸肌醇6-/3-激酶基因(目的基因或類似基因)在提高受體植物抗鹽能力中的應(yīng)用。目前已有一些通過(guò)改變某種基因的表達(dá)量來(lái)提高植物抗逆能力的方法。本發(fā)明所改變的基因能很好的實(shí)現(xiàn)提高受體植物抗鹽能力。
本發(fā)明涉及一個(gè)基因或一段核苷酸序列，其與SEQ ID NO.1至少具有40％核苷酸同源性，在植物抗鹽中的應(yīng)用。
本發(fā)明涉及一段氨基酸序列，其與SEQ ID NO.2至少具有40％氨基酸同源性，在植物抗鹽中的應(yīng)用。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施本發(fā)明涉及的科學(xué)術(shù)語(yǔ)如下*“目的基因”，系指擬南芥中的多磷酸肌醇6-/3-激酶基因。
*“類似基因”，系指任何同“目的基因”編碼序列中的任何區(qū)域同源性在40％以上的DNA片段(基因片段)，或任何DNA片段(基因片段)，其編碼的氨基酸序列同“目的基因”編碼的氨基酸序列中任何區(qū)域有40％以上的同源率?！邦愃苹颉笨梢允菑娜魏紊锘蚪M中克隆的，也可以是人工合成或用PCR在體外擴(kuò)增的。
*“基因片段”，系指長(zhǎng)度在300個(gè)堿基對(duì)(bp)以上的同“目的基因”或“類似基因”DNA序列中的任何域區(qū)同源律在40％以上的任何DNA片段，或任何編碼100個(gè)氨基酸以上的DNA片段，其編碼的氨基酸序列同“目的基因”或“類似基因”編碼的氨基酸序列中的任何區(qū)域同源性在40％以上。該基因片段可以是從任何生物基因組中克隆的，也可以是人工合成的或用PCR在體外擴(kuò)增的。
*“受體植物”系指整個(gè)植物界包括低等植物、高等植物、藻類以及任何利用光合作用生存的水生物，主要包括光合水生物、藻類、厥類、裸子植物(松、柏等)、被子植物(蔬菜、糧食作物、油料作物、藥用植物、苗木、花卉)等。
*“轉(zhuǎn)基因”，系指通過(guò)任何方法導(dǎo)入植物個(gè)體一段外源的雙鏈脫氧核糖核苷酸(DNA)片段，可以是游離在染色體外，也可以整合到受體植物染色體的基因組上；可以通過(guò)生殖過(guò)程傳遞到后代，也可以不傳遞到后代。外源基因可以是從任何生物基因組中克隆的，也可以是人工合成的或用PCR在體外擴(kuò)增的。
*“抗逆植物”，指任何具有抗鹽、抗旱、抗寒、抗熱、抗蟲(chóng)等特性的植物。
現(xiàn)已證實(shí)，通過(guò)改變鹽效應(yīng)基因在植物中的表達(dá)量，能夠明顯的提高和降低植物對(duì)外界鹽處理的敏感性，即相應(yīng)的改變的植物對(duì)外界鹽環(huán)境的適應(yīng)能力。因此，通過(guò)轉(zhuǎn)基因等手段調(diào)節(jié)相應(yīng)鹽應(yīng)答基因能有效的提高植物的抗鹽能力。本發(fā)明將目的基因或類似基因?qū)胧荏w植物中，選育出的轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性明顯高于野生型植株。將目的基因或類似基因裝配于強(qiáng)力組成型表達(dá)的強(qiáng)力啟動(dòng)子(如CaMV35S)或其他類型(可誘導(dǎo)啟動(dòng)子等)之下，構(gòu)建成可以在植物中表達(dá)的載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法或其他方法，使目的基因或類似基因在受體植物中大量表達(dá)，從而使轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽特性得以提高。本發(fā)明的關(guān)鍵是多磷酸肌醇6-/3-激酶基因在受體植物中得以大量表達(dá)或抑制，使轉(zhuǎn)基因植株的抗鹽能力達(dá)到最高點(diǎn)，受體植物對(duì)其他相關(guān)逆境因子(如寒冷、干旱等)的耐受性也同時(shí)得以提高。
本發(fā)明所述目的基因或相似基因是從植物中克隆得到的，與擬南芥多磷酸肌醇6-/3-激酶基因至少具有40％同源性且具有相似功能的所有基因。擬南芥多磷酸肌醇6-/3-激酶基因的cDNA長(zhǎng)900bp，編碼300個(gè)氨基酸。在GenBank中進(jìn)行同源搜索，發(fā)現(xiàn)在其它植物如水稻中都有同源序列，且相似性為56％。擬南芥多磷酸肌醇6-/3-激酶基因序列為SEQ ID NO.1。
擬南芥多磷酸肌醇6-/3-激酶基因編碼蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO.2。
1.構(gòu)建可以在植物中大量表達(dá)的基因表達(dá)載體，將目的基因或類似基因裝配于具有不同篩選標(biāo)記的基因表達(dá)載體上，置于強(qiáng)力組成型表達(dá)強(qiáng)力啟動(dòng)子(如CaMV35S)或其他類型的啟動(dòng)子(如可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)之下，構(gòu)建成可以在植物中表達(dá)的載體。
2.借助農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法、化學(xué)轉(zhuǎn)化法(如PEG轉(zhuǎn)化)、基因槍或其他方法(如花粉管轉(zhuǎn)化)，將上述基因表達(dá)載體導(dǎo)入受體植物中，并在啟動(dòng)子的帶動(dòng)下，使目的基因在轉(zhuǎn)基因受體植物中大量表達(dá)；根據(jù)基因表達(dá)載體上的篩選標(biāo)記篩選具有抗性的再生植株。
3.對(duì)第一代抗性再生植株進(jìn)行DNA(Southern Blots)，RNA(Northern Blots)及蛋白(Western Blots)雜交分析，并檢測(cè)其抗鹽性及其他相關(guān)的抗逆性；4.對(duì)上述蛋白分析呈陽(yáng)性的第一代個(gè)體進(jìn)行繼代繁殖，并分析其后代(F1，F(xiàn)2，F(xiàn)3，F(xiàn)4)中目的基因的含量(表達(dá)水平)及個(gè)體的抗鹽性及其他相關(guān)的抗逆性。
5.將其幼苗在100-200mM NaCl或更高鹽濃度下生長(zhǎng)，觀測(cè)轉(zhuǎn)基因植物與野生型植物間的差別以檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物的抗鹽能力，從而篩選出具有高抗鹽性的轉(zhuǎn)基因植株。
在其它植物種類中的轉(zhuǎn)基因操作均類似于以上操作步驟。
本發(fā)明的有益效果是，可以明顯提高植物的抗鹽能力，從而使受體植物能夠在高鹽環(huán)境中生長(zhǎng)，克服外界鹽壓力對(duì)植物生長(zhǎng)和產(chǎn)量的影響。將本發(fā)明應(yīng)用于植物，將有利于植物在高鹽地區(qū)的推廣以及保持產(chǎn)量的正常。例如，將多磷酸肌醇6-/3-激酶基因轉(zhuǎn)入楊樹(shù)，可在北方高鹽及干旱地區(qū)有較大作用，可用于防沙固沙。因此，本發(fā)明對(duì)于提高植物抗鹽性有重要作用。


圖1植物表達(dá)載體pBinAR-HPT/AtIP3K結(jié)構(gòu)圖。該表達(dá)載體為pBinAR-HPT。其上有多個(gè)酶切位點(diǎn)，上游為CaMV35S強(qiáng)力啟動(dòng)子。擬南芥多磷酸肌醇6-/3-激酶基因(IP3K)插入到CaMV35S啟動(dòng)子后。
圖2轉(zhuǎn)基因擬南芥的鑒定。利用蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)對(duì)兩個(gè)轉(zhuǎn)基因系進(jìn)行鑒定。其中1，2為反義轉(zhuǎn)基因系，3為野生型擬南芥。在野生型中能明顯看到IP3K蛋白質(zhì)印跡痕跡，說(shuō)明在野生型中IP3K有表達(dá)。但在反義轉(zhuǎn)基因植物中，沒(méi)有明顯的IP3K蛋白質(zhì)印跡痕跡，說(shuō)明該基因系植株為反義轉(zhuǎn)基因擬南芥。
圖3轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性試驗(yàn)。在100mM NaCl環(huán)境下轉(zhuǎn)基因種子萌發(fā)率大大高于野生型種子，并且轉(zhuǎn)基因幼苗明顯大于野生型幼苗。
圖4轉(zhuǎn)基因擬南芥在125mM NaCl條件下的耐鹽性試驗(yàn)。125mM NaCl環(huán)境下轉(zhuǎn)基因種子萌發(fā)率大大高于野生型種子，并且轉(zhuǎn)基因幼苗明顯大于野生型幼苗。
圖5轉(zhuǎn)基因擬南芥在125mM NaCl條件下的耐鹽性試驗(yàn)。在125mM NaCl環(huán)境下轉(zhuǎn)基因種子萌發(fā)率大大高于野生型種子。
圖6轉(zhuǎn)基因擬南芥在150mM NaCl條件下的耐鹽性試驗(yàn)。在150mM NaCl環(huán)境下轉(zhuǎn)基因種子萌發(fā)率大大高于野生型種子。
圖7不同鹽濃度(100mM；125mM；150mM；175mM)對(duì)野生型與轉(zhuǎn)基因擬南芥種子萌發(fā)率影響的比較。轉(zhuǎn)基因系種子的萌發(fā)率明顯高于野生型擬南芥種子。
圖8植物表達(dá)載體pBinAR-HPT/AtIP3K結(jié)構(gòu)圖。該表達(dá)載體為pBinAR-HPT。其上有多個(gè)酶切位點(diǎn)，上游為CaMV35S強(qiáng)力啟動(dòng)子。擬南芥多磷酸肌醇6-/3-激酶基因(IP3K)插入到CaMV35S啟動(dòng)子后。
圖9轉(zhuǎn)基因煙草的鑒定。PCR表明IP3K基因已經(jīng)整合到植物基因組中。PCR擴(kuò)增條帶為631bp片斷。其中1.DNA分子標(biāo)記；2.載體陽(yáng)性對(duì)照；3.空白陰性對(duì)照；4.野生型對(duì)照；5-13.轉(zhuǎn)基因系。
圖10轉(zhuǎn)基因煙草在200mM NaCl條件下的耐鹽性試驗(yàn)。轉(zhuǎn)基因煙草在200mM NaCl環(huán)境下萌發(fā)率大大高于野生型種子，并且轉(zhuǎn)基因幼苗明顯大于野生型幼苗。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1本發(fā)明將從擬南芥中克隆的多磷酸肌醇6-/3-激酶基因(目的基因)在擬南芥中表達(dá)后，轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗鹽性明顯高于野生型。將多磷酸肌醇6-/3-激酶基因裝配于強(qiáng)力組成型表達(dá)的花椰菜花葉病毒35S強(qiáng)力啟動(dòng)子(CaMV35S)之下，構(gòu)建成可以在植物中表達(dá)的載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，使該目的基因在轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)大量表達(dá)，具體操作如下1.擬南芥多磷酸肌醇6-/3-激酶基因的克隆利用動(dòng)物三磷酸肌醇激酶(inositol 1，4，5-trisphosphate kinase)序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中利用Basic Local Alignment Search Tool工具尋找植物中三磷酸肌醇激酶同源序列。所尋找到的擬南芥多磷酸肌醇6-/3-激酶基因序列(在發(fā)明內(nèi)容中已有敘述)定位于擬南芥第5號(hào)染色體上。利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR 和同源引物5’-GATCGAATTCATGCTCAAGGTCCCTGAACACC-3’和5’-GTCACTCGAGCTAGCGCCCGTTCTCAAGTAGG-3’擴(kuò)增得到擬南芥多磷酸肌醇6-/3-激酶基因片段(AtIP3K)。并利用該片斷篩選擬南芥cDNA文庫(kù)，得到擬南芥多磷酸肌醇6-/3-激酶基因。
2.植物表達(dá)載體pBinAR-HPT/AtIP3K的構(gòu)建將具有潮霉素篩選標(biāo)記的表達(dá)載體pBinAR-HPT首先用限制性內(nèi)切酶XbaI/SalI消化后，將載體純化后回收；同時(shí)，將篩選得到的cDNA文庫(kù)中擬南芥多磷酸肌醇6-/3-激酶基因用SmaI/HindIII酶切，然后將其回收后同載體連接，得到具有潮霉素篩選標(biāo)記的植物表達(dá)載體pBinAR-HPT/AtIP3K，如圖1所示。
3、擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化將植物表達(dá)載體pBinAR-HPT/AtIP3K導(dǎo)入農(nóng)桿菌中，用含有pBinAR-HPT/AtIP3K的農(nóng)桿菌培養(yǎng)液感染野生擬南芥花序，收集種子。種子在共生培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基+25毫克/升潮霉素)上篩選。將篩選后種子轉(zhuǎn)入土壤中生長(zhǎng)。再將收獲的種子播種在含有100毫克/升潮霉素的MS培養(yǎng)基上，篩選出純合體，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行分子鑒定，如圖2所示。
4.轉(zhuǎn)基因植物的抗鹽能力鑒定將轉(zhuǎn)基因系種子在含有100mM NaCl濃度的MS培養(yǎng)基上萌發(fā)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因系種子萌發(fā)率明顯高于野生型植物。并且個(gè)體生長(zhǎng)也比野生型植物生長(zhǎng)情況好，如圖3所示。
實(shí)施例21.利用與實(shí)施例1相同的方法從擬南芥中克隆得到擬南芥多磷酸肌醇6-/3-激酶基因。并將擬南芥多磷酸肌醇6-/3-激酶基因插入到植物表達(dá)載體pBinAR-HPT中，構(gòu)建pBinAR-HPT/AtIP3K表達(dá)載體。并進(jìn)行轉(zhuǎn)基因鑒定。具體方法如實(shí)施例1。
2.將經(jīng)過(guò)篩選的轉(zhuǎn)基因種子在125mM NaCl濃度下萌發(fā)生長(zhǎng)，并與野生型擬南芥種子進(jìn)行對(duì)比。
3.對(duì)轉(zhuǎn)基因與野生型種子的萌發(fā)率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并觀察小苗的生長(zhǎng)。
4.在125mM NaCl條件下，IP3K轉(zhuǎn)基因小苗的個(gè)體生長(zhǎng)情況明顯好于野生型小苗，如圖4所示。
5.在125mM NaCl條件下，IP3K轉(zhuǎn)基因種子的萌發(fā)率也明顯高于野生型小苗，如圖5所示。
實(shí)施例31.用與實(shí)施例1相同的方法從擬南芥中克隆得到擬南芥多磷酸肌醇6-/3-激酶基因。并將擬南芥多磷酸肌醇6-/3-激酶基因插入到植物表達(dá)載體pBinAR-HPT中，構(gòu)建pBinAR-HPT/AtIP3K表達(dá)載體。并進(jìn)行轉(zhuǎn)基因鑒定。具體方法與實(shí)施例1相同。
2.將經(jīng)過(guò)篩選的轉(zhuǎn)基因種子在150mM和175mM NaCl濃度下萌發(fā)生長(zhǎng)，并與野生型擬南芥種子進(jìn)行對(duì)比。
3.對(duì)轉(zhuǎn)基因與野生型種子的萌發(fā)率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并觀察小苗的生長(zhǎng)。
4.在150mM NaCl條件下，IP3K轉(zhuǎn)基因種子的萌發(fā)率也明顯高于野生型小苗，如圖6所示。
5.對(duì)100mM，125mM，150mM，175mM NaCl濃度情況下IP3K轉(zhuǎn)基因植物與野生型植物萌發(fā)率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，均證明IP3K轉(zhuǎn)基因方法能夠提高植物的抗鹽能力，如圖7所示。
實(shí)施例41.植物表達(dá)載體pBinAR-HPT/AtIP3K的構(gòu)建將具有潮霉素篩選標(biāo)記的表達(dá)載體pBinAR-HPT首先用限制性內(nèi)切酶XbaI/SalI消化后，將載體純化后回收；同時(shí)，將cDNA文庫(kù)中擬南芥多磷酸肌醇6-/3-激酶基因用XbaI/XhoI酶切，然后將其回收后同載體連接，得到具有潮霉素篩選標(biāo)記的植物表達(dá)載體pBinAR-HPT/AtIP3K，如圖8所示。
2.煙草的遺傳轉(zhuǎn)化將植物表達(dá)載體pBinAR-HPT/AtIP3K導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404中(Zhang &Zeevaart 1999)，用含有pHXZ/BADH的農(nóng)桿菌培養(yǎng)液感染野生煙草葉切片，在共生培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基)上共培養(yǎng)2天后，轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基上(MS+1毫克/升6-BAP、0.1毫克/升NAA、25毫克/升潮霉素)；20-23天后，將再生的轉(zhuǎn)基因幼苗切下，轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上(MS+0.1毫克/升NAA、50毫克/升潮霉素)，誘導(dǎo)生根；14天后將已生根的幼苗轉(zhuǎn)移到土壤中培養(yǎng)，將收獲的T1種子播種在含有100毫克/升潮霉素的MS培養(yǎng)基上，篩選出純合體，對(duì)其進(jìn)行分子鑒定，如圖9所示。
3.轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性試驗(yàn)轉(zhuǎn)基因煙草在含有鹽(200mM)和潮霉素的培養(yǎng)基中萌發(fā)，去除隱性純合子以后拍照。野生型在含鹽(200mM)培養(yǎng)基中萌發(fā)。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因煙草萌發(fā)率明顯高于野生型煙草，如圖10所示。
SEQUENCE LISTING<110>武漢大學(xué)<120>多磷酸肌醇6-/3-激酶基因在植物抗鹽中的應(yīng)用<130>多磷酸肌醇6-/3-激酶基因在植物抗鹽中的應(yīng)用<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>903<212>DNA<213>擬南芥<400>1atgctcaagg tccctgaaca ccaagttgct ggtcacattg ctagtgatgg gaagctcggt 60ccactcgtag atgaccaagg ccggttcttc aagccacttc agggagattc tcgtggcgaa120cacgaggcta agttctatga gtctttcaca tcgaacatga aggttccaga tcacatccat180agatacttcc cggtgtatca cggcactcag ctagttgaag catctgatgg atctggcaag240cttcctcatc ttgttcttga tgatgttgtt tcagggtacg caaacccgtc ggtaatggat300gttaagattg gatctaggac atggtacccg gatgtatcag aagaatactt caagaaatgt360attaagaaag atagacagac caccacggtt tcgttggggt tcagggtttc aggttttaag420atttttgatc accaagaatc aagtttttgg agagctgaga agaagcttgt tcttgggtat480aatgcagatg gtgctagatt ggctctgagg aagtttgtgt catcgaactc tcccgctgac540tctaacttga caccaaactg tgcttttgca tcagaggttt atggcggttg taacgggatc600ttagcgcagt tgttggagct taaagattgg ttcgaaaccc aaacgcttta ccatttcaat660tcctgctcga ttctgatgat ttacgagaat gaatcaatct tgatgcaagg aggagatgat720gcaccggcac cacgggcaca agtgaagctg gtggatttcg cgcatgttct tgatggaaac780ggtgtcatcg accataattt cttgggtgga ctctgctctt tcataaagtt catcaaagat840attcttcaga gcgttgaaaa gcacgatgaa accgatactt ccctacttga gaacgggcgc900tag 903
<210>2<211>300<212>PRT<213>擬南芥<400>2Met Leu Lys Val Pro Glu His Gln Val Ala Gly His Ile Ala Ser Asp1 5 10 15Gly Lys Leu Gly Pro Leu Val Asp Asp Gln Gly Arg Phe Phe Lys Pro20 25 30Leu Gln Gly Asp Ser Arg Gly Glu His Glu Ala Lys Phe Tyr Glu Ser35 40 45Phe Thr Ser Asn Met Lys Val Pro Asp His Ile His Arg Tyr Phe Pro50 55 60Val Tyr His Gly Thr Gln Leu Val Glu Ala Ser Asp Gly Ser Gly Lys65 70 75 80Leu Pro His Leu Val Leu Asp Asp Val Val Ser Gly Tyr Ala Asn Pro85 90 95Ser Val Met Asp Val Lys Ile Gly Ser Arg Thr Trp Tyr Pro Asp Val100 105 110Ser Glu Glu Tyr Phe Lys Lys Cys Ile Lys Lys Asp Arg Gln Thr Thr115 120 125Thr Val Ser Leu Gly Phe Arg Val Ser Gly Phe Lys Ile Phe Asp His130 135 140Gln Glu Ser Ser Phe Trp Arg Ala Glu Lys Lys Leu Val Leu Gly Tyr145 150 155 160Asn Ala Asp Gly Ala Arg Leu Ala Leu Arg Lys Phe Val Ser Ser Asn165 170 175
Ser Pro Ala Asp Ser Asn Leu Thr Pro Asn Cys Ala Phe Ala Ser Glu180 185 190Val Tyr Gly Gly Cys Asn Gly Ile Leu Ala Gln Leu Leu Glu Leu Lys195 200 205Asp Trp Phe Glu Thr Gln Thr Leu Tyr His Phe Asn Ser Cys Ser Ile210 215 220Leu Met Ile Tyr Glu Asn Glu Ser Ile Leu Met Gln Gly Gly Asp Asp225 230 235 240Ala Pro Ala Pro Arg Ala Gln Val Lys Leu Val Asp Phe Ala His Val245 250 255Leu Asp Gly Asn Gly Val Ile Asp His Asn Phe Leu Gly Gly Leu Cys260 265 270Ser Phe Ile Lys Phe Ile Lys Asp Ile Leu Gln Ser Val Glu Lys His275 280 285Asp Glu Thr Asp Thr Ser Leu Leu Glu Asn Gly Arg290 295 300
權(quán)利要求
1.一種擬南芥多磷酸肌醇6-/3-激酶基因在植物抗鹽中的應(yīng)用。
2.一種多磷酸肌醇6-/3-激酶基因在受體植物中抗鹽的應(yīng)用。
3.一種與SEQ ID NO.1至少40％核苷酸同源性的核苷酸序列在植物抗鹽中的應(yīng)用。
4.一種與SEQ ID NO.2至少40％氨基酸同源性的氨基酸序列在植物抗鹽中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種擬南芥多磷酸肌醇6－/3－激酶基因在植物抗鹽中的應(yīng)用，通過(guò)從目的植物中克隆多磷酸肌醇6－/3－激酶基因，再通過(guò)分子生物學(xué)和轉(zhuǎn)基因手段，以適當(dāng)方式將該基因連接到相應(yīng)載體上并生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物。該基因?yàn)榻鉀Q植物、糧食和經(jīng)濟(jì)作物在高鹽環(huán)境存活率低、生長(zhǎng)緩慢和產(chǎn)量低的問(wèn)題提供一種技術(shù)途徑。將有利于植物在高鹽地區(qū)的推廣以及保持產(chǎn)量的正常。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1760361SQ20051001848
公開(kāi)日2006年4月19日 申請(qǐng)日期2005年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月30日
發(fā)明者夏惠君, 張洪霞 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)