專利名稱：乳制品中雙歧桿菌檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于食品檢測領(lǐng)域，具體涉及一種奶粉或酸奶中雙歧桿菌的檢測方法。
背景技術(shù)：
雙歧桿菌(Bifidobacterium)是發(fā)現(xiàn)最早的生理性細菌之一，自從1899年被Tissier博士第一次分離得到，對雙歧桿菌的研究日益受到各國學(xué)者的重視。雙歧桿菌具有調(diào)節(jié)腸道菌群、降低膽固醇、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、合成維生素等一系列生理功能，對人體健康有著十分重要的意義，被譽為益生菌中的“佼佼者”，正因為雙歧桿菌具有特殊的生理功能和保健作用，因此成為微生態(tài)保健食品常用的益生菌。
對雙歧桿菌制品開發(fā)應(yīng)用的研究，始于50年代中期，日本生物科學(xué)研究所首先研制出應(yīng)用于嬰幼兒的雙歧桿菌制品。進入80年代，各國的各大公司及科研機構(gòu)也都紛紛加入雙歧桿菌制品的開發(fā)應(yīng)用研究中，目前世界各先進國家都有雙歧桿菌制品投放市場，中國雖然起步晚，但也有商家在嘗試性推出此類產(chǎn)品。市場上雙歧桿菌制品的種類繁多，按其功能可分為含雙歧桿菌食品、含雙歧桿菌或雙歧桿菌生產(chǎn)促進物質(zhì)的特殊保健食品和雙歧桿菌藥品等。雙歧桿菌酸奶指以鮮牛奶為原料，添加雙歧桿菌或內(nèi)含雙歧桿菌的混合菌種進行發(fā)酵培養(yǎng)而成的酸奶產(chǎn)品。
雙歧桿菌具有的特殊生理功能和保健功能是眾所周知的，在國外已開發(fā)的益生菌制品很多，而國內(nèi)該類產(chǎn)品還未達到普及的程度，目前隨著雙歧桿菌乳制品種類和數(shù)量的不斷增加，有關(guān)雙歧制品的許多問題應(yīng)該法規(guī)化、程序化，對雙歧桿菌的攝取量、活菌數(shù)量和菌數(shù)檢測方法仍沒有明確的規(guī)定，尤其是混合發(fā)酵乳制品中雙歧桿菌測定十分困難。
《GB/T 16347-1997》中只規(guī)定了乳酸菌活菌數(shù)的檢測方法，2004年國家才發(fā)布了雙歧桿菌檢測方法《GB/T 4789.34-2003》，在這個標(biāo)準(zhǔn)中是采用非選擇培養(yǎng)基計數(shù)，這種方法雖然可以實現(xiàn)雙歧桿菌的活菌檢測，但不具有很好的鑒別性，鏈球菌、乳桿菌和其他類型菌都會在其上生長增殖，計數(shù)時還需要進一步對菌落鑒定，加大了計數(shù)的工作量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種準(zhǔn)確、簡便的雙歧桿菌檢測方法。發(fā)明人為了選擇性地檢測雙歧桿菌，在培養(yǎng)基中添加抗菌素或其他試劑，使得培養(yǎng)基對其他雜菌有一定程度的抑制，而對雙歧桿菌抑制作用很小。發(fā)明人通過正交實驗得到了雙歧桿菌選擇性計數(shù)的最適抗菌素配比和用量，從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明提供了一種乳制品中雙歧桿菌的檢測方法，其特征在于，在檢測培養(yǎng)基中添加抗菌素；其中檢測培養(yǎng)基TPY培養(yǎng)基、BBL培養(yǎng)基、BL培養(yǎng)基或MRS培養(yǎng)基。
其中TPY培養(yǎng)基的配方為胰酶解酪朊10g大豆蛋白胨5g葡萄糖5g低聚果糖 5g酵母粉5g吐溫-80 1gK2HPO42gMgCl2·6HO20.5gZnSO4·7HO20.25gFeCl30.05g
CaCl20.15g西紅柿汁 200mLL-半胱氨酸鹽酸 0.5g蒸餾水 定容至1000mLpH 7.2±0.1其中BBL培養(yǎng)基的配方為蛋白胨 15g酵母粉 2g葡萄糖 20g可溶性淀粉 0.5g氯化鈉 5g5％L-半胱氨酸鹽酸 10ml西紅柿浸出液 400ml肝浸液 80ml吐溫80 1ml瓊脂 20g蒸餾水 定容至1000mLPH 7.0±0.1其中BL培養(yǎng)基的配方為胰胨 5g蛋白胨 5g植物胨 3g酵母粉 2g葡萄糖 10g可溶性淀粉 0.5g牛肉膏 3g吐溫80 1.0ml
A液10mlB液5ml肝提取液 150ml瓊脂 20g5％L-半胱氨酸鹽酸 10ml蒸餾水 定容至1000mLPH 7.2±0.1其中A液磷酸二氫鉀10g、磷酸氫二鉀10g定容至100ml；B液硫酸鎂10g、硫酸鐵0.5g、氯化鈉0.5g、硫酸錳0.337g定容至250ml。
本發(fā)明所述方法，其中抗菌素選自氯化鋰、丙酸鈉、雙氯青霉素中的一種或多種；優(yōu)選的抗菌素溶液配比量為每100ml液體培養(yǎng)基30％氯化鋰 0.5-3.0ml30％丙酸鈉 1.0-5.0ml10％雙氯青霉素 0.1-1.0ml。
本發(fā)明所述方法詳述如下1、主要設(shè)備生化培養(yǎng)箱、厭氧培養(yǎng)箱、顯微鏡、無菌超凈工作臺；高壓滅菌鍋；干熱滅菌箱；無菌注射器；無菌過濾器(孔徑為0.45μm)等。
2、培養(yǎng)基和試劑培養(yǎng)基TPY培養(yǎng)基，115℃，15-20min滅菌；BBL培養(yǎng)基，115℃，15-20min滅菌。BL培養(yǎng)基115℃，15-20min滅菌。
稀釋水為質(zhì)量分數(shù)0.85％生理鹽水用于稀釋待測樣品。
3、抗菌素溶液氯化鋰用無菌蒸餾水配制成質(zhì)量分數(shù)30％溶液；丙酸鈉用無菌蒸餾水配制成質(zhì)量分數(shù)10％溶液；雙氯青霉素用無菌蒸餾水配制成5×10-6溶液。
抗菌素溶液配比量為每100ml液體培養(yǎng)基30％氯化鋰0.5-3.0ml、30％丙酸鈉1.0-5.0ml、10％雙氯青霉素0.1-1.0ml。
4、按GB/T 4789.34-2003雙歧桿菌檢測的操作步驟和菌種鑒定方法進行檢測。
5、通過幾批樣品的檢測，在該三種選擇性培養(yǎng)基上厭氧培養(yǎng)后只有一種菌落生長即雙歧桿菌菌落，得到的活菌數(shù)與實際含量非常接近，這說明此抗菌素配比可以最大程度抑制其他菌的生長同時對雙歧桿菌生長的抑制很小。
雙歧桿菌的測定要選擇適合雙歧桿菌生長的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基又分為非選擇性培養(yǎng)基和選擇性培養(yǎng)基兩種?？捎糜跈z測雙歧桿菌的培養(yǎng)基有TPY、BBL、BL、MRS等，但上述培養(yǎng)基是非選擇性的，為了選擇性地檢測雙歧桿菌，要在培養(yǎng)基中添加抗菌素或其他試劑，這樣可以對其他雜菌有一定程度的抑制。本研究主要針對氯化鋰、丙酸鈉、雙氯青霉素3種抗菌素進行研究，通過正交實驗得到雙歧桿菌選擇性計數(shù)的最適抗菌素配比和用量。
本發(fā)明所述的乳制品中雙歧桿菌的檢測方法，具有很好的鑒別性，鏈球菌、乳桿菌和其他類型菌都不會在其檢測培養(yǎng)基上生長增殖，計數(shù)工作量大大降低，具有準(zhǔn)確、簡便的特點。
具體實施例方式
實施例1待測樣品已知雙歧桿菌活菌數(shù)(5×1011cfu/g)的奶粉樣品樣品的制備將已知活菌數(shù)的雙歧桿菌菌粉按一定比例與嗜酸乳桿菌菌粉干混均勻后，添加到奶粉中，待測。
按配方配制BL培養(yǎng)基胰胨5g、蛋白胨5g、植物胨3g、酵母粉2g、葡萄糖10g、可溶性淀粉0.5g、牛肉膏3g、吐溫80 1.0ml、A液10ml、B液5ml、肝提取液150ml、瓊脂20g、5％L-半胱氨酸鹽酸10ml、蒸餾水定容至1000mL。
其中A液磷酸二氫鉀10g、磷酸氫二鉀10g定容至100ml；B液硫酸鎂10g、硫酸鐵0.5g、氯化鈉0.5g、硫酸錳0.337g定容至250ml。
調(diào)PH7.2±0.1；115℃，20min滅菌。A液B液20min滅菌。
于培養(yǎng)基中添加抗菌素，每100ml液體培養(yǎng)基30％氯化鋰0.5ml30％丙酸鈉2.0ml10％雙氯青霉素0.3ml。
按GB/T 4789.34-2003雙歧桿菌檢測的操作步驟和菌種鑒定方法進行檢測。
結(jié)果雙歧桿菌活菌數(shù)為4.2×1011cfu/g實施例2待測樣品已知雙歧桿菌活菌數(shù)(5×1011cfu/g)的奶粉樣品樣品的制備將已知活菌數(shù)的雙歧桿菌菌粉按一定比例與嗜熱鏈球菌菌粉干混均勻后，添加到奶粉中，待測。
按配方配制BBL培養(yǎng)基蛋白胨15g、酵母粉2g、葡萄糖20g、可溶性淀粉0.5g、氯化鈉5g、5％L-半胱氨酸鹽酸10ml、西紅柿浸出液400ml、肝浸液80ml、吐溫80 1ml、瓊脂20g、蒸餾水定容至1000mL。調(diào)PH至7.1，115℃，15min滅菌。
于培養(yǎng)基中添加抗菌素，每100ml液體培養(yǎng)基30％氯化鋰1.0ml30％丙酸鈉3.0ml10％雙氯青霉素0.5ml。
按GB/T 4789.34-2003雙歧桿菌檢測的操作步驟和菌種鑒定方法進行檢測。
結(jié)果雙歧桿菌活菌數(shù)為4.5×1011cfu/g
實施例3待測樣品實驗室制備的酸奶樣品按配方配制TPY培養(yǎng)基胰酶解酪朊10g、大豆蛋白胨5g、葡萄糖5g、低聚果糖5g、酵母粉5g、吐溫-80 1g、K2HPO42g、MgCl2·6HO20.5g、ZnSO4·7HO20.25g、FeCl30.05g、CaCl20.15g、西紅柿汁200mL、L-半胱氨酸鹽酸0.5g、定容至1000mL調(diào)pH＝7.2，115℃，15-20min滅菌。
于培養(yǎng)基中添加抗菌素，每100ml液體培養(yǎng)基30％氯化鋰1.5ml30％丙酸鈉3.0ml10％雙氯青霉素0.7ml按GB/T 4789.34-2003雙歧桿菌檢測的操作步驟和菌種鑒定方法進行檢測。
結(jié)果雙歧桿菌活菌數(shù)為2.6×109cfu/g。
權(quán)利要求
1.乳制品中雙歧桿菌檢測方法，其特征在于，在檢測培養(yǎng)基中添加抗菌素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其中檢測培養(yǎng)基選自TPY培養(yǎng)基、BBL培養(yǎng)基、BL培養(yǎng)基或MRS培養(yǎng)基。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其中TPY培養(yǎng)基的配方為胰酶解酪朊10g大豆蛋白胨5g葡萄糖5g低聚果糖 5g酵母粉5g吐溫-80 1gK2HPO42gMgCl2·6HO20.5gZnSO4·7HO20.25gFeCl30.05gCaCl20.15g西紅柿汁 200mLL-半胱氨酸鹽酸0.5g蒸餾水定容至1000mLpH7.2±0.1
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其中BBL培養(yǎng)基的配方為蛋白胨15g酵母粉2g葡萄糖20g可溶性淀粉0.5g氯化鈉5g5％L-半胱氨酸鹽酸 10ml西紅柿浸出液 400ml肝浸液80ml吐溫801ml瓊脂 20g蒸餾水定容至1000mLpH7.0±0.1
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其中BL培養(yǎng)基的配方為胰胨 5g蛋白胨5g植物胨3g酵母粉2g葡萄糖10g可溶性淀粉0.5g牛肉膏3g吐溫801.0mlA液 10mlB液 5ml肝提取液 150ml瓊脂 20g5％L-半胱氨酸鹽酸 10ml蒸餾水定容至1000mLPH7.2±0.1其中A液磷酸二氫鉀10g、磷酸氫二鉀10g定容100ml；B液硫酸鎂10g、硫酸鐵0.5g、氯化鈉0.5g、硫酸錳0.337g定容至250ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其中抗菌素選自氯化鋰、丙酸鈉、雙氯青霉素中的一種或多種。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述方法，其中抗菌素溶液配比量每100ml液體培養(yǎng)基30％氯化鋰 0.5-3.0ml30％丙酸鈉 1.0-5.0ml10％雙氯青霉素 0.1-1.0ml。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種乳制品中雙歧桿菌的檢測方法，在培養(yǎng)基中添加抗菌素抑制其他雜菌生長，從而選擇性地檢測雙歧桿菌。本發(fā)明主要針對氯化鋰、丙酸鈉、雙氯青霉素3種抗菌素進行研究，得到雙歧桿菌選擇性計數(shù)的最適抗菌素配比和用量。本發(fā)明所述方法具有準(zhǔn)確、簡便的特點。
文檔編號C12Q1/04GK1880471SQ200510011930
公開日2006年12月20日 申請日期2005年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月14日
發(fā)明者焦發(fā)道, 徐敬華, 夏元軍, 孟祥晨, 呂文君, 王占東, 軒詩海 申請人:黑龍江省完達山乳業(yè)股份有限公司