專利名稱：構(gòu)建bac亞克隆庫(kù)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及BAC亞克隆的制備。
背景技術(shù)：
生物體全基因組測(cè)序意義非比尋常，通過(guò)對(duì)全基因組序列的分析可以獲得大量的遺傳信息，為功能基因組學(xué)和比較基因組學(xué)等研究奠定基礎(chǔ)。測(cè)定生物體的基因組序列，鑒定序列的生物學(xué)功能，研究生物體的進(jìn)化規(guī)律，已成為生命科學(xué)研究領(lǐng)域的熱門課題。
克隆步移法是常用的測(cè)序法之一。其基本環(huán)節(jié)包括構(gòu)建基困組DNA大片段BAC庫(kù)；利用高密度的遺傳圖譜和BAC克隆的指紋圖譜將BAC克隆定位到染色體上，構(gòu)建基于BAC克隆的全基因組物理圖譜；BAC克隆的亞克隆庫(kù)構(gòu)建；亞克隆測(cè)序、組裝，獲得BAC插入片段序列；最后，將重疊BAC克隆的序列拼接獲得全基因組序列。
構(gòu)建BAC亞克隆庫(kù)是克隆步移法測(cè)序的重要環(huán)節(jié)之一。大規(guī)?；蚪M測(cè)序，要求構(gòu)建出高質(zhì)量的BAC亞克隆庫(kù)，即具有足夠的克隆數(shù)，無(wú)或極少有大腸桿菌基因組DNA污染，空克隆少。目前普遍采用價(jià)格昂貴的試劑盒、按照繁瑣的操作規(guī)程構(gòu)建BAC亞克隆庫(kù)，既增加建庫(kù)成本和工作量，又極易造成DNA的污染，最終影響亞克隆庫(kù)的質(zhì)量。如用QIAGEN試劑盒抽提一個(gè)BAC克隆DNA的成本就為30美元，構(gòu)建一個(gè)BAC亞克隆庫(kù)的費(fèi)用則需50美元左右。按玉米全基因組測(cè)序需構(gòu)建15,000個(gè)亞克隆庫(kù)計(jì)，花費(fèi)高達(dá)750,000美元。針對(duì)這些問(wèn)題，我們?cè)O(shè)計(jì)了一系列獨(dú)特的操作步驟，利用國(guó)產(chǎn)廉價(jià)的試劑盒，按照簡(jiǎn)便的操作程序，便可達(dá)到構(gòu)建高質(zhì)量BAC亞克隆庫(kù)的目的，而費(fèi)用大大降低，構(gòu)建一個(gè)亞克隆庫(kù)約需15美元左右。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種簡(jiǎn)便、廉價(jià)、快速、高效的BAC亞克隆庫(kù)構(gòu)建方法。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是現(xiàn)有構(gòu)建BAC亞克隆庫(kù)的方法步驟復(fù)雜繁瑣、費(fèi)用昂貴，且易存在DNA的污染，影響亞克隆庫(kù)的質(zhì)量。
本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)施構(gòu)建BAC亞克隆庫(kù)的主要環(huán)節(jié)包括BAC DNA的提取和純化；BAC DNA的片段化及末端修補(bǔ)；目標(biāo)片段的回收及與載體的連接；連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化。而DNA的量和純度，對(duì)于構(gòu)建高質(zhì)量的BAC亞克隆庫(kù)十分關(guān)鍵。
本發(fā)明技術(shù)方案包括以下步驟
(一)BAC DNA的提取利用Solution I、Solution II和Solution III(配制方法參見(jiàn)Sambrook和Russell編寫的《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》第三版)，采用堿裂解法大量制備BAC DNA，由于粗提物含較多RNA，利用RNase酶處理粗提物，用氯仿抽提去除RNase酶，再用異丙醇沉淀DNA；(二)BAC DNA的純化回收利用普通瓊脂糖膠，低電壓、長(zhǎng)時(shí)間電泳，使共價(jià)閉環(huán)BAC DNA與大腸桿菌基因組DNA片段充分分開(kāi)。切取超螺旋BAC DNA，用溶膠液(國(guó)產(chǎn))溶解瓊脂糖膠，用注射器簡(jiǎn)單抽打BAC DNA使之?dāng)嗔褳椤?0kb的片段，這樣便可用國(guó)產(chǎn)的凝膠回收試劑盒回收純化BAC DNA，其中，對(duì)試劑盒的使用進(jìn)行了改進(jìn)，即先用去蛋白液(國(guó)產(chǎn))洗滌吸附有DNA的離心柱，再按使用說(shuō)明漂洗及洗脫DNA，使用該方法有效避免了大腸桿菌基因組DNA的污染，回收到足量(回收率＞85％)且純凈的BAC DNA；(三)BAC DNA的片段化及末端修補(bǔ)采用GeneMachines公司的HydroshearDNA剪切儀對(duì)BAC DNA大片段進(jìn)一步剪切，剪切的片段集中在2.5-5kb之間。為確保后續(xù)酶學(xué)反應(yīng)的高效性，利用國(guó)產(chǎn)的PCR產(chǎn)物純化試劑盒對(duì)片段化后的BACDNA進(jìn)一步純化，得到了回收率＞90％、純凈的BAC DNA，采用EPICENTRE的End-ItTMDNA末端修補(bǔ)試劑盒對(duì)BAC DNA片段末端進(jìn)行修補(bǔ)；
(四)目標(biāo)片段的回收及與載體的連接采用普通瓊脂糖膠，利用國(guó)產(chǎn)的凝膠回收試劑盒，回收2.5-5kb之間的DNA片段，連接反應(yīng)按4∶1(外源DNA片段∶載體)的比例，16℃連接過(guò)夜；(五)連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化為了提高轉(zhuǎn)化率、獲得足夠的克隆，通常用乙醇沉淀法濃縮連接產(chǎn)物中的DNA，此方法的弊端之一是極易造成DNA丟失，在此，利用國(guó)產(chǎn)的PCR產(chǎn)物純化試劑盒，有效去除連接反應(yīng)液中的蛋白和離子，高效純化濃縮DNA，電擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞(感受態(tài)細(xì)胞制備方法參見(jiàn)Sambrook和Russell編寫的《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》第三版)，每次轉(zhuǎn)化可獲得1500個(gè)以上的克隆。
本發(fā)明的技術(shù)效果價(jià)廉、操作簡(jiǎn)便、快速、高效。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)玉米BAC亞克隆庫(kù)的構(gòu)建實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作出解釋和說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不受具體實(shí)施例的限制?？梢灶A(yù)見(jiàn)到，構(gòu)建不同來(lái)源的BAC亞克隆庫(kù)可參照本實(shí)施例實(shí)現(xiàn)。
(一)BAC DNA的提取1、1.5ml管中加入200μl 2×YT(含12.5μg/ml的氯霉素)培養(yǎng)基，接種相應(yīng)的BAC菌種，于37℃、150rpm培養(yǎng)6hr；
2、250ml三角瓶中加入50ml 2×YT(含12.51μg/ml的氯霉素)培養(yǎng)基，取1中培養(yǎng)物50μl于其中，于37℃、250rpm培養(yǎng)14hr；3、用50ml離心管，于4℃以6500rpm離心10min收菌；4、吸去培養(yǎng)液，于4℃以6500rpm離心1min去盡殘液，獲細(xì)菌沉淀；5、加入4ml預(yù)冷的Solution I，劇烈振蕩，使茵體充分散開(kāi)；6、加入8ml新制的Solution II，快速混均(不超過(guò)5min)；7、加入6ml預(yù)冷的Solution III，輕輕混均，冰上放置5-10min；8、于4℃以11000rpm離心15min，吸上清于一50ml新管；9、加入0.7V異丙醇，混均，于4℃以12000rpm離心15min；10、棄上清，并于4℃以12000rpm離心30秒，去盡殘液；11、用800μl TE溶解沉淀，并轉(zhuǎn)入2ml離心管中；12、加入10μl RNase酶(10mg/ml)，于37℃以50rpm處理1hr；13、加入1V氯仿，充分混均，以12600rpm離心15min；14、取水相于一新管，加入1/10V 3MNaAc(pH5.2)和0.7V異丙醇，充分混均，并以12600rpm離心15min；15、棄上清，并以12000rpm離心30秒，去盡殘液；
16、用70％乙醇以12600rpm離心5min洗沉淀，去上清及殘留；17、室溫放置約10min使乙醇揮發(fā)盡；18、加入160μl TE溶解沉淀；(二)BAC DNA的純化回收1、制備1％TAE瓊脂糖膠；2、在160μl的粗提物中加入6×Loading Buffer后上樣；3、低電壓(約80V)、長(zhǎng)時(shí)間(約3hr)電泳，使超螺旋BAC DNA與大腸桿菌基因組DNA片段等充分分開(kāi)；4、切取超螺旋BAC DNA，稱重；5、加3V溶膠液PN，于50℃至膠完全溶解；6、用100μl注射器抽打BAC DNA一次，使之?dāng)嗔褳椤?0kb的片段；用天為時(shí)代的離心柱型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收純化BAC DNA；7、將以上溶液加入普通型(CB2)吸附柱，以12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液；8、用500μl去蛋白液PD洗吸附柱，以12000rpm離心1min，棄廢液；9、用800μl漂洗液PW洗吸附柱，以12000rpm離心1min，棄廢液；
10、用500μl漂洗液再洗吸附柱，以12000rpm離心1min，棄廢液；11、將吸附柱放回收集管，以12600rpm離心2min，盡量去除漂洗液；12、取出吸附柱，放入一干凈離心管；在吸附膜中間加入200μl洗脫緩沖液EB(65℃預(yù)熱)，室溫放置2min，12600rpm離心1min收集BAC DNA溶液；-20℃保存；(三)BAC DNA的片段化及純化1、片段化前，應(yīng)確保BAC DNA完全溶解且溶液中無(wú)雜質(zhì)無(wú)氣泡；2、用GeneMachines公司的HydroshearDNA剪切儀，按使用說(shuō)明剪切BAC DNA大片段；本項(xiàng)目選用的參數(shù)為Volume(200μl)、Speed code(12)、Cycle(20)；剪切后片段大小集中在2.5-5kb之間；3、用天為時(shí)代的離心柱型PCR產(chǎn)物純化試劑盒對(duì)片段化后的BAC DNA進(jìn)一步純化，以確保后續(xù)酶學(xué)反應(yīng)的高效性；具體操作如下4、在片段化后的BAC DNA溶液中，加入5V的結(jié)合液PB(50℃預(yù)熱)，充分混均，轉(zhuǎn)入超薄型(CB1)吸附柱；室溫放置1min；12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液；
5、用700μl漂洗液PW洗吸附柱，以12000rpm離心30秒，棄廢液；6、用500μl漂洗液再洗吸附柱，以12000rpm離心30秒，棄廢液；7、將吸附柱放回收集管，以12600rpm離心2min，盡量去除漂洗液；8、取出吸附柱，放入一干凈離心管；在吸附膜中間加入40μl洗脫緩沖液EB(65℃預(yù)熱)，室溫放置1min；12000rpm離心1min收集溶液；(四)片段化后的末端修補(bǔ)用EPICENTRE的End-ItTMDNA末端修補(bǔ)試劑盒對(duì)BACDNA末端修補(bǔ)；具體操作如下1、50μl反應(yīng)體系中包含34μl 片段化后的BAC DNA溶液5μl10×End-Repair Buffer5μl2.5mM dNTP Mix5μl10mM ATP1μlEnd-Repair Enzyme Mix2、于16℃溫育14hr；3、70℃處理10min使酶失活，終止反應(yīng)；
(五)目標(biāo)片段的純化回收1、制備1％TAE瓊脂糖膠；2、在50μl修補(bǔ)液中加6×Loading Buffer，上樣、電泳；3、用天為時(shí)代的離心柱型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(CB1超薄型吸附柱)，回收純化2.5-5kb之間的DNA片段；最后用20μl洗脫液洗脫；(六)目標(biāo)片段與載體的連接1、20μl 連接反應(yīng)體系含xμl 去離子水2μl 10x T4DNA連接酶緩沖液2μl 50％PEG 600050ng pBluescriptII KS+(EcoR V酶切/CIP去磷酸化)200ng DNA片段0.8μl T4DNA連接酶2、于16℃連接14hr；3、用天為時(shí)代的離心柱型PCR產(chǎn)物純化試劑盒(CB1超薄型吸附柱)濃縮純化連接產(chǎn)物DNA；最后用10μl洗脫液洗脫；(七)連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化在20μl的大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞中加入2μl濃縮純化的連接產(chǎn)物DNA；按電擊轉(zhuǎn)化的常規(guī)程序操作。
按以上過(guò)程，構(gòu)建的玉米BAC亞克隆庫(kù)克隆數(shù)超過(guò)1500，空克隆和大腸桿菌DNA污染率低于5％，插入片段平均為3kb。
權(quán)利要求
1.一種BAC亞克隆庫(kù)的構(gòu)建方法，包括以下步驟BAC DNA的提取和純化；BAC DNA的片段化及末端修補(bǔ)；目標(biāo)片段的回收及與載體的連接；連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化。
2.權(quán)利要求1的方法，其中BAC DNA的提取和純化中包括用去蛋白液PD洗吸附柱。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中BAC DNA的片段化用GeneMachines公司的HydroshearDNA剪切儀按說(shuō)明書進(jìn)行。
4.權(quán)利要求1或2的方法，其中BAC DNA的末端修補(bǔ)用EPICENTRE的End-ItTMDNA末端修補(bǔ)試劑盒按說(shuō)明書進(jìn)行。
5.權(quán)利要求1或2的方法，其中的載體選用商業(yè)化的pBluescriptIIKS+載體。
6.權(quán)利要求1或2的方法，其中連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞中。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種改進(jìn)的BAC亞克隆庫(kù)構(gòu)建方法。主要通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)BAC DNA的提取和純化；BAC DNA的片段化及末端修補(bǔ)；目標(biāo)片段的回收及與載體的連接；連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化。以玉米為例，構(gòu)建的BAC亞克隆庫(kù)中，克隆數(shù)超過(guò)1500，空克隆和大腸桿菌DNA污染率低于5％，插入片段平均為3kb。該方法具有簡(jiǎn)便、廉價(jià)、快速、高效的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12P19/00GK1884575SQ200510011979
公開(kāi)日2006年12月27日 申請(qǐng)日期2005年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月21日
發(fā)明者徐明良, 田秀紅, 李建生, 戴景瑞, 鄭德剛, 楊琴 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)