專利名稱：運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子基因序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼一組特化(specialized)蛋白質(zhì)的人類基因，所述蛋白質(zhì)促進(jìn)選定神經(jīng)元群體的生長(zhǎng)、維持、存活和功能能力。
背景技術(shù)：
神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子(neuronotrophic factor NTF)是一組特化的蛋白質(zhì)，其功能是促進(jìn)選定神經(jīng)元群體的存活、生長(zhǎng)、維持和功能能力。最近的研究證明，在某些生長(zhǎng)和發(fā)育階段在脊椎動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)生神經(jīng)元死亡。然而，添加來(lái)自相關(guān)靶組織的可溶性神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子有助于減輕這種神經(jīng)元死亡現(xiàn)象。下列引文討論了神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子(將其內(nèi)容收入本文作為參考)Chau，R.M.W.等，1990，NeuronotrophicFactor，Chin.J.Neuroanatomy 6，129；Kuno，M.，1990，TargetDependence of Motoneuronal SurvivalThe Current Status，Neurosci.Res.9，155；Bard，Y.A.，1989，Trophic Factors andNeuronal Survival，Neuron 2，1525；Oppenheim，R.W.，1989，TheNeurotrophic Theory and Naturally Occurring Motoneuron Death，TINS 12，252；Bard Y.A.，1988，What，If Anything，is a NeurotrophicFactor？，TINS 11，343；以及Thoenen，H.和Edgar，D.，1985，Neurotrophic Factors，Science 229，238。
在脊椎動(dòng)物的神經(jīng)肌肉系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)，胚胎運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活依賴衍生自相關(guān)發(fā)育的骨骼肌的特異營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。已經(jīng)通過(guò)體內(nèi)和體外兩種研究證明，骨骼肌生成的物質(zhì)能夠通過(guò)預(yù)防胚胎運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元退化及后續(xù)天然細(xì)胞死亡而增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活和發(fā)育。見(jiàn)O′Brian，R.J.和Fischbach，G.D.，1986，Isolation of Embryonic Chick Motoneuronsand Their Survival In Vitro，J.Neurosci.6，3265；Hollyday，M.和Hamburger，V.，1976，Reduction of the Naturally Occurring MotorNeuron Loss by Enlargement of the Periphery，J.Comp.Neurol.170，311(將其內(nèi)容收入本文作為參考)。類似的，幾位研究人員報(bào)告，雞和大鼠骨骼肌具有某些營(yíng)養(yǎng)因子，它們能夠在體內(nèi)和在體外兩種條件下預(yù)防胚胎運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的天然細(xì)胞死亡。見(jiàn)McManaman，J.L.等，1988，Purification of a Skeletal Muscle Polypeptide WhichStimulates Choline Acetyltransferase Activity in CulturedSpinal Cord Neurons，J.Biol.Chem.263，5890；Oppenheim，R.W.等，1988，Reduction of Naturally Occurring Motoneuron Death InVitro by a Target Derived Neurotrophic Factor，Science 240，919；以及Smith，R.G.等，1986，Selective Effects of SkeletalMuscle Extract Fractions on Motoneurons Development In Vivo，J.Neurosci.6，439(將其內(nèi)容收入本文作為參考)。
另外，已經(jīng)由大鼠骨骼肌分離得到一種多肽，發(fā)現(xiàn)它選擇性增強(qiáng)雞胚運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元在體內(nèi)的存活，以及膽堿乙酰基轉(zhuǎn)移酶在這些運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中的活性。這種多肽命名為膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶發(fā)育因子(CDF)，而且已經(jīng)證明它的生物學(xué)功能與其它營(yíng)養(yǎng)因子不同，諸如神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、睫狀神經(jīng)節(jié)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)、腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(RGNTF)。見(jiàn)Levi-Montalcini，R.，1982，Developmental Neurobiology and theNatural History of Nerve Growth Factor，Ann.Rev.Neurosci.5，341；Varon，S.等，Growth Factors，在《Advances in Neurology》第47卷“Functional Recovery in Neurological Disease”中，Waxman，S.G.編，Raven出版社，紐約，第493-521頁(yè)，1988；Barde，Y.A.，1989，Trophic Factors and Neuronal Survival，Neuron2，1525；以及Chau，R.M.W.等，1991，The Effect of a 30kD Proteinfrom Tectal Extract of Rat on Cultured Retinal Neurons，Sciencein China，Series B，34，908(將其內(nèi)容收入本文作為參考)。
已經(jīng)報(bào)告了來(lái)自大鼠肌肉組織、表觀分子量35kD和22kD的兩種運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子的分離和鑒定。見(jiàn)Chau，R.M.W.等，MuscleNeuronotrophic Factors Specific for Anterior Horn Motoneuronsof Rat Spinal Cord，在《Recent Advances in Cellular and MolecularBiology》第5卷中，Peeters出版社，Leuven，比利時(shí)，第89-94頁(yè)，1992。表觀分子量35kD蛋白質(zhì)命名為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子1(MNTF1)，而表觀分子量22kD蛋白質(zhì)命名為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子2(MNTF2)。已經(jīng)在體外證明，這兩種營(yíng)養(yǎng)因子支持大鼠腰部脊髓的分離前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和脊髓外植體二者的生長(zhǎng)和/或再生。
后來(lái)報(bào)告了，由人成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤cDNA文庫(kù)克隆得到人MNTF1基因片段。見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)6,309,877。將人MNTF1 cDNA片段亞克隆到表達(dá)載體中，而所表達(dá)融合蛋白中包含的MNTF1多肽片段顯示與“天然”MNTF1蛋白相似的生物學(xué)活性，即它支持大鼠前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的體外生長(zhǎng)。
盡管已經(jīng)測(cè)定了MNTF1的多個(gè)生物學(xué)方面，而且已經(jīng)報(bào)告了編碼具有MNTF活性的肽的cDNA片段，然而尚未公布人MNTF1的全長(zhǎng)cDNA。由此，仍然需要測(cè)定可用于在人染色體DNA的特定區(qū)域內(nèi)定位整個(gè)MNTF基因的其它MNTF cDNA序列。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及定位于染色體16q22內(nèi)、編碼運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子(特別是與MNTF1有關(guān)的多肽，包括與MNTF1具有相同上游調(diào)控序列即啟動(dòng)子和/或轉(zhuǎn)錄起始序列的MNTF相關(guān)多肽)的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及新型DNA序列，包括編碼幾個(gè)開(kāi)放讀碼框的cDNA，其包括至少一個(gè)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子，對(duì)應(yīng)于MNTF基因的人染色體DNA；包含這些新DNA序列的載體；包含這些新DNA序列的表達(dá)系統(tǒng)和相關(guān)宿主；合成的MNTF肽；以及由上述表達(dá)系統(tǒng)生成的新重組人MNTF1蛋白。本發(fā)明的其它方面包括雜交流程中所使用的MNTF相關(guān)引物和探針，以及這些測(cè)定法中所使用的組成物、試劑盒和實(shí)驗(yàn)材料組(panel)。
附圖描述相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員通過(guò)參照附圖可以更好的理解本發(fā)明并領(lǐng)會(huì)其優(yōu)點(diǎn)，其中

圖1顯示了MNTF1基因在成人MTC實(shí)驗(yàn)材料組(panel)(Clontech)中的表達(dá)型式；圖2顯示了MNTF1基因在胎兒MTC實(shí)驗(yàn)材料組(Clontech)中的表達(dá)型式；圖3顯示了通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)由六種不同人體組織分離得到的總RNA的分析垂體(第1道)、胎盤(第2道)、腦(第3道)、視網(wǎng)膜(第4道)、心(第5道)和胎兒肌肉(第6道)；圖4顯示了通過(guò)RACE流程由來(lái)自垂體(第1道)、胎盤(第2道)、胎兒和成人腦(第3道)、視網(wǎng)膜(第4道)、心(第5道)和胎兒肌肉(第6道)的總RNA生成的DNA片段；圖5顯示了來(lái)自垂體組織的MNTF cDNA與16號(hào)染色體序列的比對(duì)；圖6通過(guò)DNA測(cè)序證實(shí)了cDNA相對(duì)于16號(hào)染色體序列的兩個(gè)位置的變異。
發(fā)明描述本發(fā)明涉及神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子家族，以及編碼這些因子的基因，所述因子具有對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元發(fā)揮營(yíng)養(yǎng)和向性作用的能力。已經(jīng)證明，分離的因子、重組的因子和化學(xué)合成的多肽因子能夠誘導(dǎo)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的繼續(xù)存活和神經(jīng)突派生。見(jiàn)例如美國(guó)專利號(hào)6,309,877和2004年1月21日提交的國(guó)際PCT專利申請(qǐng)“MNTF Peptides and Compositions andMethods of Use”，后者要求2003年1月21日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/441,772的權(quán)益，將其完整收入本文作為參考。因此，將這些因子歸類為“運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子”或“MNTF”。此外，MNTF顯示抗疤和抗炎作用，在神經(jīng)病、神經(jīng)性疼痛、糖尿病性神經(jīng)病和疼痛的治療中有進(jìn)一步應(yīng)用。本發(fā)明包括由人腦、垂體和胎盤組織來(lái)源分離的新cDNA序列，以及來(lái)自人16號(hào)染色體的相應(yīng)DNA序列。
出于方便，在本文中將包含定位于16號(hào)染色體上的全長(zhǎng)MNTF1基因(SEQ ID NO2)中編碼MNTF1的序列和/或額外側(cè)翼核酸序列的核酸稱為MNTF相關(guān)核酸、多核苷酸或寡核苷酸。類似的，在本文中將由在全長(zhǎng)MNTF1基因中發(fā)現(xiàn)的開(kāi)放讀碼框編碼的其它多肽稱為MNTF相關(guān)蛋白、多肽或肽。
I.MNTF1生物學(xué)活性已經(jīng)由大鼠和人兩種來(lái)源分離得到MNTF，而且已經(jīng)在體內(nèi)和在體外兩種條件下檢驗(yàn)了它們的生物學(xué)活性。例如，已經(jīng)在surgically-axotomized和遺傳患病兩種動(dòng)物中檢驗(yàn)了它們的潛在生物學(xué)活性。見(jiàn)例如美國(guó)專利號(hào)6,309,877。
最近，在顯示合成MNTF增強(qiáng)外周神經(jīng)再生的研究中在體內(nèi)確認(rèn)了MNTF的營(yíng)養(yǎng)作用。將大鼠坐骨神經(jīng)中封閉的8mm裂隙填充90％含MNTF的Vitrogen。MNTF濃度(摩爾稀釋度)和1個(gè)月后由此產(chǎn)生的用FluoroGold由遠(yuǎn)端殘端標(biāo)記的跨過(guò)裂隙的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)目是鹽水對(duì)照，540；10-7M，678；10-6M，765；10-5M，873；10-4M，1111；10-3M，1130。
此外，在最近的體內(nèi)研究中還確認(rèn)了MNTF的向性作用。將大鼠股神經(jīng)切斷并縫合，然后在最佳濃度10-4M的MNTF或鹽水中浸泡3周。通過(guò)股肌肉和皮膚分支的雙重標(biāo)記來(lái)評(píng)估再生情況(見(jiàn)Brushart，T.M.等，2002，The Journal of Neuroscience 22(14)，6631-6638，收入本文作為方法學(xué)的參考)。用鹽水處理后，平均100個(gè)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元正確突出(project)到肌肉，而平均87個(gè)錯(cuò)誤突出到皮膚；平均51個(gè)是雙重標(biāo)記的。用MNTF處理后，正確突出到肌肉的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元平均數(shù)目增加到173個(gè)(p＝0.0008)，而平均59個(gè)突出到皮膚且47個(gè)是雙重標(biāo)記的。MNTF對(duì)感覺(jué)神經(jīng)元突出的型式?jīng)]有顯著作用。
II.MNTF基因序列的表達(dá)和克隆運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子(MNTF)最初是通過(guò)用針對(duì)3周齡大鼠肌肉提取物的抗體篩選成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤cDNA文庫(kù)(Clontech)而作為33個(gè)氨基酸的肽分離得到的(美國(guó)專利號(hào)6,309,877，收入本文作為參考)?？寺〉玫組NTF基因的927bp片段，并測(cè)定了它的核酸序列(公布于美國(guó)專利號(hào)6,309,877的SEQ ID NO2)。
圖1顯示了含MNTF編碼序列的mRNA在胎兒胸腺、垂體、肝、腎和8-9周胎盤中強(qiáng)表達(dá)，而在胎兒肌肉中弱表達(dá)。在成人肌肉中的表達(dá)可忽略。
進(jìn)一步的克隆和測(cè)序?qū)嶒?yàn)產(chǎn)生了對(duì)MNTF序列的如下改進(jìn)。
腦cDNA的部分序列包括927bp片段起點(diǎn)上游的額外序列(SBQ IDNO1的第1-582位核酸殘基)。
由垂體組織分離得到相對(duì)豐富的約1.8kb cDNA。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)PCR和RACB擴(kuò)增序列，并測(cè)定由此產(chǎn)生的1859bp cDNA的序列(見(jiàn)SEQ ID NO1)。SEQ ID NO1包含與部分腦cDNA序列相同的927bp片段起點(diǎn)上游的5′序列。另外，SEQ ID NO1包含與927bp片段的第1-236位序列完全匹配的部分(SEQ ID NO1的第583-757位核酸殘基)。然而，SEQID NO1包含相對(duì)于927bp片段的許多變異(見(jiàn)表1)。
表1
因此，SEQ ID NO1的第758-1473位核酸殘基與最初公布的927bp序列的相應(yīng)區(qū)域不完全匹配。此外，先前沒(méi)有公布MNTF轉(zhuǎn)錄本額外下游殘基即SEQ ID NO1的第1474-1859位殘基的序列。
還使用由標(biāo)準(zhǔn)化人胎盤制備的cDNA文庫(kù)由另一種組織來(lái)源分離并測(cè)序另一種MNTF cDNA。胎盤cDNA序列符合SEQ ID NO1。
因此，本發(fā)明提供了為MNTF編碼和/或MNTF相關(guān)核酸改進(jìn)的序列信息即SEQ ID NO1、與SEQ ID NO1互補(bǔ)的序列及其部分或片段。此外，優(yōu)選的實(shí)施方案將包括SEQ ID NO1中與先前公布的927bp片段部分不完全對(duì)應(yīng)的部分(SEQ ID NO1中第758-1473位核酸殘基以外)。
III.染色體DNA上的MNTF基因序列為了與相應(yīng)SEQ ID NO1序列比較核苷酸或多肽序列，可以使用可通過(guò)National Center for Biotechnology Information(網(wǎng)址ncbi.nlm.nih.gov)公眾可獲得的BLAST程序進(jìn)行整體序列比對(duì)。在進(jìn)行整體比對(duì)前，可以將SEQ ID NO1提交給GenBank?？梢允褂肗ationalCenter for Biotechnology Information提供的缺省參數(shù)進(jìn)行整體比對(duì)。
使用諸如http//www.ncbi.nlm.nih.gov或http//genome.ucsc.edu等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行的DNA分析顯示，含SEQ ID NO1的基因位于16號(hào)染色體上16q22帶。染色體帶蹤跡代表在分辨率800條帶的吉姆薩染色(Giemsa-stained)的染色體上看到的條帶的大致位置。BarbaraTrask、Vivian Cheung、Norma Nowak和BAC Resource Consortium的其他人員使用熒光原位雜交(FISH)測(cè)定了大型基因組克隆在染色體上的細(xì)胞遺傳定位。關(guān)于BAC Resource Consortium的更多信息，見(jiàn)“Integration of cytogenetic landmarks into the draft sequenceof the human genome”，Nature，409953-958，2001年2月以及所附站點(diǎn)Human BAC Resource。
在Genbank中，基因座是AC092383，登錄號(hào)AP001588，人類16號(hào)染色體克隆RP11-787D11。SEQ ID NO1在克隆RP11-787D11中的位置在80244和80730之間。
MNTF 1859bp cDNA序列(SEQ ID NO1)定位于NIN283基因的一個(gè)內(nèi)含子內(nèi)，所述NIN283基因位于染色體16q22的74813548至74907022(使用UCSC基因組blat)。為了測(cè)定16號(hào)染色體上MNTF cDNA序列前任何上游調(diào)控序列的位置，使用計(jì)算機(jī)分析進(jìn)行理論建模，由染色體16q22的74813548至74907022(使用UCSC基因組blat)的區(qū)域鑒定潛在啟動(dòng)子和/或轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。
SEQ ID NO2顯示了來(lái)自16號(hào)染色體的4359bp序列(對(duì)應(yīng)于74818596至74814238，使用UCSC基因組blat)，它包括MNTF cDNA序列上游的基因組序列，包含推定第一個(gè)啟動(dòng)子位點(diǎn)(SEQ ID NO2的第862-911位核酸殘基)、推定第二個(gè)啟動(dòng)子位點(diǎn)(SEQ ID NO2的第2315-2364位核酸殘基)和潛在轉(zhuǎn)錄起始序列(SEQ ID NO2的第2355-2501位核酸殘基)。SEQ ID NO2還包含MNTF cDNA(第2501-4359位核酸殘基)，它包含編碼已知具有MNTF活性、21個(gè)氨基酸的肽(SEQ ID NO29)的區(qū)域(第3058-3120位核酸殘基)。
圖5顯示了來(lái)自垂體組織的MNTF cDNA與16號(hào)染色體序列的比對(duì)。MNTF cDNA序列與16號(hào)染色體序列在兩個(gè)位置有所不同。圖6通過(guò)DNA測(cè)序證實(shí)了cDNA序列相對(duì)于16號(hào)染色體序列的兩個(gè)位置的變異。
因此，本發(fā)明的其它實(shí)施方案包括SEQ ID NO2、與SEQ ID NO2互補(bǔ)的序列及其部分或片段。優(yōu)選的片段將包含至少一個(gè)推定啟動(dòng)子和/或潛在起始序列。
IV.MNTF相關(guān)多肽對(duì)衍生自cDNA序列的三個(gè)閱讀框的分析顯示，MNTF cDNA序列(SEQID NO1)中存在幾個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)。下文表2中所示氨基酸序列是每個(gè)閱讀框中編碼的推定肽序列，由甲硫氨酸(M)的起始密碼子(ATG)開(kāi)始且由終止密碼子結(jié)束。
表2
SEQ ID NO29包含美國(guó)專利號(hào)6,309,877中公開(kāi)為SEQ ID NO4的33個(gè)氨基酸中的21個(gè)，已經(jīng)證明具有MNTF活性。有趣的是，SEQ ID NO29不是由MNTF mRNA的第一個(gè)開(kāi)放閱讀框編碼的。在任何推定肽區(qū)域之前似乎不存在清晰的Kozak序列，說(shuō)明MNTF編碼序列上游存在的額外ORF可能為MNTF和/或MNTF相關(guān)多肽表達(dá)的翻譯控制提供另外的機(jī)制。
其它實(shí)施方案包括生物學(xué)活性哺乳動(dòng)物多肽，包括例如所含氨基酸序列與本文公布的氨基酸序列至少80％相同、分離的、在體外表達(dá)的或化學(xué)合成的多肽，以及使用這些多肽來(lái)促進(jìn)哺乳動(dòng)物神經(jīng)元的存活、生長(zhǎng)、增殖或維持和神經(jīng)干細(xì)胞分化成神經(jīng)元的方法。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明包括包含本文公布的推定肽序列的至少10個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少15個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少20個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少25個(gè)連續(xù)氨基酸殘基或至少30個(gè)連續(xù)氨基酸殘基的多肽。
本發(fā)明范圍內(nèi)的MNTF相關(guān)多肽還可以是包含SEQ ID NO1的開(kāi)放閱讀框且其附著異源蛋白的融合蛋白。異源蛋白具有與MNTF相關(guān)多肽本質(zhì)上不相似的氨基酸序列。異源蛋白可以融合在MNTF相關(guān)多肽的N末端或C末端。融合蛋白可以包含但不限于酶融合蛋白，例如β-半乳糖苷酶融合物、聚組氨酸融合物、MYC標(biāo)簽融合物和Ig融合物。這些融合蛋白(特別是聚組氨酸融合物)能夠促進(jìn)重組MNTF相關(guān)多肽的純化。
可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)來(lái)生成融合蛋白。例如，可以使用在兩個(gè)連續(xù)基因片段之間產(chǎn)生互補(bǔ)突出的錨定引物來(lái)進(jìn)行基因片段的PCR擴(kuò)增。可以將片段退火，并再次擴(kuò)增以生成嵌合基因序列(Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，1992)?？梢栽诤线m的宿主細(xì)胞中表達(dá)嵌合基因。或者，可以將編碼MNTF相關(guān)多肽的DNA片段克隆到已經(jīng)包含異源蛋白的商品化表達(dá)載體中，導(dǎo)致MNTF相關(guān)蛋白與異源蛋白符合讀框地融合。
V.表達(dá)載體本發(fā)明的另一種形式提供了包含編碼一個(gè)或多個(gè)本文所述開(kāi)放閱讀框序列的MNTF相關(guān)多核苷酸的載體。載體可以是用于維持核酸分子的克隆載體，或是表達(dá)載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知多種克隆和表達(dá)載體。實(shí)例包括質(zhì)粒載體、單鏈或雙鏈?zhǔn)删w載體、單鏈或雙鏈標(biāo)準(zhǔn)DNA或RNA病毒載體或人工染色體(諸如BAC和YAC)。表達(dá)載體包含編碼可操作連接啟動(dòng)子的本文所述MNTF相關(guān)多肽的核苷酸序列。本領(lǐng)域眾所周知適于在多種原核和真核宿主細(xì)胞中控制轉(zhuǎn)錄和翻譯的啟動(dòng)子、終止子和其它調(diào)控區(qū)(Sambrook等，Molecular CloningA LaboratoryManual，第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約，1989)。
本發(fā)明的還有一種形式還提供了包含本發(fā)明表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、酵母和其它真菌或細(xì)菌。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知適于各種表達(dá)載體的宿主細(xì)胞(Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約，1989)。
可以通過(guò)諸如磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、陽(yáng)離子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、轉(zhuǎn)導(dǎo)、感染、脂轉(zhuǎn)染和本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它技術(shù)將表達(dá)載體導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞(Sambrook等，MolecularCloningA Laboratory Manual，第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約，1989)。
VI.核酸檢測(cè)除了在檢測(cè)MNTF相關(guān)蛋白、多肽和/或肽表達(dá)中的用途以外，本文公開(kāi)的核酸序列具有多種其它用途。例如，它們可以作為探針或引物用于牽涉核酸雜交的實(shí)施方案。由此，本發(fā)明的另一個(gè)方面包括通過(guò)檢測(cè)患者生物學(xué)樣品中的核苷酸序列與編碼MNTF蛋白的核苷酸序列或其衍生物的雜交來(lái)檢測(cè)MNTF相關(guān)轉(zhuǎn)錄本表達(dá)的另外方法。
可以使用核苷酸雜交測(cè)定法，其中在雜交條件下使來(lái)自患者生物學(xué)樣品的核酸接觸本發(fā)明的MNTF相關(guān)多核苷酸，并檢測(cè)雜交產(chǎn)物?？梢允褂眠@種方法來(lái)檢測(cè)MNTF相關(guān)基因組DNA或mRNA。可以使用Northern印跡分析、RT-PCR或PCR和連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)作為測(cè)定法的基礎(chǔ)，這些技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的。PCR和LCR技術(shù)在本領(lǐng)域廣泛使用。例如，基本的PCR技術(shù)描述于美國(guó)專利號(hào)4,683,202、4,683,195、4,800,159和4,965,188?；镜腖CR技術(shù)描述于EPA-320,308、EPA-439,182、EPA-336,731、WO 89/09835、WO 89/12696和WO 90/01069。
寡核苷酸探針或引物優(yōu)選包含與所比較的MNTF相關(guān)核苷酸序列(沿著長(zhǎng)度)具有至少60％同源性的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸或至少30個(gè)連續(xù)核苷酸。用于進(jìn)行PCR以檢測(cè)MNTF相關(guān)核酸的這些探針/引物和方法的實(shí)例見(jiàn)實(shí)施例1和3。
因此，本發(fā)明的核苷酸序列可以利用它們與DNA和/或RNA互補(bǔ)鏈選擇性形成雙鏈分子或提供引物用于由樣品擴(kuò)增DNA或RNA的能力。表3列出了可用作探針和/或引物的許多例示性MNTF相關(guān)核苷酸序列，進(jìn)一步的細(xì)節(jié)見(jiàn)實(shí)施例1和3。
表3
根據(jù)設(shè)想的應(yīng)用，可能期望采用不同的雜交條件以實(shí)現(xiàn)探針或引物對(duì)靶序列的不同程度選擇性。
對(duì)于需要高選擇性的應(yīng)用，通常采用相對(duì)較高的嚴(yán)謹(jǐn)條件來(lái)形成雜合物。例如，相對(duì)較低的鹽和/或較高的溫度條件，諸如約0.02M至約0.10M NaCl和約50℃至約70℃的溫度。這些高嚴(yán)謹(jǐn)條件容許探針或引物與模板或靶鏈之間存在很少(如果有的話)錯(cuò)配，而且特別適于分離特異基因或檢測(cè)特異mRNA轉(zhuǎn)錄本。一般可以認(rèn)識(shí)到可以通過(guò)添加逐漸增加的甲酰胺的量使得條件更加嚴(yán)謹(jǐn)。
對(duì)于其它應(yīng)用，例如定點(diǎn)誘變，優(yōu)選較低嚴(yán)謹(jǐn)條件。在這些條件下可以發(fā)生雜交，盡管雜交鏈的序列并非完全互補(bǔ)，而是在一個(gè)或多個(gè)位置錯(cuò)配?？梢酝ㄟ^(guò)提高鹽濃度和/或降低溫度使得條件更不嚴(yán)謹(jǐn)。
在某些實(shí)施方案中，與檢測(cè)雜交的合適手段諸如標(biāo)記物組合使用本發(fā)明限定序列的核酸將是有利的。本領(lǐng)域知道能夠被檢測(cè)的多種指示手段，包括熒光、放射性、酶、或其它配體，諸如親和素/生物素。
一般而言，設(shè)想本文所述探針或引物可以作為試劑用于檢測(cè)相應(yīng)基因表達(dá)的溶液雜交，像PCRTM，以及采用固相的實(shí)施方案。在涉及固相的實(shí)施方案中，將測(cè)試DNA或RNA吸附或通過(guò)其它手段附著在選定基質(zhì)或表面上。然后將此固定的單鏈核酸與選定探針在期望條件下進(jìn)行雜交。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知為具體應(yīng)用優(yōu)化雜交條件。洗滌雜交分子以除去非特異結(jié)合的探針?lè)肿雍螅ㄟ^(guò)測(cè)定結(jié)合的標(biāo)記物的量來(lái)檢測(cè)和/或定量雜交結(jié)果。
可以依照標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook等，1989)由細(xì)胞、組織或其它樣品分離作為模板用于擴(kuò)增的核酸。在某些實(shí)施方案中，對(duì)全細(xì)胞或組織勻漿或生物學(xué)流體樣品進(jìn)行分析而無(wú)需充分純化模板核酸。核酸可以是基因組DNA或是分級(jí)或完整細(xì)胞RNA。在使用RNA時(shí)，可能希望首先將RNA轉(zhuǎn)變成互補(bǔ)DNA。
術(shù)語(yǔ)“引物”在用于本文時(shí)涵蓋能夠在模板依賴性過(guò)程中引發(fā)新生核酸合成的任何核酸。通常，引物是長(zhǎng)度為10至20和/或30個(gè)堿基的寡核苷酸，但是也可以采用更長(zhǎng)的序列。
使設(shè)計(jì)與對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO1或SEQ ID NO2部分的核酸選擇性雜交的引物對(duì)接觸容許選擇性雜交的模板核酸。一旦雜交，使模板-引物復(fù)合物接觸一種或多種促進(jìn)模板依賴性核酸合成的酶。進(jìn)行多輪擴(kuò)增(也稱為循環(huán))，直至生成足夠量的擴(kuò)增產(chǎn)物。
可以檢測(cè)或定量擴(kuò)增產(chǎn)物。在某些應(yīng)用中，可以通過(guò)目測(cè)手段進(jìn)行檢測(cè)。或者，檢測(cè)可能牽涉通過(guò)化學(xué)發(fā)光、所摻入放射性標(biāo)記物的放射性閃爍照相、或熒光標(biāo)記物或者甚至通過(guò)使用電和/或熱脈沖信號(hào)的系統(tǒng)(Affymax technology，Bellus，1994)間接檢測(cè)產(chǎn)物。
在任何擴(kuò)增后，可能希望將擴(kuò)增產(chǎn)物與模板和/或過(guò)量引物分離。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook等，1989)通過(guò)瓊脂糖、瓊脂糖-丙烯酰胺或聚丙烯酰胺凝膠電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物。還可以通過(guò)本領(lǐng)域知道的層析技術(shù)來(lái)進(jìn)行核酸分離，諸如吸附、分配、離子交換、羥磷灰石、分子篩、反相、柱、紙、薄層和氣相層析以及HPLC。
VII.測(cè)定試劑盒、試劑和實(shí)驗(yàn)材料組(panel)還包括用于進(jìn)行核苷酸雜交測(cè)定法的測(cè)定試劑盒，它包含對(duì)MNTF相關(guān)核酸特異的探針和/或引物或其衍生物。試劑盒還可包含樣品制備試劑、清洗試劑、檢測(cè)試劑和信號(hào)生成試劑。
實(shí)施例1為了鑒定哪些組織具有最高的MNTF表達(dá)，由自多種不同組織來(lái)源獲得的cDNA擴(kuò)增PCR產(chǎn)物。衍生自多種組織的成人和胎兒cDNA實(shí)驗(yàn)材料組是由Clontech定購(gòu)的，而基因特異引物是根據(jù)染色體定位實(shí)驗(yàn)(見(jiàn)下文)合成的。
使用了下列引物組正向5′TTT CTT CCT CCC TAC ATC TCT C 3′(SEQ ID NO3)反向5′GAG GGT AAT ATC TGT TGG ATC 3′(SEQ ID NO4)預(yù)期PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度是541個(gè)堿基對(duì)。
A.PCR方案1.Master mix PCR 1X35μl水5μl 10X緩沖液1.5μl MgCl2(50mmol)1μl dNTP1μl每種引物2U Taq Platinum聚合酶5μl DNA模板2.PCR循環(huán)5’95℃38個(gè)循環(huán)
30”95℃30”53℃退火45”72℃延伸5’72℃最后的延伸B.結(jié)果圖1顯示了MNTF成人組織表達(dá)在所有組織中是大致相同的，除了腦和骨骼肌較低以外。在圖1中，使用引物來(lái)擴(kuò)增541bp MNTF1產(chǎn)物(頂部圖)，并針對(duì)G3PDH持家基因表達(dá)(底部圖)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。兩塊凝膠泳道中的樣品是一致的。由左至右第1道，標(biāo)志物；第2道，腦；第3道，肺；第4道，胸腺；第5道，骨骼??；第6道，腎；第7道，心；第8道，肝；第9道，胎盤；和第10道，陰性H2O對(duì)照。
圖2顯示了MNTF胎兒組織表達(dá)在胸腺、腎和肝中最高，而在骨骼肌中最低。在圖2的頂部圖中第1道，標(biāo)志物；第2道，腦；第3道，肺；第4道，胸腺；第5道，骨骼??；第6道，脾；第7道，腎；第8道，心；第9道，肝；和第10道，陰性H2O對(duì)照。
這個(gè)實(shí)驗(yàn)確定了胸腺、腎和肝組織在胎兒和成人中都具有相對(duì)較高水平的MNTF表達(dá)。
實(shí)施例2通過(guò)RISO RNA分離方法(產(chǎn)品目錄編號(hào)06-200)(GenemedBiotechnologies公司，South San Francisco，CA)由下列組織提取總RNA海馬、胎盤、腦(胎兒腦和成人腦)、視網(wǎng)膜、垂體、心、胎兒肌肉。該方法將RNA酶的有效且已知的抑制劑硫氰酸胍(GTC)與β-巰基乙醇結(jié)合起來(lái)用于減緩RNA降解的速率。它還破壞核蛋白復(fù)合物，容許RNA釋放到溶液中并與蛋白質(zhì)污染物分離。通過(guò)酸性酚和氯仿抽提將最后的總RNA進(jìn)一步純化除去污染物，并通過(guò)異丙醇沉淀進(jìn)行濃縮。通過(guò)乙醇沉淀和清洗以除去任何殘余蛋白質(zhì)和污染鹽而進(jìn)行進(jìn)一步純化。
通過(guò)凝膠電泳測(cè)定由組織樣品提取的總RNA的純度和量，并以A260/A280比率指示。由1g組織分離得到約3.5mg總RNA；A260/A280比率是1.65，而A260/A230比率是約1.20。
圖3顯示了對(duì)由10mg不同人體組織樣品分離得到的總RNA的分析。在1.2％瓊脂糖甲醛凝膠的每條泳道加樣3μg RNA。第1-6道分別顯示了來(lái)自垂體、胎盤、腦、視網(wǎng)膜、心和胎兒肌肉的總RNA。M道顯示了0.24-9.7kb RNA階梯標(biāo)志物。
通過(guò)Genemed cDNA制備技術(shù)(未決的專利)由mRNA制備cDNA。有些mRNA購(gòu)自Clontech(Palo Alto，CA)。使用參與將mRNA復(fù)制成雙鏈cDNA及隨后制備用于載體連接的末端的酶構(gòu)建代表性cDNA文庫(kù)。使用禽類成髓細(xì)胞血癥病毒逆轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)六聚物引物合成第一條鏈。使用RNA酶H和DNA聚合酶I合成第二條鏈。通過(guò)T4DNA聚合酶處理補(bǔ)平末端后，制備用于通過(guò)銜接頭連接進(jìn)行克隆的雙鏈cDNA分子。
實(shí)施例3使用標(biāo)準(zhǔn)DNA純化試劑盒制備用于測(cè)序的DNA。DNA測(cè)序是采用Sanger等人(1977)開(kāi)發(fā)的雙脫氧法進(jìn)行的，該方法利用DNA聚合酶摻入2′，3′-雙脫氧核苷酸作為底物的能力。使用DNA聚合酶通過(guò)向延伸鏈添加核苷酸來(lái)復(fù)制單鏈DNA模板。鏈延伸發(fā)生于引物即與模板退火的寡核苷酸的3′端。添加到延伸產(chǎn)物上的脫氧核苷酸是通過(guò)與模板的堿基對(duì)匹配來(lái)選擇的。延伸產(chǎn)物通過(guò)形成在引物生長(zhǎng)端的3′-羥基與所引入脫氧核苷酸的5′-磷酸基之間磷酸二酯鍵而生長(zhǎng)。生長(zhǎng)采取5′向3′方向。DNA聚合酶還能夠摻入核苷酸堿基的類似物。當(dāng)在生長(zhǎng)鏈的3′端摻入雙脫氧核苷酸類似物后，鏈延伸在A、C、G、或T處選擇性終止，因?yàn)殒溔狈?′-羥基。
使用PE Applied Biosystems的ABI377測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。在Applied Biosystems用于自動(dòng)化熒光測(cè)序的策略中，使用5′-染料標(biāo)記引物(染料引物)或3′-染料標(biāo)記雙脫氧核苷酸三磷酸(染料終止物)將熒光染料標(biāo)記物摻入DNA延伸產(chǎn)物。DNA測(cè)序儀檢測(cè)用于鑒定A、C、G、和T延伸反應(yīng)的四種不同染料發(fā)出的熒光。每種染料在受到氬離子激光的激發(fā)后發(fā)出不同波長(zhǎng)的光，而且可以在凝膠中檢測(cè)并辨別指示四種堿基的四種顏色。
實(shí)施例4使用兩種不同的策略即標(biāo)準(zhǔn)PCR和5′-RACE來(lái)分離和篩選MNTF基因。
A.標(biāo)準(zhǔn)PCR第一種策略用不同的引物組篩選基因。目的是確定目標(biāo)cDNA文庫(kù)中是否存在全長(zhǎng)MNTF序列。下列寡核苷酸序列是MNTF序列的標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增中所使用的引物對(duì)的實(shí)例。
TTGGGGACATTTTGGGGTGA(SEQ ID NO5)GCTCGATGTCTTGCAGAAGG(SEQ ID NO6)AGGGTAACACTTAGAAGTAGC(SEQ ID NO7)TCACCCCAAAATGTCCCCA(SEQ ID NO8)使用標(biāo)準(zhǔn)PCR法來(lái)篩選由不同組織制備的cDNA。使用每對(duì)引物來(lái)擴(kuò)增海馬、胎兒腦、胎盤、視網(wǎng)膜、垂體、胎兒肌肉或心組織的cDNA文庫(kù)。
擴(kuò)增條件如下20mM Tris-HCl pH7.5、50mM KCl、3.5mM MgCl2、0.1％ Triton X-100、0.8mM dNTP、100pmol每種引物、和2.5U TaqDNA聚合酶(Applied Biosystems)。如下進(jìn)行35個(gè)循環(huán)94℃，1分鐘；55℃，2分鐘；72℃，3分鐘。
通過(guò)電泳分離DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，并在紫外光下顯影。若有明顯的擴(kuò)增條帶，則在低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠上分離，酚抽提，并乙醇沉淀。制備擴(kuò)增的條帶用于克隆。分離得到一個(gè)部分PCR片段并測(cè)序。由自腦組織制備的cDNA擴(kuò)增得到長(zhǎng)度為約700堿基對(duì)、對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO1的第1-713位核酸殘基的部分DNA序列。
B.5′-RACE擴(kuò)增5′-RACE是用于尋找MNTF基因5′端的另一種策略。5′-RACE或錨定PCR便于由信使RNA(mRNA)分離和鑒定MNTF 5′端。修改用于快速擴(kuò)增cDNA末端的RACE系統(tǒng)(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)，并用于獲得MNTF cDNA。使用RACE方法由總mRNA擴(kuò)增限定內(nèi)部位點(diǎn)與MNTF mRNA 3′或5′端未知序列之間的cDNA序列。由不同組織分離mRNA后，使用基因特異反義寡核苷酸引發(fā)第一條cDNA鏈的合成。這容許MNTF特異mRNA和相關(guān)mRNA家族轉(zhuǎn)變成cDNA，并將完整延伸至信使5′末端的可能性最大化。合成cDNA后，純化第一條鏈產(chǎn)物以除去未摻入的dNTP和MNTF引物。使用TdT(末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶)向cDNA的3′末端添加同聚物尾。然后使用嵌套基因特異引物混合物以及容許由同聚物尾進(jìn)行擴(kuò)增的含互補(bǔ)同聚物錨定引物和相應(yīng)銜接頭引物的組合通過(guò)PCR擴(kuò)增加尾cDNA。這容許擴(kuò)增MNTF特異引物序列與mRNA 5′末端之間的未知序列。
圖4顯示了通過(guò)RACE方法生成的DNA片段。反應(yīng)使用了約0.1μgmRNA。圖4所示結(jié)果是由1μl RACE反應(yīng)液得到的。反應(yīng)溫度是94℃ 2分鐘；30個(gè)循環(huán)的94℃ 50秒鐘、65℃ 30秒鐘、和72℃ 3分鐘；以及最后72℃ 10分鐘。圖4的第1-6道分別顯示了來(lái)自垂體、胎盤、腦(胎兒腦和成人腦)、視網(wǎng)膜、心和胎兒肌肉的總RNA。DNA分子量標(biāo)志物標(biāo)以M。由垂體RNA生成相對(duì)豐富的約1.8kb的RACE產(chǎn)物。
可以使用下列寡核苷酸序列作為引物在RACE方法中用于擴(kuò)增MNTF序列5’-CTG TTA GCT TGG TAC CGA GCT CGG ATC-3’(SEQ ID NO9)5’-TAG GGG AAA GAT TGC TCC TGC CTT TAG-3’(SEQ ID NO10)5’-TAT TGC CTG GCT GTT GGC ACA TGA CTG-3’(SEQ ID NO11)5’-CTG CTC CAT GCT AAG TGC TTG GTC TTC-3’(SEQ ID NO12)通過(guò)RACE由垂體組織分離得到MNTF基因的cDNA。SEQ ID NO1所示序列是由幾個(gè)DNA測(cè)序反應(yīng)的結(jié)果組合而成的。該序列包含對(duì)應(yīng)于MNTF mRNA的1859個(gè)連續(xù)堿基，每個(gè)測(cè)序結(jié)果的平均長(zhǎng)度為919個(gè)堿基。
實(shí)施例5由8-9周標(biāo)準(zhǔn)化人胎盤制備的Superscript cDNA文庫(kù)購(gòu)自Invitrogen(產(chǎn)品目錄編號(hào)SL.2NBHP89W)。為了便于由5′-cDNA端和3′-cDNA端擴(kuò)增并克隆MNTF基因，使用基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的RACE技術(shù)和方案。
由cDNA文庫(kù)分離MNTF cDNA。使用5′端RACE鑒定5′端序列，而使用3′端RACE鑒定3′端序列。依照DNA RACE試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行分離基因的方法。制造商(Ambion公司，Austin，TX)描述了各個(gè)步驟的細(xì)節(jié)。然后對(duì)分離的基因測(cè)序以確認(rèn)基因的身份。
將MNTF cDNA亞克隆到載體pcDNA3.1/V5-His-TOPO載體中。通過(guò)DNA測(cè)序反應(yīng)確認(rèn)5′端和3′端序列的連接。
胎盤cDNA的完整DNA序列與來(lái)自垂體的MNTF相關(guān)cDNA(SEQ ID NO1)一致。
實(shí)施例6鑒定為NIN283的基因也位于染色體16q22。NIN283應(yīng)答神經(jīng)損傷而表達(dá)(編號(hào)NM 032268，4633bp mRNA序列)。公布的NIN283基因序列位于染色體16q22的74812469至74813547、74907023至74907118、74918235至75918340、74919933至7490022、以及74921184至74924445。MNTF 1859bp cDNA序列位于染色體16q22的74814238至74816096(使用UCSC基因組blat)。兩種核苷酸序列之間沒(méi)有重疊或匹配，盡管MNTF基因序列位于NIN283基因的第一個(gè)和第二個(gè)片段(或外顯子)之間，一個(gè)內(nèi)含子區(qū)域內(nèi)。
為了確認(rèn)MNTF基因確實(shí)獨(dú)立于NIN283，而非未曾報(bào)告的剪接形式的NIN283外顯子，使用來(lái)自骨骼肌的polyA(+)RNA進(jìn)行RT-PCR。制備了三組引物在第一組中，正向引物位于NIN283的第一個(gè)外顯子中，而反向引物位于MNTF的編碼區(qū)中；在第二組中，正向引物位于MNTF的編碼區(qū)中，而反向引物位于NIN283的第四個(gè)外顯子中。如果存在這樣的剪接形式，即MNTF作為NIN283的一個(gè)外顯子，那么預(yù)計(jì)將看到PCR產(chǎn)物。然而，在任何PCR反應(yīng)中都沒(méi)有形成顯著的PCR產(chǎn)物。這些RT-PCR反應(yīng)的結(jié)果說(shuō)明，MNTF和NIN283極不可能是相關(guān)的。
其它實(shí)施方案盡管已經(jīng)參照某些優(yōu)選形式相當(dāng)詳細(xì)的描述了本發(fā)明，然而其它形式也是可能的。例如，其他人描述了mRNA轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)利用率的組織特異和/或發(fā)育階段變異。因此，根據(jù)組織、細(xì)胞或發(fā)育階段，MNTF相關(guān)mRNA或cDNA的5′端可能包含額外或較少的核酸殘基，其可能包含SEQ ID NO2選定部分(例如推定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn))。此外，依照本發(fā)明各個(gè)方面在雜交和/或擴(kuò)增測(cè)定法中所使用的相應(yīng)MNTF相關(guān)寡核苷酸將能夠提供這些變異的更加確定的表達(dá)型式。因此，正如所附權(quán)利要求中所表征的本發(fā)明的精神和范圍應(yīng)當(dāng)不限于本文所含優(yōu)選形式的描述。
序列表<110>Genervon Biopharmaceuticals LLC<120>運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子基因序列<130>12593<150>60/518,581<151>2003-11-07<160>32<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>1859<212>DNA<213>人類(Homo sapiens)<400>1cagctgctca gaggagtagc tgggaccagg gcccttcagt attctacctc cagacccagc 60ctaagcccac gctctctgag aaggccttgt atacactgaa ctccctcatg tatttcactg120acaactgttt tctgtgccca tgaagagttg caagagcacc ttgaaaacac aagcaaacat180atcatatcaa cttccaggca tctaattaat tgtgcaccaa aatcgttacc cttccaatct240tgcaacagaa gagcaaaagc tgcttagacc ttactcaaag gctccaaagc agaaacaagt300tttgcttctt gcagcaatgt gtaacagagg aaacagatgt cctggaagat cccatggtct360gtttcaggtg agatggaacc aatgctgcac acgaagattc atctcaaatg aaatgcacag420gaaaagccaa ttactttatg tgaataaaag aataaatccc taaagcagtg gttctcaacc480agagtgatac cacccacacc ccagagggca tttgggaatt cttggggaca ttttggggtg540acacactgaa ctgctggatg ctatcagcat ttagtaggta tgctcgatgt cttgcagaag600gacatgatgg tcctacacag taaggaatgg attacctaca atattaatag cagcctccca660tacacacttt tgacaccctt ccctaaagga ttaatatgct ccaaccttcc tgtccccaca720gttcagtggc tctccctacc ctcaccatga tcggatgaaa aaaaataagg tttcacagct780taagagtgaa attctggaat ccaactacaa gctcataact gtagcatgga acctggtagt840agcataataa ataaattttt agtaagaggc ttaagaaatt ttagcaaaaa aagcactccc900tttcttcctc cctacatatc tcatatgttt ttcaacacaa aaaattctgt gattttagag960aaacttctta cagtactttt aagttcaaaa ccagatgctc attacagttc ttttaaacac 1020caaactagtc atctcaaaaa tatggctaac tctctggact aaattccata ggaaaaatta 1080ttaatttcaa aatgcctaat tttgatcaaa tgcctgaaag agccaaaggc aatcatgtcc 1140tgcttctcac tcagggcaga gttccatgag gtcagaaaag ctccaatgat atccggaggt 1200ctgtcagaga ttaaaatatc atcctaacaa ttcacaagct acttctaagt gttaccctaa 1260
attagtcact aatcgtttct cccccaacac tatttcacaa attaaagttt acagaattga 1320caaaaaacca aaccaaatga aaacaaaccc caggctattt gcaggggggg ggaaagagat 1380accccaaaag tcaaccctat ttcacagtag ttaaaagagt gatccaacag atattaccct 1440ccataaagta ccctaaaggc aggagcaatc tttcccctac actatctaaa ttttcccaac 1500tcacccaaaa gaatcttaag atgtaacttc atcactcaac ttgccaatta gcaaatagcg 1560gcccccacat cccttttggc caattttcta gatgcctgac ctagcagaca gacctgtttt 1620cctcctgcca ggcctttttt gccctcccgc taggagcctg ggaaatcccc ctccaacctt 1680ttgctggcct gtcaccagaa gttcataaaa tgaattcatc cagattctct gaatcctcct 1740tttccccagt catgtgccaa cagccaggca ataatgcccc accgtgacag gctccctgtt 1800acaaaaagat gcagattcac gggaagacca agcacttagc atggagcaga agaaaaaaa1859<210>2<211>4359<212>DNA<213>人類<400>2accacagaat gcttttcctt ctccagaaac catgtgaagg cccattactt ctagcacacc 60tatggcggga cacaaaggct ttctgattca ctccaaggga gctggcaatt ctcccccatt120agctaacaat aaaagaaaat taaatcactt gagaacccta cagtggcagc aaaatagagc180ccaagagata cctcctagca tgttcaaaga cttattaaaa gccacgttgg gccaggcgtg240gtggcttatg cctataatcc caataccttg ggaggttgag gtgggaggat tgcttaaagc300ccggagtttg aggccagcct aggcaacata gtgagacctc atctctacaa aagattgtat360aaaatttagc caggtgtagt ggtgcgcacc tgagtcccag ctactctgga agctgagatg420ggaagacggc ttgagcccaa gagtttgagg ctacagtgaa ccatgattgc accatggcac480tccagcctgg gcaacagagc aagaccctgt ctcaaaaata aataaataac aaaaacaaaa540cacaatcacc ttgtatcagt ctcagttgat ggcttgatga caataaagaa cagtttagac600tttctgaaag tgcatacata tatatacaca tatgactaag aaggtgaagt gaagccctca660atggccagcc cttttatagt agaacctaga aaacagcaac ttctttcaac atggtggatg720gtgcatgttt tgtaccccac atttagaaat ccatactctg agacaaacag aactaccgaa780agagaatgac caggcctcca gaatagcacc gaggcagcca tcaggagtta tagcaaaact840ttttaacgtg gaaagggagt cactctgctt ctataaagca gcccttatca gcggcattat900gagtaaaagc agcccactaa tgcaggccag actttaggac acagaaccag attccatttg960ggggctacag ctagcacagc tgtaaacctc tctccaccca tcaaattctg agaccattag 1020gcctggcacg gtggctcatg cctgtggtcc cagcactttg ggaagccaag ctgggaggat 1080
caactgagcc caggagtctg agactgcagt gagctatgat ctcgccactg cactccagcc 1140tgggtgacag aataagaccc tgtctcaaaa gaaaaaaaaa aaaaatctga ggcgattgaa 1200ggcagacaac tataagagag tgcccccata ggaactccac cactctccat ttagaatgtc 1260ctttgacttt tgtgcacatt atctcatgag accctcacta tgactctgag aggtaagcag 1320gacaggcgtc ttctacattt tacagatgaa taaattgtga ctgaggttaa atgactcgct 1380tgcccaaggt cacaaatcat gcagctaatc agctgcctaa ccaggagatg agcctagcac 1440tctgactcgt aggccagcgc aatctccagg acaccatgcg gctttgtgat gttttcagat 1500aagaggcgga agagggtact ggttaagagc ccaggttctg gcaccagcca acctgcattc 1560caatcccatc tccaccacct actaaccacc tgatcttgtg tgagttcctt aacctcccca 1620aacctgtttc cttacctgca caatgggggt gggagagaac agtcttactc catagagtca 1680gagtgatgat taagtgagat gatgaacata aagtactcaa attcatgtac tcaaaaaatg 1740tgagtggcag gcacagtgca ggacccacaa cagagatcaa ggaacacagt cctgctctca 1800cggagcttag actttaggca aaccatacac agaaaaaagt aaacagataa aatacttaca 1860aagtgtgtta agaatgatta aggtgcaggg cgcagtggct cacgcctgta atcctatcac 1920tttgggaggc cgggtcaggc agatcacctg aggtcgggag tttgagacca gcctgataaa 1980catggagaaa tcccgtctct acaaaaaaca aaattagccc caagcttatt gggcatggtg 2040gcgcatgcca gtaatcccag ctactcggga ggctgaggca ggagaattgc ttgaacccgg 2100gaggcggaga ctgcagtgag cagaggtcgc accactgcac tccagcctgg gcaacaagag 2160cgaaactctg tctcaaaaaa aagaatgatt aaggtaacag gtgagtgact ggagagaata 2220accggagggg ccaattttta agagtggtct ctaagcccta agggatcaga aagagaaatt 2280cgtgtgaaga acggagagaa aagcactcta ggattaggga atggtatacg tgggggtcac 2340agcacaggga agtcaggaac ctagagaaga caaatgtgac tacagcgctt cctctcccgg 2400gatttgcgga gcaaggctgg agctcgtgag ggtgaccaca actattttaa aaacgacaaa 2460gataaggctc aagagagggg atatgtcttg cccaaggtca cagctgctca gaggagtagc 2520tgggaccagg gcccttcagt attctacctc cagacccagc ctaagcccac gctctctgag 2580aaggccttgt atacactgaa ctccctcatg tatttcactg acaactgttt tctgtgccca 2640tgaagagttg caagagcacc ttgaaaacac aagcaaacat atcatatcaa cttccaggca 2700tctaattaat tgtgcaccaa aatcgttacc cttccaatct tgcaacagaa gagcaaaagc 2760tgcttagacc ttactcaaag gctccaaagc agaaacaagt tttgcttctt gcagcaatgt 2820gtaacagagg aaacagatgt cctggaagat cccatggtct gtttcaggtg agatggaacc 2880aatgctgcac acgaagattc atctcaaatg aaatgcacag gaaaagccaa ttactttatg 2940tgaataaaag aataaatccc taaagcagtg gttctcaacc agagtgatac cacccacacc 3000
ccagagggca tttgggaatt cttggggaca ttttggggtg acacactgaa ctgctggatg 3060ctatcagcat ttagtaggta tgctcgatgt cttgcagaag gacatgatgg tcctacacag 3120taaggaatgg attacctaca atattaatag cagcctccca tacacacttt tgacaccctt 3180ccctaaagga ttaatatgct ccaaccttcc tgtccccaca gttcagtggc tctccctacc 3240ctcaccatga tcggatgaaa aaaaataagg tttcacagct taagagtgaa attctggaat 3300ccaactacaa gctcataact gtagcatgga acctggtagt agcataataa ataaattttt 3360agtaagaggc ttaagaaatt ttagcaaaaa aagcactccc tttcttcctc cctacatatc 3420tcatatgttt ttcaacacaa aaaattctgt gattttagag aaacttctta cagtactttt 3480aagttcaaaa ccagatgctc attacagttc ttttaaacac caaactagtc atctcaaaaa 3540tatggctaac tctctggact aaattccata ggaaaaatta ttaatttcaa aatgcctaat 3600tttgatcaaa tgcctgaaag agccaaaggc aatcatgtcc tgcttctcac tcagggcaga 3660gttccatgag gtcagaaaag ctccaatgat atccggaggt ctgtcagaga ttaaaatatc 3720atcctaacaa ttcacaagct acttctaagt gttaccctaa attagtcact aatcgtttct 3780cccccaacac tatttcacaa attaaagttt acagaattga caaaaaacca aaccaaatga 3840aaacaaaccc caggctattt gcaggggggg ggaaagagat accccaaaag tcaaccctat 3900ttcacagtag ttaaaagagt gatccaacag atattaccct ccataaagta ccctaaaggc 3960aggagcaatc tttcccctac actatctaaa ttttcccaac tcacccaaaa gaatcttaag 4020atgtaacttc atcactcaac ttgccaatta gcaaatagcg gcccccacat cccttttggc 4080caattttcta gatgcctgac ctagcagaca gacctgtttt cctcctgcca ggcctttttt 4140gccctcccgc taggagcctg ggaaatcccc ctccaacctt ttgctggcct gtcaccagaa 4200gttcataaaa tgaattcatc cagattctct gaatcctcct tttccccagt catgtgccaa 4260cagccaggca ataatgcccc accgtgacag gctccctgtt acaaaaagat gcagattcac 4320gggaagacca agcacttagc atggagcaga agaaaaaaa 4359<210>3<211>22<212>DNA<213>人類<400>3tttcttcctc cctacatctc tc 22<210>4<211>21<212>DNA<213>人類<400>4
gagggtaata tctgttggat c21<210>5<211>20<212>DNA<213>人類<400>5ttggggacat tttggggtga 20<210>6<211>20<212>DNA<213>人類<400>6gctcgatgtc ttgcagaagg 20<210>7<211>21<212>DNA<213>人類<400>7agggtaacac ttagaagtag c21<210>8<211>19<212>DNA<213>人類<400>8tcaccccaaa atgtcccca 19<210>9<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>載體引物<400>9ctgttagctt ggtaccgagc tcggatc 27<210>10<211>27<212>DNA<213>人類<400>10taggggaaag attgctcctg cctttag 27<210>11<211>27<212>DNA
<213>人類<400>11tattgcctgg ctgttggcac atgactg 27<210>12<211>27<212>DNA<213>人類<400>12ctgctccatg ctaagtgctt ggtcttc 27<210>13<211>24<212>PRT<213>人類<400>13Met Ser Trp Lys Ile Pro Trp Ser Val Ser Gly Glu Met Glu Pro Met1 5 10 15Leu His Thr Lys Ile His Leu Lys20<210>14<211>56<212>PRT<213>人類<400>14Met Leu Asp Val Leu Gln Lys Asp Met Met Val Leu His Ser Lys Glu1 5 10 15Trp Ile Thr Tyr Asn Ile Asn Ser Ser Leu Pro Tyr Thr Leu Leu Thr20 25 30Pro Phe Pro Lys Gly Leu Ile Cys Ser Asn Leu Pro Val Pro Thr Val35 40 45Gln Trp Leu Ser Leu Pro Ser Pro50 55<210>15<211>78<212>PRT<213>人類<400>15Met Glu Pro Gly Ser Ser Ile Ile Asn Lys Phe Leu Val Arg Gly Leu1 5 10 15
Arg Asn Phe Ser Lys Lys Ser Thr Pro Phe Leu Pro Pro Tyr Ile Ser20 25 30His Met Phe Phe Asn Thr Lys Asn Ser Val Ile Leu Glu Lys Leu Leu35 40 45Thr Val Leu Leu Ser Ser Lys Pro Asp Ala His Tyr Ser Ser Phe Lys50 55 60His Gln Thr Ser His Leu Lys Asn Met Ala Asn Ser Leu Asp65 70 75<210>16<211>30<212>PRT<213>人類<400>16Met Ser Cys Phe Ser Leu Arg Ala Glu Phe His Glu Val Arg Lys Ala1 5 10 15Pro Met Ile Ser Gly Gly Leu Ser Glu Ile Lys Ile Ser Ser20 25 30<210>17<211>21<212>PRT<213>人類<400>17Met Pro His Arg Asp Arg Leu Pro Val Thr Lys Arg Cys Arg Phe Thr1 5 10 15Gly Arg Pro Ser Thr20<210>18<211>21<212>PRT<213>人類<400>18Met Lys Ser Cys Lys Ser Thr Leu Lys Thr Gln Ala Asn Ile Ser Tyr1 5 10 15Gln Leu Pro Gly Ile20<210>19
<211>48<212>PRT<213>人類<400>19Met Cys Asn Arg Gly Asn Arg Cys Pro Gly Arg Ser His Gly Leu Phe1 5 10 15Gln Val Arg Trp Asn Gln Cys Cys Thr Arg Arg Phe Ile Ser Asn Glu20 25 30Met His Arg Lys Ser Gln Leu Leu Tyr Val Asn Lys Arg Ile Asn Pro35 40 45<210>20<211>6<212>PRT<213>人類<400>20Met Ser Cys Arg Arg Thr1 5<210>21<211>30<212>PRT<213>人類<400>21Met Lys Lys Asn Lys Val Ser Gln Leu Lys Ser Glu Ile Leu Glu Ser1 5 10 15Asn Tyr Lys Leu Ile Thr Val Ala Trp Asn Leu Val Val Ala20 25 30<210>22<211>29<212>PRT<213>人類<400>22Met Leu Ile Thr Val Leu Leu Asn Thr Lys Leu Val Ile Ser Lys Ile1 5 10 15Trp Leu Thr Leu Trp Thr Lys Phe His Arg Lys Asn Tyr20 25<210>23<211>7<212>PRT<213>人類
<400>23Met Arg Ser Glu Lys Leu Gln1 5<210>24<211>25<212>PRT<213>人類<400>24Met Lys Thr Asn Pro Arg Leu Phe Ala Gly Gly Gly Lys Glu Ile Pro1 5 10 15Gln Lys Ser Thr Leu Phe His Ser Ser20 25<210>25<211>38<212>PRT<213>人類<400>25Met Pro Asp Leu Ala Asp Arg Pro Val Phe Leu Leu Pro Gly Leu Phe1 5 10 15Cys Pro Pro Ala Arg Ser Leu Gly Asn Pro Pro Pro Thr Phe Cys Trp20 25 30Pro Val Thr Arg Ser Ser35<210>26<211>11<212>PRT<213>人類<400>26Met Tyr Phe Thr Asp Asn Cys Phe Leu Cys Pro1 5 10<210>27<211>5<212>PRT<213>人類<400>27Met Val Cys Phe Arg1 5
<210>28<211>11<212>PRT<213>人類<400>28Met Lys Cys Thr Gly Lys Ala Asn Tyr Phe Met1 5 10<210>29<211>21<212>PRT<213>人類<400>29Met Leu Ser Ala Phe Ser Arg Tyr Ala Arg Cys Leu Ala Glu Gly His1 5 10 15Asp Gly Pro Thr Gln20<210>30<211>20<212>PRT<213>人類<400>30Met Leu Gln Pro Ser Cys Pro His Ser Ser Val Ala Leu Pro Thr Leu1 5 10 15Thr Met Ile Gly20<210>31<211>25<212>PRT<213>人類<400>31Met Pro Asn Phe Asp Gln Met Pro Glu Arg Ala Lys Gly Asn His Val1 5 10 15Leu Leu Leu Thr Gln Gly Arg Val Pro20 25<210>32<211>25<212>PRT<213>人類<400>32
Met Asn Ser Ser Arg Phe Ser Glu Ser Ser Phe Ser Pro Val Met Cys1 5 10 15Gln Gln Pro Gly Asn Asn Ala Pro Pro20 2權(quán)利要求
1.由選自下組的MNTF相關(guān)核酸序列組成的分離多核苷酸a)SEQ ID NO1；b)SEQ ID NO1的片段；c)SEQ ID NO2；和d)SEQ ID NO2的片段；e)與SEQ ID NO1或其片段完全互補(bǔ)的核酸序列；和f)與SEQ ID NO2或其片段完全互補(bǔ)的核酸序列。
2.權(quán)利要求1的分離多核苷酸，所述SEQ ID NO1的片段包含這樣的5′末端，其選自SEQ ID NO1的第1-1849位殘基，包括該5′末端和3′末端的SEQ ID NO1的至少10個(gè)連續(xù)核酸殘基，其中該3′末端選自SEQ ID NO1的第10-1859位殘基。
4.權(quán)利要求1的分離多核苷酸，其中SEQ ID NO1的片段選自下組a)SEQ ID NO3；b)SEQ ID NO5；c)SEQ ID NO6；和d)SEQ ID NO10。
5.權(quán)利要求1的分離多核苷酸，其中與SEQ ID NO1的片段完全互補(bǔ)的核酸序列選自下組a)SEQ ID NO4；b)SEQ ID NO7；c)SEQ ID NO8；d)SEQ ID NO11；和e)SEQ ID NO12。
6.權(quán)利要求1的分離多核苷酸，所述SEQ ID NO1的片段包含至少一個(gè)開(kāi)放閱讀框。
7.權(quán)利要求6的分離多核苷酸，其中該至少一個(gè)開(kāi)放閱讀框編碼選自下組的多肽a)SEQ ID NO13；b)SEQ ID NO14；c)SEQ ID NO15；d)SEQ ID NO16；e)SEQ ID NO17；f)SEQ ID NO18；g)SEQ ID NO19；h)SEQ ID NO20；i)SEQ ID NO21；a)SEQ ID NO22；b)SEQ ID NO23；c)SEQ ID NO24；d)SEQ ID NO25；e)SEQ ID NO26；f)SEQ ID NO27；g)SEQ ID NO28；h)SEQ ID NO29；i)SEQ ID NO30；j)SEQ ID NO31；和k)SEQ ID NO32。
8.包含依照權(quán)利要求7的第一多核苷酸和第二多核苷酸的組合物，其中第一多核苷酸包含編碼SEQ ID NO29的開(kāi)放閱讀框。
9.權(quán)利要求1的分離多核苷酸，所述SEQ ID NO2的片段包含至少一個(gè)推定MNTF啟動(dòng)子序列和至少一個(gè)開(kāi)放閱讀框。
10.權(quán)利要求9的分離多核苷酸，其中所述推定MNTF啟動(dòng)子序列選自下組a)SEQ ID NO2的第862-911位殘基；和b)SEQ ID NO2的第2315-2364位殘基。
11.權(quán)利要求10的分離多核苷酸，其中所述SEQ ID NO2的片段包含潛在轉(zhuǎn)錄起始序列，它包含SEQ ID NO2的第2501-4359位殘基。
12.權(quán)利要求9的分離多核苷酸，其中所述至少一個(gè)開(kāi)放閱讀框編碼選自下組的多肽a)SEQ ID NO13；b)SEQ ID NO14；c)SEQ ID NO15；d)SEQ ID NO16；e)SEQ ID NO17；f)SEQ ID NO18；g)SEQ ID NO19；h)SEQ ID NO20；i)SEQ ID NO21j)SEQ ID NO22；k)SEQ ID NO23；l)SEQ ID NO24；m)SEQ ID NO25；n)SEQ ID NO26；o)SEQ ID NO27；p)SEQ ID NO28；q)SEQ ID NO29；r)SEQ ID NO30；s)SEQ ID NO31；和t)SEQ ID NO32。
13.由SEQ ID NO1的開(kāi)放閱讀框編碼的分離MNTF相關(guān)多肽。
14.融合蛋白，其包含連接異源蛋白的、由SEQ ID NO1的開(kāi)放閱讀框編碼的MNTF相關(guān)多肽的。
15.與依照權(quán)利要求1的分離多核苷酸可操作連接的表達(dá)載體，其中至少一個(gè)開(kāi)放閱讀框可操作連接與目的宿主載體相容的控制序列。
16.用權(quán)利要求15的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的分離宿主細(xì)胞。
17.用于測(cè)定介質(zhì)中是否存在MNTF相關(guān)多核苷酸的方法，包括下列步驟使可能含有MNTF相關(guān)核酸序列的介質(zhì)接觸在預(yù)先選定的雜交條件下在所述介質(zhì)中與所述MNTF相關(guān)核酸序列發(fā)生雜交但與所述MNTF相關(guān)核酸序列以外的核酸序列不發(fā)生雜交的合成且分離的寡核苷酸；并在所述預(yù)先選定的雜交條件下檢測(cè)所述MNTF相關(guān)核酸序列的存在。
18.比較不同樣品中MNTF相關(guān)表達(dá)產(chǎn)物的相對(duì)豐度的方法，包括下列步驟獲得第一樣品和第二樣品，其中第一樣品與第二樣品不同；對(duì)第一樣品和第二樣品檢測(cè)MNTF相關(guān)表達(dá)產(chǎn)物；并比較第一和第二樣品中MNTF相關(guān)表達(dá)產(chǎn)物的相對(duì)豐度。
19.權(quán)利要求18的方法，其中MNTF RNA是表達(dá)產(chǎn)物。
20.權(quán)利要求18的方法，其中MNTF相關(guān)多肽是表達(dá)產(chǎn)物。
21.權(quán)利要求18的方法，其中具有至少SEQ ID NO29的多肽是表達(dá)產(chǎn)物。
22.權(quán)利要求18的方法，其中所述比較包括用與所述RNA互補(bǔ)的核酸探針進(jìn)行雜交的步驟。
23.雜交測(cè)定法中所使用的實(shí)驗(yàn)材料組，包含兩種或多種依照權(quán)利要求1的多核苷酸，其穩(wěn)定結(jié)合在固相支持物的表面。
全文摘要
本發(fā)明涉及與編碼運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子的序列有關(guān)的核酸、由這些序列編碼的多肽、以及用于檢測(cè)這些序列測(cè)定法，所述運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子促進(jìn)哺乳動(dòng)物神經(jīng)元的存活、生長(zhǎng)、增殖或維持。
文檔編號(hào)C12N15/00GK1878784SQ200480032339
公開(kāi)日2006年12月13日 申請(qǐng)日期2004年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月7日
發(fā)明者B·B·薛 申請(qǐng)人:健能萬(wàn)生物制藥公司